CN116355926A - 一种金柑蔗糖生物合成关键酶基因FcSPP克隆和异源表达方法 - Google Patents

一种金柑蔗糖生物合成关键酶基因FcSPP克隆和异源表达方法 Download PDF

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CN116355926A CN202310220286.3A CN202310220286A CN116355926A CN 116355926 A CN116355926 A CN 116355926A CN 202310220286 A CN202310220286 A CN 202310220286A CN 116355926 A CN116355926 A CN 116355926A
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Abstract

本发明提供了一种金柑蔗糖生物合成关键酶SPP基因克隆和异源表达方法，涉及分子生物技术领域。本发明从脆蜜金柑转录组测序数据筛选的Unigene设计CDS序列扩增引物，以RNA反转录的cDNA为模板，经PCR扩增、产物回收、测序分析获得FcSPP基因的CDS序列。根据所述CDS序列设计RACE扩增引物，经过RACE扩增得到5’末端和3’末端cDNA序列，而后将上述各片段拼接获得cDNA全长序列。本发明还利用原核表达的方式诱导表达并获得FcSPP基因CDS编码的纯化蛋白；利用获得FcSPP基因全长cDNA序列设计可用于检测该基因在果实发育不同时期表达量情况的实时定量PCR引物。

Description

一种金柑蔗糖生物合成关键酶基因FcSPP克隆和异源表达 方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种金柑蔗糖生物合成关键酶基因FcSPP克隆和异源表达方法。
背景技术
蔗糖是植物体内的能量载体，是植物生长、发育过程中的重要化合物之一，大部分光合产物均以蔗糖的形式供应和运输。此外，蔗糖在植物体内还具有重要的代谢调控作用，如调节植物内转运蛋白或相关酶活性，作为信号因子诱导或阻断某些基因的表达，调控植物花的诱导、组织分化、种子发育等过程。高等植物中蔗糖的生物合成由两步反应组成：首先由蔗糖磷酸合成酶(SPS)催化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖形成蔗糖-6-磷酸，而后由磷酸蔗糖磷酸酶(SPP)进一步水解蔗糖-6-磷酸形成蔗糖，磷酸蔗糖磷酸酶(SPP)既是催化是蔗糖生物合成的最后一步反应，也是光合碳同化途径中最后一个酶，该过程是不可逆转的催化反应。
金柑(Fortunella crassifiolia Swingle)是带皮食用型的柑橘类果树，其光合产物经过一系列糖代谢反应最终以蔗糖、葡萄糖和果糖等可溶性糖形式分散于果实不同部位，形成果实的风味品质。金柑果实的糖类物质含量是衡量其品质高低的重要指标，果肉中蔗糖、葡萄糖和果糖比例通常为2:1:1，蔗糖是主要的可溶性糖。蔗糖代谢早期研究仅将SPS确定为蔗糖合成途径的主要调节点，近年来的拟南芥、水稻、玉米等模式植物蔗糖代谢机理中的SPP基因结构和功能的研究表明，SPP参与了调控蔗糖合成，可作为蔗糖生物合成途径中的关键酶。发掘和鉴定果树中SPP基因的结构和功能，有助于进一步探明果树中蔗糖生物合成的分子机理，为后期开展分子植物育种，培育果实高糖新品种提供有利的目的基因。获取目前，金柑等果树中的磷酸蔗糖磷酸酶(SPP)相关研究较少，亦尚未见金柑SPP基因的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金柑蔗糖生物合成关键酶基因FcSPP克隆和异源表达方法，克隆金柑SPP基因的CDS和cDNA全长序列并构建异源表达载体，筛选可用的实时定量PCR引物，为后期开展该基因的功能验证、基因编辑等研究提供目标序列。
本发明提供了一种金柑FcSPP基因，其所述金柑FcSPP基因的CDS序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明还提供了一组扩增上述金柑FcSPP基因的CDS序列的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID No.4所示的上游引物FcSPP-5CDS和序列如SEQ ID No.5所示的下游引物FcSPP-3CDS。
本发明还提供了上述金柑FcSPP基因的CDS序列的扩增方法，包括以下步骤：以金柑总RNA反转录的cDNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增，扩增产物为所述CDS序列；
