CN112074601A

CN112074601A - 具有增强的性状的转基因植物

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Publication number: CN112074601A
Application number: CN201980028673.9A
Authority: CN
Inventors: T·R·亚当斯; M·邓; C·迪特里希; S·M·达夫; K·K·加伯特; A·D·霍尔舍; B·卡鲁纳南达; L·L·路非亚; M·H·马龙; A·乃拉姆; T·L·斯勒温斯基; 孙进东; T·V·文卡特希; 赵建民
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2018-05-29
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2020-12-11
Also published as: EP3802811A4; EP3802811A1; US20210071188A1; CA3096118A1; AR114534A1; WO2019231924A1; US20230128674A1; BR112020021983A2; MX2020012896A

Abstract

本公开提供了具有增强的性状，如增加的产量、增加的氮利用效率和增强的耐旱性或水利用效率的重组DNA构建体和转基因植物。转基因植物可包括田间作物以及此类转基因植物的植物繁殖体、植物部分和子代。还提供了制备和使用此类转基因植物的方法。本公开还提供了从此类转基因植物产生种子、使这种种子生长以及选择具有增强的性状的子代植物的方法。还公开了具有改变的表型的转基因植物，所述改变的表型可用于筛选和选择针对所需的增强的性状的转基因事件。

Description

具有增强的性状的转基因植物

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年5月29日提交的美国临时申请号62/677,448的优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。

序列表的并入

名称为“MONS:457WO.txt”的序列表文件随本文一起提交并且以引用的方式整体并入本文，所述序列表文件是100千字节(在MS-WINDOWS中测量)并且创建于2019年5月28日。

技术领域

本文公开了重组DNA构建体，具有改变的表型、增强的性状、增加的产量、增加的氮利用效率和增加的水利用效率的植物；此类植物的繁殖体、子代和田间作物；以及制造和使用此类植物的方法。还公开了从此类植物产生种子、使这种种子生长和/或选择具有改变的表型、增强的性状、增加的产量、增加的氮利用效率和增加的水利用效率的子代植物的方法。

发明内容

在一个方面，本公开提供了重组DNA构建体，所述重组DNA构建体各自包含：(a)与选自由SEQ ID NO:1-9组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列；(b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:10-18和30-39组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

包含重组DNA构建体的植物可以是田间作物植物，如玉米、大豆、棉花、卡诺拉(canola)、水稻、大麦、燕麦、小麦、草皮草、苜蓿、甜菜、向日葵、藜麦以及甘蔗。与对照植物相比，包含重组DNA构建体的植物可具有改变的表型或增强的性状。所述增强的性状可以是，例如，与对照植物相比，从种植到成熟的天数减少、茎杆大小增加、叶片数量增加、营养阶段的植株高度生长速率增加、穗大小增加、每植株的穗干重增加、每个穗的籽粒数量增加、每个籽粒的重量增加、每个植株的籽粒数量增加、穗空减少、谷粒灌浆期延长、植株高度降低、根分枝数量增加、总根长增加、产量增加、氮利用效率增加以及水利用效率增加。所述改变的表型可以是例如植株高度、生物量、冠层面积、花青素含量、叶绿素含量、施水量、水含量和水利用效率。

根据另一个方面，本公开提供了用于改变植物的表型、增强植物的性状、增加植物的产量、增加植物的氮利用效率或增加植物的水利用效率的方法，所述方法包括产生包含本公开的重组DNA构建体的转基因植物。产生转基因植物的步骤还可包括用重组DNA构建体转化植物细胞或组织，以及使转基因植物从包含所述重组DNA构建体的植物细胞或组织再生或发育出来。然后可将所述转基因植物与(a)自身；(b)来自同一株系的第二植物；(c)野生型植物；或(d)来自不同株系的第二植物杂交以产生一种或多种子代植物；并且可从与对照植物相比，具有增加的产量、增加的氮利用效率或增加的水利用效率或其他改变的表型或增强的性状的子代植物中选择植物。进一步提供了通过这种方法产生的植物。

根据另一方面，本公开提供了在定点整合中用作供体模板的重组DNA分子，其中重组DNA分子包含插入序列，所述插入序列包含：(a)与选自由SEQ ID NO:1-9组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列；(b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:10-18和30-39组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

所述重组DNA分子的插入序列可包含在植物细胞中具有功能性并与所述多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子。所述重组DNA分子还可包含侧接插入序列的至少一个同源臂，以指导插入序列整合到所需的基因组基因座中。进一步提供了包含所述插入序列的植物、繁殖体和植物细胞。根据一些实施方案，所述重组DNA分子还可包含表达盒，所述表达盒编码位点特异性核酸酶和/或一种或多种指导RNA。

根据另一方面，本公开提供了在定点整合中用作供体模板的重组DNA分子，其中重组DNA分子包含用于调节内源性基因的表达的插入序列，其中所述内源性基因包含：(a)编码mRNA分子的多核苷酸序列，所述mRNA分子与选自由SEQ ID NO:1-9组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性；或(b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有与选自由SEQ ID NO:10-18和30-39组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。

所述插入序列可包含启动子、增强子、内含子或终止子区域，其可对应于内源性基因的启动子、增强子、内含子或终止子区域。进一步提供了包含所述插入序列的植物、繁殖体和植物细胞。所述重组DNA分子还可包含至少一个侧接所述插入序列的同源臂。根据一些实施方案，所述重组DNA分子还可包含表达盒，所述表达盒编码位点特异性核酸酶和/或一种或多种指导RNA。

根据另一个方面，本公开提供了用于改变植物的表型、增强植物的性状、增加植物的产量、增加植物的氮利用效率或增加植物的水利用效率的方法，所述方法包括：(a)通过以下步骤修饰植物细胞的基因组：(i)鉴定所述植物的对应于选自本文的表1和表14中的基因列表的基因的内源性基因及其同源物，和(ii)经由基因组编辑或定点整合修饰所述植物细胞中的内源性基因的序列以修饰、增强或增加所述内源性基因的表达水平；以及(b)使植物从所述植物细胞再生或发育出来。

具体实施方式

在所附序列表中：

SEQ ID NO 1至9是可用于重组DNA构建体中以赋予植物增强的性状的核苷酸序列或DNA编码序列或链，各自表示蛋白质的编码序列。

SEQ ID NO 10至18是以相同顺序分别由SEQ ID NO 1至9的核苷酸或DNA序列编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO 19至29是可用于重组DNA构建体中以赋予植物增强的性状或改变的表型的核苷酸或DNA序列，各自表示具有特定类型的表达模式的启动子。

SEQ ID NO 30至39是与具有SEQ ID NO 10至18的氨基酸序列的蛋白质同源的蛋白质的氨基酸序列。

除非另外规定，否则本说明书文本中的核酸序列当从左向右阅读时是以5’至3’方向给出。本领域技术人员将会知道，给定DNA序列被理解为定义了除了用尿嘧啶(U)核苷酸置换DNA的胸腺嘧啶(T)核苷酸之外与该DNA序列相同的对应RNA序列。因此，提供特定DNA序列被理解为定义了精确的RNA等同物。给定第一多核苷酸序列，无论是DNA还是RNA，进一步限定其精确补体的序列(其可以是DNA或RNA)，即通过形成沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对与第一多核苷酸完全杂交的第二多核苷酸。与靶基因或靶基因的片段“基本上相同”或“基本上互补”意指多核苷酸链(或双链多核苷酸的至少一条链)被设计来与靶基因或靶基因的片段或与靶基因或靶基因的片段的转录物杂交(一般在生理条件诸如在活的植物或动物细胞中发现的那些生理条件下杂交)；本领域技术人员将理解，此种杂交不一定需要100％序列同一性或互补性。如本文所用，“可操作地连接”意指重组DNA构建体中的两个或更多个DNA片段缔合，以使得一者(例如，编码蛋白质的DNA)的表达或功能受另一者(例如，启动子)控制或影响。当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，则第一核酸序列与第二核酸序列是“可操作地”相连的或“连接的”。例如，如果启动子提供DNA的转录或表达，则启动子序列与DNA是“可操作地连接的”。一般而言，可操作地连接的DNA序列是连续的。

如本文所用，关于两个或更多个核苷酸或蛋白质序列的术语“同一性百分比”和“百分比相同”(包括任何数值的百分比同一性)是通过以下方式计算的：(i)在比较窗口上比较两个最佳比对的序列(核苷酸或蛋白质)，(ii)确定在这两个序列中出现相同的核酸碱基(对于核苷酸序列而言)或氨基酸残基(对于蛋白质而言)的位置的数目以产生匹配位置的数目，(iii)将所述匹配位置的数目除以所述比较窗中的位置总数，并且然后(iv)将此商乘以100％以产生同一性百分比。对于同一性百分比，如果在允许比对中存在一个或多个空位的情况下两个或更多个多核苷酸或蛋白质序列的最大数目的有序核苷酸或氨基酸被线性地比对或匹配(即相同)，则所述两个或更多个序列被最佳地比对。为了计算DNA序列与RNA序列之间的“同一性百分比”，RNA序列的尿嘧啶(U)被认为与DNA序列的胸腺嘧啶(T)相同。如果将比较窗口定义为两个或更多个序列之间的比对区域(即，不包括在所比较的序列之间不相同的在所比对的多核苷酸序列的5'和3'端的核苷酸或在所比对的蛋白质序列的N-末端和C-末端的氨基酸)，则“同一性百分比”也可称为“比对同一性百分比”。如果在没有指定特定比较窗口的情况下相对于参考序列计算“同一性百分比”，则通过将比对区域上的匹配位置的数目除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当两个序列(查询和目标)被最佳地比对(在允许其比对中存在空位的情况下)时，查询序列的“同一性百分比”等于两个序列之间相同位置的数目除以查询序列在其长度(或比较窗口)上的位置总数，然后乘以100％。

如本文所用，关于两个核苷酸序列的术语“互补性百分比”或“百分比互补”(包括任何数值互补性百分比)类似于同一性百分比的概念，但是指当查询序列和目标序列被线性地排列并且最佳地碱基配对时查询序列中与目标序列的核苷酸最佳碱基配对或杂交的核苷酸的百分比。这种互补性百分比可以是在两条DNA链、两条RNA链，或DNA链与RNA链之间。通过以下方式计算“互补性百分比”：(i)在比较窗口上以线性且完全延伸的排列(即，无折叠或二级结构)使两个核苷酸序列最佳地碱基配对或杂交，(ii)确定在所述比较窗口上两个序列之间碱基配对的位置的数目以产生互补位置的数目；(iii)将所述互补位置的数目除以所述比较窗口中的位置总数，以及(iv)将此商乘以100％以产生两个序列的互补性百分比。可基于已知的核苷酸碱基配对，如G-C、A-T和A-U，通过氢键合来确定两个序列的最佳碱基配对。如果在没有指定特定比较窗口的情况下相对于参考序列计算“互补性百分比”，则通过将两个线性序列之间的互补位置的数目除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当两个序列(查询和目标)被最地佳碱基配对(在允许存在错配或非碱基配对的核苷酸但没有折叠或二级结构的情况下)时，查询序列的“互补百分比”等于两个序列之间的碱基配对位置的数目除以查询序列在其长度上的位置总数(或除以查询序列在比较窗口上的位置数目)，然后乘以100％。

如本文所用，术语“表达”是指植物、植物细胞或植物组织产生多核苷酸或蛋白质，其可产生改变的表型或增强的性状。表达也可指将来自基因的信息借以用于功能性基因产物的合成中的过程，所述功能性基因产物可包括但不限于可起到例如酶促、结构或调控功能的其他多核苷酸或蛋白质。具有调控功能的基因产物包括但不限于影响靶蛋白质的转录或翻译的发生或水平的元件。在一些情况下，表达产物是非编码功能性RNA。

表达的“调节”是指实现多核苷酸或蛋白质的过表达或压制的过程。

如本文所用的术语“压制”是指在基因的任何发育或瞬时阶段，植物、植物细胞或植物组织中的靶多核苷酸或靶蛋白质的表达水平与在野生型或对照植物、细胞或组织中的表达相比较低。如在压制的上下文中使用的术语“靶蛋白质”是指被压制的蛋白质；类似地，“靶mRNA”是指可被压制，或一旦表达就会被降解从而导致它所编码的靶蛋白质被压制的多核苷酸。如在压制的上下文中使用的术语“靶基因”是指“靶蛋白质”和/或“靶mRNA”。在替代非限制性实施方案中，压制靶蛋白质和/或靶多核苷酸可直接或间接地产生增强的性状或改变的表型。在一个示例性实施方案中，靶蛋白质是这样的蛋白质，其可间接地增加或减少一种或多种其他蛋白质的表达，所述一种或多种其他蛋白质的表达的增加或减少分别与增强的性状或改变的表型相关。在另一个示例性实施方案中，靶蛋白质可结合至与改变的表型或增强的性状相关的一种或多种其他蛋白质，以增强或抑制它们的功能且由此间接地影响所述改变的表型或增强的性状。

