JP2022038517A - 免疫刺激オリゴヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

【課題】核酸分解酵素に対する優れた耐性を有する、免疫刺激性の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの提供。【解決手段】１４～１００個のデオキシヌクレオチドからなり、塩基配列として、２～５個の連続するグアニン（Ｇ）からなる同一のポリＧ部位を４つ含み、ポリＧ部位の２つはぞれぞれ５’末端と３’末端に配置され、残りのポリＧ部位は、他のポリＧ部位とスペーサ部位を介して配置されており、スペーサ部位は、１個、又は、２個以上の塩基からなり、スペーサ部位の少なくとも１つ以上は、ホスホジエステルを介したシトシン（Ｃ）－グアニン（Ｇ）配列を含む連続する３～６個の塩基からなるＣｐＧ部位を１～５個含み、ＣｐＧ部位を含むスペーサ部位以外のスペーサ部位は、グアニン（Ｇ）以外の塩基からなり、デオキシヌクレオチド間の結合の７５％以上がホスホジエステル結合である、１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。【選択図】図３

Description

本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチドに関する。
メチル化されていないシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）とがホスホジエステルを介して結合した配列（ＣｐＧ）は、Ｔｏｌｌ様受容体９番（ＴＬＲ９）を刺激して免疫応答を引き起こすことが知られている。
非特許文献１には、塩基配列が５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ－３’であるＣｐＧ オリゴデオキシヌクレオチドである「２００６」がヒトＴＬＲ９を活性化することが示されている。
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００１，ｖｏｌ．９８，ｎｏ．１６，ｐ．９２３７－９２４２
ＣｐＧ オリゴデオキシヌクレオチド「２００６」は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドであって、免疫刺激作用を有しているが、核酸分解酵素に対する耐性が不十分であった。
そこで本発明は、核酸分解酵素に対する優れた耐性を有する免疫刺激性の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを提供することを課題とする。また、本発明はよれば、四重鎖構造体、免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体、ワクチンのアジュバント、方法、免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用、医薬組成物、ガンを治療または予防する方法、及び、アレルギーを治療または予防する方法を提供することも課題とする。
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。
［１］ １４～１００個のデオキシヌクレオチドからなる一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドであって、塩基配列として、２～５個の連続するグアニン（Ｇ）からなる同一のポリＧ部位を４つ含み、上記ポリＧ部位の２つはぞれぞれ５’末端と３’末端に配置され、残りの上記ポリＧ部位は、他のポリＧ部位とスペーサ部位を介して配置されており、上記スペーサ部位は、１個、又は、２個以上の塩基からなり、上記スペーサ部位の少なくとも１つ以上は、ホスホジエステルを介したシトシン（Ｃ）－グアニン（Ｇ）配列を含む連続する３～６個の塩基からなるＣｐＧ部位を１～５個含み、ＣｐＧ部位を含む上記スペーサ部位以外のスペーサ部位は、グアニン（Ｇ）以外の塩基からなり、上記デオキシヌクレオチド間の結合の７５％以上がホスホジエステル結合である、１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
［２］ デオキシヌクレオチド間の結合の全部がホスホジエステル結合である［１］に記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
［３］ 一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの全体として、上記ＣｐＧ部位を１～５個有する［１］又は［２］に記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
［４］ ２２～５４個のデオキシヌクレオチドからなる［１］～［３］のいずれかに記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
［５］ 上記ＣｐＧ部位が、Ｙ１Ｙ２ＣＧＹ３Ｙ４で表され、Ｙ１及びＹ４は、それぞれ独立にアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及び、チミン（Ｔ）からなる群より選択される少なくとも１種の塩基であり、Ｙ２及びＹ３はそれぞれ独立にアデニン（Ａ）、又は、チミン（Ｔ）である、［１］～［４］のいずれかに記載の１本鎖オリゴヌクレオチド。
［６］ 上記ＣｐＧ部位がＧＴＣＧＴＴである、［１］～［５］のいずれかに記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
［７］ 上記ＣｐＧ部位を含むスペーサ部位以外のスペーサ部位が同一の塩基配列である、［１］～［６］のいずれかに記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
［８］ 後述する配列番号１～９、１７～２２の塩基配列、及び、上記塩基配列において、上記スペーサ部位におけるＣＧ配列以外の１～３塩基が欠損、置換若しくは付加された配列のいずれかの配列を有する、［１］～［７］のいずれかに記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
［９］ ［１］～［８］のいずれかに記載の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドからなる四重鎖構造体。
［１０］ 担体と、上記担体に担持された［９］に記載の四重鎖構造体とを含む、免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体。
［１１］ ［１０］に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体を含む、ワクチンのアジュバント。
［１２］ ヒトを含む哺乳動物、鳥類、又は、魚類の感染症予防のための方法であって、感染症の原因となる病原体由来の無毒化、又は、弱毒化された抗原と、［１０］に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体を、連続して、又は、同時に投与することにより、体内に病原体に対する抗体産生を促し、感染症に対する免疫を獲得することを含む、方法。
［１３］ ヒトを含む哺乳動物、鳥類、又は、魚類の感染症予防用ワクチン製造における、［１０］に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用。
［１４］ ヒトを含む哺乳動物、鳥類、又は、魚類の感染症予防用のための、［１０］に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用。
［１５］ がん治療、又は、予防用ワクチン製造における［１０］に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用。
［１６］ がん治療、又は、予防のための［１０］に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用。
［１７］ ［１０］に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体を含む、アレルギー治療又は予防のための医薬組成物。
［１８］ 更にアレルゲン又はその一部を含む、［１７］に記載の医薬組成物。
［１９］ アレルギー治療又は予防用医薬製造における、［１０］に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用。
［２０］ アレルギー治療又は予防のための、［１０］に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用。
［２１］ がんの治療又は予防のための方法であって、がん抗原又はその一部分と、［１０］に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体を、連続して或いは同時に投与することにより、体内にがん抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導し、がん抗原を提示するがん細胞を攻撃させることにより、がんを治療、又は、予防する方法。