所述PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s，54℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min，4℃保温。
优选的，所述PCR扩增的体系为：2×Taq PCR MasterMix 10μl、引物FcSPP-5CDS 1μl、引物FcSPP-3CDS 1μl、反转录cDNA模板1μl和RNase-free ddH2O 16μl。
本发明还提供了一种金柑FcSPP基因，所述金柑FcSPP基因的cDNA全长序列如SEQID No.2所示。
本发明还提供了一组扩增上述金柑FcSPP基因的cDNA序列的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID No.10所示的上游引物FcSPP-5UTR和序列如SEQ ID No.11所示的下游引物FcSPP-3UTR。
本发明还提供了上述金柑FcSPP基因的cDNA序列的扩增方法，包括以下步骤：以金柑总RNA反转录的cDNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增；
所述PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s，54℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保温。
优选的，所述PCR扩增的体系为：
Figure BDA0004116320910000021
High Fidelity(HiFi)PCRSuperMix 10μl、FcSPP-5UTR引物1μl、FcSPP-3UTR 1μl、cDNA模板1μl和RNase-free ddH2O7μl。
本发明还提供了基于上述金柑FcSPP基因的cDNA的UTR区域设计的RACE引物组，包括序列如SEQ ID No.6所示的第一轮5’UTR区RACE扩增特异引物FcSPP-5GSP1和SEQ IDNo.7所示的第一轮3’UTR区RACE扩增特异引物FcSPP-3GSP1，以及SEQ ID No.8所示的第二轮5’UTR区RACE扩增特异引物FcSPP-5GSP2和SEQ ID No.9所示的第二轮3’UTR区RACE扩增特异引物FcSPP-3GSP2。
本发明还提供了一组测定上述金柑FcSPP基因表达量的特异性引物对，包括序列如SEQ ID No.14所示的上游引物FcSPP-F2和序列如SEQ ID No.15所示的下游引物FcSPP-R2。
优选的，利用荧光定量PCR扩增法测定所述金柑FcSPP基因表达量，程序包括：扩增曲线95℃5min，95℃10s、60℃30s、40个循环，72℃单点检测信号；溶解曲线95℃15s、60℃60s、95℃15s，连续检测信号。
优选的，所述荧光定量PCR扩增法的体系为：2×SYBR Premix Ex Taq 10μl、FcSPP-F2引物1μl、FcSPP-R2 1μl、cDNA模板2μl和RNase-free ddH2O 15μl。
本发明还提供了上述金柑FcSPP基因的CDS序列或上述引物对在金柑FcSPP基因异源表达中的应用。
本发明还提供了上述金柑FcSPP基因或上述特异性引物对在金柑蔗糖生物合成机理研究中的应用。
有益效果：本发明提供了一种金柑蔗糖生物合成关键酶基因FcSPP，基于前期转录组数据筛选的Unigene(sjg218640)设计CDS序列扩增引物，以RNA反转录的cDNA为模板，经PCR扩增、产物回收、测序分析获得FcSPP基因的CDS序列。。根据所述CDS序列设计RACE扩增引物，经过第一轮和第二轮RACE扩增得到FcSPP基因cDNA的5’UTR和3’UTR区域序列，而后将上述得到的各片段进行拼接获得FcSPP基因的cDNA全长序列，再依据拼接获得的全长序列，在两端UTR序列区域内设计引物FcSPP-5UTR和FcSPP-3UTR，扩增获得FcSPP基因cDNA片段。扩增产物切胶回收后进行测序，测序结果进行ORF分析，并与拼接获得的FcSPP基因cDNA全长序列进行比对，鉴定所获得的FcSPP基因cDNA全长序列。本发明还以FcSPP基因CDS为目标序列，构建了异源表达载体pCZN1-FcSPP，诱导表达获得FcSPP基因CDS编码的纯化蛋白，为后期开展该基因的功能验证、基因编辑等研究提供目标序列；利用获得的FcSPP基因设计和筛选可用于检测该基因时空表达情况的实时荧光定量PCR引物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为金柑FcSPP基因的PCR扩增结果图，图中M为DL2000 DNA Marker；A为金柑FcSPP基因CDS序列扩增产物；B为金柑FcSPP基因的RACE扩增产物，1为5’-RACE扩增产物，2为3’-RACE扩增产物；C为金柑FcSPP基因的cDNA全长序列扩增产物；