可使用多种方法来施加压制。非限制性实例包括：压制途径中的一种或多种内源性基因或基因的子集；压制已导致蛋白质活性降低的一种或多种突变；压制抑制剂的产生；升高、降低或消除酶活性需要的底物水平，以产生新的蛋白质；活化通常沉默的基因；或累积在自然条件下通常不会升高的产物。

相反，如本文所用的术语“过表达”是指在基因的任何发育或瞬时阶段，植物、植物细胞或植物组织中的多核苷酸或蛋白质的表达水平与在野生型植物、细胞或组织中的表达相比较高。过表达可在通常缺乏与本发明多肽功能上等效或相同的多肽的表达的植物细胞中发生。过表达也可发生在这样的植物细胞中，在所述植物细胞中通常会发生本发明的多肽或功能上等效的分子的内源性表达，但是这种正常表达处于较低水平。因此，过表达导致所述多肽在植物、细胞或组织中的产量大于正常产量或“过量生产”。

如本文在过表达的上下文中所使用的术语“靶蛋白质”是指过表达的蛋白质；“靶mRNA”是指这样的mRNA，其编码并被翻译从而产生也可过表达的靶蛋白质。如在过表达的上下文中使用的术语“靶基因”是指“靶蛋白质”和/或“靶mRNA”。在替代实施方案中，靶蛋白质可直接或间接地实现增强的性状或改变的表型。在后一种情况下，它可例如通过影响一种或多种其他蛋白质的表达、功能或可用的底物来实现。在示例性实施方案中，靶蛋白质可结合至与改变的表型或增强的性状相关的一种或多种其他蛋白质，以增强或抑制它们的功能。

可使用多种途径来实现过表达。在一个实施方案中，可通过将编码一种或多种多核苷酸和/或多肽的DNA序列置于启动子的控制下来实现过表达，所述启动子的实例包括但不限于内源性启动子、异源启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。在一个示例性的实施方案中，所述启动子是组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S转录起始区。因此，取决于所使用的启动子，过表达可在整个植物中、在植物的特定组织中，或在存在或不存在不同诱导剂(inducing agent)或诱导剂(inducible agent)如激素或环境信号的情况下发生。

如本文所用，“植物”包括整株植物、转基因的植物、分生组织、芽器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花、花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚芽、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞、花粉、叶肉细胞等)以及它们的子代。可在所公开的方法中使用的植物的类别一般与适于转化和育种技术的高等植物和低等植物的类别一样广泛，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼属植物、裸蕨植物、石松类、苔藓植物和多细胞藻类。

如本文所用，“转基因植物细胞”是指利用稳定整合的重组DNA，例如通过农杆菌介导的转化、通过使用包覆有重组DNA的微粒进行轰击，或通过其他方式(如定点整合)而转化的植物细胞。本公开的植物细胞可以是最初转化的植物细胞或再生为分化的组织(例如再生为具有稳定整合的重组DNA的转基因植物)的子代植物细胞，或源自转基因植物或其子代植物的植物部分、种子或花粉。如本文所用，“转基因植物”和“转基因植物部分”分别是指这样的植物或植物部分，所述植物或植物部分的至少一个细胞的基因组中具有使用转化方法引入的稳定整合的重组DNA构建体或序列。

如本文所用，“对照植物”是指不含赋予增强的性状或改变的表型的本公开的重组DNA的植物。对照植物用于鉴定并选择具有增强的性状或改变的表型的转基因植物。适合的对照植物可以是用于产生转基因植物的亲本株系的非转基因植物，例如没有重组DNA的野生型植物。适合的对照植物也可以是含有赋予其他性状的重组DNA的转基因植物，例如具有增强的除草剂耐受性的转基因植物。在一些情况下，适合的对照植物可以是不含重组DNA的杂合或半合子转基因植物株系(称为阴性分离株或阴性等基因系)的子代。

如本文所用，“繁殖体”包括减数分裂和有丝分裂的所有产物，包括但不限于植物、种子和能够繁殖新植物的植物部分。繁殖体包括整株植物、细胞、花粉、胚珠、花、胚芽、叶、根、茎、芽、分生组织、谷粒或种子或能够生长成整株植物的任何植物部分。繁殖体还包括嫁接物，其中植物的一部分被嫁接到不同植物(甚至是不同物种的植物)的另一部分，以产生活生物体。繁殖体还包括通过克隆或通过将减数分裂产物聚集在一起，或允许减数分裂产物集合在一起以形成胚芽或受精卵(自然地或在人工干预下)而产生的所有植物和种子。

如本文所用，“子代”包括包含从祖先植物衍生出的本公开的重组DNA的任何植物、种子、植物细胞和/或可再生植物部分。对于转基因，子代可以是纯合的或杂合的。子代可从由包含本公开的重组DNA的转基因植物产生的种子和/或从由用来自包含本公开的重组DNA的转基因植物的花粉或胚珠受精的植物产生的种子生长。

如本文所用，“性状”是植物或特定植物材料或细胞的生理、形态、生物化学或物理特征。在一些情况下，这种特征对于人眼是可见的，并且可机械地测量，如种子或植物大小、重量、形状、形式、长度、高度、生长速率和发育阶段，或者可通过生物化学技术，如检测种子或叶的蛋白质、淀粉、某些代谢物或油含量来测量，或者可通过观察代谢或生理过程(例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖浓度的耐受性)来测量，或者可通过测量一种或多种基因的表达水平(例如，通过采用RNA印迹分析、RT-PCR、微阵列基因表达测定或报告基因表达系统)来测量，或者可通过农业观察，如高渗胁迫耐受性或产量来测量。然而，可使用任何技术来测量转基因植物中任何选定的化合物或大分子的量、比较水平或差异。

如本文所用，“增强的性状”是指由于重组DNA在转基因植物中的稳定整合和表达产生的转基因植物的特征。此类性状包括但不限于特征在于增强的植物形态、生理、生长和发育、产量、营养增强、抗病性或抗虫性，或环境或化学耐受性的增强的农艺性状。在本公开的一些具体方面，增强的性状选自由以下组成的组：从种植到成熟的天数减少、茎杆大小增加、叶片数量增加、营养阶段的植株高度生长速率增加、穗大小增加、每植株的穗干重增加、每个穗的籽粒数量增加、每个籽粒的重量增加、每个植株的籽粒数量增加、穗空减少、谷粒灌浆期延长、植株高度降低、根分枝数量增加、总根长增加、耐旱性、水利用效率增加、耐寒性、氮利用效率增加、产量增加以及改变的表型，如表6-8和10-15中所示。在本公开的另一方面，该性状是在非胁迫条件下产量增加或在环境胁迫条件下产量增加。胁迫条件可包括生物胁迫和非生物胁迫，例如，干旱、阴凉、真菌病、病毒病、细菌病、昆虫侵染、线虫侵染、低温暴露、热暴露、渗透胁迫、氮营养素利用率降低、磷营养素可用性降低和高植物密度。“产量”可受许多性质影响，所述性质包括但不限于植物高度、植物生物量、荚果数量、荚果在植物上的位置、节间数目、荚果破碎的发生率、谷粒大小、穗大小、穗尖灌浆、籽粒败育、结瘤和固氮的效率、养分同化的效率、对生物和非生物胁迫的抗性、碳同化、植物构型、抗倒伏性、种子发芽百分比、幼苗生长势以及幼年性状。产量还可受以下因素影响：发芽效率(包括在受胁迫条件下的发芽)、生长速率(包括在受胁迫条件下的生长速率)、花期和持续时间、穗数目、穗大小、穗重量、每个穗或荚果的种子数目、种子大小、种子的组成(淀粉、油、蛋白质)以及种子灌浆的特征。

本文还使用的术语“性状修饰”涵盖通过相对于不包含本公开的重组DNA的植物(如野生型植物或阴性分离株)，在包含所述重组DNA的植物中产生特征的可检测差异来改变天然存在的性状。在一些情况下，可定量地评价性状修饰。例如，性状修饰可导致观察到的性状特征或表型与对照植物相比增加或减少。已知修饰的性状中可存在自然变异。因此，所观察到的性状修饰导致植物中性状特征或表型的正态分布和量级与对照植物相比发生变化。

本公开涉及具有改善的经济上重要的特征，更具体地增加的产量的植物。更具体地，本公开涉及包含本公开的重组多核苷酸的转基因植物，其中所述植物与对照植物相比具有增加的产量。与对照植物相比，本公开的许多植物表现出增加的产量或改善的产量性状构成成分。在实施方案中，本公开的植物表现出与产量有关的改善的性状，包括但不限于增加的氮利用效率、增加的氮胁迫耐受性、增加的水利用效率和增加的耐旱性，如下文所定义和讨论的。

产量可被定义为来自作物的具有经济价值的可测量产品。产量可在数量和/或质量范围内加以定义。产量可直接取决于若干因素，例如器官的数量和大小、植物构型(如分枝的数量、植物生物量等)、花期和持续时间、谷粒灌浆期。根构型和发育、光合效率、养分吸收、胁迫耐受性、早期生长势、延迟的衰老和功能性保绿性表型可以是决定产量的重要因素。因此，优化上述因素可有助于增加作物产量。

本文中提及产量相关性状的增加也可被认为是指植物的一个或多个部分的生物量(重量)的增加，所述一个或多个部分可包括地上和/或地下(可收获)植物部分。特别地，此类可收获部分是种子，并且本公开的方法的执行产生相对于适合对照植物的种子产量，具有增加的产量且特别是增加的种子产量的植物。术语植物的“产量”可涉及所述植物的营养生物量(根和/或芽生物量)、繁殖器官和/或繁殖体(如种子)。

本公开的植物的产量的增加可用许多方式来衡量，所述方式包括容重(testweight)、每植株的种子数目、种子重量、每单位面积的种子数目(例如，每英亩种子或种子重量)、每英亩蒲式耳数、每英亩吨数或每公顷公斤数。例如，玉米产量可以例如以每英亩蒲式耳数或每公顷公吨数表示的每单位生产面积的去壳玉米粒产量来衡量。这还经常基于水分调整(例如在15.5％的水分下)来报告。产量的增加可归因于关键生物化学化合物(如氮、磷和碳水化合物)的利用率增加，或者归因于对环境胁迫(如冷、热、干旱、盐、阴凉、高植物密度以及害虫或病原体侵袭)的反应改善。因此本公开还可用于提供由于植物生长调控因子表达的修饰或者细胞周期或光合作用途径的修饰而具有改善的生长和发育以及最终增加的产量的植物。同样令人感兴趣的是产生表现出就种子成分而言的产量的增加的植物，所述就种子构成成分而言的产量的增加可能或可能不对应于总体植物产量的增加。

在一个实施方案中，“苜蓿产量”也可以饲料产量、收获时地上生物量的量来衡量。导致生物量增加的主要因素包括营养生长、分枝、节和节间、叶面积和叶面积指数增加。

在另一个实施方案中，“卡诺拉产量”也可以荚果数量、每植株的荚果数量、每个节的荚果数量、节间的数量、荚果破碎的发生率、每个角果的种子数、每个角果的种子重量、改善的种子、油或蛋白质组成来衡量。

另外，“玉米(corn)或玉蜀黍(maize)产量”也可以每单位生产面积的去壳玉米粒的产量、每英亩的穗数、每个穗的籽粒行数和每行的籽粒数、每个穗的籽粒数或重量、每个籽粒的重量、穗数、穗重、新鲜或干燥的穗生物量(重量)来衡量。

在又一个实施方案中，“棉花产量”可以每个植株的棉铃数、棉铃的大小、纤维质量、以g/植物表示的籽棉产量、以lb/英亩表示的籽棉产量、以lb/英亩表示的皮棉产量以及捆的数量来衡量。

“水稻产量”的具体实施方案还可包括每丘圆锥花序数、每丘谷粒数和每圆锥花序实粒数。

“大豆产量”的另一个进一步的实施方案还可包括每株豆荚数、每英亩豆荚数、每株种子数、每豆荚种子数、每粒种子重量、每豆荚重量、每节豆荚数、节数以及每株节间数。

在另一个进一步实施方案中，“甘蔗产量”可以蔗茎产量(吨/英亩；kg/公顷)、总可回收糖(磅/吨)和糖产量(吨/英亩)来衡量。

在再一个进一步实施方案中，“小麦产量”可包括：每单位面积的谷物、谷粒数量、谷粒重量、谷粒大小、每头谷粒数、每头种子数、每株种子数、每英亩头数、每株能活分蘖数、种子组成(例如碳水化合物、淀粉、油和蛋白质)和种子灌浆特征。

