BR112021008331A2 - composições e métodos para edição gênica mediada por ochrobactrum - Google Patents

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Shujun Chang
Hyeon-Je Cho
Zhan-Bin Liu
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Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA EDIÇÃO GÊNICA MEDIADA POR OCHROBACTRUM. Trata-se de métodos e composições para aumentar, aprimorar ou melhorar a eficiência da edição gênica. As configurações de componentes de vetor com base em Ochrobactrum e Agrobacterium, como CRISPR Cas endonucleases e RNAs-guia, são fornecidas, as quais aprimoram a eficiência da modificação do genoma direcionado.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA EDIÇÃO GÊNICA MEDIADA POR OCHROBACTRUM CAMPO DA REVELAÇÃO
[0001] A presente revelação se refere ao campo de biologia de planta molecular, em particular, a composições e métodos para modificar o genoma de uma célula.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0002] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório nº de Série U.S. 62/753577 depositado em 31 de outubro de 2018, que é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADA ELETRONICAMENTE
[0003] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida eletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo nomeado “20190912_7789WOPCT_SequenceListingTXT”, criado 12 de setembro de 2019, e que tem um tamanho de 603 quilobytes e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida neste documento formatado em ASCII faz parte do relatório descritivo e é incorporada na sua totalidade neste documento a título de referência.
ANTECEDENTES DA REVELAÇÃO
[0004] A tecnologia de DNA recombinante tornou possível inserir sequências de DNA em locais genômicos alvo e/ou modificar sequências cromossômicas endógenas específicas. As técnicas de integração específicas de sítio, que empregam sistemas de recombinação específicos de sítio, assim como outros tipos de tecnologias de recombinação, foram usados para gerar inserções direcionadas de genes de interesse em uma variedade de organismos. As técnicas de edição de genoma como nucleases de dedo de zinco (ZFNs) projetistas, nucleases efetoras tipo ativador de transcrição (TALENs) ou meganucleases de homing são disponíveis para produzir perturbações de genoma direcionadas, porém, estes sistemas tendem a ter baixa especificidade e empregam nucleases projetadas que precisam ser reprojetadas para cada sítio-alvo, o que as torna dispendiosas e demoradas para preparar.
[0005] Tecnologias mais novas utilizando sistemas de imunidade adaptativos arqueais ou bacterianos foram identificados, chamados de CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Interespaçadas Regularmente Agrupadas), que compreendem domínios diferentes de proteínas efetoras que englobam uma variedade de atividades (reconhecimento de DNA, ligação e opcionalmente clivagem).
[0006] Apesar da identificação e caracterização de alguns destes sistemas, permanece uma necessidade de identificar efetores e sistemas inovadores, assim como demonstrar atividade em eucariotas, particularmente animais e plantas, para efetuar edição aprimorada de polinucleotídeos endógenos e heterólogos introduzidos anteriormente e para métodos e composições para aprimorar a frequência e a eficiência de reparo direcionado à homologia de sítios de ruptura de fita dupla.
SUMÁRIO DA REVELAÇÃO
[0007] Em um aspecto, é fornecido um método para aumentar a eficiência de edição de um sítio-alvo em uma planta, em que o método compreende (a) fornecer a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar ao sítio-alvo e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem no sítio-alvo; (b) identificar pelo menos uma célula vegetal de (a) que tem uma modificação no sítio-alvo, em que a modificação inclui pelo menos uma deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos no sítio- alvo; e (c) regenerar uma planta a partir da pelo menos uma célula vegetal de (b) que tem a modificação no sítio-alvo tendo eficiência de edição aumentada em comparação com uma planta de controle que tem uma modificação no sítio-alvo fornecida por uma planta de controle T-DNA de edição, em que a planta de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA- guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo codificando um RNA-guia, em que o RNA- guia é complementar ao sítio-alvo, e em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem no sítio-alvo.
[0008] Em um aspecto, é fornecido um método para aumentar a eficiência de alterar o perfil de ácido graxo na semente de uma planta, em que o método compreende (a) fornecer a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas; (b) obter uma planta da célula vegetal de (a); (c) avaliar a planta de (b) quanto à presença da pelo menos uma modificação de nucleotídeo; (d) selecionar uma planta de progênie de (c) que tem um perfil de ácido graxo alterado; e (e) obter semente da planta de progênie de (d) que tem eficiência de edição aumentada em comparação com uma semente de controle de uma planta que tem uma modificação da sequência genômica de FAD2, da sequência genômica de FAD3, ou a combinação das mesmas fornecida por uma semente de controle T-DNA de edição, em que a semente de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que o cassete de expressão de RNA- guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA- guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas.
[0009] Em um aspecto, é fornecido um método para aumentar a eficiência de alterar o perfil de ácido graxo na semente de uma planta, em que o método compreende (a) fornecer a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas; (b) obter uma planta a partir da célula vegetal de (a); (c) avaliar a planta de (b) quanto à presença da pelo menos uma modificação de nucleotídeo; (d) realizar uma triagem de uma planta de progênie de (c) que tem um perfil de ácido graxo alterado que é desprovido do RNA- guia e da Cas endonuclease; e (e) obter semente da planta de progênie de (d) que tem eficiência de edição aumentada em comparação com uma semente de controle de uma planta que tem uma modificação da sequência genômica de FAD2, da sequência genômica de FAD3, ou a combinação das mesmas fornecida por uma semente de controle T-DNA de edição, em que a semente de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA- guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo codificando um RNA-guia, e em que o RNA- guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas.
[0010] Em um aspecto, é fornecido um método para aumentar a eficiência de introdução de um nucleotídeo de interesse em um sítio-alvo no genoma de uma planta, em que o método compreende (a) fornecer a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e o Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease clive no sítio-alvo; (b) colocar a célula vegetal de (a) em contato com um DNA de doador compreendendo o polinucleotídeo de interesse; (c) identificar pelo menos uma célula vegetal de (b) compreendendo em seu genoma o polinucleotídeo de interesse integrado no sítio-alvo; e (d) regenerar uma planta da pelo menos uma célula vegetal que tem em seu genoma o polinucleotídeo de interesse integrado no sítio-alvo que tem eficiência aumentada de introdução do polinucleotídeo de interesse no sítio-alvo no genoma da célula vegetal em comparação com uma planta de controle que tem uma introdução do polinucleotídeo de interesse no sítio-alvo no genoma da célula vegetal fornecida por uma planta de controle T-DNA de edição, em que a planta de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease clive no sítio-alvo.
Em um aspecto, o método compreende ainda um traço de interesse ou um cassete de modelo de modificação de nucleotídeo, em que o traço de interesse ou cassete de modelo de modificação de nucleotídeo compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo do traço de interesse ou nucleotídeo e o traço de interesse ou cassete de modelo de modificação de nucleotídeo é capaz de realizar ao menos uma modificação de nucleotídeo no sítio-alvo do traço de interesse ou do nucleotídeo.
Em um aspecto, o método compreende ainda um cassete de modelo de modificação, em que o cassete de modelo de modificação compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo de um sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas e o cassete de modelo de modificação possibilita a pelo menos uma modificação de nucleotídeo da sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, da sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou a combinação das mesmas.
Em um aspecto, o sítio-alvo é selecionado dentre o grupo consistindo em uma sequência de promotor, uma sequência de terminador, uma sequência de elemento regulador, uma sequência de codificação, um sítio de splice, um sítio de poliubiquitinação, um sítio de íntron, um motivo de melhora de íntron, um gene de interesse e um traço de interesse.