［２２］ アレルギーの治療又は予防のための方法であって、［１０］に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体を投与することにより、アレルゲン特異的なヘルパー１Ｔ（Ｔｈ１）細胞をヘルパー２Ｔ（Ｔｈ２）細胞よりも活性化させることによって、アレルギーを治療、又は、予防する方法。
本発明によれば、核酸分解酵素に対する優れた耐性を有する免疫刺激性の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドが提供できる。また、本発明によれば、四重鎖構造体、免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体、ワクチンのアジュバント、方法、免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用、医薬組成物、ガンを治療または予防する方法、及び、アレルギーを治療または予防する方法も提供できる。
ＣｐＧ オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の構造解析結果である。具体的には、各ＣｐＧ ＯＤＮの２０℃で得られた光吸収スペクトルから９０℃で得られた光吸収スペクトルを減算して得られた差分吸収スペクトルである。 各ＣｐＧ ＯＤＮの４ｍＭ Ｋ＋の存在下での２５℃での円偏光二色性スペクトルである。 １０－ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（レーン１）、ＧＤ１と同じ２２ｍｅｒの鎖長で直鎖構造のオリゴヌクレオチド（レーン２、配列番号１４）、ＧＤ１（レーン３）、ＧＤ２と同じ３０ｍｅｒの鎖長で直鎖構造のオリゴヌクレオチド（レーン４、配列番号１５）、ＧＤ２（レーン５）、ＧＤ３と同じ３８ｍｅｒの鎖長で直鎖構造のヌクレオチド（レーン６、配列番号１６）、及び、ＧＤ３（レーン７）のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果である。 ヒトＴＬＲ９の構造遺伝子を組み込み、ヒトＴＬＲ９が恒常的に発現するようにした２９３ＸＬ－ｈＴＬＲ９細胞と、ヒトＴＬＲ９が発現していない２９３ＸＬ－ｎｕｌｌ細胞とにおける、各試料の転写因子ＮＦ－κＢの活性化を誘導する作用を調べるために、細胞破砕液内のレポータータンパク質であるルシフェラーゼの発現量を定量した結果である。 データは平均±ＳＤ（ｎ＝５）を表す。＊は一元配置分散分析を行った後にＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水［Ｄ－ＰＢＳ］対照群との比較のためのシダックの多重比較検定を行った結果を示す。＊＊＊＊はｐ＜０．０００１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５を表す。ｎｓはｐ＞０．０５を表し、有意差がないことを表す。 ５０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で１、２、４、２４時間インキュベートした後の各ＣｐＧ ＯＤＮのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析結果である。 図５Ａの試験におけるインキュベート開始時のＯＤＮ量に対する残留ＯＤＮを表すグラフである。 蛍光色素で修飾した各試料のマウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４細胞への取り込みを、細胞の蛍光強度を指標に測定し、細胞表面に結合している各試料に由来する蛍光強度を求め、差分した結果である。－ＣｐＧは蛍光色素で修飾した各試料を加えていない未処理の細胞の蛍光強度を示す。 各試料で刺激したマウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４細胞におけるサイトカイン誘導、４μＭの各試料で２４時間刺激した後のマウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４細胞におけるＩＬ－６、ＩＬ－１２、及び、ＩＦＮ－βの相対的なｍＲＮＡレベルである。 データは平均±ＳＤ（ｎ＝５）を表す。＊は一元配置分散分析を行った後に他のグループとの比較のためのテューキーの多重比較検定を行った結果を示す。＊＊＊＊はｐ＜０．０００１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５を表す。ｎｓはｐ＞０．０５を表し、有意差がないことを表す。＃は、一元配置分散分析を行った後にＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水［Ｄ－ＰＢＳ］対照群との比較のためのダネットの多重比較検定を行った結果を示す。＃＃＃＃はｐ＜０．０００１、＃＃＃はｐ＜０．００１、＃＃はｐ＜０．０１、＃はｐ＜０．０５を表す。ｎｓはｐ＞０．０５を表し、有意差がないことを表す。 各試料で刺激したマウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４細胞におけるサイトカイン誘導、４μＭの各試料で２４時間刺激した後のマウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４細胞におけるＩＬ－６、ＩＬ－１２、及び、ＩＦＮ－βの相対的なｍＲＮＡレベルである。 各試料の免疫賦活特性に及ぼすＣｐＧ部位の位置、及び、数の影響を示すグラフであり、そのうちＣｐＧ部位の位置の影響を示すものである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝５）を表す。＊は一元配置分散分析を行った後に他のグループとの比較のためのテューキーの多重比較検定を行った結果を示す。＊＊＊＊はｐ＜０．０００１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５を表す。ｎｓはｐ＞０．０５を表し、有意差がないことを表す。 図９Ａと同様の試験結果であり、ＣｐＧ部位と、ポリＧ配列との距離の影響を示すものである。 図９Ａと同様の試験結果であり、ＣｐＧ部位の数の影響を示すものである。 ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＧ４ ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）誘導性サイトカイン産生を表す図である。このうち、ヒトＰＢＭＣにおけるＧ４ ＣｐＧ ＯＤＮのサイトカイン誘導に対するインキュベーション時間の影響である。８μＭのＧ４ ＣｐＧ ＯＤＮｓを４、２４、及び、４８時間インキュベートしたヒトＰＢＭＣの上清に含まれるＩＬ－６をＥＬＩＳＡ方法により定量した。 データは平均±ＳＤ（ｎ＝５）を表す。＊は二元配置分散分析を行った後に他のグループとの比較のためのテューキーの多重比較検定を行った結果を示す。＊＊＊＊はｐ＜０．０００１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５を表す。 ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＧ４ ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）誘導性サイトカイン産生を表す図である。このうち、ポジティブコントロール２００６＿ＰＤと比較したＧ４ ＣｐＧ ＯＤＮのサイトカイン誘導である。８μＭ ＧＤ３、又は、２００６＿ＰＤを２４時間インキュベートしたヒトＰＢＭＣからの上清に含まれるＩＬ－６、及び、ＩＦＮ－γのＥＬＩＳＡ方法により定量した。 データは平均±ＳＤ（ｎ＝４）を表す。＊は一元配置分散分析を行った後に他のグループとの比較のためのテューキーの多重比較検定を行った結果を示す。＊はｐ＜０．０５を表す。 マウスにおけるＧＤ３、又は、２００６＿ＰＤによるＩＬ－６の経時的誘導を表す図である。データは５匹のマウスの平均±ＳＤを表す。＊は二元配置分散分析を行った後にシダックの多重比較検定を行った結果を示す。＊＊はｐ＜０．０１を表す。ｎｓはｐ＞０．０５を表し、有意差がないことを表す。§は検出下限（３．９ｐｇ／ｍＬ）、ＢＩは注入前を表す。 １０－ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（レーン１、レーン１２）、ＧＤ２と同じ３０ｍｅｒの鎖長で直鎖構造のオリゴヌクレオチド（レーン２、配列番号１５）、ＧＤ２－１Ｌ（レーン３、配列番号１７）、ＧＤ２（レーン４、配列番号２）、ＧＤ２－３Ｌ（レーン５、配列番号１９）、ＧＤ３と同じ３８ｍｅｒの鎖長で直鎖構造のヌクレオチド（レーン６、配列番号１６）、ＧＤ３－１Ｌ（レーン７、配列番号１８）、ＧＤ３（レーン８、配列番号３）、ＧＤ２Ｔ－１Ｌ（レーン９、配列番号２０）、ＧＤ２Ｔ－２Ｌ（レーン１０、配列番号２１）、及び、ＧＤ２Ｔ－３Ｌ（レーン１１、配列番号２２）のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果である。 １０－ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（レーン１）、ＧＤ３と同じ３８ｍｅｒの鎖長で直鎖構造のヌクレオチド（レーン２、列番号１６）、ＧＤ３（レーン３、配列番号３）、ＧＤ３－ＧＣ１２３（レーン４、配列番号１２）、ＧＤ３－ＧＣ３（レーン５、配列番号９）のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果である。 ＮＦ－κＢ転写因子によって誘導される分泌型胚性アルカリホスファターゼ遺伝子を組み込んだＲＡＷ ２６４．７ マクロファージであるＲＡＷ－ＢＬＵＥ細胞を用いて、各試料の転写因子ＮＦ－κＢの活性化を誘導する作用を調べるために、培地中に分泌されたアルカリホスファターゼの発現量を定量した結果である。データは平均±ＳＤ（ｎ＝５）を表す。対照群としてＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水［Ｄ－ＰＢＳ］を用いた。