图2为金柑FcSPP基因CDS序列阳性克隆菌株PCR鉴定结果；
图3位金柑FcSPP基因cDNA序列5’UTR区域阳性克隆菌株的PCR鉴定结果；
图4为金柑FcSPP基因cDNA序列3’UTR区域阳性克隆菌株的PCR鉴定结果；
图5为金柑FcSPP基因包含CDS、5’UTR和3’UTR区域的cDNA片段阳性克隆菌株的PCR鉴定结果；
图6为金柑FcSPP蛋白的二级结构图，图中蓝色：α-螺旋(Alpha helix)，绿色：β-折叠(Beta turn)，黄色：无规则卷曲(Random coil)，红色：延伸链(Extended strand)；
图7为金柑FcSPP蛋白的三级结构预测图；
图8为不同物种来源的SPP基因编码氨基酸序列比对分析结果图，图中At为拟南芥(Arabidopsis thaliana)学名缩写，Md为苹果(Malus domestica)，Fc为金柑(Fortunellacrassifiolia Swingle)，Nt为烟草(Nicotiana tabacum)，Zm为玉米(Zeamays)，Os为水稻(Oryza sativa)；
图9为诱导表达的金柑FcSPP蛋白SDS-PAGE图，图中M为蛋白质分子质量标准(14.4～116KD)；1为空载的pCZN1诱导表达的菌液；2为重组质粒pCZN1-FcSPP未诱导表达的菌液；3为重组质粒pCZN1-FcSPP诱导表达后的菌液；4为重组质粒pCZN1-FcSPP诱导表达后菌体破碎收集的上清液；5为重组质粒pCZN1-FcSPP诱导表达后菌体破碎收集的沉淀；
图10为金柑FcSPP蛋白纯化后的SDS-PAGE图，图中M为蛋白质分子质量标准(14.4～116KD)；1重组质粒pCZN1-FcSPP诱导表达后制备的包涵体溶液；2为包涵体溶液过亲和层析柱流出的溶液；3为第1遍洗脱的上清液；4为第2遍洗脱的上清液；
图11为金柑FcSPP蛋白的分子质量检测结果图，图中M为蛋白质分子质量标准(14.4～116KD)；1为0.5mg/mLBSA标准品；2为金柑FcSPP纯化蛋白样品；
图12为FcSPP基因在脆蜜金柑果实发育不同时期的果肉组织中相对表达量结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种金柑FcSPP基因，所述金柑FcSPP基因的CDS序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供一组扩增上述金柑FcSPP基因CDS序列的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID No.4所示的上游引物FcSPP-5CDS和序列如SEQ ID No.5所示的下游引物FcSPP-3CDS。
在本发明中，FcSPP-5CDS的序列为ATGGATCGACTTAGTGCTGCT，FcSPP-3CDS的序列为TTATATTACCTTTATTCTTACGATGATG。
本发明还提供了上述金柑FcSPP基因的CDS序列的扩增方法，包括以下步骤：以金柑总RNA反转录的cDNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增，扩增产物为所述CDS序列；
所述PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s，54℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min，4℃保温。
本发明所述PCR扩增的体系为：2×Taq PCR MasterMix 10μl、引物FcSPP-5CDS 1μl、引物FcSPP-3CDS 1μl、反转录cDNA模板1μl和RNase-free ddH2O 16μl。
本发明所述金柑FcSPP基因的cDNA全长序列优选如SEQ ID No.2所示，且其CDS序列编码的氨基酸序列优选如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了一组扩增上述金柑FcSPP基因cDNA的引物对，所述引物对包括序列如SEQ ID No.10所示的上游引物FcSPP-5UTR和序列如SEQ ID No.11所示的下游引物FcSPP-3UTR。
在本发明中，FcSPP-5UTR的序列为GGACTGAAACCTTGGCTTACGC，FcSPP-3UTR的序列为TCATTGTTCAAGACGACGATCATAA。
本发明还提供了上述金柑FcSPP基因cDNA序列的扩增方法，包括以下步骤：以金柑总RNA反转录的cDNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增；