Em um aspecto, o sítio-alvo é selecionado a partir do grupo consistindo em um polinucleotídeo que codifica resistência ao marcador selecionável, resistência a doenças, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância à salinidade, tolerância ao metal, tolerância a herbicida, eficiência de uso de água melhorada, utilização de nitrogênio aprimorada, fixação de nitrogênio melhorada, resistência a pragas, resistência a herbívoros, resistência a patógeno, aprimoramento de rendimento, melhora de saúde, aprimoramento de vigor, aprimoramento de crescimento, aprimoramento de capacidade fotossintética, melhora de nutrição, composição de proteína alterada, composição de óleo alterada, biomassa aumentada, comprimento de broto aumentado, comprimento de raiz aumentado, arquitetura de raiz aprimorada, modulação de um metabólito, modulação do proteoma, peso de semente aumentado, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, perfil de ácido graxo alterado, composição de proteína de semente alterada, composição de nutriente de semente alterada, fertilidade aprimorada, fecundidade aprimorada, tolerância ambiental aprimorada, vigor aprimorado, resistência aprimorada a doenças, tolerância aprimorada a doenças, tolerância aprimorada a uma molécula heteróloga, adequação aprimorada, característica física aprimorada, massa maior, produção aumentada de uma molécula bioquímica, produção diminuída de uma molécula bioquímica, regulação crescente de um gene, regulação decrescente de um gene, regulação crescente de um caminho bioquímico, regulação decrescente de um caminho bioquímico, estimulação de reprodução celular e supressão de reprodução celular.
Em um aspecto, o polinucleotídeo codifica um perfil de ácido graxo alterado.
Em um aspecto, a planta é uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea.
Em um aspecto, a monocotiledônea é selecionada dentre o grupo consistindo em milho, arroz, sorgo, centeio, cevada, trigo, milheto, aveias, cana-de-açúcar, relva e switchgrass.
Em um aspecto, a dicotiledônea é selecionada dentre o grupo consistindo em soja, canola, alfafa, girassol, algodão, tabaco, amendoim, batata, tabaco, Arabidopsis e cártamo.
Em um aspecto, o T-DNA de edição fornecido à célula vegetal é fornecido por meio de transformação mediada por Agrobacterium.
Em um aspecto, o T-DNA de edição fornecido à célula vegetal é fornecido por meio de transformação mediada por Ochrobactrum.
Em um aspecto, o T-DNA de edição fornecido à célula vegetal é fornecido por meio de transformação mediada por Rhizobiaceae.
Em um aspecto, o RNA-guia é operacionalmente ligado a um promotor de U6 polimerase III de planta.
Em um aspecto, a Cas endonuclease é uma Cas9 endonuclease otimizada de planta.
Em um aspecto, o gene de Cas endonuclease é operacionalmente ligado a um sinal de direcionamento nuclear a montante da região de codificação de Cas e um sinal de localização nuclear a jusante da região de codificação de Cas.
Em um aspecto, o sítio-alvo é localizado na sequência genética de um gene de FAD2, um gene de FAD3 ou uma combinação dos mesmos.
Em um aspecto, uma planta, célula vegetal ou semente produzida pelos métodos fornecidos no presente documento.
Em um aspecto, uma planta compreendendo um traço de interesse editado, em que a planta se origina de uma célula vegetal compreendendo um traço de interesse editado produzido pelos métodos fornecidos no presente documento.
Em um aspecto, em que o T-DNA de edição compreende ainda um cassete de expressão de marcador selecionável, um cassete de expressão de marcador de cor ou uma combinação dos mesmos. Em um aspecto, a Cas endonuclease é expressa pela SEQ ID NO:1.
[0011] Em um aspecto, é fornecido um construto de DNA recombinante para aumentar a edição que compreende um T-DNA de edição para um traço ou polinucleotídeo de interesse, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA- guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA- guia é complementar ao traço ou polinucleotídeo de interesse e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita a clivagem de Cas endonuclease no traço ou polinucleotídeo de interesse. Em um aspecto, o construto de DNA recombinante compreende ainda um cassete de modelo de modificação de traço ou polinucleotídeo de interesse, em que o cassete de modelo de modificação de traço ou polinucleotídeo de interesse compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo do traço ou polinucleotídeo de interesse e o cassete de modelo de modificação de traço ou polinucleotídeo de interesse é capaz de realizar pelo menos uma modificação de nucleotídeo no traço ou polinucleotídeo de interesse. Em um aspecto, o construto de DNA recombinante compreende ainda um cassete de expressão de marcador selecionável, um cassete de expressão de marcador de cor, ou uma combinação dos mesmos.
[0012] Em um aspecto, é fornecida uma planta que compreende uma sequência de nucleotídeos modificados, em que a sequência de nucleotídeos modificados foi produzida fornecendo a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA- guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA- guia é complementar à sequência de nucleotídeos e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA- guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência de nucleotídeos. Em um aspecto, o T-DNA de edição compreende ainda um cassete de modelo de modificação de nucleotídeo, em que o cassete de modelo de modificação de nucleotídeo compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo da sequência de nucleotídeos e o cassete de modelo de modificação de nucleotídeo é capaz de realizar pelo menos uma modificação de nucleotídeo na sequência de nucleotídeos.
[0013] Em um aspecto, é fornecida uma planta que compreende uma sequência de nucleotídeos modificados, em que a sequência de nucleotídeos modificados foi produzida fornecendo a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA- guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA- guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta ou uma combinação das mesmas, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas. Em um aspecto, o T- DNA de edição compreende ainda um cassete de modelo de modificação de polinucleotídeo, em que o cassete de modelo de modificação de polinucleotídeo compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo de uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, e o cassete de modelo de modificação de polinucleotídeo possibilita a pelo menos uma modificação de nucleotídeo da sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, da sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou a combinação das mesmas.
[0014] Em um aspecto, a planta é uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é selecionada dentre o grupo consistindo em milho, arroz, sorgo, centeio, cevada, trigo, milheto, aveias, cana-de-açúcar, relva e switchgrass. Em um aspecto, a dicotiledônea é selecionada dentre o grupo consistindo em soja, canola, alfafa, girassol, algodão, tabaco, amendoim, batata, tabaco, Arabidopsis e cártamo.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0015] A revelação pode ser mais completamente entendida a partir da seguinte descrição detalhada e dos desenhos anexos e Listagem de Sequências que formam uma parte deste pedido, que são incorporados no presente documento a título de referência.
[0016] A Figura 1A mostra um construto sintético compreendendo editar componentes do vetor binário RV019927, conforme descrito no presente documento, para transformação de soja.
[0017] A Figura 1B mostra um construto sintético compreendendo editar componentes do vetor binário RV019928, conforme descrito no presente documento, para transformação de soja.
[0018] A Figura 1C mostra um construto sintético compreendendo editar componentes do vetor binário RV019929, conforme descrito no presente documento, para transformação de soja.
[0019] A Figura 1D mostra um construto sintético compreendendo editar componentes do vetor binário RV019930, conforme descrito no presente documento, para transformação de soja.
[0020] A Figura 2 mostra eficiência de edição de gene com vetores binários diferentes RV019927, RV019928, RV019929 e RV019930.
[0021] A Figura 3A mostra as edições feitas na sequência de codificação de FAD2-1A conforme descrito no presente documento, como o experimento de RV019927.
[0022] A Figura 3B mostra as edições feitas na sequência de codificação de FAD2-1B conforme descrito no presente documento, como o experimento de RV019927.
[0023] A Figura 4A mostra as edições feitas na sequência de codificação de FAD2-1A conforme descrito no presente documento, como o experimento de RV019929.
[0024] A Figura 4B mostra as edições feitas na sequência de codificação de FAD2-1B conforme descrito no presente documento, como o experimento de RV019929.
[0025] A Figura 5A mostra as edições feitas na sequência de codificação de FAD3a conforme descrito no presente documento, como o experimento de RV019929.