以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
（一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド）
本明細書において、「オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）」は、オリゴデオキシリボヌクレオチドであり、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びチミン（Ｔ）から選ばれる塩基に、デオキシリボースを介してリン酸が結合された構成単位（デオキシリボヌクレオチド、以下、単に「デオキシヌクレオチド」ともいう。）の複数からなる。
本発明の１本鎖ＯＤＮは、１４～１００個のデオキシヌクレオチドからなり、好ましくは２０～８０個のデオキシヌクレオチドからなり、より好ましくは、２２～５４個のデオキシヌクレオチドからなる。
本発明の１本鎖ＯＤＮにおけるデオキシヌクレオチド間の結合は、全結合数の７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは、すべての結合がホスホジエステル結合である。
なお、なお、以下の一本鎖ＯＤＮの塩基配列の説明では、デオキシヌクレオチド間のすべての結合がホスホジエステル結合（大文字の塩基の配列として表される）である場合について説明するが、上記のとおり、オリゴデオキシヌクレオチド間の結合の２５％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは５％以下は、デオキシヌクレオチドのリン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換されたホスホロチオエート結合等が含まれいてもよい。
本発明の１本鎖ＯＤＮは、２～５個の連続するグアニン（Ｇ）からなる同一の（配列の）ポリＧ部位を４つ含む。なかでも、３～５個の連続するグアニン（Ｇ）からなる同一のポリＧ部位を４つ含むことが好ましく、３個の連続するグアニンからなる同一のポリＧ部位（ＧＧＧ）を４つ含むことがより好ましい。
このうち、２つのポリＧ部位は、５’末端と３’末端にそれぞれ配置され、残りの（２つの）ポリＧ部位は、他のポリＧ部位とスペーサ部位を介して配置されている。すなわち、本発明の１本鎖ＯＤＮは、５’－（ポリＧ部位）－（スペーサ部位）－（ポリＧ部位）－（スペーサ部位）－（ポリＧ部位）－（スペーサ部位）－（ポリＧ部位）－３’であり、４つのポリＧ部位と、それらの間に配置された３つのスペーサ部位を有している。
このスペーサ部位は、１個、又は、２個以上の塩基からなり、一般に５個以下の塩基からなることが好ましく、３つのスペーサ部位の少なくとも１つ以上は、ホスホジエステルを介したシトシン（Ｃ）－グアニン（Ｇ）配列を含む連続する３～６個の塩基からなるＣｐＧ部位を１～５個含む。なお、隣り合うＣｐＧ部位は、１塩基以上離れていることが好ましく、この塩基は、Ａ又はＴが好ましく、Ｔがより好ましい。
一本鎖ＯＤＮの全体として３つ含まれるスペーサ部位のうち、ＣｐＧ部位を含むもの以外、すなわち、ＣｐＧ部位を含まないスペーサ部位は、グアニン（Ｇ）以外の塩基（Ａ、Ｔ、及び、Ｃからなる群より選択される少なくとも１種の塩基）からなることが好ましい。
ＣｐＧ部位は、好ましくは、（５’末端側）Ｙ１Ｙ２ＣＧＹ３Ｙ４（３’末端側）で表され、Ｙ１及びＹ４は、Ａ、Ｃ、Ｇ、又は、Ｔであり、Ｙ２はＡ又はＴであり、Ｙ３はＡ又はＴである。
なかでも、一本鎖ＯＤＮがより優れた本発明の効果を有する点で、Ｙ２は、Ｔが好ましく、Ｙ３はＴが好ましい。
なかでも、ＣｐＧ部位がＧＴＣＧＴＴである場合、更に優れた本発明の効果が得られる。
本発明の１本鎖ＯＤＮは、全体として上記ＣｐＧ部位を１～５個有することが好ましく、スペーサ部位のいずれか１つが、ＣｐＧ部位を１～５個有し、残りの２つのスペーサ部位は、ＣｐＧ部位を含まないことが好ましい。また、このとき、ＣｐＧ部位を有しない２つのスペーサ部位は、同一の塩基配列であることが好ましい。
本発明の１本鎖オリゴヌクレオチドは、下記塩基配列、及び、下記塩基配列において、すでに説明したスペーサ部位におけるＣＧ以外の１～３塩基が欠損、置換若しくは付加された配列のいずれかの配列を有することが好ましい。
なお、「スペーサ部位におけるＣＧ以外の」塩基とは、一本鎖ＯＤＮ全体との関係で表すと、ポリＧ部位、及び、「ＣＧ」のいずれにも該当しない塩基を意味する。
５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号１）
５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号２）
５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号３）
５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴｍ５ＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号４）
５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴｍ５ＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号５）
５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴｍ５ＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号６）
５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴｍ５ＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号７）
５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴｍ５ＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴｍ５ＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号８）
５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号９）
５’－ＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号１７）
５’－ＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号１８）
５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号１９）
５’－ＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧ－３’（配列番号２０）
５’－ＧＧＧＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＧＧＧ－３’（配列番号２１）
５’－ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号２２）
なお、上記配列中、ｍ５Ｃはメチル化シトシン（５－メチルシトシン）を示す。上記配列は、デオキシヌクレオチド間の全ての結合がホスホジエステル結合であるが、上述のとおり、一部がホスホロチオエート結合等であってもよい。また、本明細書において大文字の塩基はデオキシヌクレオチド間の結合がホスホジエステル結合であることを意味する。なお、「ｍ５Ｃ」は、大文字１字として扱う。
１本鎖ＯＤＮは、核酸合成装置を用いて合成できる。また、バクテリア、又は、ウイルスのゲノムＯＤＮを鋳型として、ＣｐＧを含む領域をＰＣＲによって増幅させる方法を用いることもできる。また、環状プラスミドＯＤＮを宿主細胞中で増幅させ、回収した環状プラスミドを制限酵素で切断して得ることもできる。
本発明の１本鎖ＯＤＮは、４組のポリＧ部位を有する。そのため、１本鎖からなる四重鎖構造体（グアニン四重鎖構造体）が容易に誘起される。本発明の１本鎖ＯＤＮからなる四重鎖構造体は、１本鎖ＯＤＮのみから構成されることが好ましい。一本鎖ＯＤＮからなる四重鎖構造体（以下、「Ｇ４ ＣｐＧ ＯＤＮ」ともいう。）は、そのトポロジーとして、「平行」型、「逆平行」型、及び、「ハイブリッド」型が知られている。本発明の四重鎖構造体はいずれの形態であってもよいが、「ハイブリッド」型が好ましい。
本発明の四重鎖構造体は核酸分解酵素に対する優れた耐性を有するとともに、驚くべきことに、そのコンパクトな構造から、細胞への優れた吸収性を併せ持ち、結果として、線状一本鎖ＣｐＧ ＯＤＮと比較して、優れた免疫刺激作用を有する。