所述PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s、54℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保温。
本发明所述PCR扩增的体系
Figure BDA0004116320910000051
High Fidelity(HiFi)PCRSuperMix 10μl、FcSPP-5UTR引物1μl、FcSPP-3UTR 10μl、cDNA模板1μl和RNase-free ddH2O 7μl。
本发明还提供了本发明还提供了基于上述金柑FcSPP基因的cDNA的UTR区域设计的RACE引物组，包括序列如SEQ ID No.6所示的第一轮5’UTR区RACE扩增特异引物FcSPP-5GSP1和SEQ ID No.7所示的第一轮3’UTR区RACE扩增特异引物FcSPP-3GSP1，以及SEQ IDNo.8所示的第二轮5’UTR区RACE扩增特异引物FcSPP-5GSP2和SEQ ID No.9所示的第二轮3’UTR区RACE扩增特异引物FcSPP-3GSP2。
在本发明中，FcSPP-5GSP1的序列为GAATCACGACGATAATGAGCTTCCCACA，FcSPP-3GSP1的序列为GTGGGAGTTATCTGGTGAGGAGAGGGCA；FcSPP-5GSP2序列为CCCACAATGCATTAAACCTAAGCAGTGA，FcSPP-3GSP2序列为GGTGAGGAGAGGGCATGTTCAATTGTCTC。
本发明还提供了一组测定上述金柑FcSPP基因表达量的特异性引物对，包括序列如SEQ ID No.14所示的上游引物FcSPP-F2和序列如SEQ ID No.15所示的下游引物FcSPP-R2。
在本发明中，所述定量检测引物对的信息如下所示：
FcSPP-F2(SEQ ID No.14)CAAGGTGCTGGCAAGGGAC
FcSPP-R2(SEQ ID No.15)TCTTCTTGGGCATTGCTAACC
本发明利用荧光定量PCR扩增法测定所述金柑FcSPP基因表达量，程序包括：扩增曲线95℃5min，95℃10s、60℃30s、40个循环，72℃单点检测信号；溶解曲线95℃15s、60℃60s、95℃15s，连续检测信号。
本发明所述荧光定量PCR扩增法的体系，优选为：2×SYBRPremix Ex Taq 10μl、FcSPP-F2引物1μl、FcSPP-R21μl、cDNA模板2μl和RNase-free ddH2O 15μl。
本发明还提供了上述金柑FcSPP基因的CDS序列或上述引物对在金柑FcSPP基因异源表达中的应用。
本发明还提供了上述金柑FcSPP基因或上述特异性引物对在金柑蔗糖生物合成机理研究中的应用。
在本发明中，磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)在果树发育不同时期，其基因表达量存在较大差异，FcSPP基因相对表达量随着果实发育呈逐步升高趋势，果实的成熟期(DAF180)、膨大期(DAF120)的基因表达量显著高于果实初果期(DAF15)和生长期(DAF60)，说明FcSPP基因在脆蜜金柑果实发育后期，参与调控其他碳水化合物向蔗糖转化的代谢过程。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种金柑蔗糖生物合成关键酶基因FcSPP克隆和异源表达方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、材料与方法
1.1试验材料本研究供试材料均取自广西壮族自治区亚热带作物研究所亚非鲜食加工兼用型热区水果资源圃，供试品种为四倍体脆蜜金柑(审定号：桂审果2014003号)，三年生嫁接苗，砧木为枳壳。
根据金柑果实发育特点，自谢花后15d(DAF15)、60d(DAF60)、120d(DAF120)和180d(DAF180)分别采集不同发育时期的金柑果实，每个时期采集20个果实。采集后样品立即运回实验室，除DAF15样品果实较小，无法分离果肉和果皮外，其他样品均去除果皮、种子保留果肉样品，所有样品经液氮速冻，液氮下研磨分装后，-80℃超低温冰箱保存，用于脆蜜金柑FcSPP基因克隆。
1.2主要试剂Vazyme HiScript-TS 5’/3’RACE Kit、HiScript III 1st StrandcDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)、2×Taq PCR MasterMix、
Figure BDA0004116320910000071