[0026] A Figura 5B mostra as edições feitas na sequência de codificação de FAD3b conforme descrito no presente documento, como o experimento de RV019929.
[0027] A Figura 6 representa um exemplo de uma pluralidade de sequências de polinucleotídeos de sítio-alvo (TS) flanqueando o cassete de DNA de doador. “POI" significa "polinucleotídeo de interesse", que, em alguns exemplos, codificou um traço de interesse, por exemplo, um traço de interesse ou importância agronômica.
[0028] A Figura 7 representa ilustrações esquemáticas de diferentes vetores e estratégias experimentais para os experimentos de HDR de soja. A Figura 7A representa a estratégia experimental para o Vetor 9. A Figura 7B representa a estratégia experimental para o Vetor 10. A Figura 7C representa a estratégia experimental para o Vetor 11. A Figura 7D representa a estratégia experimental para o Vetor 12. A Figura 7E representa a estratégia experimental para o Vetor
13. A Figura 7F representa a estratégia experimental para o Vetor 14. A Figura 7G representa a estratégia experimental para o Vetor 15. A Figura 7H representa a estratégia experimental para o Vetor 16. A Figura 7I representa a estratégia experimental para o Vetor 17.
[0029] A Figura 8 representa o Vetor 9 de transformação de soja (SEQ ID NO:97), correspondente ao esquema da Figura 7A.
[0030] A Figura 9 representa o Vetor 10 de transformação de soja (SEQ ID NO:98), correspondente ao esquema da Figura 7B.
[0031] A Figura 10 representa o Vetor 11 de transformação de soja (SEQ ID NO:99), correspondente ao esquema da Figura 7C.
[0032] A Figura 11 representa o Vetor 12 de transformação de soja (SEQ ID NO:100), correspondente ao esquema da Figura 7D.
[0033] A Figura 12 representa o Vetor 13 de transformação de soja (SEQ ID NO:101), correspondente ao esquema da Figura 7E.
[0034] A Figura 13 representa o Vetor 14 de transformação de soja (SEQ ID NO:102), correspondente ao esquema da Figura 7F.
[0035] A Figura 14 representa o Vetor 15 de transformação de soja (SEQ ID NO:103), correspondente ao esquema da Figura 7G.
[0036] A Figura 15 representa o Vetor 16 de transformação de soja (SEQ ID NO:104), correspondente ao esquema da Figura 7H.
[0037] A Figura 16 representa o Vetor 17 de transformação de soja (SEQ ID NO:105), correspondente ao esquema da Figura 7I.
[0038] A Figura 17 mostra o projeto e estratégia experimental de vetor e resultados para os experimentos de HDR de soja para o Vetor 9. A Figura 17A representa o projeto e estratégia experimental de vetor. A Figura 17B mostra os resultados de leitura individuais para as amostras. A Figura 17C mostra a concentração normalizada de leituras de cópia de HDR.
[0039] A Figura 18 mostra o projeto e estratégia experimental de vetor e resultados para os experimentos de HDR de soja para o Vetor 10. A Figura 18A representa o projeto e estratégia experimental de vetor. A Figura 18B mostra os resultados de leitura individuais para as amostras. A Figura 18C mostra a concentração normalizada de leituras de cópia de HDR.
[0040] A Figura 19 mostra o projeto e estratégia experimental de vetor e resultados para os experimentos de SDN2 de soja para o Vetor 13. A Figura 19A representa o projeto e estratégia experimental de vetor. A Figura 19B mostra a sequência-alvo de soja de tipo selvagem (SEQ ID NO:106) e a sequência de DNA de doador para gRNA2 (SEQ ID NO:107). As Figuras 19C e 19D mostram verificação de sequenciamento de edições.
[0041] A Figura 20 mostra a estratégia experimental e esquema de vetor para os experimentos de HDR de soja para o Vetor 12. A Figura 21 mostra os resultados para três repetições de duas linhagens de germoplasma diferentes para o Vetor 14.
[0042] A Figura 22 mostra os resultados para três repetições de duas linhagens de germoplasma diferentes para o Vetor 15.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0043] As descrições de sequência (Tabela 1) resumem a Listagem de Sequências anexa ao presente documento, que é aqui incorporada a título de referência. A Listagem de Sequências contém códigos de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de letra única e três letras para aminoácidos conforme definido nos padrões da IUPAC- IUB descritos em Nucleic Acids Research 13:3.021 a 3.030 (1985) e no Biochemical Journal 219(2):345 a 373 (1984). Tabela 1. Descrição da Listagem de Sequências SEQ ID NO: Descrição SEQ ID NO: 1 Sequência de nucleotídeos de Cas9 otimizada com códon de soja SEQ ID NO: 2 Sequência de aminoácidos do sinal de localização nuclear AT-NLS SEQ ID NO: 3 Sequência de aminoácidos do sinal de localização nuclear VirD2 SEQ ID NO: 4 Sequência de nucleotídeos do promotor constitutivo de soja GM-EF1A2 SEQ ID NO: 5 Sequência de nucleotídeos de promotor GM-U6-
13.1 de soja SEQ ID NO: 6 Sequência de nucleotídeos de promotor GM-U6-
9.1 de soja SEQ ID NO: 7 Sequência de nucleotídeos de GM-FAD2-1 CR1 SEQ ID NO: 8 Sequência de nucleotídeos de GM-FAD3-CR2 SEQ ID NO: 9 Sequência de nucleotídeos de construto de RV019927 SEQ ID NO: 10 Sequência de nucleotídeos de construto de RV019929
SEQ ID NO: 11 Sequência de nucleotídeos de iniciador de FAD2-F1 SEQ ID NO: 12 Sequência de nucleotídeos de iniciador de FAD2-R1 SEQ ID NO: 13 Sequência de nucleotídeos de sonda de FAD2- T1 SEQ ID NO: 14 Sequência de nucleotídeos de iniciador de FAD2-F2 SEQ ID NO: 15 Sequência de nucleotídeos de sonda de FAD2- T2 SEQ ID NO: 16 Sequência de nucleotídeos de iniciador de FAD3-F1 SEQ ID NO: 17 Sequência de nucleotídeos de iniciador de FAD3-R2 SEQ ID NO: 18 Sequência de nucleotídeos de sonda de FAD3- T2 SEQ ID NO: 19 Sequência de nucleotídeos de iniciador de FAD3-F2 SEQ ID NO: 20 Sequência de nucleotídeos de iniciador de SIP-130F SEQ ID NO: 21 Sequência de nucleotídeos de iniciador de SIP-198R SEQ ID NO: 22 Sequência de nucleotídeos de sonda de SIP- 170T SEQ ID NO: 23 Sequência de nucleotídeos de iniciador de PCR WOL1007 SEQ ID NO: 24 Sequência de nucleotídeos de iniciador de PCR WOL1008
SEQ ID NO: 25 Sequência de nucleotídeos de iniciador de PCR WOL1009 SEQ ID NO: 26 Sequência de nucleotídeos de iniciador de PCR WOL1100 SEQ ID NO: 27 Sequência de nucleotídeos de iniciador de PCR WOL1101 SEQ ID NO: 28 Sequência de nucleotídeos de iniciador de PCR WOL1102 SEQ ID NO: 29 Sequência de nucleotídeos de iniciador de PCR WOL1103 SEQ ID NO: 30 Sequência de nucleotídeos de construto de RV005393 SEQ ID NO: 31 Sequência de nucleotídeos de construto de RV019928 SEQ ID NO: 32 Sequência de nucleotídeos de construto de RV019930 SEQ ID NO: 33 Sequência de nucleotídeos de alelo WT de FAD2-1A perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2-1 CR1 SEQ ID NO: 34 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.1 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 35 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.2 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 36 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.3 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 37 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.4 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 38 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.5 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 39 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.6 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 40 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.7 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 41 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.8 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 42 Sequência de nucleotídeos de alelo WT de FAD2-1B perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2-1 CR1 SEQ ID NO: 43 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.1 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1
SEQ ID NO: 44 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.2 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 45 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.3 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 46 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.4 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 47 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.5 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 48 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.6 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 49 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.7 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 50 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.8 perto do experimento de RV019927 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1
SEQ ID NO: 51 Sequência de nucleotídeos de alelo WT de FAD2-1A perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2-1 CR1 SEQ ID NO: 52 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.1 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 53 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.2 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 54 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.3 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 55 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.4 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 56 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.5 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 57 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.6 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 58 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.7 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 59 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1A da variante de 1.8 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 60 Sequência de nucleotídeos de alelo WT de FAD2-1B perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2-1 CR1 SEQ ID NO: 61 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.1 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 62 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.2 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 63 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.3 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 64 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.4 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 65 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.5 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1
SEQ ID NO: 66 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.6 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 67 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.7 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 68 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD2-1B da variante de 1.8 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD2- 1 CR1 SEQ ID NO: 69 Sequência de nucleotídeos de alelo WT de FAD3a perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 70 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3a da variante de 1.1 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 71 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3a da variante de 1.2 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 72 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3a da variante de 1.3 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 73 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3a da variante de 1.4 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 74 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3a da variante de 1.5 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2
SEQ ID NO: 75 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3a da variante de 1.6 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 76 Sequência de nucleotídeos de alelo WT de FAD3b perto do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 77 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3b da variante de 1.1 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 78 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3b da variante de 1.2 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 79 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3b da variante de 1.3 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 80 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3b da variante de 1.4 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 81 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3b da variante de 1.5 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 82 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3b da variante de 1.6 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 83 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3b da variante de 1.7 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2 SEQ ID NO: 84 Sequência de nucleotídeos de alelo editado de FAD3b da variante de 1.8 perto do experimento de RV019929 do sítio de GM-FAD3 CR2
SEQ ID NO: 85 Sequência de nucleotídeos de gene de FAD2-1A de soja.