一本鎖ＯＤＮから四重鎖構造体を誘起する方法は特に制限されず、後述する実施例に記載するような公知の方法を用いることができる。具体的には、四重鎖構造体の内部に、１価の金属イオン（カチオン）を取り込むことで、四重鎖構造体の安定性がより向上するため、イオン源化合物の存在下で、加熱する方法等が使用できる。なお、１価の金属イオンとしては、例えば、カリウムイオン、及び、ナトリウムイオン等が挙げられる。
＜免疫刺激ＯＤＮ複合体＞
本発明の第２の側面は、上記のようにして調製された１本鎖ＯＤＮからなる四重鎖構造体と生理学的に許容しうる担体とが複合体化された免疫刺激ＯＤＮ複合体である。複合体化させることによって、より優れた本発明の効果が得られる。
「生理学的に許容しうる担体」とは、体内の細胞、組織あるいは器官に、本発明の目的を阻害するような障害を及ぼさない物質を指す。このような担体の例には、たとえば、高分子化合物、エマルション、リポソーム、無機化合物粒子、金属粒子、金属酸化物粒子、炭素系粒子、及び、これらの修飾物が包含され、好ましくはカチオン性である。
高分子化合物としては、カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン、キトサン、ポリリシン、ＬＬ－３７、Ｔａｔなどが例示される。これらのカチオン性ポリマーは本発明の四重鎖構造体と静電的に結合する。生分解性ポリマーであるｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ） （ＰＬＧＡ）に四重鎖構造体を内包する方法もある。また、デンドリマー等の多量体も担体として利用しうる。
エマルションとしては、水／油型エマルションや水／油／水型エマルションが例示され、その水相に四重鎖構造体を内包する方法などがありうる。リポソームとしては、脂質二重膜で構成されたリポソームに四重鎖構造体を内包する方法や、カチオン性リポソーム、例えば長鎖アルキル基とアミノ基もしくはアンモニウム基を含むものに四重鎖構造体を静電的に結合する方法などがある。
無機化合物粒子としては、たとえばリン酸カルシウム粒子、水酸化アパタイト粒子、炭酸アパタイト粒子、シリカナノ粒子などが例示される。金属粒子としては、金粒子、銀粒子、白金粒子、シリコンナノ粒子などがある。金属酸化物粒子としては、酸化亜鉛粒子や二酸化チタン粒子、アルミナ粒子、ジルコニア粒子などが例示される。炭素系粒子には、フラーレン、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンなどが例示される。
これらの担体粒子のサイズは特に限定しないが、長さ又は最も長い径の平均（Ｄ５０）が１０ｎｍ～１μｍであることが好ましく、より好ましくは１００～８００ｎｍである。粒子形状は特に限定されず、球状、フレーク状、円柱状等であってよい。
上記担体のうち、カチオン性リポソーム及び無機化合物粒子が好ましく、長鎖アルキル基とアミノ基もしくはアンモニウム基を含むカチオン性リポソーム、例えばリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ－［１－（２，３－Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、 ＤＭＴＡＰ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＯＡＢ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ （ｂｒｏｍｉｄｅ ｓａｌｔ））、ＤＯＤＡＰ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＣ－ＣＨＯＬ（３ｂ－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）－ｃａｒａｍｏｙｌ］ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｈｙｃｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ－［２－［（１，５，１０，１４－Ｔｅｔｒａａｚａｔｅｔｒａｄｅｃａｎｅ－１－ｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，３－ｂｉｓ（ｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）－１－ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｉｕｍ）等あるいは、電荷を持たないＤＯＰＥ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎ）等との混合物であってもよく（たとえば、ＤＯＳＰＡ／ＤＯＰＥ （３：１ ｗｔ／ｗｔ））、無機化合物としてリン酸カルシウムやＤＥＡＥデキストランが好ましい。或いはこれらの混合物が好ましい。
本発明の四重鎖構造体のこれらの担体との複合体化方法は特に限定されない。表面が正に帯電している担体には四重鎖構造体を適当なバッファ中で混合することによって静電的に結合させることができる。四重鎖構造体はリン酸カルシウム粒子、水酸化アパタイト粒子、炭酸アパタイト粒子、フラーレン、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンに吸着する。また、表面が正に帯電していない担体への担持方法としては、担体粒子の表面を、正電荷をもつ物質、たとえばポリエチレンイミン、キトサン、ポリリシンなど、で修飾して四重鎖構造体を静電的に結合させる、あるいは、担体粒子表面にマレイミド基を導入し、一方、四重鎖構造体の末端にチオール基を導入することによって共有結合を形成させることなどの方法がある。
四重鎖構造体と担体との質量比は、１本鎖オリゴヌクレオチドの塩基鎖長、担体の性状、共に使用する抗原等に応じて、適宜調整することが好ましい。典型的には、四重鎖構造体：担体の質量比を０．０５：１～１０：１とするのが好ましい。
免疫刺激ＯＤＮ複合体の効果は、ＴＬＲ９を有する細胞、たとえばヒト及びマウスの形質細胞様樹状細胞、マウスマクロファージ、マウス定常型樹状細胞、に与えた後、Ｉ型ＩＦＮや炎症性サイトカインの遺伝子の発現量を定量すること、あるいはＩ型ＩＦＮや炎症性サイトカインの分泌量を定量することによって求めることができる。たとえば、遺伝子発現量はリアルタイム定量ＰＣＲなどによって、分泌量はＥＬＩＳＡ法などによって定量することができる。
免疫刺激ＯＤＮ複合体は、抗原やアレルゲンとともに与えることによってアジュバント効果を発揮することが期待できる。該複合体は、遊離の抗原やアレルゲンと混合して投与することができる。また、抗原やアレルゲンを該複合体と同一の担体に複合化させて投与する方法、あるいは抗原やアレルゲンを予め１本鎖ＯＤＮと結合させてから担体に複合化させて投与する方法がある。更に、抗原やアレルゲンを該複合体と別の担体に複合化し、該複合体と混合して投与する方法などがある。
抗原やアレルゲンの担体との複合体化方法は特に限定されないが、たとえば、カチオン性リポソームの中空に抗原やアレルゲンを内包した後、カチオン性リポソームの表面に四重鎖構造体を静電的に結合する方法や、リン酸カルシウム粒子、水酸化アパタイト粒子、炭酸アパタイト粒子の表面に四重鎖構造体と抗原あるいはアレルゲンを同時に吸着させる方法などがある。
また、リン酸カルシウム粒子、水酸化アパタイト粒子、炭酸アパタイト粒子を調製する際の原料液に四重鎖構造体と抗原あるいはアレルゲンを混合しておくことによって、これらの粒子の中に四重鎖構造体と抗原あるいはアレルゲンを同時に内包することもできる。予め四重鎖構造体に抗原やアレルゲンを結合させてから担体に担持する場合には、四重鎖構造体の末端をチオール基で修飾し、一方、抗原やアレルゲンのアミノ基にマレイミド基を導入し、チオール基とマレイミド基を共有結合させる方法などがある。
抗原の例としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原、手足口病ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、及びウエストナイル熱ウイルス抗原などが挙げられる。また、アレルゲンの例としては、スギ花粉アレルゲン、ブタクサアレルゲン、イネアレルゲン、及びダニアレルゲンなどが挙げられる。また、癌細胞の抗原なども挙げられる。
ワクチンとは、感染症の予防に用いる医薬品を指す。無毒化あるいは弱毒化された抗原を投与することで、体内に病原体に対する抗体産生を促し、感染症に対する免疫を獲得する。特に限定しないが、毒性を弱めた微生物やウイルスを使用する生ワクチンとしては、ＢＣＧ、経口生ポリオ（ＯＰＶ）ワクチン、痘苗（天然痘）、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、麻疹・風疹混合ワクチン（ＭＲワクチン）、流行性耳下腺炎（おたふく）、ワクチン水痘ワクチン、黄熱ワクチン、ロタウイルスワクチン、帯状疱疹ワクチンなどが実用化されている。化学処理などにより死んだウイルス、細菌、リケッチア、或いは抗原部分のみを培養したものを含めた不活化ワクチンとしては、インフルエンザウイルスワクチン、肺炎球菌ワクチン、狂犬病ワクチン、コレラワクチン、二種混合（ＤＴ）ワクチン（ジフテリア・破傷風混合ワクチン）、三種混合（ＤＰＴ）ワクチン（ジフテリア・百日咳・破傷風混合ワクチン）、四種混合（ＤＰＴ－ＩＰＶ）ワクチン（ジフテリア・百日咳・破傷風・不活化ポリオ混合ワクチン）、日本脳炎ワクチン、百日咳ワクチンなどが実用化されている。