HighFidelity(HiFi)PCR SuperMix购自南京诺唯赞生物技术有限公司；PMDTM19-T VectorCloning Kit、RNA提取试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自TAKARA；实时荧光定量PCR试剂SYBR Green master购自德国Roche公司；pCZN-1质粒+ArcticExpress(DE3)感受态细胞购自南京钟鼎生物技术有限公司。
1.3主要仪器设备高速冷冻离心机(Mikro220R)、电子分析天平(BCE323-1CCN)、摇床(精骐IS-RSD3)、PCR仪(Biometra TOne 96G)、凝胶成像系统(FIREREADER V10)、实时荧光定量PCR(LightCycler480Ⅱ)。
2、试验方法
2.1基因组RNA提取和逆转录cDNA第一链合成
采用Trizol法提取金柑果肉样品总RNA，严格按照试剂盒操作说明进行。将提取的RNA在ND5000超微量紫外可见分光光度仪上，测定260nm和280nm的吸收值，确保抽提样品的OD260/OD280在1.8～2.0范围，并用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳检测抽提RNA的完整性和DNA污染情况，确保条带清晰。随后将符合质量的RNA进行反转录，以提取的总RNA为模板，按反转录试剂盒说明合成cDNA第一链，于-40℃保存备用。
2.2金柑FcSPP基因cDNA全长克隆
根据专利申请人前期委托深圳华大基因科技服务有限公司开展脆蜜金柑转录组测序技术服务(委托合同编号：F22FTSSCKF4155)，从获得的脆蜜金柑果肉转录组数据中，经差异表达基因分析筛选到FcSPP基因的Unigene(sjg218640)，并进行ORF预测CDS，以预测的CDS序列为模板设计扩增引物FcSPP-5CDS和FcSPP-3CDS，果肉总RNA的反转录cDNA产物为模板进行PCR扩增，扩增体系20μl：2×Taq PCR MasterMix 10μl、引物FcSPP-5CDS 1μl、引物FcSPP-3CDS 1μl、反转录cDNA模板1μl和RNase-free ddH2O 16μl；PCR程序为：95℃5min；95℃30s、54℃30s、72℃2min，30个循环；72℃10min，4℃保温。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收后连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞和筛选鉴定出阳性克隆。大肠杆菌转化和阳性克隆鉴定的方法为：离心管中加入100μl大肠杆菌感受态细胞和连接产物，轻轻混匀后冰浴30min，再经42℃金属浴60s，快速置于冰上2min，向离心管中加入890μl不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃下200r/min培养1h，吸取100ul菌液均匀涂在含Amp的蓝白斑筛选琼脂培养基上，37℃下倒置待平板吸收全部菌液，过夜培养；次日挑取白色阳性单菌落于400μl LB Amp+培养基中，37℃扩摇3h后，用M13通用引物进行PCR检测(检测结果如图2所示)，分装阳性菌液过夜扩摇后，送南京集思慧远生物科技有限公司进行测序。测序结果与筛选到的Unigene进行序列比对，确认扩增序列，重组质粒命名为pMD19T-FcSPP。。
FcSPP-5CDS(SEQ ID No.4)：ATGGATCGACTTAGTGCTGCT；
FcSPP-3CDS(SEQ ID No.5)：TTATATTACCTTTATTCTTACGATGATG。
根据扩增获得的CDS序列，按RACE试剂盒配制反应体系，分别合成5’/3’RACE-Ready cDNA。5’RACE-Ready cDNA合成反应体系20μl：先按RNA2μl、5’CDS Primer 2μl、dNTPMix 2μl和RNase-free ddH2O 7μl，配制13μl反应液，PCR仪上72℃反应3min后置于冰上2min，随后再加入5×FS Buffer 4μl、10×Enzyme Mix 2μl、5’TS Oligo 1μl，PCR仪上按42℃90min，70℃15min进行反应，产物4℃保温。3’RACE-Ready cDNA合成反应体系20μl：先按RNA2μl、5’CDS Primer 2μl、dNTPMix 2μl和RNase-free ddH2O 8μl，配制14μl反应液，PCR仪上72℃反应3min后置于冰上2min，随后再加入5×FS Buffer4μl、10×Enzyme Mix 2μl，在PCR仪按42℃90min，70℃15min进行反应，产物4℃保温。5’3’：