上文针对许多核心作物定义了术语“产量”、“种子产量”。术语“增加的”、“改进的”、“增强的”是可互换的，并且在本文中有定义。

在另一个实施方案中，本公开提供了一种用于产生具有改变的表型、增强的性状或增加的产量的植物的方法；所述方法的执行赋予植物改变的表型、增强的性状或增加的产量。

“增加的产量”可表现为以下中的一种或多种：(i)植物的一个或多个部分，特别是植物的地上(可收获)部分的植物生物量(重量)增加、根生物量增加(根数增加，根厚度增加、根长增加)或任何其他可收获部分的生物量增加；或(ii)早期生长势的增加，其在本文中被定义为发芽后约三周幼苗地上区域的改善。“早期生长势”是指尤其是在植物生长的早期阶段期间的活跃健康的植物生长，并且可能是因植物适应性增强，由于例如，植物能更好地适应它们所处的环境(例如，优化能源资源的使用、养分的吸收以及芽与根之间的碳水化合物分配)所导致。例如，玉米的早期生长势是玉米种子在种植后发芽和出苗的能力与幼小的玉米植株在出苗后生长和发育的能力的组合。具有早期生长势的植物还表现出增加的幼苗存活和更好的作物定植(establishment)，这往往导致田地高度均匀，大多数植物基本上同时达到各个发育阶段，这往往导致产量的增加。因此，早期生长势可通过测量多种因素如籽粒重量、发芽百分比、出苗百分比、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和芽(root andshoot)的生物量、冠层大小和颜色等来确定。

进一步地，产量的增加也可表现为(iii)总种子产量的增加，这可能归因于以下中的一者或多者：由于基于每植株和/或基于单粒种子的种子重量增加而导致的种子生物量(种子重量)增加；每个植株的圆锥花序数量增加；豆荚数量增加；节数量增加；每个圆锥花序/植株的花(“小花”)数量增加；种子灌浆率增加；灌浆种子的数量增加；种子大小(长度，宽度，面积，周长)增加，这也会影响种子的组成；和/或种子体积增加，这也可影响种子的组成。在一个实施方案中，增加的产量可以是增加的种子产量，并且选自以下中的一种或多种：(i)种子重量增加；(ii)灌浆种子的数量增加；和(iii)收获指数增加。

增加的产量也可(iv)导致经修饰的构型，或者可由于经修饰的植物构型而发生。

增加的产量还可表现为(v)增加的收获指数，其表示为可收获部分(如种子)的产量与总生物量的比率

产量的增加还可表现为(vi)籽粒重量的增加，其是根据计数的灌浆种子的数量和它们的总重量而外推的。籽粒重量增加可归因于种子大小和/或种子重量增加、胚芽大小增加、胚乳大小增加、糊粉层和/或盾片，或关于导致籽粒重量增加的种子其他部位的增加。

产量的增加还可表现为(vii)穗生物量(其是穗的重量)的增加，并且可基于每个穗、每植株或每地块表示。

本公开还延伸至植物的可收获部分，如但不局限于种子、叶、果实、花、圆荚、荚果、角果、坚果、茎、根茎、块茎以及球茎。本公开此外涉及源自这种植物的可收获部分的产物，如干燥颗粒、粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本公开提供了一种用于增加植物的“产量”或者植物或植物部分的“广阔英亩产量”(其被定义为每单位面积的可收获植物部分)，例如每英亩种子或种子重量、每英亩磅数、每英亩蒲式耳数、每英亩吨数、每英亩吨数、每公顷公斤数的方法。

本公开进一步提供了一种通过产生包含本公开的多核酸序列的植物来改变植物的表型、增强植物的性状，或增加植物的产量的方法，其中所述植物可与自身、来自同一株系的第二植物、野生型植物，或来自不同株系的植物杂交以产生种子。所得植物的种子可从可育植物中收获，并且用于生长出一种或多种本公开的植物的子代。除了用重组DNA构建体直接转化植物之外，可通过将具有稳定整合的重组DNA构建体的第一植物与缺乏所述DNA的第二植物杂交来制备转基因植物。举例来说，可将重组DNA引入到可经受转化以产生转基因植物的第一植物株系中，所述第一植物株系可与第二植物株系杂交以使重组DNA渗入到第二植物株系中。

与对照植物相比，用重组DNA构建体转化并且具有本公开的多核苷酸的选定转基因植物提供改变的表型、增强的性状或增加的产量。与重组DNA相关的遗传标记物的使用可促进所需重组DNA纯合的转基因子代的产生。可使携带这两种亲本性状的DNA的子代植物回交到亲本株系中多次(例如通常6至8代)，以产生基因型基本上与一个重复出现的原始转基因亲本系相同，但具有另一个转基因亲本系的重组DNA的子代植株。术语“子代”表示通过本公开的方法制备的、含有如本文所述的重组多核苷酸的亲本植物的任何世代的子代。

如本文所用，“氮利用效率”是指导致每施氮单位的植物产量、生物量、生长势和生长速率增加的过程。这些过程可包括植物对氮的吸收、同化、累积、信号传导、感测、再易位(在植物内)以及利用。

如本文所用，“氮限制条件”是指这样的生长条件或环境，所述生长条件或环境提供的氮少于植物充分或成功新陈代谢、生长、繁殖成功和/或生存能力所需的最佳量。

如本文所用，“增加的氮胁迫耐受性”是指植物在经受少于最佳量的可用/施用氮时或在氮限制条件下正常生长、发育或出产，或更快或更好地生长、发育或出产的能力。

如本文所用，“增加的氮利用效率”是指植物在经受与在正常或标准条件下相同量的可用/施用氮时比正常情况更快或更好地生长、发育或出产的能力；当经受少于最佳量的可用/施用氮时或在氮限制条件下，植物正常生长、发育或出产或更快或更好地生长、发育或出产的能力。

增加的植物氮利用效率可在田间转化为在供应较少量氮时收获相似数量的产量，或者通过供应最佳/足够量的氮获得的增加的产量。增加的氮利用效率可改善植物的氮胁迫耐受性，并且还可改善作物品质和种子的生物化学成分，如蛋白质产量和油产量。术语“增加的氮利用效率”、“增强的氮利用效率”和“氮胁迫耐受性”在本公开中可互换使用来指代在氮限制条件下具有增加的生产力的植物。

如本文所用，“水利用效率”是指每单位蒸腾的水蒸气叶片同化的二氧化碳的量。它是控制干旱环境下植物生产力的最重要的性状之一。“耐旱性”是指植物适应天旱(arid)或干旱(drought)条件的程度。植物对水亏缺的生理反应包括叶片萎蔫、叶片面积减少、叶片脱落以及通过将养分引导至植物的地下部分来刺激根生长。植物在开花和种子发育(繁殖阶段)期间更容易受到干旱的影响，因为植物的资源偏向于支持根生长。此外，脱落酸(ABA)(一种植物胁迫激素)诱导叶片气孔(参与气体交换的微观孔隙)的闭合，从而减少通过蒸腾作用造成的水流失并降低光合作用的速率。这些反应在短期内增加了植物的水利用效率。术语“增加的水利用效率”、“增强的水利用效率”和“增加的耐旱性”在本公开中可互换使用来指在水限制条件下具有增加的生产力的植物。

如本文所用，“增加的水利用效率”是指植物在经受与在正常或标准条件下相同量的可用/施用水时比正常情况更快或更好地生长、发育或出产的能力；当经受减少量的可用/施用水(水输入)时或在水胁迫或水亏缺胁迫条件下，植物正常生长、发育或出产或更快或更好地生长、发育或出产的能力。

如本文所用，“增加的耐旱性”是指植物在经受减少量的可用/施用水和/或在急性或慢性干旱条件下正常生长、发育或出产，或比正常更快或更好地生长、发育或出产的能力；在经受减少量的可用/施水量(水输入)时或在水亏缺胁迫条件下或在急性或慢性干旱条件下，植物正常生长、发育或出产的能力。

如本文所用，“干旱胁迫”是指导致水亏缺并使植物经受胁迫和/或植物组织损害并且/或者不利地影响谷粒/作物产量的干燥时期(急性或慢性/长期)；导致水亏缺和/或温度升高并使植物经受胁迫和/或植物组织损害并且/或者不利地影响谷粒/作物产量的干燥时期(急性或慢性/长期)。

如本文所用，“水亏缺”是指这样的条件或环境，其提供的水的量比植物的充分/成功生长和发育所需的水最佳量少。

如本文所用，“水胁迫”是指这样的条件或环境，其提供的水的量与植物/作物的充分/成功生长和发育所需的水量相比不适当(更少/不足或更多/过量)，从而使植物经受胁迫和/或植物组织损害和/或不利地影响谷粒/作物产量。

如本文所用，“水亏缺胁迫”是指这样的条件或环境，其提供的水的量与植物/作物的充分/成功生长和发育所需的水量相比较少/不足，从而使植物经受胁迫和/或植物组织损害和/或不利地影响谷粒产量。

如本文所用，“多核苷酸”是包含多个聚合的核苷酸的核酸分子。多核苷酸可被称为核酸、寡核苷酸或其任何片段。在许多情况下，多核苷酸编码多肽(或蛋白质)或其结构域或片段。另外，多核苷酸可包含启动子、内含子、增强子区域、聚腺苷酸化位点、翻译起始位点、5'或3'非翻译区、报告基因、可选择标记物(selectable marker)、可评分标记物等。多核苷酸可以是单链或双链DNA或RNA。多核苷酸任选地包含经修饰的碱基或经修饰的主链。多核苷酸可以是例如基因组DNA或RNA、转录物(如mRNA)、cDNA、PCR产物、克隆的DNA、合成DNA或RNA等。可将多核苷酸与一种或多种碳水化合物、一种或多种脂质、一种或多种蛋白质或其他材料组合以执行特定的活动(如转化)或形成诸如肽核酸(PNA)的组合物。多核苷酸可包含呈有义或反义取向的序列。“寡核苷酸”基本上等同于术语扩增引物、引物、寡聚物、元件、靶标和探针，并且优选是单链的。

如本文所用，“重组多核苷酸”或“重组DNA”是不呈其天然状态的多核苷酸，例如，多核苷酸包含未在自然界中发现的一系列核苷酸(表示为核苷酸序列)，或者多核苷酸处于除其被天然发现的环境以外的环境下；例如，与通常在自然界中与之邻近的多核苷酸分离，或与通常不邻近于其的多核苷酸相邻(或邻接)。“重组多核苷酸”或“重组DNA”是指已在包含含有天然存在的DNA或cDNA或合成DNA的DNA的细胞外进行遗传工程化和构建的多核苷酸或DNA。例如，可将所讨论的多核苷酸克隆到载体中，或者以其他方式与一种或多种另外的核酸重组。

如本文所用，“多肽”包含多个连续的聚合的氨基酸残基，例如，至少约15个连续的聚合的氨基酸残基。在许多情况下，多肽包含一系列聚合的氨基酸残基，其是转录调控因子或其结构域或部分或片段。另外，所述多肽可包含：(i)定位结构域；(ii)活化结构域；(iii)阻抑结构域；(iv)低聚结构域；(v)蛋白质-蛋白质相互作用结构域；(vi)DNA结合结构域；等。所述多肽任选地包含经修饰的氨基酸残基、未由密码子编码的天然存在的氨基酸残基、非天然存在的氨基酸残基。

如本文所用，“蛋白质”是指一系列氨基酸、寡肽、肽、多肽或其部分，无论是天然存在的还是合成的。

如本文所用，“重组多肽”是通过重组多核苷酸的翻译产生的多肽。

“合成多肽”是通过使用本领域中已知的方法使分离的氨基酸残基连续聚合而产生的多肽。

“分离的多肽”(无论是天然存在的还是重组的多肽)比野生型细胞中处于其天然状态的多肽在细胞内(或细胞外)的富集程度更高，例如，超过5％富集、超过约10％富集，或超过约20％或超过约50％或更高的富集，例如，可替代地表示：相对于100％下标准化的野生型，105％、110％、120％、150％或更高的富集。这种富集不是野生型植物自然反应的结果。可替代地或另外地，例如通过各种蛋白质纯化方法中的任一种，将分离的多肽与通常与之相关联的其他细胞构成成分分离。