がんワクチンは、がんの治療又は予防目的で使用されるワクチンのことを指す。抗原（がん抗原）としては、正常細胞ではまったく発現していないか、発現していても少量であり、癌細胞においては過剰に発現している抗原タンパク質の全長又は一部分（ペプチド）を用いる。特に限定しないが、悪性黒色腫（メラノーマ）におけるＭＡＧＥ、乳癌などにおけるＨＥＲ２／ｎｅｕ、大腸癌におけるＣＥＡ、各種白血病や各種癌におけるＷＴ１、悪性黒色腫、食道癌、胃癌、卵巣癌などにおけるＮＹ－ＥＳＯ－１などが挙げられる。これらのがん抗原タンパク質（又はその分解ペプチド）を体内の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が認識し、癌細胞を攻撃する（細胞性免疫）。癌抗原（ペプチド）を人為的に投与し、特異的なＣＴＬを誘導（分化増殖）することでがんを治療するのが、がんワクチン療法である。
なお、発がんウイルスの感染阻止を目的とするワクチンもがんワクチンに含まれる。Ｂ型肝炎ウィルスワクチン（肝硬変を経て肝がんを引き起こす）やヒトパピローマウイルス（子宮頸がんを引き起こす）などが実用化されている。
花粉症やハウスダストアレルギーの患者は、それぞれのアレルゲンに特異的なヘルパー２Ｔ（Ｔｈ２）経路がヘルパー１Ｔ（Ｔｈ１）経路に対して優勢になっている。すなわち、アレルゲン特異的なＴｈ１経路を活性化し、Ｔｈ２経路に対して優勢にすることが治療戦略のひとつである。マウスにおいてはＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比がＴｈ１／Ｔｈ２の比の指標となるが、ヒトにおいてはＩｇＧ４／ＩｇＧ１の比がＴｈ１／Ｔｈ２の比の指標となる場合もある。
本願に係る治療対象として、ヒトを含む哺乳動物（サルなどの霊長類；イヌ、ネコなどのコンパニオンアニマル；馬、ブタ、牛、ヤギ、羊などの家畜；ラット、マウスなどの実験動物）、鳥類（野鳥又は鶏や七面鳥などの家禽）或いは魚類（水産養殖の生物種：例えば、アユやサケ科魚類などの淡水魚や、ブリ、カンパチなどの海水魚）が挙げられ、ＴＬＲ９が発現している種であれば特に限定しなくてよい。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（分子内グアニン四重鎖構造の形成）
表１の配列番号１～９、及び、１７～２２の塩基配列を有する一本鎖ＣｐＧ ＯＤＮを合成し、熱処理によりグアニン四重鎖構造を形成させた（Ｇ４ ＣｐＧ ＯＤＮ）。具体的には、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を含む緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎ：以下、「Ｄ－ＰＢＳ」ともいう。）中に一本鎖ＣｐＧ ＯＤＮを溶解し、９５℃で５分間インキュベーション後、温度を３０℃まで３０分かけて下げることにより行った。
また、比較のために、表１の配列番号１０～１６の一本鎖ＯＤＮも準備した。
Figure 2022038517000002
（吸収スペクトル解析）
熱処理によりグアニン四重鎖構造を形成させた一本鎖ＣｐＧ ＯＤＮをＤ－ＰＢＳを用いて２μＭに調製した。紫外可視近赤外分光光度計（Ｊａｓｃｏ Ｖ－６７０ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて２２０－３２０ｎｍの吸収スペクトルを測定した。測定条件は「ｓｃａｎ ｓｐｅｅｄ」が４００ｎｍ／ｍｉｎ、「ｄａｔａ ｐｉｔｃｈ」が１ｎｍ、「ｂａｎｄ ｗｉｄｔｈ」が２．０ｎｍで、ＵＶ／Ｖｉｓ（紫外／可視）測定である。測定は、２０℃と９０℃で行い、２０℃での吸収スペクトルから９０℃での吸収スペクトルを差し引くことで、差分スペクトルを得た。図１は、ＧＤ１、ＧＤ２、及び、ＧＤ３の差分吸収スペクトルである。
図１から、ＧＤ１、ＧＤ２、及び、ＧＤ３はいずれも２９５ｎｍに負のピークを示したことから、グアニン四重鎖構造を形成していることが示された。
（円偏光二色性スペクトル解析）
熱処理によりグアニン四重鎖構造を形成させた一本鎖ＣｐＧ ＯＤＮをＤ－ＰＢＳを用いて２ｕＭに調製した。円二色性分散計（Ｊａｓｃｏ Ｊ－７２５ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ）を用いて２２０～３２０ｎｍの円偏光二色性スペクトルを２５℃で測定した。測定条件は、「ｓｃａｎ ｒａｔｅ」が５０ｎｍ／ｍｉｎ、「ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｉｍｅ」が２．０ｓ、「ｂａｎｄ ｗｉｄｔｈ」が１．０ｎｍ、「ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」が０．２ｎｍ、「ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」が１００ｍｄｅｇである。
図２は、ＧＤ１、ＧＤ２、及び、ＧＤ３の円偏光二色性スペクトルである。
図２から、ＧＤ１、ＧＤ２は２６０ｎｍと２９０ｎｍに正のピークを示した。またＧＤ３は２６０ｎｍと２９０ｎｍにわたるブロードのピークをもつことから、ハイブリッド型のグアニン四重鎖構造を形成していることが示された。
（電気泳動による構造の解析）
１２％のポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ；１－ｍｍ ｔｈｉｃｋ；ＴＥＦＣＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、４ｍＭ ＫＣｌを含む０．５×Ｔｒｉｓ－ｂｏｒａｔｅ－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）ｂｕｆｆｅｒ（０．０８９Ｍ、ｐＨ８．３－８．５；ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｋｕｓａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）中で電気泳動を行った。泳動は１８０Ｖの定電圧で行った。
図３は、ＰＡＧＥ電気泳動の結果である。レーン１は、１０－ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒであり、レーン２は、ＧＤ１と同じ２２ｍｅｒの鎖長で直鎖構造のオリゴヌクレオチドであり、レーン３は、ＧＤ１であり、レーン４はＧＤ２と同じ３０ｍｅｒの鎖長で直鎖構造のオリゴヌクレオチドであり、レーン５はＧＤ２であり、レーン６は、ＧＤ３と同じ３８ｍｅｒの鎖長で直鎖構造のヌクレオチドであり、レーン７はＧＤ３である。
図３の結果から、同じ鎖長を持つ直鎖オリゴヌクレオチドと比較して、ＧＤ１、ＧＤ２、及び、ＧＤ３は低分子量の位置に存在することが示された。このことから、ＧＤ１、ＧＤ２、及び、ＧＤ３はコンパクトに折りたたまれた構造（グアニン四重鎖構造体）を形成していることを示された。
（ＨＥＫ２９３細胞を用いた免疫活性化の評価）
ヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのＥ１遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株ＨＥＫ２９３細胞に、ヒトＴＬＲ９の構造遺伝子を組み込み、ヒトＴＬＲ９が恒常的に発現するようにした２９３ＸＬ－ｈＴＬＲ９細胞において、転写因子ＮＦ－κＢの活性化を誘導する作用を調べることで、免疫活性化を評価した。
２９３ＸＬ－ｈＴＬＲ９細胞を、１．３×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度でダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に播種した。転写因子ＮＦ－κＢの活性化を調べるためのレポーターアッセイ用プラスミドｐＮｉＦｔｙ－ｌｕｃ（インビボジェン社）ならびに遺伝子導入の標準化のためのプラスミドｐＧＬ４．７４（プロメガ社）をトランスフェクション試薬であるＬｙｏＶｅｃ（インビボジェン社）を用いて、導入した。
２０時間後、ＧＤ１、ＧＤ２、ＧＤ３、及び、２００６＿ＰＤを終濃度が０．５μＭとなるように添加した。各試料の添加２４時間後に、細胞を回収し、破砕し、細胞破砕液内のレポータータンパク質であるルシフェラーゼの発現量を定量した。
図４は、得られた細胞破砕液についてルシフェラーゼの発現量の定量を行った結果である。グアニン四重鎖構造を形成させたＣｐＧオリゴヌクレオチドＧＤ１、ＧＤ２、ＧＤ３は２９３ＸＬ－ｈＴＬＲ９細胞においてＮＦ－κＢの活性化の誘導を示した。また、ヒトＴＬＲ９が発現していない２９３ＸＬ－ｎｕｌｌ細胞ではＮＦ－κＢの活性化は誘導されなかった。このことから、グアニン四重鎖構造を形成させたＣｐＧオリゴヌクレオチドＧＤ１、ＧＤ２、ＧＤ３はヒトＴＬＲ９を介して、転写因子ＮＦ－κＢの活性化を誘導することが示された。また、転写因子ＮＦ－κＢの活性化は直鎖のＣｐＧ ＯＤＮである「２００６＿ＰＤ」よりも高いことが示された。
（血清中での安定性）