设计RACE扩增的5’-RACE引物FcSPP-5GSP1和3’-RACE引物FcSPP-3GSP1，分别将获得的5’/3’RACE-Ready cDNA产物按1:1体积加入Dilution Buffer进行稀释，并稀释溶液作为模板进行第一轮扩增。5’/3’RACE扩增反应体系为50μl：5’/3’RACE-Ready cDNA 2.5μl、FcSPP-5GSP1/FcSPP-3GSP1(10μM)1μl、10×Universal Primer Mix(UPM)5μl、2×PCR Mix25μl和RNase-free ddH2O 16.5μl。PCR程序均为：98℃1min；98℃10s、68℃15s、72℃3min，25个循环；72℃5min，4℃保温。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并根据试验结果设计第二轮扩增即巢式PCR(Nested PCR)引物，5’-RACE引物FcSPP-5GSP2和3’-RACE引物FcSPP-3GSP2，将第一轮RACE扩增产物按1:49ddH2O稀释后作为模板，分别扩增5’/3’RACE产物，反应体系20μl：第一轮RACE扩增产物稀释液2μl、FcSPP-5GSP2/FcSPP-3GSP2(10μM)0.4μl、Nested Primer 0.4μl、2×PCR Mix 10μl和RNase-free ddH2O 7.2μl。PCR程序均为：98℃1min；98℃10s、68℃15s、72℃3min，25个循环；72℃5min，4℃保温，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
FcSPP-5GSP1(SEQ ID No.6):GAATCACGACGATAATGAGCTTCCCACA；
FcSPP-3GSP1(SEQ ID No.7):GTGGGAGTTATCTGGTGAGGAGAGGGCA
FcSPP-5GSP2(SEQ ID No.8):CCCACAATGCATTAAACCTAAGCAGTGA
FcSPP-3GSP2(SEQ ID No.9):GGTGAGGAGAGGGCATGTTCAATTGTCTC
切胶回收产物，按试剂盒说明分别连接到pMD19-T载体上，反应体系10μl：PMD19-TVector 1μl、回收产物4μl、Solution I 2μl，经16℃反应5min后，置于冰上保存，随后进行大肠杆菌转化和阳性克隆鉴定。大肠杆菌转化和阳性克隆鉴定的方法为：离心管中加入100μl大肠杆菌感受态细胞和连接产物，轻轻混匀后冰浴30min，再经42℃金属浴60s，快速置于冰上2min，向离心管中加入890μl不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃下200r/min培养1h，吸取100ul菌液均匀涂在含Amp的蓝白斑筛选琼脂培养基上，37℃下倒置待平板吸收全部菌液，过夜培养；次日挑取白色阳性单菌落于400μl LB Amp+培养基中，37℃扩摇3h后，用M13通用引物进行PCR检测(检测结果如图3和图4所示)，分装阳性菌液过夜扩摇后，送南京集思慧远生物科技有限公司进行测序。
利用软件将上述PCR扩增获得的FcSPP基因CDS、5’末端和3’末端cDNA序列进行拼接获得FcSPP基因的cDNA全长序列，在NCBI数据库中进行ORF Finder查找开放阅读框，并在基因两端UTR区域设计引物FcSPP-5UTR和FcSPP-3UTR，以总RNA的反转录cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系20μl：
Figure BDA0004116320910000101
High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix 10μl、FcSPP-5UTR引物1μl、FcSPP-3UTR 10μl、cDNA模板1μl和RNase-free ddH2O 7μl。PCR程序为：95℃5min；95℃30s、54℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保温。扩增产物切胶回收后，连接到pMD19-T载体上，随后进行大肠杆菌转化和阳性克隆鉴定(鉴定结果如图5所示)，挑选阳性克隆菌株进行测序，测序结果进行ORF分析，并将拼接的目的基因全长序列与扩增测序序列进行比对，确定所拼接的序列是否为目的基因cDNA序列5’3’。
FcSPP-5UTR(SEQ ID No.10):GGACTGAAACCTTGGCTTACGC
FcSPP-3UTR(SEQ ID No.11):TCATTGTTCAAGACGACGATCATAA
2.3金柑FcSPP基因的生物信息学分析