SEQ ID NO: 86 Sequência de nucleotídeos de gene de FAD2-1B de soja SEQ ID NO: 87 Sequência de nucleotídeos de gene de FAD3a de soja SEQ ID NO: 88 Sequência de nucleotídeos de gene de FAD3b de soja SEQ ID NO: 89 Sequência de nucleotídeos de sequência de codificação de FAD2-1A (CDS) de soja SEQ ID NO: 90 Sequência de aminoácidos de gene de FAD2-1A de soja SEQ ID NO: 91 Sequência de nucleotídeos de sequência de codificação de FAD2-1B (CDS) de soja SEQ ID NO: 92 Sequência de aminoácidos de gene de FAD2-1B de soja SEQ ID NO: 93 Sequência de nucleotídeos de sequência de codificação de FAD3a (CDS) de soja SEQ ID NO: 94 Sequência de aminoácidos de gene de FAD3a de soja SEQ ID NO: 95 Sequência de nucleotídeos de sequência de codificação de FAD3b (CDS) de soja SEQ ID NO: 96 Sequência de aminoácidos de gene de FAD3b de soja SEQ ID NO:97 Sequência de nucleotídeos de Vetor 9 SEQ ID NO:98 Sequência de nucleotídeos de Vetor 10 SEQ ID NO:99 Sequência de nucleotídeos de Vetor 11 SEQ ID NO:100 Sequência de nucleotídeos de Vetor 12 SEQ ID NO:101 Sequência de nucleotídeos de Vetor 13
SEQ ID NO:102 Sequência de nucleotídeos de Vetor 14 SEQ ID NO:103 Sequência de nucleotídeos de Vetor 15 SEQ ID NO:104 Sequência de nucleotídeos de Vetor 16 SEQ ID NO:105 Sequência de nucleotídeos de Vetor 17 SEQ ID NO:106 A sequência de DNA artificial representada na Figura 19B para a sequência de soja WT (SEQ ID NO:106) SEQ ID NO:107 Sequência de DNA artificial representada na Figura 19B para o DNA de doador para gRNA2 (SEQ ID NO:107) SEQ ID NO:108 Sequência de nucleotídeos de PHP70365; pVIR8
[0044] Em um aspecto, são fornecidos composições e métodos relacionados ao aprimoramento da edição de polinucleotídeos endógenos e heterólogos introduzidos anteriormente e para aprimorar a frequência e eficiência de reparo direcionado à homologia de sítios de ruptura de fita dupla. Em um aspecto, são fornecidas plantas, como plantas de soja, foram modificadas usando técnicas de edição genômica reveladas no presente documento para fornecer uma eficiência de edição aprimorada de polinucleotídeos endógenos e heterólogos introduzidos anteriormente e uma frequência e eficiência aprimoradas de reparo direcionado à homologia de sítios de ruptura de fita dupla. Em um aspecto, a presente revelação constatou que modificar rupturas de DNA direcionado em loci genômicos de uma planta usando tecnologia de edição genômica, incluindo o T-DNA de edição conforme descrito no presente documento forneceu edição aprimorada de polinucleotídeos endógenos e heterólogos introduzidos anteriormente e aprimorou a frequência e eficiência de reparo direcionado à homologia de sítios de ruptura de fita dupla. Em um aspecto, o T-DNA de edição compreende um cassete de gRNA perto da borda direita e colocado a montante de um cassete de expressão de Cas endonuclease em um sistema de transformação de vetor binário. Em um aspecto, o sistema de transformação de vetor binário compreendendo o T-DNA de edição é entregue a uma célula vegetal de soja por transformação mediada por Ochrobactrum.
[0045] Em um aspecto, sementes modificadas, como sementes de soja, são dotadas de níveis aumentados de ácido oleico e níveis reduzidos de ácido linolênico. As sojas descritas no presente documento podem conter ainda um ou mais dos níveis reduzidos de ácidos graxos saturados, como um ou mais dentre ácidos palmíticos e esteáricos, e níveis reduzidos de ácido linoleico.
[0046] Os óleos produzidos de sementes descritas no presente documento podem conter níveis baixos de ácidos graxos saturados que são desejáveis no fornecimento de uma dieta saudável. As gorduras que são sólidas à temperatura ambiente podem ser usadas em aplicações como a produção de margarinas não lácteas e pastas, e várias aplicações em confecções e em cozimento. São fornecidos óleos e triglicerídeos para aplicações de gordura sólidas que podem conter uma predominância da dissociação muito alta, ácido esteárico de ácido graxo de cadeia longa e um saldo de ácido graxo monoinsaturado com gordura muito pouco poli-insaturada. São fornecidas as frações de gordura sólida que têm uma estrutura de triacilgicerídeo com ácidos graxos saturados ocupando as posições sn-1 e sn-3 dos triglicerídeos e um ácido graxo insaturado na posição sn-2. Esta composição de ácido graxo geral e estrutura de triglicerídeo confere uma estrutura de cristal de gordura sólida ideal e um ponto de fusão máximo com teor mínimo de ácido graxo saturado.
[0047] As composições de óleo, sementes e plantas modificadas reveladas no presente documento são produzidas por técnicas de edição genômica que facilitam a edição aprimorada dos alelos FAD2-1A, FAD-2-1B, FAD3a e FAD3b. A fita de sentido ou o complemento da mesma pode ser editada.