如本文所用，“功能片段”是指保留全长多肽的全部或部分分子、生理或生物化学功能的本文提供的多肽的一部分。功能片段往往含有在序列表中提供的多肽中鉴定的一个或多个结构域，如Pfam结构域(参见下文)。在某些实施方案中，提供SEQ ID NO:1-9中任一者的片段，所述片段包含SEQ ID NO:1-9中任一者的至少约50、至少约75、至少约95、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225、至少约250、至少约275、至少约300、至少约500、至少约600、至少约700、至少约750、至少约800、至少约900或至少约1000个连续核苷酸、或至少约1250个连续核苷酸，或至少约1500个连续核苷酸、或至少约1750个连续核苷酸，或至少约2000个连续核苷酸、或至少约2250个连续核苷酸，或至少约2500个连续核苷酸，或至少约2750个连续核苷酸或更长的连续核苷酸，并且具有如本文所公开的活性。进一步提供了SEQ ID NO:10-18和30-39中任一者的片段，所述片段包含SEQID NO:10-18和30-39中任一者的至少约50、至少约75、至少约95、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225、至少约250、至少约275、至少约300、至少约500、至少约600、至少约700、至少约750、至少约800、至少约900或至少约1000个连续核苷酸或更长的连续核苷酸，并且具有如本文所公开的活性。

如本公开中使用的“重组DNA构建体”包含至少一个具有在植物细胞中可操作的启动子和本公开的多核苷酸的表达盒。DNA构建体可用作将重组DNA构建体递送至植物细胞中以便实现重组分子在植物细胞基因组中的稳定整合的手段。在一个实施方案中，所述多核苷酸可编码这样的蛋白质或蛋白质的变体或蛋白质的片段，其在功能上被定义为在包括植物细胞、植物部分、外植体和整株植物的转基因宿主细胞中维持活性。在另一个实施方案中，多核苷酸可编码干扰调控表达的内源性类别的小RNA(包括但不限于taRNA、siRNA和miRNA)的运转的非编码RNA。重组DNA构建体使用本领域普通技术人员已知的方法组装，并且通常包含可操作地连接至DNA的启动子，其表达提供增强的农艺性状。

其他构建体构成成分可包括另外的调控元件，如用于增强转录的5'前导序列和内含子、3'非翻译区(如聚腺苷酸化信号和位点)以及用于转运或靶向或信号肽的DNA。

如本文所用，“同源物(homolog)”或“同源物(homologues)”是指一组蛋白质中执行相同生物学功能的的蛋白质，例如，属于同一Pfam蛋白质家族并在本公开的转基因植物中提供共同的增强的性状的蛋白质。同源物由同源基因表达。关于同源基因，同源物包括直系同源物，例如，在不同物种中表达的通过物种形成从共同祖先基因进化并编码保留相同功能的蛋白质的基因；但不包括旁系同源物，即通过复制相关但已进化为编码具有不同功能的蛋白质的基因。同源基因包括天然存在的等位基因和人工产生的变体。

遗传密码的简并性提供了用不同的碱基替代基因的蛋白质编码序列的至少一个碱基，而不会引起从所述基因产生的多肽的氨基酸序列改变的可能性。当进行最佳比对时，同源蛋白质或其相应的核苷酸序列在被鉴定为与当在植物细胞中表达时赋予增强的性状或改变的表型相关联的蛋白质或其相应核苷酸序列的全长上通常具有至少约60％的同一性，在一些情况下至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或甚至至少约99.5％的同一性。在本公开的一方面，同源蛋白质与可从本文公开的序列构建的蛋白质和同源物的共有氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的同一性。

同源物是通过比较蛋白质序列，例如人工或使用基于计算机的工具，使用已知的序列比较算法(如BLAST和FASTA)从序列相似性中推断出来的。序列搜索和局部比对程序(例如BLAST)可用于针对各种生物体的蛋白质序列的数据库搜索基础生物体的查询蛋白质序列，以查找相似序列，并且汇总期望值(E值)可用于衡量序列相似性的水平。因为对特定生物体而言，具有最低E值的蛋白质命中物不一定是直系同源物，或不一定是唯一的直系同源物，所以使用相互查询来筛选具有显著E值的命中序列以进行直系同源物鉴定。相互查询需要针对基础生物体的蛋白质序列的数据库搜索重要命中物。当相互查询的最佳命中物是查询蛋白质本身或查询蛋白质的旁系同源物时，命中物可被鉴定为直系同源物。通过相互查询过程，将所有同源物中的直系同源物与旁系同源物进一步区分开来，从而允许推断基因的功能等效性。由在本发明的转基因植物中有用的DNA编码的同源物的进一步方面是由于天然序列中一个或多个氨基酸的缺失或插入而与所公开的蛋白质不同的那些蛋白质。

作为一种或多种已知的保守氨基酸替代(例如，缬氨酸是丙氨酸的保守替代物并且苏氨酸是丝氨酸的保守替代物)的结果，其他功能性同源蛋白质的一个或多个氨基酸与本文公开的性状改善蛋白质的氨基酸不同。用于天然序列内的氨基酸的保守性替代可选自所述天然存在的氨基酸所属的类别的其他成员。这些各种类别内的代表性氨基酸包括但不限于：(1)酸性(带负电荷)的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电荷的)氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)中性非极性(疏水性)氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。天然蛋白质或多肽内氨基酸的保守替代物可选自天然存在的氨基酸所属的组的其他成员。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。天然保守的氨基酸替代组是：缬氨酸-亮氨酸、缬氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本公开的进一步方面包括由于天然序列中的一个或多个氨基酸的缺失或插入而导致的在一个或多个氨基酸上与所述蛋白质序列中的那些氨基酸不同的蛋白质。

一般而言，术语“变体”是指与参考(天然)多核苷酸或多肽相比，分别在其核苷酸或氨基酸序列上具有一些合成或天然产生的差异的分子。这些差异包括在天然多核苷酸或氨基酸序列中的替代、插入、缺失或此类改变的任何所需的组合。

关于多核苷酸变体，当前公开的多核苷酸与多核苷酸变体之间的差异是有限的，使得前者和后者的核苷酸序列总体上相似，并且在许多区域中相同。由于遗传密码的简并性，前者与后者核苷酸序列之间的差异可以是沉默的(例如，由多核苷酸编码的氨基酸是相同的，并且变异多核苷酸序列与目前公开的多核苷酸编码相同的氨基酸序列)。变异核苷酸序列可编码不同的氨基酸序列，在这种情况下，此类核苷酸差异将导致相对于类似公开的多核苷酸序列的氨基酸替代、添加、缺失、插入、截短或融合。这些变异可产生编码共有至少一种功能特征的多肽的多核苷酸变体。遗传密码的简并性还指示许多不同的变异多核苷酸可编码相同和/或基本相似的多肽。

如本文所用，“基因”或“基因序列”是指基因、其互补序列及其5'和/或3'非翻译区(UTR)及其互补序列的部分或完整编码序列。基因也是遗传的功能单位，并且从物理层面上讲，是沿着参与产生多肽链的DNA(或RNA，在RNA病毒的情况下)分子的核苷酸的特定区段或序列。后者可进行后续加工，如化学修饰或折叠以获得功能性蛋白质或多肽。举例来说，转录调控因子基因编码可起作用或需要加工来起到转录起始子作用的转录调控因子多肽。

如本文使用，术语“启动子”一般是指参与识别和结合RNA聚合酶II和其他蛋白质(反式作用转录因子)以启始转录的DNA分子。启动子可最初从基因的基因组拷贝的5′未翻译区域(5′UTR)分离。替代地，启动子可为合成产生的或操纵的DNA分子。启动子也可以是嵌合的，即通过两个或更多个异源DNA分子的融合产生的启动子。植物启动子包括获自植物、植物病毒、真菌和细菌(如土壤杆菌属和根瘤菌属细菌)的启动子DNA。

在植物的所有或大多数组织中启动转录的启动子被称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段启动转录的启动子被称为“发育”启动子。其表达在植物的某些组织中相对于其他植物组织得到增强的启动子被称为“组织增强”或“组织优选”的启动子。在植物的特定组织中表达、在其他植物组织中很少表达或不表达的启动子被称为“组织特异性”启动子。例如，“种子增强的”或“种子优选的”启动子相对于植物的其他组织在种子组织中驱动相关的转基因或可转录核苷酸序列(即，与所述启动子可操作地连接的转基因或可转录核苷酸序列)的增强或更高的表达水平，而“种子特异性”启动子将驱动种子组织中相关转基因或可转录核苷酸序列(即，与所述启动子可操作地连接的转基因或可转录核苷酸序列)的表达，而所述相关转基因或可转录核苷酸序列在植物的其他组织中很少表达或不表达。也可以此方式描述针对其他组织类型(如根、分生组织、叶等)的其他类型的组织特异性或组织优选的启动子。在植物的某一细胞类型(例如小孢子母细胞)中表达的启动子被称为“细胞类型特异性”启动子。“诱导型”启动子是响应于环境刺激(诸如寒冷、干旱或光照)或其他刺激(诸如伤害或化学应用)而启动转录的启动子。植物中许多生理和生物化学过程表现出约24小时周期的内源性节律。“昼夜启动子”是在昼夜节律振荡器的控制下表现出改变的表达谱的启动子。昼夜调控受制于环境输入(如光线和温度)以及昼夜节律钟的协调。

种子优选或种子特异性启动子的实例包括来自种子组织中表达的基因的启动子，如美国专利号5,420,034中公开的油菜籽蛋白、美国专利号6,433,252中公开的玉蜀黍L3油脂蛋白、由Russell等人(1997)Transgenic Res.6(2):157-166公开的玉米蛋白Z27、由Belanger等人(1991)Genetics 129:863-872公开的球蛋白1、由Russell(1997)同上公开的谷蛋白1以及由Stacy等人(1996)Plant Mol Biol.31(6):1205-1216公开的抗氧化过氧化物氧还酶(Per1)。每个以上参考文献的内容和公开内容以引用的方式并入本文。例如，国际申请号PCT/US2017/057202中提供了分生组织优选的或分生组织特异性的启动子的实例，所述申请的内容和公开内容以引用的方式并入本文。

可在植物中使用的组成型启动子的许多实例是本领域已知的，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S和19S启动子(参见例如，美国专利号5,352,605)、增强的CaMV 35S启动子，如具有Omega区的CaMV 35S启动子(参见例如Holtorf,S.等人,Plant Molecular Biology,29:637-646(1995)或双重增强的CaMV启动子(参见例如，美国专利号5,322,938)、玄参花叶病毒(FMV)35S启动子(参见例如，美国专利号6,372,211)、紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子(参见例如，美国专利号6,420,547)、花生褪绿条纹病毒启动子(参见例如，美国专利号5,850,019)、胭脂碱或章鱼碱启动子、泛素启动子，如大豆聚泛素启动子(参见例如，美国专利号7,393,948)、拟南芥S-腺苷甲硫氨酸合成酶启动子(参见例如，美国专利号8,809,628)等，或前述启动子的任何功能性部分，上述参考文献各自的内容和公开内容以引用的方式并入本文。

可在单子叶植物如谷物或玉米植物中使用的组成型启动子的实例包括例如，各种肌动蛋白基因启动子，如水稻肌动蛋白1启动子(参见例如，美国专利号5,641,876；还参见SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76)和水稻肌动蛋白2启动子(参见例如，美国专利号6,429,357；还参见例如SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78)；CaMV 35S或19S启动子(参见例如，美国专利号5,352,605；对于CaMV 35S还参见例如，SEQ ID NO:79)；玉蜀黍泛素启动子(参见例如，美国专利号5,510,474)；薏苡聚泛素启动子(参见例如，SEQ ID NO:80)；水稻或玉蜀黍Gos2启动子(参见例如，Pater等人,The Plant Journal,2(6):837-44 1992；对于水稻Gos2启动子，还参见例如SEQ ID NO:81)；FMV 35S启动子(参见例如，美国专利号6,372,211)；双重增强的CMV启动子(参见例如，美国专利号5,322,938)；MMV启动子(参见例如，美国专利号6,420,547；还参见，例如SEQ ID NO:82)；PCLSV启动子(参见例如，美国专利号5,850,019；还参见例如，SEQ ID NO:83)；Emu启动子(参见例如，Last等人,Theor.Appl.Genet.81:581(1991)；和Mcelroy等人,Mol.Gen.Genet.231:150(1991))；来自玉蜀黍、水稻或其他物种的微管蛋白启动子；胭脂碱合酶(nos)启动子；章鱼碱合酶(ocs)启动子；甘露碱合酶(mas)启动子；或植物醇脱氢酶(例如，玉蜀黍Adh1)启动子；本领域已知或以后鉴定的在谷物或玉米植物中提供组成型表达的任何其他启动子(包括病毒启动子)；本领域已知的可用于单子叶植物或谷物植物中的任何其他组成型启动子；以及任何前述启动子的任何功能性序列部分或截短。每个以上参考文献的内容和公开内容以引用的方式并入本文。