使用SIB的Translate toll工具对已获得FcSPP基因的ORF区进行氨基酸序列翻译。采用ProParam在线软件进行蛋白质理化性质预测，SOPMA在线软件预测蛋白二级结构，SWISS-MODELWorkspace软件预测蛋白三级结构；从NCBI数据库中获取拟南芥、水稻等模式植物的SPP蛋白序列，借助CLUSTAL X软件和GeneDOC软件进行多重序列比对和保守序列分析，并利用NCBI上的CD-Search工具查找FcSPP基因编码蛋白的保守结构域。
2.4金柑FcSPP基因的原核表达
以获得的重组质粒pMD19T-FcSPP为模板，在FcSPP基因CDS序列的FcSPP-5CDS和FcSPP-3CDS引物上添加NdeⅠ(CATATG)和XbaⅠ(TCTAGA)酶切位点，进行PCR获得扩增产物。经电泳检测回收扩增产物，用T4 DNA连接酶将扩增产物与空pCZN-1载体连接，连接产物经16℃过夜培养转化到ArcticExpress(DE3)感受态细胞，在含有氨苄青霉素(Amp)的平板培养基上进行抗性筛选，菌液PCR扩增筛选阳性克隆，并送公司测序鉴定，鉴定正确的表达载体重命名为pCZN1-FcSPP。
挑取转化平板上测序正确的阳性克隆菌株接种到TB培养液(含50μg/mLAmp)，37℃220r/m振荡培养过夜；次日按1:100比例转接于含Amp的TB培养液，37℃220r/m振荡培养过夜；待OD600值在0.6～0.8时，吸取1mL培养液经离心、弃上清后，加入100μL上样缓冲液重悬菌体沉淀，备用；剩余培养物中加入IPTG并调整浓度至0.2mmol/L，在15℃220r/m振荡培养过夜，诱导融合蛋白表达，次日吸取1mL培养液，经离心、弃上清后，加入100μL上样缓冲液重悬菌体沉淀，备用；剩余培养液经离心、弃上清，用PBS溶液重悬菌体沉淀，重悬液随后经超声波破碎，分别吸取取上清液和沉淀液体加入上样缓冲液重悬。采用12％SDS-PAGE对上述重悬液进行电泳检测，考马斯亮蓝染色显带。
2.5金柑FcSPP蛋白制备和纯化
将最适IPTG浓度和温度条件下诱导表达后的培养菌液，经低温离心后，收集菌体沉淀加入裂解液重悬，重悬液经超声破碎、离心，收集沉淀。使用包涵体洗涤液清洗包涵体3次，并用溶解缓冲液按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜。利用低压层析系统，将包涵体溶液以0.5mL/min流流速上样至Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱，并用Ni-IDA缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液。将洗脱液装入透析袋，4℃环境经PBS溶液透析过夜获得FcSPP纯化蛋白。采用12％SDS-PAGE对上述纯化蛋白进行电泳检测，考马斯亮蓝染色显带检测纯度。
2.6实时荧光定量PCR检测
已发表的β-actin基因(Cs1g05000)为内参基因，特异性引物为：
actin-F(SEQ ID No.12)CCGACCGTATGAGCAAGGAAA；
actin-R(SEQ ID No.13)TTCCTGTGGACAATGGATGGA，
根据FcSPP基因的CDS序列设计定量表达引物
FcSPP-F2(SEQ ID No.14)CAAGGTGCTGGCAAGGGAC
FcSPP-R2(SEQ ID No.15)TCTTCTTGGGCATTGCTAACC，
采用两步法实时荧光定量PCR检测金柑FcSPP基因在果实发育不同阶段的果肉组织表达情况，扩增条件设置为：扩增曲线95℃5min，循环1次；95℃10s，60℃30s，循环40次，72℃单点检测信号；熔解曲线95℃15s，60℃60s，95℃15s，连续检测信号。采用2-ΔΔct方法计算结果，每个样品设置3个生物学重复。
3、结果与分析
3.1金柑FcSPP基因克隆结果
如图1所示，金柑FcSPP基因CDS序列的PCR产物长度约为1200bp，与预期结果基本符合。测序结果显示，该片段长度为1191bp，与转录组测序分析筛选的候选基因进行比对，确定为目的序列。利用3’-RACE引物扩增获得长度为283bp的片段(图1中B)；利用5’-RACE引物扩增获得长度为262bp的片段(图1中B)。将上述CDS序列、5’UTR序列和3’UTR序列进行拼接，获得金柑FcSPP基因cDNA全长序列1638bp(SEQ ID No.2)。在获得的cDNA全长序列两端UTR区设计引物，PCR扩增获得一条长度为1537bp的cDNA片段(图1中C)。将获得的扩增片段测序后与拼接的cDNA全长序列进行比对，结果显示该片段包含基因的ORF区域，且UTR区域与拼接的cDNA全长序列一致，表明成功获得金柑FcSPP基因cDNA全长序列。
3.2金柑FcSPP基因家族鉴定及编码蛋白序列分析