核酸分解酵素が含まれる牛胎児血清中でのグアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ１、ＧＤ２、及び、ＧＤ３の安定性を電気泳動のバンドを指標に定量した。終濃度が５０％となるように牛胎児血清を調製し、その中でグアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ１、ＧＤ２、ＧＤ３と、比較として直鎖ＣｐＧ ＯＤＮ２００６＿ＰＤを１時間、２時間、４時間、２４時間インキュベートした。その後、電気泳動を行い、それぞれのオリゴヌクレオチド由来のバンドの濃さを定量することで、分解されていないオリゴヌクレオチドの量を求め、血清処理する前のサンプルを１００％とした残存量を算出した。図５Ａ、及び、図５Ｂはその結果である。
図５Ａ、及び、図５Ｂから、直鎖ＣｐＧ ＯＤＮ「２００６＿ＰＤ」は牛胎児血清中で１時間後にはほとんど分解されたのに対して、グアニン四重鎖構造を形成させたＣｐＧオリゴヌクレオチドＧＤ１、ＧＤ２、ＧＤ３はそれぞれ８１％、５０％、３２％が分解されずに残っていることが示された。また牛胎児血清中で４時間処理した場合でも、分解されないＧＤ１、ＧＤ２、ＧＤ３が観察された。このことから、グアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ１、ＧＤ２、ＧＤ３は直鎖ＣｐＧ ＯＤＮと比較して、核酸分解酵素に対する耐性を有していることが示された。
（細胞への取り込み）
５’末端に蛍光色素であるＣｙ５を修飾したグアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ２、ＧＤ３のマウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４細胞への取り込みを細胞の蛍光強度を指標に測定した。グアニン四重鎖構造を形成させた５’末端Ｃｙ５修飾ＧＤ１、ＧＤ２をＯｐｔｉ ＭＥＭに終濃度が５μＭとなるように添加した。
この溶液をＲＡＷ２６４細胞が接着している９６ｗｅｌｌプレートに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。その後、溶液を取り除き、ＰＢＳで２回洗浄した。次に細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を用いて剥離し、遠心分離で回収しＰＢＳに懸濁した。
細胞が取り込んだＣｙ５修飾ＣｐＧ ＯＤＮの量をＣｙ５由来の蛍光を指標にＳＯＮＹスペクトル型セルアナライザー ＳＰ６８００において解析した。また、５’末端Ｃｙ５修飾ＧＤ１、ＧＤ２とＲＡＷ２６４細胞を４℃で２時間インキュベートしたサンプルを準備し、細胞表面に結合しているＣｐＧオリゴヌクレオチドＧＤ１、ＧＤ２の蛍光強度を求め、差分することにより、細胞内に取り込まれた５’末端Ｃｙ５修飾ＣｐＧ ＯＤＮを定量した。図６はその結果である。
図６から、５’末端Ｃｙ５修飾ＣｐＧオリゴヌクレオチドＧＤ１、ＧＤ２はＲＡＷ細胞に取り込まれていることが示された。また、直鎖ＣｐＧ ＯＤＮ「２００６＿ＰＤ」と比較して、グアニン四重鎖構造を形成させたＣｐＧ ＯＤＮは細胞に多く取り込まれることが示された。
（マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４細胞を用いた免疫活性化の評価）
トル様受容体９を発現しているＲＡＷ２６４細胞を用いて、グアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ１、ＧＤ２、ＧＤ３から誘導されるインタロイキン６（ＩＬ－６）、ＩＬ－１２、インターフェロン（ＩＦＮ）－βの誘導を調べた。ＲＡＷ２６４細胞を、５．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度でイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）に播種した。２４時間後、グアニン四重鎖構造を形成させたＣＧＤ１、ＧＤ２、及び、ＧＤ３を終濃度が４μＭとなるように添加した。２４時間後、細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン製）で全ＲＮＡを抽出した後、逆転写酵素（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）でｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－β遺伝子の発現量をリアルタイム定量ＰＣＲによって測定した。ＩＦＮ－β遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子の発現量によりノーマライゼーションした。図７はその結果である。
図７から、グアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ２、ＧＤ３は顕著に高いＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－βが誘導されることが示された。
グアニン四重鎖構造を形成させたＣｐＧ ＯＤＮの効果がグアニン四重鎖構造のループ領域に導入したＣｐＧ部位に起因することを示すために、ＣｐＧ部位のシトシン（Ｃ）がメチル化されたもので、５－メチルシトシンに置換したグアニン四重鎖構造を形成させたＯＤＮである、ＧＤ２－Ｍｅｔ、ＧＤ３－Ｍｅｔを用いて図７と同様の実験をした。図８はその結果である。
図８から、グアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ２、ＧＤ３のＣｐＧ部位中のシトシンをメチル化することによりＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－β遺伝子の誘導は認められなかった。トル様受容体９はメチル化されていないＣｐＧ部位と結合して構造を変化させることにより、シグナル伝達を行うことが報告されている。このことから、グアニン四重鎖構造自身には免疫活性化する機能は無く、グアニン四重鎖構造に導入したＣｐＧ部位が免疫活性化の機能を有することが示された。
グアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ２、ＧＤ３に存在する複数のＣｐＧ部位の効果をより詳細に検討するために、１カ所もしくは２カ所シトシンを５－メチルシトシンに置換したグアニン四重鎖構造を形成させたオリゴヌクレオチドのＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－β遺伝子の誘導を調べた。図９Ａ、図９Ｂ、及び、図９Ｃはその結果である。図９Ａ～図９Ｃから、一カ所でもＣｐＧ部位があれば、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－βが誘導されることが示された。
（ヒト末梢血単核球細胞を用いた免疫活性化の評価）
Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）から購入したヒト末梢血単核球 （Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ．，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）を用いて、グアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ１、ＧＤ２、ＧＤ３から誘導されるインタロイキン６（ＩＬ－６），ＩＬ－１２，ＩＦＮ－βの誘導を調べた。
ヒト末梢血単核球細胞を２．６×１０７ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度でロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ １６４０）に播種した。グアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ１、ＧＤ２、ＧＤ３を終濃度が４μＭとなるように添加した。
６、２４、４８時間後、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αの誘導量をＩＬ－６ Ｒｅａｄｙ－Ｓｅｔ－Ｇｏ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＦＮ－γ Ｒｅａｄｙ－Ｓｅｔ－Ｇｏ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）， Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－α Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｅｔ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ） （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）にて測定した。図１０Ａ、及び、図１０Ｂはその結果である。