[0048] Um "FAD2", "FAD2-1", "FAD2-1A" ou FAD2-1B" ou uma "planta modificada por FAD2", "planta modificada por FAD2- 1", "planta modificada por FAD2-1A" ou "planta modificada por FAD2-1B" geralmente se referem a uma planta modificada ou planta mutante que tem uma ou mais alterações de nucleotídeo em uma região genômica que codifica um polipeptídeo de FAD2, FAD2-1, FAD2-1A ou FAD2-1B. Um "FAD3", "FAD3a", "FAD3b", “planta modificada por FAD3", "planta modificada por FAD3a" ou uma "planta modificada por FAD3b” geralmente se refere a uma planta modificada ou planta mutante que tem uma ou mais alterações de nucleotídeo em uma região genômica que codifica um polipeptídeo de FAD3, FAD3a, FAD3b. As alterações de nucleotídeo nas regiões genômicas de FAD2, FAD2-1, FAD2-1A ou FAD2-1B e/ou FAD3, FAD3a, FAD3b podem incluir modificações que resultam em uma ou mais dentre as SEQ ID NOs: 34 a 41, 43 a 50, 52 a 59, 61 a 68, 70 a 75 e 77 a 84 sendo contidas dentro da região genômica.
[0049] Em alguns aspectos, os polinucleotídeos revelados no presente documento podem ser polinucleotídeos isolados. Um “polinucleotídeo isolado” geralmente refere-se a um polímero de ribonucleotídeos (RNA) ou desoxirribonucleotídeos (DNA) que é de fita simples ou dupla, opcionalmente contendo bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas. Um polinucleotídeo isolado na forma de DNA pode ser compreendido de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.
[0050] Os termos “polinucleotídeo”, “sequência polinucleotídica”, “sequência de ácido nucleico”, “fragmento de ácido nucleico” e “fragmento de ácido nucleico isolado” são usados de forma intercambiável no presente documento. Esses termos englobam sequências nucleotídicas e similares. Um polinucleotídeo pode ser um polímero de RNA ou DNA que é de fita simples ou dupla que contém opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas. Um polinucleotídeo na forma de um polímero de DNA pode ser compreendido de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou misturas dos mesmos. Os nucleotídeos (normalmente encontrados em sua forma 5’-monofosfato) são denominados por uma designação de letra única conforme segue: “A” para adenilato ou desoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), “C” para citidilato ou desoxicitidilato, “G” para guanilato ou desoxiguanilato, “U” para uridilato, “T” para desoxitimidilato, “R” para purinas (A ou G), “Y” para pirimidinas (C ou T), “K” para G ou T, “H” para A ou C ou T, “I” para inosina e “N” para qualquer nucleotídeo.
[0051] Um elemento regulador geralmente se refere a um elemento regulador transcricional envolvido na regulação da transcrição de uma molécula de ácido nucleico como um gene ou um gene-alvo. O elemento regulador é um ácido nucleico e pode incluir um promotor, um intensificador, um íntron, uma região não traduzida 5' (5'-UTR, também conhecida como uma sequência líder) ou uma 3'-UTR ou uma combinação das mesmas. Um elemento regulador pode atuar em “cis” ou “trans” e geralmente atua em
“cis”, isto é, ativa a expressão de genes localizados na mesma molécula de ácido nucleico, por exemplo, um cromossomo, onde o elemento regulador está localizado. A molécula de ácido nucleico regulada por um elemento regulador não precisa necessariamente codificar um peptídeo ou polipeptídeo funcional, por exemplo, o elemento regulador pode modular a expressão de um RNA de interferência curto ou um RNA antissentido.
[0052] Um elemento potencializador é qualquer molécula de ácido nucleico que aumenta a transcrição de uma molécula de ácido nucleico quando funcionalmente ligado a um promotor independentemente da sua posição relativa. Um potencializador pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nível ou a especificidade para tecido de um promotor.
[0053] Um repressor (também chamado, por vezes, no presente documento de silenciador) é definido como qualquer molécula de ácido nucleico que inibe a transcrição quando ligado funcionalmente a um promotor independentemente da posição relativa.
[0054] Promotores que podem ser úteis nos métodos e composições fornecidos incluem aqueles que contêm elementos em cis, promotores funcionais em uma célula vegetal, promotores tecido-específico e preferenciais em termos de tecido, promotores regulados pelo desenvolvimento e promotores constitutivos. “Promotor” geralmente se refere a um fragmento de ácido nucleico com capacidade para controlar a transcrição de um outro fragmento de ácido nucleico. Um promotor geralmente inclui uma sequência de promotor de núcleo (também conhecida como promotor mínimo) que inclui uma região reguladora mínima para iniciar a transcrição, isto é um sítio de iniciação da transcrição.
[0055] O termo “elemento em cis” geralmente se refere a um elemento regulador da transcrição que afeta ou modula a expressão de um polinucleotídeo apto a ser transcrito operacionalmente ligado, em que o polinucleotídeo apto a ser transcrito está presente na mesma sequência de DNA. Um elemento em cis pode funcionar para ligar fatores de transcrição que são polipeptídeos de atuação em trans que regulam a transcrição.
[0056] Um “promotor funcional em uma planta” é um promotor com capacidade para iniciar a transcrição em células vegetais independentemente da sua origem ser ou não ser de uma célula vegetal.
[0057] “Promotor tecido-específico” e “promotor preferencial em termos de tecido” são usados de forma intercambiável para se referir a um promotor que é expresso predominantemente, mas não necessariamente exclusivamente, em um tecido ou órgão, mas que pode ser também expresso em uma célula específica.
[0058] “Promotor regulado pelo desenvolvimento” geralmente se refere a um promotor cuja atividade é determinada por eventos de desenvolvimento.
[0059] “Promotor constitutivo” geralmente se refere a promotores ativos em todos ou na maioria dos tecidos ou tipos de célula de uma planta em todos ou na maioria dos estágios de desenvolvimento. Assim como com outros promotores classificados como “constitutivos” (por exemplo, ubiquitina), alguma variação dos níveis absolutos da expressão pode existir entre diferentes tecidos ou estágios. O termo "promotor constitutivo" ou "independente de tecido" são usados de modo intercambiável no presente documento.
[0060] São fornecidas sequências que são sequências nucleotídicas heterólogas que podem ser usadas nos métodos e composições revelados no presente documento. Uma “sequência nucleotídica heteróloga” geralmente se refere a uma sequência que não é de ocorrência natural com a sequência da revelação. Embora essa sequência nucleotídica seja heteróloga à sequência, a mesma pode ser homóloga ou nativa ou heteróloga ou estranha ao hospedeiro vegetal. Entretanto, é reconhecido que as presentes sequências podem ser usadas com suas sequências de codificação nativas para aumentar ou reduzir a expressão resultante em uma alteração no fenótipo na semente transformada. Os termos “sequência nucleotídica heteróloga”, “sequência heteróloga”, “fragmento de ácido nucleico heterólogo” e “sequência de ácidos nucleicos heteróloga” são usados de forma intercambiável no presente documento.
[0061] A sequência polinucleotídica dos alvos da presente divulgação (por exemplo, SEQ ID NOS: 85 a 88) e as sequências de codificação SEQ ID NO: 89, 91, 93 ou 95, codificando os polipeptídeos 90, 92, 94 ou 96 respectivamente, pode ser modificada ou alterada para reduzir sua expressão ou as características da proteína. Os exemplos de tais modificações são uma ou mais das sequências listadas na Tabela
1. Como uma pessoa de habilidade comum na técnica apreciará, a modificação ou alteração pode ser também realizada sem afetar substancialmente a função de expressão gênica. Os métodos são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Sequências podem ser modificadas, por exemplo, por inserção, deleção ou substituição de sequências molde por meio de qualquer abordagem de modificação. As sequências genômicas contêm íntrons e éxons que podem ser direcionados de acordo com os métodos revelados no presente documento.