克隆的FcSPP基因CDS序列经软件翻译，编码长度为396个氨基酸的蛋白(SEQ IDNo.3)。由图6和图7所示，蛋白分子质量预测为44.54kDa，二级结构中α-螺旋和无规则卷曲所占比例较大，分别占比为38.89％和38.64％，从三级结构预测结果亦可明显看出显示这两种二级结构所占比例较大。如图8所示，经比对分析，金柑FcSPP蛋白的保守结构域与拟南芥、水稻等植物已知的SPP蛋白一致，在金柑FcSPP蛋白中含有2个保守结构域，从N端到C端分别为S6PP(8-261aa)和S6PP_C(262-394)，表明该蛋白属于植物磷酸蔗糖磷酸酶(sucrosephosphate phosphatase,SPP)家族成员。
3.3金柑FcSPP基因的原核表达与蛋白纯化
测序正确的重组质粒转化感受态细胞，挑选已诱导的单克隆在最适IPTG浓度和温度条件下进行诱导培养，表达产物经SDS-PAGE电泳检测，结果如图9～11所示，重组质粒菌的表达产物在45kDa处有明显蛋白条带，其大小与预期的重组蛋白条带大小相符合。根据SDS-PAGE和质检分析结果可知，金柑FcSPP基因编码蛋白的分子质量为45.96kDa，与理论预测的分子量相近，表明通过诱导表达、纯化，已得到符合要求的FcSPP蛋白。
3.4金柑果实发育不同时期的FcSPP基因表达
磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)在果树发育不同时期，其基因表达量存在较大差异，由图12可知，FcSPP基因相对表达量随着果实发育呈逐步升高趋势，果实的成熟期(DAF180)、膨大期(DAF120)的基因表达量显著高于果实初果期(DAF15)和生长期(DAF60)，说明FcSPP基因在脆蜜金柑果实发育后期，参与调控其他碳水化合物向蔗糖转化的代谢过程。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种金柑FcSPP基因，其特征在于，所述金柑FcSPP基因的CDS序列如SEQ ID No.1所示。
2.一组扩增权利要求1所述金柑FcSPP基因的CDS序列的引物对，其特征在于，所述引物对包括序列如SEQ ID No.4所示的上游引物FcSPP-5CDS和序列如SEQ ID No.5所示的下游引物FcSPP-3CDS。
3.权利要求1所述金柑FcSPP基因的CDS序列的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：以金柑总RNA反转录的cDNA为模板，利用权利要求2所述引物对进行PCR扩增，扩增产物为所述CDS序列；
所述PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s，54℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min，4℃保温。
4.一种金柑FcSPP基因，其特征在于，所述金柑FcSPP基因的cDNA全长序列如SEQ IDNo.2所示。
5.一组扩增权利要求4所述金柑FcSPP基因的cDNA序列的引物对，其特征在于，所述引物对包括序列如SEQ ID No.10所示的上游引物FcSPP-5UTR和序列如SEQ ID No.11所示的下游引物FcSPP-3UTR。
6.权利要求4所述金柑FcSPP基因的cDNA序列的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：以金柑总RNA反转录的cDNA为模板，利用权利要求5所述引物对进行PCR扩增；
所述PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃30s，54℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保温。
7.基于权利要求2所述金柑FcSPP基因的cDNA的UTR区域设计的RACE引物组，其特征在于，包括序列如SEQ ID No.6所示的第一轮5’UTR区RACE扩增特异引物FcSPP-5GSP1和SEQID No.7所示的第一轮3’UTR区RACE扩增特异引物FcSPP-3GSP1，以及SEQ ID No.8所示的第二轮5’UTR区RACE扩增特异引物FcSPP-5GSP2和SEQ ID No.9所示的第二轮3’UTR区RACE扩增特异引物FcSPP-3GSP2。
8.一组测定权利要求1或权利要求4所述金柑FcSPP基因表达量的特异性引物对，其特征在于，包括序列如SEQ ID No.14所示的上游引物FcSPP-F2和序列如SEQ ID No.15所示的下游引物FcSPP-R2。
9.权利要求1所述金柑FcSPP基因的CDS序列或权利要求2所述引物对在金柑FcSPP基因异源表达中的应用。
10.权利要求1所述金柑FcSPP基因或权利要求8所述特异性引物对在金柑蔗糖生物合成机理研究中的应用。
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