如本文使用，术语“前导序列”是指从基因的基因组拷贝的未翻译5′区域(5′UTR)分离的DNA分子，并且一般被定义为在转录起始位点(TSS)与蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸区段。替代地，前导序列可以是合成产生或操纵的DNA元件。前导序列可用作用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达的5′调控元件。如本文所用，术语“内含子”是指可从基因的基因组拷贝中分离或鉴定的DNA分子，并且一般可被定义为在翻译之前的mRNA加工过程中剪接出来的区域。替代地，内含子可以是合成产生或操纵的DNA元件。内含子可含有实现可操作地连接的基因的转录的增强子元件。内含子可用作用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达的调控元件。DNA构建体可包括内含子，并且内含子可能或可能不涉及到可转录多核苷酸分子。

如本文所用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用转录调控元件，也被称为顺式元件，其赋予总体表达模式的方面，但是通常不足以单独驱动可操作地连接的多核苷酸的转录。不同于启动子，增强子元件通常不包括转录起始位点(TSS)或TATA盒或等效序列。启动子可天然地包含一个或多个影响可操作地连接的多核苷酸的转录的增强子元件。分离的增强子元件还可融合至启动子以产生嵌合启动子顺式元件，其赋予基因表达的总体调节的方面。启动子或启动子片段可包含一个或多个实现可操作地连接的基因的转录的增强子元件。据信许多启动子增强子元件结合DNA结合蛋白质且/或影响DNA拓扑结构，产生选择性允许或限制RNA聚合酶接近DNA模板或者促进转录起始位点上双螺旋的选择性打开的局部构象。增强子元件可以起到结合调节转录的转录因子的作用。一些增强子元件结合多于一个转录因子，并且转录因子可以不同亲和力与多于一个增强子结构域相互作用。

本公开的表达盒可包含位于一个或多个基因的5'或3'处或者位于一个或多个基因内的“转运肽”或“靶向肽”或“信号肽”分子。这些术语一般是指当与目标蛋白质连接时将该蛋白质引导至特定组织、细胞、亚细胞位置或细胞器的肽分子。实例包括但不限于叶绿体转运肽(CTP)、叶绿体靶向肽、线粒体靶向肽、核靶向信号、核输出信号、液泡靶向肽和液泡分选肽。对于使用叶绿体转运肽的描述，参见美国专利号5,188,642和美国专利号5,728,925。对于本公开中拟南芥属EPSPS基因的转运肽区域的描述，参见Klee,H.J.等人(MGG(1987)210:437-442。本公开的表达盒还可包含一个或多个内含子。本公开的表达盒可含有在该盒的3'端附近的DNA，所述DNA充当终止来自异源核酸的转录的信号并且指导所得mRNA的聚腺苷酸化。这些通常被称为“3′-非翻译区”或“3′-非编码序列”或“3′-UTR”。“3’非翻译序列”意指位于结构核苷酸序列下游的DNA序列，并且包括编码聚腺苷酸化和其他能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的序列。聚腺苷酸化信号在植物中起到使聚腺苷酸核苷酸添加到mRNA前体的3'端的作用。聚腺苷酸化信号可来源于天然基因、各种植物基因或T-DNA。聚腺苷酸化序列的一个实例是胭脂碱合酶3′序列(nos 3’；Fraley等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-4807,1983)。Ingelbrecht等人,Plant Cell 1:671-680,1989举例说明了不同3'非翻译序列的用途。

本公开的表达盒也可含有一种或多种编码可选择标记物并赋予对诸如抗生素或除草剂的选择剂的抗性的基因。许多可选择标记物基因是本领域已知的，并且可在本公开中使用：赋予以下耐受性的可选择标记物基因：赋予对像卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、壮观霉素(aadA)、美国专利公布2009/0138985A1和庆大霉素(aac3和aacC4)之类的抗生素的耐受性；或赋予对像草甘膦(例如，5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，美国专利号5,627,061；美国专利号5,633,435；美国专利号6,040,497；美国专利号5,094,945)、磺酰除草剂(例如，乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶)之类的除草剂的耐受性；赋予对乙酰乳酸合酶抑制剂如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基氧基苯甲酸酯和苯酞(phthalide)(美国专利6,225,105；5,767,366；4,761,373；5,633,437；6,613,963；5,013,659；5,141,870；5,378,824；5,605,011))、双丙氨膦或草丁膦或衍生物(例如，草丁膦乙酰转移酶(bar)的耐受性；赋予对草丁膦或草铵膦(美国专利5,646,024；5,561,236；5,276,268；5,637,489；5,273,894)、麦草畏(麦草畏单加氧酶，专利申请公布US2003/0115626A1)或稀禾定(修饰的乙酰辅酶A羧化酶，用于赋予对环己二酮的耐受性)和芳氧基苯氧基丙酸酯(吡氟氯禾灵，美国专利号6,414,222)的耐受性。

本公开的转化载体可含有一个或多个“表达盒”，每个表达盒包含与目标多核苷酸序列可操作连接的天然或非天然植物启动子，所述目标多核苷酸序列与3’UTR序列和终止信号可操作地连接，用于在适当的宿主细胞中表达。它通常还包含正确翻译多核苷酸或转基因所需的序列。如本文中使用的术语“转基因”是指人工并入到宿主细胞基因组中的多核苷酸分子。这种转基因可与宿主细胞异源。术语“转基因植物”是指包含这种转基因的植物。编码区通常编码目标蛋白质，但是也可编码目标功能性RNA，例如反义RNA，有义或反义方向的非翻译的RNA、miRNA、非编码RNA，或在压制或过表达目标基因序列中使用的合成RNA。包含目标核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意味着它的构成成分中的至少一种相对于它的其它构成成分中的至少一种是异源的。如本文所用，术语“嵌合”是指由两个或更多个遗传上不同的来源(例如来自一种基因或生物体的第一分子和来自另一种基因或生物体的第二分子)产生的DNA分子。

如本文所用，术语“异源”是指两种或更多种构成成分(包括DNA分子)的组合，且这种组合通常在自然界中是不存在的。举例来说，该两个DNA分子可源自不同物种和/或该两个DNA分子可源自不同基因，例如，来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因，或者所述DNA分子中的一者可以是合成的并且不存在于自然界中。第一DNA分子相对于可操作地连接的第二DNA分子为异源的，条件是这种组合通常不存在于自然界中，即，所述第二DNA分子并非天然地可操作地连接至第一元件。

本公开中的重组DNA构建体一般包含3'元件，所述3'元件通常含有聚腺苷酸化信号和位点。已知的3’元件包括例如美国专利号6,090,627中公开的来自诸如nos 3’、tml3’、tmr 3’、tms 3’、ocs 3’、tr7 3’的根癌土壤杆菌基因的3’元件；来自诸如小麦(小麦(Triticum aesevitum))热休克蛋白17(Hsp17 3’)、小麦泛素基因、小麦果糖-1,6-二磷酸酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脱氢酶基因和水稻β-微管蛋白基因的植物基因的3’元件(其全部公开于美国专利申请公布2002/0192813 A1中)；以及豌豆(豌豆(Pisumsativum))二磷酸核酮糖羧化酶基因(rbs 3’)和来自宿主植物内的基因的3’元件。

转基因植物可包含本文公开的一种或多种多核苷酸的堆叠，其导致产生多个多肽序列。可通过传统育种方法中的一种或两种或通过遗传工程化方法获得包含多核苷酸堆叠的转基因植物。这些方法包括但不限于使各自包含目标多核苷酸的各个转基因品系杂交，用第二基因转化包含本文公开的第一基因的转基因植物，以及将基因共转化到单个植物细胞中。基因的共转化可使用包含多种基因的单个转化载体或在多个载体上单独携带的基因来进行。

作为传统转化方法的替代，可将DNA序列(如转基因，一个或多个表达盒等)经由定点整合插入或整合到植物或植物细胞的基因组内的特定位点或基因座中。因此，本公开的一个或多个重组DNA构建体和一个或多个分子可包含供体模板序列，所述供体模板序列包含至少一种转基因、表达盒或其他DNA序列，以用于插入到植物或植物细胞的基因组中。这种用于定点整合的供体模板还可包含侧接插入序列(即，待被插入到植物基因组中的序列、转基因、盒等)的一个或两个同源臂。本公开的一个或多个重组DNA构建体还可包含一个或多个表达盒，所述表达盒编码位点特异性核酸酶和/或任何一个或多个相关蛋白质以进行定点整合。这一个或多个核酸酶表达盒可与供体模板存在于同一分子或载体中(顺式)，或存在于单独的分子或载体中(反式)。

植物基因组内的任何位点或基因座都可潜在地被选择用于本文所提供的转基因、构建体或可转录DNA序列的定点整合。用于定点整合的若干方法在本领域中是已知的，这些方法涉及切割基因组DNA以在所需的基因组位点或基因座处产生双链断裂(DSB)或切口的不同的蛋白质(或蛋白质复合物和/或指导RNA)。简言之，如本领域中所理解的，在修复由核酸酶引入的DSB或切口的过程中，供体模板DNA可被整合到DSB或切口的位点处或附近的基因组中。供体模板中一个或多个同源臂的存在可促进在经由同源重组的修复过程中插入序列被采用并被靶向到植物基因组中，尽管插入事件也可通过非同源末端连接(NHEJ)发生。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程化的或天然的大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶和RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)。对于使用RNA指导的位点特异性核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)的方法，所述一个或多个重组DNA构建体还将包含编码一个或多个指导RNA以将核酸酶引导至植物基因组内的所需位点的序列。

如本文所用，术语“同源臂”是指与被转化的植物或植物细胞中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸序列。同源臂可包含至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少250个、至少500个或至少1000个核苷酸。

如本文所用，“可操作地连接”是指重组DNA构建体中的两个或更多个DNA片段缔合，以使得一个(例如，编码蛋白质的DNA)的表达或功能受另一个(例如，启动子)控制或影响。

包含或源自用本公开的重组DNA转化的植物细胞的转基因植物可用堆叠性状进一步增强，例如，具有由本文所公开的DNA的表达产生的增强的性状与除草剂抗性和/或抗虫性性状的组合的作物植物。例如，本公开的基因可与其他目标农艺学性状堆叠在一起，所述其他目标农艺学性状诸如提供除草剂抗性或昆虫抗性的性状，诸如使用来自苏云金芽孢杆菌的基因来提供针对鳞翅目、鞘翅目、同翅目、半翅目和其他昆虫的抗性，或改善的品质性状，如改善的营养价值。已经证明转基因植物对其展示耐受性并且可应用本公开的方法的除草剂包括但不限于草甘膦、麦草畏、草铵膦、磺酰脲、溴苯腈、达草灭、2,4-D(2,4-二氯苯氧基)乙酸、芳氧基苯氧基丙酸酯、对羟基苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂(HPPD)和原卟啉原氧化酶抑制剂(PPO)除草剂。编码参与除草剂耐受性的蛋白质的多核苷酸分子在本领域中是已知的，并且包括但不限于编码公开于美国专利5,094,945、5,627,061、5,633,435和6,040,497中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核苷酸分子，其用于赋予草甘膦耐受性；编码美国专利号5,463,175中公开的草甘膦氧化还原酶(GOX)和美国专利号申请公布2003/0083480A1中公开的草甘膦-N-乙酰基转移酶(GAT)的多核苷酸分子，其也用于赋予草甘膦耐受性；编码美国专利申请公布2003/0135879A1中公开的麦草畏单氧酶的多核苷酸分子，其用于赋予麦草畏耐受性；编码美国专利号4,810,648中公开的溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子，其用于赋予溴苯腈耐受性；编码Misawa等人,(1993)Plant J.4:833-840和Misawa等人,(1994)Plant J.6:481-489中描述的八氢番茄红素去饱和酶(crtI)的多核苷酸分子，其用于赋予达草灭耐受性；编码Sathasiivan等人(1990)Nucl.AcidsRes.18:2188-2193中描述的乙酰羟基酸合成酶(AHAS，又名ALS)的多核苷酸分子，其用于赋予对磺酰脲类除草剂的耐受性；DeBlock,等人(1987)EMBO J.6:2513-2519中公开的称为bar基因的多核苷酸分子，其用于赋予草铵膦和双丙氨膦耐受性；美国专利申请公布2003/010609A1中公开的多核苷酸分子，其用于赋予N-氨基甲基膦酸耐受性；美国专利号6,107,549中公开的多核苷酸分子，其用于赋予吡啶类除草剂抗性；用于赋予对多种除草剂如草甘膦、阿特拉津、ALS抑制剂、异噁唑草酮和草铵膦除草剂的耐受性的分子和方法公开于美国专利号6,376,754和美国专利申请公布2002/0112260中。用于赋予昆虫/线虫/病毒抗性的分子和方法公开于美国专利5,250,515；5,880,275；6,506,599；5,986,175和美国专利申请公布2003/0150017A1中。