[0062] SEQ ID NO: 85 (gene de FAD2-1A de soja) tem o códon inicial na posição 1 a 3 e o códon de parada na posição
1.329 a 1.331, exon1 é das posições 1 a 3, intron1 é das posições 4 a 170, exon2 é das posições 171 a 1.331.
[0063] SEQ ID NO: 86 (gene de FAD2-1B de soja) tem o códon inicial na posição 1 a 3 e o códon de parada na posição
1.322 a 1.324, exon1 é das posições 1 a 3, intron1 é das posições 4 a 163, exon2 é das posições 164 a 1.324.
[0064] SEQ ID NO: 87 (gene de FAD3a de soja) tem o códon inicial na posição 1 a 3 e o códon de parada na posição
3.866 a 3.868, exon1 é das posições 1 a 293, intron1 é das posições 294 a 460, exon2 é das posições 461 a 550, intron2 é das posições 551 a 874, exon3 é das posições 875 a 941, intron3 é das posições 942 a 1.076, exon4 é das posições 1.077 a 1.169, intron4 é das posições 1.170 a 1.278, exon5 é das posições
1.279 a 1.464, intron5 é das posições 1.465 a 1.756, exon6 é das posições 1.757 a 1.837, intron6 é das posições 1.838 a
2.874, exon7 é das posições 2.875 a 3.012, intron7 é das posições 3.013 a 3.685, exon8 é das posições 3.686 a 3.868.
[0065] SEQ ID NO: 88 (gene de FAD3b de soja) tem o códon inicial na posição 1 a 3 e p códon de parada na posição
3.894 a 3.896, exon1 é das posições 1 a 305, intron1 é das posições 306 a 497, exon2 é das posições 498 a 587, intron2 é das posições 588 a 935, exon3 é das posições 936 a 1.002, intron3 é das posições 1.003 a 1.144, exon4 é das posições
1.145 a 1.237, intron4 é das posições 1.238 a 1.335, exon5 é das posições 1.336 a 1.521, intron5 é das posições 1.522 a
1.636, exon6 é das posições 1.637 a 1.717, intron6 é das posições 1.637 a 1.717, exon7 é das posições 2.950 a 3.087, intron7 é das posições 3.088 a 3.713, exon8 é das posições
3.714 a 3.896.
[0066] Promotores variantes podem ser usados nos métodos e composições revelados no presente documento. Um “promotor variante”, conforme usado no presente documento, é a sequência do promotor ou a sequência de um fragmento funcional de um promotor que contém alterações nas quais um ou mais nucleotídeos da sequência original são deletados, adicionados e/ou substituídos, mantendo-se substancialmente a função de promotor. Um ou mais pares de bases podem ser inseridos, deletados ou substituídos internamente a um promotor. No caso de um fragmento de promotor, promotores variantes podem incluir alterações afetando a transcrição de um promotor mínimo ao qual é operacionalmente ligado. Promotores variantes podem ser produzidos, por exemplo, por técnicas de mutagênese de DNA padrão ou por síntese química do promotor variante ou de uma porção do mesmo.
[0067] São fornecidas sequências que são um complemento total ou um complemento de comprimento total daquelas reveladas no presente documento, como as sequências de nucleotídeos na Tabela 1. Os termos “complemento total” e “complemento de comprimento total” são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a um complemento de uma dada sequência nucleotídica, em que o complemento e a sequência nucleotídica consistem no mesmo número de nucleotídeos e são 100% complementares.
[0068] São fornecidas sequências que são "substancialmente similares" ou "substancialmente correspondentes" àquelas reveladas no presente documento que podem ser usadas nos métodos e composições descritos no presente documento. Os termos “substancialmente similar” e “substancialmente correspondente”, conforme usado no presente documento, referem-se a fragmentos de ácido nucleico nos quais alterações em uma ou mais bases nucleotídicas não afetam a capacidade do fragmento de ácido nucleico para mediar a expressão gênica ou produzir um determinado fenótipo. Esses termos também se referem a modificações dos fragmentos de ácido nucleico da presente revelação, tais como deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alteram substancialmente as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucleico resultante em relação ao fragmento inicial não modificado. É, portanto, entendido, como os versados na técnica apreciarão, que a revelação abrange mais do que as sequências exemplificativas específicas.
[0069] São fornecidas composições e métodos que incluem materiais, etapas, recursos, componentes ou elementos que consistem essencialmente em um componente particular. A frase transicional “que consiste essencialmente em” se refere, em geral, a uma composição, método que inclui materiais, etapas, recursos, componentes ou elementos, além daqueles literalmente revelados, desde que esses materiais, etapas, recursos, componentes ou elementos adicionais não afetem materialmente a característica básica e inovadora (ou características básicas e inovadoras) da matéria reivindicada, por exemplo, uma ou mais das sequências reivindicadas.
[0070] Ademais, o técnico versado reconhece que sequências de ácido nucleico substancialmente similares englobadas por esta revelação também são definidas por sua capacidade de hibridizar, sob condições moderadamente rigorosas (por exemplo, 0,5 X SSC, 0,1% de SDS, 60 C) com as sequências exemplificadas no presente documento, ou com qualquer porção das sequências de nucleotídeos relatadas no presente documento e que são funcionalmente equivalentes ao promotor da revelação. Estimativas de tal homologia são fornecidas por hibridização DNA-DNA ou DNA-RNA sob condições de estringência, como é bem entendido pelos versados na técnica (Hames e Higgins, Eds.; em Nucleic Acid Hybridisation; IRL Press: Oxford, Reino Unido, 1985). As condições de rigor podem ser ajustadas para examinar quanto a fragmentos moderadamente similares, como sequências homólogas de organismos relacionados de modo distante, com fragmentos altamente similares, como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos aproximadamente relacionados. As lavagens pós- hibridização determinam parcialmente as condições de estringência. Um conjunto de condições usa uma série de lavagens começando com 6X SSC, 0,5% de SDS à temperatura ambiente por 15 min, então, repetida com 2X SSC, 0,5% de SDS a 45 C por 30 min e, então, repetida duas vezes com 0,2X SSC, 0,5% de SDS a 50 C por 30 min. Outro conjunto de condições rigorosas usa temperaturas mais altas em que as lavagens são idênticas àquelas acima, exceto que a temperatura das duas lavagens de 30 min finais em 0,2X SSC, 0,5% de SDS foi aumentada para 60 C. Outro conjunto de condições altamente rigorosas usa duas lavagens finais em 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 65 C.
[0071] São fornecidas sequências substancialmente similares úteis nas composições e métodos fornecidos no presente documento. Uma “sequência substancialmente similar” geralmente se refere a variantes das sequências reveladas,
tais como aquelas que resultam de mutagênese sítio-dirigida, bem como sequências sinteticamente derivadas. Os alinhamentos de sequências e os cálculos de porcentagem de identidade podem ser determinados com o uso de uma variedade de métodos de comparação projetados para detectar sequências similares ou idênticas, incluindo, mas sem limitação, o programa Megalign® do pacote de programas de computação de bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, WI). Exceto se indicado de outro modo, múltiplos alinhamentos das sequências fornecidas no presente documento foram realizados usando o método de alinhamento Clustal V (Higgins e Sharp (1989) CABIOS. 5:151 a 153) com os parâmetros padrão (PENALIDADE PARA VÃO=10, PENALIDADE DE COMPRIMENTO DE VÃO=10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares e cálculo de porcentagem de identidade de sequências proteicas com o uso do método Clustal V são KTUPLO = 1, PENALIDADE PARA VÃO = 3, JANELA = 5 e DIAGONAIS SALVAS = 5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros são KTUPLO = 2, PENALIDADE PARA VÃO = 5, JANELA = 4 e DIAGONAIS SALVAS = 4. Após o alinhamento das sequências, com o uso do programa Clustal V, é possível obter valores de “porcentagem de identidade” e “divergência” visualizando-se a tabela de “distâncias de sequência” no mesmo programa; a menos que declarado de outro modo, as identidades e divergências de porcentagem fornecidas e reivindicadas no presente documento foram calculadas dessa maneira.