図１０Ａ、及び、図１０Ｂから、グアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ２、ＧＤ３を添加して、２４時間後、４８時間後にヒト末梢血単核球細胞からＩＬ－６の発現を誘導したことが示された。ＩＬ－６の誘導量はＣｐＧオリゴヌクレオチド添加後２４時間が最も高い値を示した。また、グアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ３は、直鎖のＣｐＧ ＯＤＮ「２００６＿ＰＤ」よりも顕著に高くＩＬ－６とＩＦＮ－γを誘導することが示された。ＧＤ３はループ領域に２００６＿ＰＤと同じ数のＣｐＧ部位を有している。このことから、グアニン四重鎖構造を用いることにより、免疫活性化機能が有意に向上することが示された。
（マウスを用いた生体内での免疫活性化の評価）
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）にグアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ３を投与することにより、血液中に誘導されるＩＬ－６の量を評価した。７週齢のメスのマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の腹腔に１０ｎｍｏｌのグアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ３、又は、直鎖のＣｐＧ ＯＤＮ「２００６＿ＰＤ」を投与した。投与後２、４、２４時間毎にアニマルランセットを用いて、顎骨後ろに位置する静脈から採血を行った。採血した血液をＥＤＴＡ処理し、遠心分離により血漿を調製した。血漿中のＩＬ－６の量をＩＬ－６ Ｒｅａｄｙ－Ｓｅｔ－Ｇｏ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。図１１はその結果である。
図１１から、投与後２時間、４時間でＩＬ－６が誘導されることが示された。ＩＬ－６の誘導量はＣｐＧオリゴヌクレオチド添加後４時間が最も高い値を示した。また、グアニン四重鎖構造を形成させたＧＤ３は直鎖のＣｐＧ ＯＤＮ「２００６＿ＰＤ」よりも顕著に高くＩＬ－６を誘導することが示された。
（電気泳動による構造の解析）
１０－２０％のポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ；１－ｍｍ ｔｈｉｃｋ；ＡＴＴＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、４ｍＭ ＫＣｌを含む２５ｍＭＴｒｉｓ－１９２ｍＭＧｌｙｓｉｎ ｂｕｆｆｅｒ中で電気泳動を行った。泳動は２１ｍＡの定電流で行った。
図１２は、ＰＡＧＥ電気泳動の結果である。レーン１（及びレーン１２）は、１０－ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒであり、レーン２は、ＧＤ２（配列番号２）とＧＤ２－１Ｌ（配列番号１７）とＧＤ２－３Ｌ（配列番号１９）と同じ３０ｍｅｒの鎖長で直鎖構造のオリゴヌクレオチド（配列番号１５）であり、レーン３は、ＧＤ２－１Ｌ（配列番号１７）であり、レーン４は、ＧＤ２（配列番号２）であり、レーン５は、ＧＤ２－３Ｌ（配列番号１９）である。レーン６は、ＧＤ３（配列番号３）とＧＤ３－１Ｌ（配列番号１８）と同じ３８ｍｅｒの鎖長で直鎖構造のヌクレオチド（配列番号１６）であり、レーン７は、ＧＤ３－１Ｌ（配列番号１８）であり、レーン８は、ＧＤ３（配列番号３）である。レーン９は、２８ｍｅｒの鎖長のＧＤ２Ｔ－１Ｌ（配列番号２０）であり、レーン１０は、２８ｍｅｒの鎖長のＧＤ２Ｔ－２Ｌ（配列番号２１）であり、レーン１１は２８ｍｅｒの鎖長のＧＤ２Ｔ－３Ｌ（配列番号２２）である。
図１２の結果から、同じ鎖長を持つ直鎖オリゴヌクレオチドと比較して、ＧＤ２－１Ｌ、ＧＤ２、ＧＤ２－３Ｌ、ＧＤ３－１Ｌ、及び、ＧＤ３は低分子量の位置に存在することが示された。また、１０－ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒと比較して、２８ｍｅｒの鎖長であるＧＤ２Ｔ－１Ｌ、ＧＤ２Ｔ－２Ｌ、及び、ＧＤ２Ｔ－３Ｌは低分子量の位置に存在することが示された。このことから、ＧＤ２－１Ｌ、ＧＤ２、ＧＤ２－３Ｌ、ＧＤ３－１Ｌ、ＧＤ３、ＧＤ２Ｔ－１Ｌ、ＧＤ２Ｔ－２Ｌ、ＧＤ２Ｔ－３Ｌはコンパクトに折りたたまれた構造（グアニン四重鎖構造体）を形成していることが示された。
（電気泳動による構造の解析）
１０－２０％のポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ；１－ｍｍ ｔｈｉｃｋ；ＡＴＴＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、４ｍＭ ＫＣｌを含む２５ｍＭＴｒｉｓ－１９２ｍＭＧｌｙｓｉｎ ｂｕｆｆｅｒ中で電気泳動を行った。泳動は２１ｍＡの定電流で行った。
図１３は、ＰＡＧＥ電気泳動の結果である。レーン１は、１０－ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒであり、レーン２は、ＧＤ３（配列番号３）とＧＤ３－ＧＣ１２３（配列番号１２）とＧＤ３－ＧＣ３（配列番号９）と同じ３８ｍｅｒの鎖長で直鎖構造のオリゴヌクレオチド（配列番号１６）であり、レーン３は、ＧＤ３（配列番号３）であり、レーン４は、ＧＤ３－ＧＣ１２３（配列番号１２）であり、レーン５は、ＧＤ３－ＧＣ３（配列番号９）である。
図１３の結果から、同じ鎖長を持つ直鎖オリゴヌクレオチドと比較して、ＧＤ３、ＧＤ３－ＧＣ１２３、及び、ＧＤ３－ＧＣ３は低分子量の位置に存在することが示された。このことから、ＧＤ３、ＧＤ３－ＧＣ１２３、及び、ＧＤ３－ＧＣ３はコンパクトに折りたたまれた構造（グアニン四重鎖構造体）を形成していることが示された。
（ＲＡＷ－ＢＬＵＥ細胞を用いた免疫活性化の評価）
ＮＦ－κＢ転写因子によって誘導される分泌型胚性アルカリホスファターゼ遺伝子を組み込んだＲＡＷ ２６４．７ マクロファージであるＲＡＷ－ＢＬＵＥ細胞（インビボジェン社）において、転写因子ＮＦ－κＢの活性化を誘導する作用を調べることで、免疫活性化（免疫刺激性）を評価した。
ＲＡＷ－ＢＬＵＥ細胞を、１．０×１０５ｃｅｌｌが９６ウェルプレートの１ウェルに存在するようにダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に播種した。播種後、すぐにＧＤ２－１Ｌ、ＧＤ２、ＧＤ２－３Ｌ、ＧＤ３－１Ｌ、ＧＤ３、ＧＤ２Ｔ－１Ｌ、ＧＤ２Ｔ－２Ｌ、及び、ＧＤ２Ｔ－３Ｌを終濃度が２．０μＭとなるように添加した。各試料の添加２４時間後に、培養液を回収した。培養液に含まれるアルカリホスファターゼをアルカリホスファターゼの基質試薬であるＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液（インビボジェン社）を用いて、定量した。
図１４は、得られた培養液についてアルカリホスファターゼの発現量の定量を行った結果である。グアニン四重鎖構造を形成させたＣｐＧオリゴヌクレオチドＧＤ２－１Ｌ、ＧＤ２、ＧＤ２－３Ｌ、ＧＤ３－１Ｌ、ＧＤ３、ＧＤ２Ｔ－１Ｌ、ＧＤ２Ｔ－２Ｌ、及び、ＧＤ２Ｔ－３ＬはＲＡＷ－ＢＬＵＥ細胞においてＮＦ－κＢの活性化の誘導を示した。このことから、グアニン四重鎖構造を形成させたＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いることにより、免疫活性化機能が有意に向上することが示された。
本発明の一本鎖ＯＤＮは、単量体でのグアニン四重鎖構造が形成できる。これは、高次構造の制御が可能であることを示している。２０１４年に発表されたアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）のガイドラインは、リスク管理の観点から、凝集体量を可能な限り減らすことを製造者に推奨している。また、保管中の凝集体の変化を監視することが非常に重要とも指摘している。凝集体が時間と共に発生・成長すると考えられているため、出荷時に十分除去されていても、その後の輸送・保管・調剤・投薬プロセスで再び凝集体が増加するおそれがあるからである。その点、高次構造の制御が可能である本発明の一本鎖ＯＤＮは従来の複数のオリゴヌクレオチドを組み合わせて、デンドリマーなどＤＮＡ立体構造体を形成させることにより、安定性を向上させるものと比較して、種々の高次構造が混在しない、という点で優れている。
また、本発明の一本鎖ＯＤＮの一形態は、デオキシヌクレオチド間の結合の全てがホスホジエステル結合であり、従来のホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドにおいて懸念される副作用がより起こりにくい。
更に本発明の一本鎖ＯＤＮからなる四重鎖構造体は、核酸分解酵素に対する優れた耐性を有するとともに、そのコンパクトな構造に起因して、優れた細胞への吸収性も有している。結果として、従来の線状一本鎖ＯＤＮと比較して、より優れた免疫刺激作用を有している。
上記のような特徴を併せ持つ、本発明の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体は、アレルギー等の治療薬、及び、ワクチンアジュバント等として有用である。

Claims (22)

  1. １４～１００個のデオキシヌクレオチドからなる一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドであって、塩基配列として、
    ２～５個の連続するグアニン（Ｇ）からなる同一のポリＧ部位を４つ含み、
    前記ポリＧ部位の２つはぞれぞれ５’末端と３’末端に配置され、
    残りの前記ポリＧ部位は、他のポリＧ部位とスペーサ部位を介して配置されており、