植物细胞转化方法

用重组DNA转化植物细胞中的染色体和质体和/或将重组DNA引入到植物细胞的染色体和质体中的许多方法是本领域已知的，这些方法可用于产生转基因植物细胞和植物的方法中。两种有效的转化方法是农杆菌介导的转化和微粒轰击介导的转化。微粒轰击方法例如在美国专利5,015,580(大豆)；5,550,318(玉米)；5,538,880(玉米)；5,914,451(大豆)；6,160,208(玉米)；6,399,861(玉米)；6,153,812(小麦)和6,365,807(水稻)中有举例说明。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如美国专利5,159,135(棉花)；5,824,877(大豆)；5,463,174(卡诺拉)；5,591,616(玉米)；5,846,797(棉花)；8,044,260(棉花)；6,384,301(大豆)；7,026,528(小麦)和6,329,571(水稻)；美国专利申请公布号2004/0087030A1(棉花)和美国专利申请公布号2001/0042257A1(甜菜)，所述专利全部以引用的方式整体并入本文。植物材料的转化在营养培养基(例如，允许细胞在体外生长的营养物的混合物)上的组织培养物中进行实践。接受者细胞靶标包括但不限于分生组织细胞、芽尖、下胚轴、愈伤组织、未成熟或成熟胚芽以及配子细胞，如小孢子、花粉、精子和卵细胞。愈伤组织可起始于包括但不限于不成熟或成熟胚芽、下胚轴、幼苗顶端分生组织、小孢子等的组织来源。使含有转基因核的细胞生长成转基因植物。

如上所述，用于转化植物细胞和植物细胞中的染色体的另一种方法是使用重组DNA供体模板通过定点整合的方法在基因组的预定位点处插入DNA序列。定点整合可通过本领域已知的任何方法来实现，例如通过使用锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、TALE内切核酸酶、或RNA指导的内切核酸酶(例如Cas9或Cpf1)来实现。重组DNA构建体可通过同源重组(HR)或通过非同源末端连接(NHEJ)插入在预定位点处。除了在预定位点处将重组DNA构建体插入到植物染色体中外，基因组编辑还可通过寡核苷酸定向诱变(ODM)(Oh和May，2001；美国专利号8,268,622)或者通过利用位点特异性核酸酶引入双链断裂(DSB)或切口，并然后进行NHEJ或修复来实现。DSB或切口的修复可用于在DSB或切口的部位处引入插入或缺失，并且这些突变可能导致引入移码、氨基酸替代和/或蛋白质翻译的早期终止密码子或基因的调控序列改变。基因组编辑可在有或没有供体模板分子的情况下实现。

除用重组DNA构建体直接转化植物材料之外，转基因植物也可通过使包含重组DNA的第一植物与缺乏所述重组DNA的第二植物杂交来制备。举例来说，可将重组DNA引入到可经受转化的第一植物株系中，可使所述第一植物株系与第二植物株系杂交以使重组DNA渗入到第二植物株系中。可使具有提供增强的性状(例如增强的产量或其他产量构成成分性状)的重组DNA的转基因植物与具有赋予另一种性状(例如除草剂抗性或害虫抗性)的另一种重组DNA的转基因植物株系杂交，以产生具有赋予这两种性状的重组DNA序列的子代植物。这些杂交的子代可能会分离，使得一些植物将携带针对两种亲本性状的重组DNA，而一些植物将携带针对亲本性状之一的重组DNA；并且此类植物可通过亲本性状中的一种或两种或与亲本性状中的一种或两种相关的标记物或所述重组DNA来鉴定。例如，可通过分析或检测重组DNA来进行标记物鉴定，或者在可选择标记物与重组DNA连接的情况下，可通过应用选择剂(如与除草剂耐受性标记物一起使用的除草剂)或通过选择增强的性状或使用任何分子技术来进行标记物鉴定。可将携带两种亲本性状的DNA的子代植物与亲本株系之一回交多次(例如6至8代)，以产生除另一转基因亲本株系的重组DNA之外，基因型大致上与原始转基因亲本株系相同的子代植物。

为了进行转化，通常在任一转化实验中将DNA引入到仅较小百分比的靶标植物细胞中。标记物基因被用来提供用于鉴定通过接受重组DNA构建体并将所述构建体整合至它们的基因组中而稳定转化的那些细胞的高效系统。优选的标记物基因提供赋予对选择剂(诸如抗生素或除草剂)的抗性的选择性标记。本公开的植物可以抵抗的任何除草剂都是供选择性标记物用的试剂。使潜在转化的细胞暴露于选择剂。在存活细胞群体中，细胞是通常赋予抗性的基因被整合在其中且在其中以足以允许细胞存活的水平表达的那些细胞。可进一步测试细胞以确认外源性DNA的稳定整合。常用的选择性标记物基因包括赋予对诸如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、壮观霉素(aadA)和庆大霉素(aac3和aacC4)的抗生素的抗性或对诸如草铵膦(bar或pat)、麦草畏(DMO)和草甘膦(aroA或EPSPS)的除草剂的抗性的标记物基因。此类可选择标记物的实例在美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708；6,118,047和8,030,544中有举例说明。也可采用提供目视筛选转化体的能力的标记物，例如表达着色或荧光蛋白质(如荧光素酶或绿色荧光蛋白质(GFP))的基因或表达β-葡萄糖醛酸酶的基因或其各种显色底物已知的uidA基因(GUS)。

可在体外培养在暴露于选择剂时存活的植物细胞或在筛选测定中已被评分为阳性的植物细胞，以使小植株发育或再生。可将从转化的植物细胞再生的发育中小植株转移至植物生长混合物中，并且例如在环境控制的室内在约85％相对湿度、600ppm CO₂和25-250microEinsteins m^-2s^-1的光照下进行耐寒锻炼，然后转移至温室或生长室进行成熟。取决于初始组织和植物物种，可在鉴定出转化体后约6周至10个月内使植物再生。可使用本领域技术人员已知的常规植物育种方法对植物进行授粉以产生种子，例如转基因玉米和其他植物通常使用异花授粉和自花授粉。可测试再生的转化植物或其子代种子或植物的重组DNA表达，并且针对改变的表型或增强的农艺性状的存在来对它们进行选择。

转基因植物和种子

使源自具有本公开的转基因核的转基因植物细胞的转基因植物生长，以产生与对照植物相比具有改变的表型或增强的性状的转基因植物，并产生本公开的转基因种子和单倍体花粉。此类具有增强的性状的植物是通过选择具有增强的性状的转化植物或子代种子来鉴定。为了效率，设计了一种选择方法来评价包含重组DNA的多种转基因植物(事件)，例如来自2至20个或更多个转基因事件的多种植物。从本文提供的转基因种子生长的转基因植物表现出改善的有助于产量增加的农艺性状或提供增加的植物价值的其他性状，包括例如改善的种子质量。特别感兴趣的是具有增加的水利用效率或耐旱性、增强的高温或寒冷耐受性、增加的产量和增加的氮利用效率的植物。

表1给出作为重组DNA用于产生具有增强的性状的转基因植物的蛋白质编码基因的序列的列表。表1的要素是通过引用以下进行描述：标识DNA序列的“NUC SEQ ID NO.”；标识氨基酸序列的“PEP SEQ ID NO.”；指代基因标识符的“基因ID”；以及作为基因的通用名称和功能描述的“基因名称和描述”。

表1.蛋白质编码基因的序列

表2给出了一系列具有特定表达模式的构建体，其用于表达或压制蛋白质编码基因，作为用于生产具有增强性状的转基因植物的重组DNA。表2的要素通过引用以下进行描述：“构建体ID”，其根据与表达或压制蛋白质编码基因的多核苷酸序列可操作地连接的启动子来标识具有特定表达模式的构建体。“基因ID”标识来自表1或表2的表达的或压制的基因。“特定表达模式”描述预期表达模式或启动子类型。

表2.用于基因表达的构建体

表3提供具有特定表达模式的启动子的多核苷酸序列的列表。为了表述特定表达模式，启动子的选择不限于表3中列出的那些。

表3.启动子序列和表达模式

核苷酸SEQ ID NO.	启动子表达模式
		19	优选地面上；高
20	优选地面上；中等
		21	干旱响应
22	叶和根的干旱响应
		23	优选胚盾片
24	优选叶维管束鞘和叶肉
		25	优选叶片
26	优选分生组织
		27	优选胚珠&早期籽粒
28	优选根
		29	优选种子

针对增强的性状选择和测试转基因植物

在各自从具有重组DNA的植物细胞发育或再生的转基因植物群体中，存活至产生种子和子代植物的可育转基因植物的许多植物将不表现出增强的农艺性状。从群体中进行选择对于鉴定具有增强的性状的一种或多种转基因植物可能是必要的。利用有力测试(vigorous testing)进行的进一步评价对于理解性状的贡献性构成成分、支持性状发展决策和产生作用模式假设可能是重要的。具有增强的性状的转基因植物可从自如本文所述的那样转化的植物细胞发育、再生或衍生的植物群体中进行选择和测试，其通过在多种测定中评价植物以检测增强的性状来进行，所述增强的性状例如增加的水利用效率或耐旱性、增强的高温或寒冷耐受性、增加的产量或产量构成成分、合乎需要的构型、最佳生命周期、增加的氮利用效率、增强的种子组成(如增强的种子蛋白和增强的种子油)。

这些测定可采取多种形式，包括但不限于在温室或田间试验中直接筛选性状，或通过筛选替代性状来进行。此类分析可用于检测植物的化学组成、生物量、产量构成成分、生理性质、根构型、形态或生命周期的变化。可通过分析种子组成以及蛋白质、游离氨基酸、油、游离脂肪酸、淀粉或生育酚的含量来检测化学组成(如谷粒的营养组成)的变化。化学组成的变化也可通过分析叶片中的含量(如叶绿素或类胡萝卜素含量)来检测。可在温室或田间生长的植物上评价生物量特征的变化，并且所述变化可包括植株高度、茎直径、根和芽干重、冠层大小；以及对于玉米植物，穗长度和直径。产量构成成分的变化可通过每单位面积籽粒的总数及其单个重量来衡量。可通过评价对胁迫条件的反应，例如通过使用施加的胁迫条件(如水亏缺、氮亏缺、寒冷生长条件、病原体或昆虫侵袭或光照不足或植物密度增加)进行的测定来鉴定生理性质的变化。根构型的变化可通过根长度和分枝数来评价。可通过目测观察与朝向浓密、较高大、较厚、较窄的叶子，条纹叶，打结的性状，萎黄病，白化病，花青素产生或改变的雄穗、穗或根的变化相比看起来转化的植物似乎是正常植物的趋势来衡量形态的变化。形态的变化也可利用基于形状参数的形态测定分析，使用诸如穗直径、穗长、籽粒行数、节间长度、植株高度或茎体积的尺寸测量值来进行衡量。生命周期的变化可通过划分为各发育阶段的宏观或微观形态变化(如花粉散落天数、吐丝期(days tosilking)、叶片延伸速率)来衡量。其他选择和测试性质包括花粉散落天数、吐丝期、叶片延伸速率、叶绿素含量、叶片温度、林分、幼苗生长势、节间长度、植株高度、叶片数、叶片面积、分蘖、支柱根、保绿性或延迟的衰老、茎杆倒伏、根倒伏、植物健康、贫瘠/多产、绿裂(greensnap)和害虫抗性。另外，可评价收获的谷粒的表型特征，包括穗上每行的籽粒数、穗上的籽粒行数、籽粒败育、籽粒重量、籽粒大小、籽粒密度和物理谷粒品质。

用于筛选所需性状的测定是本领域技术人员容易设计的。下面举例说明了使用杂交玉米植物的玉米性状筛选测定。所述测定可适于筛选作为杂交系或自交系的其他植物，如卡诺拉、小麦、棉花和大豆。

可通过在与对照植物相比相同且足够的氮供应量下在田间筛选转基因植物来鉴定具有增加的氮利用效率的转基因玉米植物，其中此类植物与对照植物相比提供更高的产量。还可通过在与对照植物相比减少的氮供应量下在田间筛选转基因植物来鉴定具有增加的氮利用效率的转基因玉米植物，其中此类植物与对照植物相比提供相同或类似的产量。

可通过在多个位置使用转基因植物的子代进行数年的筛选来鉴定具有增加的产量的转基因玉米植物，其中让植物生长在最佳生产管理实践以及最大杂草和害虫控制或标准农艺实践(SAP)下。选择方法可在一个或多个种植季节(例如至少两个种植季节)在多个不同地理位置(例如最多16个或更多位置)中应用，以从统计学上将产量增加与自然环境影响区分开。