[0072] Alternativamente, o método CLUSTAL W de alinhamento pode ser usado. O método de alinhamento Clustal W (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5:151 a 153 (1989); Higgins, D. G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189 a 191 (1992)) pode ser encontrado no programa MegAlign™ v6.1 do pacote de programas de computação de bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, Wis.). Os parâmetros padrão para alinhamento múltiplo correspondem a PENALIDADE PARA VÃO = 10, PENALIDADE PARA COMPRIMENTO DE VÃO = 0,2, atraso de alinhamento de sequências divergentes = 30%, peso de transições de DNA = 0,5, matriz de peso de proteína = Série Gonnet, matriz de peso de DNA = IUB. Para alinhamentos em pares, os parâmetros padrão são Alinhamento=Lento-Preciso, penalidade para lacuna (“Gap Penalty”)=10,0, comprimento de lacuna (“Gap Length”)=0,10, matriz de peso de proteína (“Protein Weight Matrix”)=Gonnet 250 e matriz de peso de DNA (“DNA Weight Matrix”)=IUB. Após o alinhamento das sequências com o uso do programa Clustal W, é possível obter valores de “porcentagem de identidade” e "divergência" visualizando-se a tabela de “distâncias de sequência” no mesmo programa.
[0073] Em um aspecto, a % de identidade de sequência é determinada em relação a todo o comprimento da molécula (nucleotídeo ou aminoácido). Uma "porção substancial" de uma sequência de aminoácido ou nucleotídeos compreende suficiente da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou da sequência de nucleotídeos de um gene para produzir identificação putativa de tal polipeptídeo ou gene, por avaliação manual da sequência por um versado na técnica, ou por comparação e identificação de sequência automatizada por computador usando algoritmos como BLAST (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403 a 410 (1993)) e Gapped Blast (Altschul, S. F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3.389 a 3.402 (1997)). BLASTN geralmente se refere a um programa BLAST que compara uma sequência nucleotídica de consulta com uma sequência nucleotídica do banco de dados.
[0074] A presente revelação fornece genes, genes mutados, genes quiméricos e construtos de expressão recombinante. “Gene" inclui um fragmento de ácido nucleico que expressa uma molécula funcional como, mas sem limitações, uma proteína específica, incluindo sequências regulatórias antecedendo (sequências de não codificação 5') e seguindo (sequências de não codificação 3') a sequência de codificação. “Gene nativo” geralmente se refere a um gene como encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras.
[0075] Um “gene mutado” é um gene que foi alterado através de intervenção humana. Tal “gene mutado” tem uma sequência que se difere da sequência do gene não mutado correspondente por pelo menos uma adição, deleção ou substituição nucleotídica. Em determinadas concretizações da divulgação, o gene mutado compreende uma alteração que resulta de um sistema de polinucleotídeo-guia/endonuclease Cas conforme revelado no presente documento. Uma planta mutada é uma planta que compreende um gene mutado.
[0076] “Gene quimérico” ou “construção de expressão recombinante”, que são usados de forma intercambiável, incluem qualquer gene que não seja um gene nativo, compreendendo sequências reguladoras e codificantes que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências regulatórias e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes.
[0077] “Sequência codificante” geralmente se refere a uma sequência polinucleotídica que codifica uma sequência de aminoácidos específica. “Sequências regulatórias" se referem a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências de não codificação 5'), dentro ou a jusante
(sequências de não codificação 3') de uma sequência de codificação, e que influenciam a transcrição, processamento de RNA ou estabilidade ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências regulatórias podem incluir, mas sem limitações, promotores, sequências líderes de tradução, íntrons e sequências de reconhecimento de poliadenilação.
[0078] O termo "operacionalmente ligado" ou "funcionalmente ligado" geralmente se refere à associação de sequências de ácidos nucleicos em um único fragmento de ácido nucleico, de modo que a função de uma seja afetada pela outra. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificante quando é capaz de afetar a expressão daquela sequência codificante (isto é, que a sequência codificante está sob o controle transcricional do promotor). As sequências codificantes podem estar operacionalmente ligadas às sequências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.
[0079] Os termos "iniciar transcrição", "iniciar expressão", "conduzir transcrição" e "conduzir expressão" são usados de modo intercambiável no presente documento e todos se referem à função primária de um promotor. Como detalhado na presente revelação, um promotor é uma sequência de DNA genômico não codificante, normalmente a montante (5’) da sequência codificante relevante e sua função primária é atuar como um sítio de ligação para a RNA polimerase e iniciar a transcrição pela RNA polimerase. Além disso, há “expressão” de RNA, incluindo RNA funcional, ou a expressão de polipeptídeo para sequências nucleotídicas codificantes operacionalmente ligadas, visto que o RNA transcrito é, por fim, traduzido no polipeptídeo correspondente.
[0080] O termo "cassete de expressão", conforme usado no presente documento, geralmente se refere a um fragmento de ácido nucleico distinto no qual uma sequência ou fragmento de ácido nucleico pode ser clonado ou sintetizado através de técnicas de biologia molecular.
[0081] Conforme indicado no presente documento, "supressão" inclui uma redução do nível de atividade de enzima ou funcionalidade de proteína (por exemplo, um fenótipo associado a uma proteína) detectável em uma planta transgênica em comparação com o nível de atividade de enzima ou funcionalidade de proteína detectável em uma planta não transgênica ou de tipo selvagem com a enzima ou proteína nativa. O nível de atividade enzimática em uma planta com a enzima nativa é chamado no presente documento de atividade “do tipo selvagem”. O nível de funcionalidade proteica em uma planta com a proteína nativa é chamado no presente documento de funcionalidade “do tipo selvagem”. O termo “supressão” inclui baixar, reduzir, declinar, diminuir, inibir, eliminar e prevenir. Esta redução pode ser devido a uma redução na tradução do mRNA nativo em uma enzima ativa ou proteína funcional. Também pode ocorrer devido à transcrição do DNA nativo em quantidades reduzidas de mRNA e/ou à degradação rápida do mRNA nativo. O termo “enzima nativa” geralmente se refere a uma enzima que é produzida naturalmente em uma célula não transgênica ou do tipo selvagem. Os termos "não transgênico" e "tipo selvagem" são usados de modo intercambiável no presente documento.
[0082] “Alteração da expressão” ou “modulação da expressão” geralmente se refere à produção de produto gênico (ou produtos gênicos) em plantas em quantidades ou proporções que diferem significativamente da quantidade do produto gênico (ou produtos gênicos) produzida pelas plantas de tipo selvagem correspondentes (isto é, a expressão é aumentada ou reduzida).
[0083] “Transformação”, conforme usado no presente documento, geralmente se refere tanto a transformação estável como transformação transiente. Em um aspecto, cepas bacterianas úteis nos métodos para aprimorar a edição de polinucleotídeos endógenos e heterólogos introduzidos anteriormente e para aprimorar a frequência e eficiência de reparo direcionado à homologia de sítios de ruptura de fita dupla da revelação incluem, mas sem limitações, uma Agrobacteria desarmada, bactérias Ochrobactrum ou bactérias Rhizobiaceae. Em um aspecto, as diferentes cepas bacterianas são selecionadas a partir de (i) uma Agrobacteria desarmada e bactérias Ochrobactrum, (ii) uma Agrobacteria desarmada e bactérias Rhizobiaceae e (iii) bactérias Rhizobiaceae e bactérias Ochrobactrum.