    前記スペーサ部位は、１個、又は、２個以上の塩基からなり、
    前記スペーサ部位の少なくとも１つ以上は、ホスホジエステルを介したシトシン（Ｃ）－グアニン（Ｇ）配列を含む連続する３～６個の塩基からなるＣｐＧ部位を１～５個含み、
    ＣｐＧ部位を含む前記スペーサ部位以外のスペーサ部位は、グアニン（Ｇ）以外の塩基からなり、
    前記デオキシヌクレオチド間の結合の７５％以上がホスホジエステル結合である、１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
  2. 前記デオキシヌクレオチド間の結合の全部がホスホジエステル結合である請求項１に記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
  3. 一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの全体として、前記ＣｐＧ部位を１～５個有する請求項１又は２に記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
  4. ２２～５４個のデオキシヌクレオチドからなる請求項１～３のいずれか１項に記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
  5. 前記ＣｐＧ部位が、Ｙ１Ｙ２ＣＧＹ３Ｙ４で表され、Ｙ１及びＹ４は、それぞれ独立にアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及び、チミン（Ｔ）からなる群より選択される少なくとも１種の塩基であり、Ｙ２及びＹ３はそれぞれ独立にアデニン（Ａ）、又は、チミン（Ｔ）である、請求項１～４のいずれか１項に記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
  6. 前記ＣｐＧ部位がＧＴＣＧＴＴである、請求項１～５のいずれか１項に記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
  7. 前記ＣｐＧ部位を含むスペーサ部位以外のスペーサ部位が同一の塩基配列である、請求項１～６のいずれか１項に記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
  8. 下記塩基配列、及び、下記塩基配列において、前記スペーサ部位におけるＣＧ配列以外の１～３塩基が欠損、置換若しくは付加された配列のいずれかの配列を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド。
    ５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号１）
    ５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号２）
    ５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号３）
    ５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴｍ５ＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号４）
    ５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴｍ５ＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号５）
    ５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴｍ５ＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号６）
    ５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴｍ５ＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号７）
    ５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴｍ５ＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴｍ５ＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号８）
    ５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号９）
    ５’－ＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号１７）
    ５’－ＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号１８）
    ５’－ＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号１９）
    ５’－ＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧ－３’（配列番号２０）
    ５’－ＧＧＧＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧＴＧＧＧ－３’（配列番号２１）
    ５’－ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＧＧＧ－３’（配列番号２２）
    （上記配列中、ｍ５Ｃはメチル化シトシンを示す。）
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドからなる四重鎖構造体。
  10. 担体と、前記担体に担持された請求項９に記載の四重鎖構造体とを含む、免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体。
  11. 請求項１０に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体を含む、ワクチンのアジュバント。
  12. ヒトを含む哺乳動物、鳥類、又は、魚類の感染症予防のための方法であって、感染症の原因となる病原体由来の無毒化、又は、弱毒化された抗原と、請求項１０に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体を、連続して、又は、同時に投与することにより、体内に病原体に対する抗体産生を促し、感染症に対する免疫を獲得することを含む、方法。
  13. ヒトを含む哺乳動物、鳥類、又は、魚類の感染症予防用ワクチン製造における、請求項１０に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用。
  14. ヒトを含む哺乳動物、鳥類、又は、魚類の感染症予防用のための、請求項１０に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用。
  15. がん治療、又は、予防用ワクチン製造における請求項１０に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用。
  16. がん治療、又は、予防のための請求項１０に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用。
  17. 請求項１０に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体を含む、アレルギー治療又は予防のための医薬組成物。
  18. 更にアレルゲン又はその一部を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. アレルギー治療又は予防用医薬製造における、請求項１０に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用。
  20. アレルギー治療又は予防のための、請求項１０に記載の免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド複合体の使用。
  21. がんの治療又は予防のための方法であって、
    がん抗原又はその一部分と、請求項１０に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体を、連続して或いは同時に投与することにより、体内にがん抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導し、がん抗原を提示するがん細胞を攻撃させることにより、がんを治療、又は、予防する方法。
  22. アレルギーの治療又は予防のための方法であって、
    請求項１０に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体を投与することにより、アレルゲン特異的なヘルパー１Ｔ（Ｔｈ１）細胞をヘルパー２Ｔ（Ｔｈ２）細胞よりも活性化させることによって、アレルギーを治療、又は、予防する方法。
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