可通过在将水截留一段时间以诱导胁迫，然后浇水以使植物恢复活力的测定中筛选植物，来鉴定具有增加的水利用效率或耐旱性的转基因玉米植物。例如，选择过程在11天的初始无胁迫生长期后的15天的总时间段内对植物施加3次干旱/再浇水周期。每个周期由5天组成，前四天不施加水，并且在周期的第5天进行水淬。通过选择方法分析的主要表型可以是植物生长速率的变化，如通过植物干旱处理期间的高度和生物量所确定。

尽管本公开的植物细胞和方法可应用于任何植物细胞、植物、种子或花粉，例如任何水果、蔬菜、草、树或观赏植物，但是本公开的各个方面应用于玉米、大豆、棉花、卡诺拉、水稻、大麦、燕麦、小麦、草皮草、苜蓿、甜菜、向日葵、藜麦和甘蔗植物。

实施例

实施例1.玉米转化

此实施例举例说明用于产生转基因玉米植物细胞、种子和植物的转化方法，所述转基因玉米植物细胞、种子和植物具有如表5-7中所示的改变的表型，以及如表9、10、12和13中所示的增强的性状、增加的水利用效率、增加的氮利用效率，以及增加的产量和改变的性状和物候学(phenology)。

对于土壤杆菌介导的玉米胚细胞的转化，收获来自玉米植株的穗，并通过将穗喷洒或浸泡在乙醇中进行表面灭菌，然后空气干燥。从经过表面消毒的穗的单个籽粒中分离出胚芽。在切除后，在玉蜀黍胚芽中接种包含具有目标基因盒和植物可选择标记物盒的质粒DNA的土壤杆菌细胞，且然后将该玉蜀黍胚芽与土壤杆菌一起共培养数天。将共培养的胚芽转移至各种选择和再生培养基中，并在选择开始后的6至8周回收转化的R0植株，然后将其移植到盆栽土中。使再生的R0植株自交，并获取R1和随后的子代。

可重复上述过程，以从用表2中标识的重组DNA构建体转化的细胞产生转基因玉米植株的多个事件。如表5-7以及9、10、12和13所示，针对插入基因的存在和单拷贝以及各种改变或增强的性状和表型，如增加的水利用效率、增加的产量和增加的氮利用效率对转化的植物的子代转基因植株和种子进行筛选。从具有来自表2的特定重组DNA的转基因植物的多个事件的每组中，鉴定出表现出增加的产量、增加的水利用效率、增加的耐旱性、增加的氮利用效率以及改变的表型和性状的一个或多个事件。

实施例2.大豆转化

此实施例举例说明在产生具有改变的表型或增强的性状(如增加的氮利用效率、增加的水利用效率、增加的耐旱性和如表13所示的增加的产量)的转基因大豆植物细胞、种子和植物中的植物转化。

对于土壤杆菌介导的转化，让大豆种子吸涨过夜，并切下分生组织外植体。从种子吸涨开始起不迟于14小时，将大豆外植体与诱导的土壤杆菌细胞混合在一起，所述诱导的土壤杆菌细胞包含具有目标基因盒和植物可选择标记物盒的质粒DNA；并使用超声处理对该大豆外植体进行伤害。在伤害后，将外植体置于共培养物中2-5天，此时将它们转移到选择培养基中，以允许转基因芽的选择和生长。在大约6-8周内收获抗性芽，并将其放入选择性生根培养基中2-3周。将产生根的芽转移到温室中并盆栽在土壤中。将在选择时仍保持健康但不产生根的芽转移至非选择性生根培养基中另外两周。针对植物可选择标记物的表达对来自选择结束后(off selection)产生根的任何芽的根进行测试，然后将它们转移至温室并盆栽到土壤中。

可重复上述过程，以从用具有表2中标识的构建体的重组DNA转化的细胞产生转基因大豆植株的多个事件。针对插入基因的存在和单拷贝对转化的植物的子代转基因植株和种子进行筛选，并且针对如表11、12和13所示的各种改变或增强的表型和性状进行测试。

实施例3.自动化温室中改变的表型的鉴定

此实施例举例说明在自动化温室(AGH)中针对改变的表型对转基因玉米植物进行的筛选和鉴定。例如，美国专利公布号2011/0135161中公开了用于植物的自动化表型筛选的设备和方法，所述专利以引用的方式整体并入本文。

在AGH中在不同条件下(包括无胁迫、氮亏缺和水亏缺胁迫条件)的三个筛选中对玉米植物进行了测试。在0-5天的发芽阶段，所有筛选都从无胁迫条件开始，然后在表4所示的筛选特定条件下使植物生长22天。

表4.玉米植物的三个AGH筛选的描述

水亏缺被定义为比未受胁迫的植物的VWC低的特定体积含水量(VWC)。例如，未受胁迫的植物可维持在55％VWC下，而水亏缺测定的VWC可能被限定在30％VWC左右。使用可见光和高光谱成像以及通过每天直接测量盆重和施加至各个植株的水和养分的量来收集数据。

氮亏缺被定义(部分地定义)为氮的特定mM浓度，所述浓度低于未受胁迫的植物的氮浓度。例如，未受胁迫的植物可保持在8mM氮下，而在氮亏缺测定中施加的氮浓度可保持在2mM的浓度。

每个筛选最多测量十个参数。基于可见光彩色成像的测量值为：生物量、冠层面积和植株高度。生物量(Bmass)被定义为在从多个视角获取的图像中获得的植物的芽鲜重估计值(g)。冠层面积(Cnop)被定义为在自上而下的图像中看到的叶面积(mm²)。植株高度(PlntH)是指从侧面图像(mm)得出的从盆顶部到植物最高点的距离。花青素分数和面积、叶绿素分数和浓度以及水含量分数是基于高光谱成像的参数。花青素分数(AntS)是从自顶向下的高光谱图像获得的叶冠层中花青素的估计值。花青素面积(AntA)是从侧视高光谱图像中获得的茎中花青素的估计值。叶绿素分数(ClrpS)和叶绿素浓度(ClrpC)都是从自上而下的高光谱图像获得的叶冠层中叶绿素的度量值，其中叶绿素分数以相对单位度量，并且叶绿素浓度以百万分率(ppm)单位度量。含水量分数(WtrCt)是从自顶向下的高光谱图像获得的叶冠层中水的量度。水利用效率(WUE)源自每升添加的水中植物生物量的克数。施水量(WtrAp)是直接测量为保持稳定的土壤含水量而在实验过程中添加到盆(无孔盆)中的水的量。

设置这些生理筛选运行，以便将测试的转基因品系与对照品系进行比较。使用％Δ和某些p值截止值针对对照分析收集的数据。表5、6和7是包含所公开的重组DNA构建体的转基因玉米植物的总结，所述转基因玉米植物分别在无胁迫、氮亏缺和水亏缺条件下具有改变的表型。“构建体ID”是指如表2中定义的构建体标识符。

测试结果由三个数字表示：字母“p”之前的第一个数字表示在p<0.1时测试参数增加的事件数量；字母“n”前的第二个数字表示在p<0.1时测试参数减少的事件数量；字母“t”之前的第三个数字表示在特定筛选中针对给定参数测试的转基因事件的总数。测量了与非转基因对照植物相比的增加或减少。名称“-”表示尚未测试。例如，2p1n5t表示筛选了5个转基因植物事件，其中2个事件显示测量参数增加，并且1个显示测量参数减少。

表5.在AGH非胁迫筛选中具有改变的表型的转基因植物的总结。

构建体ID

AntS

Bmass

Cnop

ClrpS

PlntH

WtrAp

WtrCt

WUE

TX7G3c3

0p0n8t

1p1n8t

0p2n8t

0p1n8t

3p2n8t

0p0n8t

表6.在AGH氮亏缺筛选中具有改变的表型的转基因植物的总结。

表7.在AGH水亏缺筛选中具有改变的表型的转基因植物的总结。

实施例4.评价转基因植物的性状特征

进行性状测定以评价与非转基因对照相比，转基因植物的性状特征和表型变化。玉米和大豆植物在田间和温室条件下生长。在某些植物发育阶段，针对玉米的物候学、形态、生物量和产量构成成分研究测量了多达18个参数。对于根测定，使大豆植物在温室中在透明营养培养基中生长，以允许对根系统成像并进行分析。

玉米发育阶段由以下发育标准定义：

发育的叶片：叶片具有可见的叶领；

V阶段：玉米植物上已发育叶片的数量与所述植物的营养生长阶段相对应-即，V6阶段的玉米植物具有6片发育(完全展开)的叶片；

R1(吐丝)：定义为R1的植物必须具有一根或多根延伸到果壳叶外侧的丝。确定作物植物处于R1或以后的繁殖阶段完全是基于初级穗的发育；

R3(乳)：根据温度和相对成熟期，通常在吐丝后18-22天发生。籽粒通常是黄色的，并且每个籽粒内部的流体是乳白色的；

R6(生理成熟期)：通常在吐丝后55-65天发生(取决于温度和所观察的种质的相对成熟期组)。此时，籽粒已达到它们的最大干物质累积，并且籽粒水分为大约35％。

大豆发育阶段按以下标准定义：

充分发育的三叶叶片节：当叶片在紧接其上方的节处已经充分展开，从而使每个小叶的两个边缘不再接触时，则认为所述叶片已完全发育。在主茎的末端节上，当小叶扁平且外观与植物上的老叶相似时，则认为叶片完全发育；

VC：子叶和单叶植物叶片已充分扩展；

R1：开始开花–即在主茎的任何节上开一朵开放的花。

表8描述性状测定。性状RefID是每个性状测定的参考ID。性状测定名称是测定的描述性名称。描述中提供了所述测定所测量的内容以及所述测量是如何进行的。阳性调用的方向指示测量数量的增加或减少是否对应于测定结果中的“阳性”调用。

表8.性状测定的描述

设置这些性状测定，以便将测试的转基因品系与对照品系进行比较。将收集的数据针对对照进行分析，并且如果p值为0.2或更小，则分配阳性。表9-12是分别针对玉米物候学和形态测定、玉米产量/性状构成成分测定、大豆物候学和形态测定、产量/性状构成成分测定以及玉米和大豆根测定对包含所公开的重组DNA构建体的转基因植物的总结。

测试结果由三个数字表示：字母“p”之前的第一个数字表示具有如表9所定义的“正”变化的事件的测试数量；字母“n”之前的第二个数字表示具有与如表8所定义的“正”方向相反的“负”变化的事件的测试数量；字母“t”之前的第三个数字表示针对给定基因的特定测定的转基因事件的测试总数。与非转基因对照植物相比，测量了“正”或“负”变化。名称“-”表示尚未测试。例如，2p1n5t表示已测试了5个转基因植物事件，其中2个事件表现出测量参数的“正”变化，并且1个事件表现出测量参数的“负”变化。如表8所示，所述测定用其性状RefID来表示。

表9.玉米物候学和形态特征性状测定的测定结果的总结。

构建体ID	P50DR1	S50DR1	KRNR6	KRLR6
					TX7G1c07	_	_	0p4n8t	0p2n8t
TX7G1c10	_	_	2p4n8t	0p2n8t
					TX7G5c1	1p0n4t	1p1n4t	_	_
TX7G3c3	6p2n10t	2p0n10t	0p8n10t	0p0n10t

表10.玉米性状构成成分测定的结果的总结。

表11.大豆物候学、形态计量学和性状构成成分测定的结果的总结。

表12.玉米和大豆根测定的结果的总结。

作物	构建体ID	RTL	RBPN
				玉米	TX7G1c09	0p1n4t	0p3n4t
大豆	TX7G9c1	2p0n4t	2p0n4t

实施例5.在田间试验中针对增加的氮利用效率、增加的水利用效率和增加的产量对转基因植物的表型评价。

进行了玉米田间试验，以鉴定在氮限制条件下与非转基因对照相比可增加氮利用效率(NUE)，从而产生增加的产量表现的基因。对于表13所示的氮田间试验结果，在氮限制条件下在每个田间进行种植(60磅/英亩)，并将玉米穗重或产量与非转基因对照植物进行比较。

可进行玉米田间试验，以鉴定在水限制条件下与非转基因对照相比可增加水利用效率(WUE)，从而产生增加的产量表现的基因。可将玉米穗重量或产量与非转基因对照植物进行比较。

进行了玉米和大豆田间试验，以鉴定可在标准农艺实践下增加大田产量(BAY)的基因。在表13中给出在标准农艺学实践下进行的大田产量试验的结果，并将玉米或大豆的产量与非转基因对照植物进行了比较。

表13给出产生与对照植物相比具有增加的氮利用效率(NUE)和/或增加的大田产量(BAY)的转基因植物的基因的列表。包括具有至少一个在p≤0.2时在多个位置表现出显著的产量或穗重增加的事件的构建体中的多核苷酸序列。除非在“特定表达模式”栏中另有注释，否则该基因是用组成型启动子表达的。基于对基因功能的理解，或基于当用组成型启动子表达基因时观察到的缺乏显著的产量增加的情况，选择特定表达模式的启动子而不是组成型启动子。表13的要素描述如下：“作物”是指试验作物，其是玉米或大豆；“条件”是指田间试验的类型，其对于标准农艺实践(SAP)下的大田产量试验是BAY，而对于氮利用效率试验是NUE。“构建体ID”是指如表2所定义的构建体标识符；“基因ID”是指如表1所定义的基因标识符；“产量结果”是指具有至少一个在p≤0.2时在各个位置表现出显著产量增加的事件的构建体中的重组DNA。第一个数字是指产量或穗重显著增加的事件的测试数量，而第二个数字是构建体中每种重组DNA的事件的测试总数。通常为每个构建体测试4至8个不同的事件。

表13.在蛋白质编码转基因存在的情况下的产量和氮利用效率。

实施例6.同源物鉴定

此实施例举例说明了由表1中标识的DNA序列编码的蛋白质的同源物的鉴定，所述同源物用于提供具有增强的农艺性状的转基因种子和植物。从同源物蛋白质的序列中，可鉴定出相应的同源DNA序列，以制备具有增强的农艺性状的另外的转基因种子和植物。

使用专有序列数据库和美国国家生物技术信息中心(NCBI)非冗余氨基酸数据库(nr.aa)，由已知蛋白质序列构建“全蛋白质数据库(All Protein Database)”。对于本文提供的多核苷酸序列获自于的每种生物体，由所述生物体的已知蛋白序列构建“生物体蛋白质数据库(Organism Protein Database)”；它是所述生物体的基于NCBI分类学ID的全蛋白质数据库的子集。

使用表1中提供的氨基酸序列，使用NCBI“blastp”程序(E值截止值为1e-8)查询全蛋白质数据库。保留了多达1000个最高命中物，并将它们按生物体名称分隔。对于除查询序列的生物体以外的每种生物体，都会为来自查询生物体本身的命中物保留一个列表，其E值比所述生物体的最佳命中物更显著。所述列表含有文提供的多核苷酸的可能重复的基因，并且被称为核心列表。保留了来自每种生物体的所有命中物的另一个列表，该列表按E值排序，并且称为“命中物列表”。

使用表1中提供的多肽序列，使用NCBI“blastp”程序(E值截止值为1e-4)查询生物体蛋白质数据库。保留了多达1000个最高命中物。基于这些命中物构建了BLAST可搜索数据库，该数据库被称为“SubDB”。使用NCBI“blastp”程序(E值截止值为1e-8)用命中物列表中的每个序列查询SubDB。将具有最佳E值的命中物与来自相应生物体的核心列表进行比较。如果命中物属于核心列表，则认为所述命中物是可能的直系同源物，否则则认为它不是可能的直系同源物，并且在命中物列表中没有针对同一生物体的序列的进一步搜索。下表14和15中报告了在表1中提供的多肽序列的95％的长度上具有至少95％的同一性的同源物。

表14给出同源物基因的列表，其要素描述如下：“PEP SEQ ID NO.”标识氨基酸序列。“同源物ID”是指字母数字标识符，其数字部分是NCBI Genbank GI号；并且“基因名称和描述”是基因的通用名称和功能描述。表15描述表1中的蛋白质编码基因与其同源物之间的对应关系，以及所述基因与其同源物之间的蛋白质序列比对的水平。

表14.同源基因信息

表15.基因和同源物的对应

实施例7.使用定点整合来引入转基因或调节植物中的内源性基因的表达。

如上所介绍的，可将包含一个或多个转基因、一个或多个表达盒等的DNA序列，如表1、2和15中标识的基因的一个或多个编码序列或其同源物经由定点整合插入或整合到植物或植物细胞的基因组内的特定位点或基因座中。因此，本公开的重组DNA构建体和分子可包含供体模板，所述供体模板具有包含至少一种转基因、表达盒或其他DNA序列的插入序列，以用于插入到植物或植物细胞的基因组中。此种用于定点整合的供体模板还可包含侧接插入序列的一个或两个同源臂，以促进插入序列在所需位点或基因座处的插入。可选择植物的基因组内的任何位点或基因座，以用于插入序列的定点整合。用于定点整合的若干方法在本领域中是已知的，这些方法涉及切割基因组DNA以在所需的基因组位点或基因座处产生双链断裂(DSB)或切口的不同的蛋白质(或蛋白质复合物和/或指导RNA)。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程化的或天然的大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶和RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)。对于使用RNA指导的位点特异性核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)的方法，所述一个或多个重组DNA构建体还将包含编码一个或多个指导RNA以将核酸酶引导至植物基因组内的所需位点的序列。本公开的重组DNA分子或构建体还可包含编码位点特异性核酸酶、指导RNA和/或任何一个或多个相关蛋白质的一个或多个表达盒，以进行所需的定点整合事件。

可选择与表1和14中标识的基因相对应的植物或植物细胞的内源基因组基因座或其同源物，以用于位点特异性插入能够调节相应内源性基因的表达的重组DNA分子或序列。如上所述，重组DNA分子或序列用作供体模板，以用于将插入序列整合到植物基因组中。供体模板还可具有侧接插入序列的一个或两个同源臂，以促进靶向性插入事件。尽管可经由定点整合将转基因、表达盒或其他DNA序列插入到植物基因组的所需基因座或位点中，但也可替代地使用供体模板来置换、插入或修饰内源性基因的5'非翻译区(UTR)、上游序列、启动子、增强子、内含子、3'UTR和/或终止子区域，或其任何部分，以调节内源性基因的表达水平。用于修饰内源性基因的表达的另一种方法是通过内源性基因座的基因组编辑进行。例如，可进行靶向性基因组编辑事件以破坏或废除内源性基因的转录阻遏物的调控结合位点，以增加或修饰内源性基因的表达。

对于基因组编辑或供体模板的插入序列的位点特异性整合，在选定的基因组基因座处制造双链断裂(DSB)或切口。该DSB或切口可使用位点特异性核酸酶制造，所述核酸酶例如锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶，或RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)。在供体模板存在下，该DSB或切口可通过在供体模板的同源臂与植物基因组之间的同源重组来修复，该同源重组导致插入序列的定点整合从而在DSB或切口的位点处进行靶向性基因组修饰或插入。为了使本文所示的基因在植物中引起或产生所需的表型或性状，可如上所讨论的那样经由定点整合将包含与植物可表达启动子可操作地连接的基因的编码序列的表达构建体或转基因插入在植物基因组内的所需或选定位置中。替代地，可经由基因组编辑或定点整合来修饰如在内源性基因的调控区内的相应内源性基因的序列，以增加或改变内源性基因的表达水平，如通过添加启动子或内含子序列，或通过修饰或置换内源性基因的5'UTR序列、启动子、增强子、转录因子或阻遏物结合位点、内含子、3'UTR序列和/或终止子区域或其任何部分来进行。

在用一个或多个重组分子或一个或多个构建体转化植物细胞后，针对供体模板插入序列的定点插入或基因组修饰筛选所得事件。然后可针对内源性基因的调节、整合的转基因的表达和/或产量性状或其他表型的修饰对含有这些确认的编辑、事件或插入的植物进行测试。

Claims

1.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：

a)多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:1-9组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:10-18和30-39组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体还包含在植物细胞中具有功能性并与所述多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子。

3.一种载体或质粒，所述载体或质粒包含如权利要求1所述的重组DNA构建体。

4.一种植物，所述植物包含如权利要求1所述的重组DNA构建体。

5.如权利要求4所述的植物，其中所述植物是田间作物。

6.如权利要求5所述的植物，其中所述田间作物植物选自由以下组成的组：玉米、大豆、棉花、卡诺拉、水稻、大麦、燕麦、小麦、草皮草、苜蓿、甜菜、向日葵、藜麦以及甘蔗。

7.如权利要求4所述的植物，其中所述植物与对照植物相比具有改变的表型或增强的性状。

8.如权利要求7所述的植物，其中所述增强的性状选自由以下组成的组：与对照植物相比，从种植到成熟的天数减少、茎杆大小增加、叶片数量增加、营养阶段的植株高度生长速率增加、穗大小增加、每植株的穗干重增加、每个穗的籽粒数量增加、每个籽粒的重量增加、每个植株的籽粒数量增加、穗空减少、谷粒灌浆期延长、植株高度降低、根分枝数量增加、总根长增加、产量增加、氮利用效率增加以及水利用效率增加。

9.如权利要求7所述的植物，其中所述改变的表型选自由以下组成的组：植株高度、生物量、冠层面积、花青素含量、叶绿素含量、施水量、水含量和水利用效率。

10.一种植物部分或繁殖体，所述植物部分或繁殖体包含如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述植物部分或繁殖体选自由以下组成的组：细胞、花粉、胚珠、花、胚芽、叶、根、茎、芽、分生组织、谷粒以及种子。

11.一种用于改变植物的表型、增强植物的性状、增加植物的产量、增加植物的氮利用效率或增加植物的水利用效率的方法，所述方法包括产生包含如权利要求1所述的重组DNA构建体的转基因植物。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述重组DNA构建体还包含在植物细胞中具有功能性并与所述重组DNA构建体的多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述转基因植物通过如下方式来产生：用所述重组DNA构建体转化植物细胞或组织，以及使所述转基因植物从包含所述重组DNA构建体的所述植物细胞或组织再生或发育出来。

14.如权利要求11所述的方法，所述方法还包括：

通过将所述转基因植物与以下杂交来产生包含所述重组DNA构建体的子代植物：

a)本身；

b)来自同一株系的第二植物；

c)野生型植物；或

d)来自不同株系的第二植物，

以产生种子，使所述种子生长以产生子代植物；以及

选择与对照植物相比，具有增加的产量、增加的氮利用效率或增加的水利用效率的子代植物。

15.如权利要求11所述的方法，其中所述转基因植物通过如下方式产生：使用包含所述重组DNA构建体的供体模板将所述重组DNA构建体定点整合到植物细胞或组织的基因组中，以及使所述转基因植物从包含所述重组DNA构建体的所述植物细胞或组织再生或发育出来。

16.一种通过如权利要求11所述的方法产生的植物。

17.一种在定点整合中用作供体模板的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子包含插入序列，所述插入序列包含：

18.如权利要求17所述的重组DNA分子，其中所述插入序列还包含在植物细胞中具有功能性并与所述多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子。

19.如权利要求17所述的重组DNA分子，所述重组DNA分子还包含侧接所述插入序列的至少一个同源臂。

20.如权利要求17所述的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子还包含至少一种编码位点特异性核酸酶的盒，其中所述位点特异性核酸酶选自包括以下的组：锌指核酸酶、工程化或天然的大范围核酸酶、TALE核酸内切酶或RNA指导的核酸内切酶。

21.如权利要求17所述的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子还包含至少一种编码一种或多种指导RNA的盒。

22.一种在定点整合中用作供体模板的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子包含用于调节内源性基因的表达的插入序列，其中所述内源性基因包含：

a)编码mRNA分子的多核苷酸序列，所述mRNA分子与选自由SEQ ID NO:1-9组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；或

b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有与选自由SEQ ID NO:10-18和30-39组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

23.如权利要求22所述的重组DNA构建体，其中所述插入序列包含启动子、增强子、内含子或终止子区域。

24.如权利要求22所述的重组DNA构建体，其中所述重组DNA分子还包含至少一种编码位点特异性核酸酶的盒，其中所述位点特异性核酸酶选自包括以下的组：锌指核酸酶、工程化或天然的大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶或RNA指导的核酸内切酶。

25.如权利要求22所述的重组DNA构建体，其中所述重组DNA分子还包含至少一种编码一种或多种指导RNA的盒。

26.一种用于改变植物的表型、增强植物的性状、增加植物的产量、增加植物的氮利用效率或增加植物的水利用效率的方法，所述方法包括：

a)通过以下步骤修饰植物细胞的基因组：

i)鉴定所述植物的对应于选自表1和表14中的基因列表的基因的内源性基因及其同源物，以及

(ii)经由基因组编辑或定点整合修饰所述植物细胞中的内源性基因的序列以修饰所述内源性基因的表达水平；以及

b)使植物从所述植物细胞再生或发育出来。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述修饰步骤包括经由基因组编辑修饰所述内源性基因的调控或上游序列。