[0084] Em um aspecto, a Agrobacteria desarmada útil nos presentes métodos inclui, mas sem limitações, AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 e LBA4404 THY-.
[0085] Em um aspecto, as cepas bacterianas de Ochrobactrum úteis nos presentes métodos para aprimorar a edição de polinucleotídeos endógenos e heterólogos introduzidos anteriormente e para aprimorar a frequência e eficiência de reparo direcionado à homologia de sítios de ruptura de fita dupla incluem, mas sem limitações, Depósito B- 67078 de Ochrobactrum haywardense H1 NRRL, Ochrobactrum cytisi, Ochrobactrum daejeonense, Ochrobactrum oryzae, Ochrobactrum tritici LBNL124-A-10, HTG3-C-07, Ochrobactrum pecoris, Ochrobactrum ciceri, Ochrobactrum gallinifaecis,
Ochrobactrum grignonense, Ochrobactrum guangzhouense, Ochrobactrum haematophilum, Ochrobactrum intermedium, Ochrobactrum lupini, Ochrobactrum pituitosum, Ochrobactrum pseudintermedium, Ochrobactrum pseudogrignonense, Ochrobactrum rhizosphaerae, Ochrobactrum thiophenivorans e Ochrobactrum tritici reveladas na Publicação de Patente no U.S. 20180216123 incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0086] Em um aspecto, cepas bacterianas de Rhizobiaceae úteis nos presentes métodos para aprimorar a edição de polinucleotídeos endógenos e heterólogos introduzidos anteriormente e para aprimorar a frequência e a eficiência de reparo direcionado à homologia de sítios de ruptura de fita dupla incluem, mas sem limitações, Rhizobium lusitanum, Rhizobium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Rhizobium multihospitium, Rhizobium tropici, Rhizobium miluonense, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli, Rhizobium leguminosarum. bv. viciae, Rhizobium leguminosarum Madison, Rhizobium leguminosarum USDA2370, Rhizobium leguminosarum USDA2408, Rhizobium leguminosarum USDA2668, Rhizobium leguminosarum 2370G, Rhizobium leguminosarum 2370LBA, Rhizobium leguminosarum 2048G, Rhizobium leguminosarum 2048LBA, Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 2668G, Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 2668LBA, Rhizobium leguminosarum RL542C, Rhizobium etli USDA 9032, Rhizobium etli bv. phaseoli, Rhizobium endophyticum, Rhizobium tibeticum, Rhizobium etli, Rhizobium pisi, Rhizobium phaseoli, Rhizobium fabae, Rhizobium hainanense, Arthrobacter viscosus, Rhizobium alamii, Rhizobium mesosinicum, Rhizobium sullae, Rhizobium indigoferae,
Rhizobium gallicum, Rhizobium yanglingense, Rhizobium mongolense, Rhizobium oryzae, Rhizobium loessense, Rhizobium tubonense, Rhizobium cellulosilyticum, Rhizobium soli, Neorhizobium galegae, Neorhizobium vignae, Neorhizobium huautlense, Neorhizobium alkalisoli, Aureimonas altamirensis, Aureimonas frigidaquae, Aureimonas ureilytica. Aurantimonas coralicida, Fulvimarina pelagi, Martelella mediterranea, Allorhizobium undicola, Allorhizobium vitis, Allorhizobium borbor, Beijerinckia fluminensis, Agrobacterium larrymoorei, Agrobacterium radiobacter, Rhizobium selenitireducens corrig. Rhizobium rosettiformans, Rhizobium daejeonense, Rhizobium aggregatum, Pararhizobium capsulatum, Pararhizobium giardinii, Ensifer mexicanus, Ensifer terangae, Ensifer saheli, Ensifer kostiensis, Ensifer kummerowiae, Ensifer fredii, Sinorhizobium americanum, Ensifer arboris, Ensifer garamanticus, Ensifer meliloti, Ensifer numidicus, Ensifer adhaerens, Sinorhizobium sp., Sinorhizobium meliloti SD630, Sinorhizobium meliloti USDA1002, Sinorhizobium fredii USDA205, Sinorhizobium fredii SF542G, Sinorhizobium fredii SF4404, e Sinorhizobium fredii SM542C.. Consultar o documento no U.S. 9.365.859 incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0087] Em um aspecto, as bactérias da classe Alphaproteobacteria, ordem Rhizobiales útil nos presentes métodos para aprimorar a edição de polinucleotídeos endógenos e heterólogos introduzidos anteriormente e para aprimorar a frequência e eficiência de reparo direcionado à homologia de sítios de ruptura de fita dupla incluem, mas sem limitações, bactérias da família Rhizobiaceae, gênero Rhizobium, Chelatobacter, Sinorhizobium e não classificado Rhizobiaceae, a família Bartonellaceae, gênero Bartonella e Bartonellaceae não classificada, a família Brucellaceae, gênero Brucella, Mycoplana, Ochrobactrum, e Brucellaceae não classificada, a família Phyllobacteriaceae, gênero Phyllobacterium, Aminobacter, Aquamicrobium, Defluvibacter, Mesorhizobium, Pseudaminobacter e Phyllobacteriaceae não classificada, a família Methylocystaceae, gênero Methylocytis, Albibacter, Methylosinus, Terasakiella e Methylocystaceae não classificada, a família Beijerinckiaceae, gênero Beijerinckia, e Beijerinckiaceae não classificada e a família Bradyrhizobium, gênero Afipia, Blastobacter, Bosea, Nitrobacter, Rhodoblastus, Rhodopseudomonas e Bradyrhizobiaceae não classificada.
[0088] "Transformação estável" geralmente se refere à introdução de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo hospedeiro resultante em herança geneticamente estável. Após transformação estável, o fragmento de ácido nucleico é integrado de forma estável no genoma do organismo hospedeiro e qualquer geração subsequente. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucleico transformados são chamados de organismos “transgênicos”. “Transformação transiente” geralmente se refere à introdução de um fragmento de ácido nucleico no núcleo, ou organela que contém DNA, de um organismo hospedeiro, resultando em expressão gênica sem herança geneticamente estável.
[0089] O termo "introduzido" significa fornecer um ácido nucleico (por exemplo, construto de expressão) ou proteína a uma célula. Introduzido inclui referência à incorporação de um ácido nucleico em uma célula eucarionte ou procarionte, em que o ácido nucleico pode ser incorporado no genoma da célula e inclui referência à provisão transitória de um ácido nucleico ou proteína à célula. Introduzido inclui referência a métodos de transformação estáveis ou transitórios, assim como cruzamento sexual. Dessa forma, “introduzido”, no contexto da inserção de um fragmento de ácido nucleico (por exemplo, construto de DNA recombinante/construto de expressão) em uma célula, significa “transfecção” ou “transformação” ou “transdução” e inclui referência à incorporação de um fragmento de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica onde o fragmento de ácido nucleico pode ser incorporado no genoma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídio ou DNA mitocondrial), convertido em um replicon autônomo ou expresso de forma transiente (por exemplo, mRNA transfectado).
[0090] “Genoma”, conforme se aplica a células vegetais, abrange não apenas o DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo, mas também DNA de organelas encontrado dentro de componentes subcelulares (por exemplo, mitocôndrias ou plastídios) da célula.
[0091] A "modificação genética" geralmente se refere à modificação de qualquer sequência de ácidos nucleicos ou elemento genético por inserção, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos em uma sequência de nucleotídeos endógenos por edição de genoma ou por inserção de um ácido nucleico recombinante, por exemplo, como parte de um vetor ou construto em qualquer região do DNA genômico de planta por técnicas de transformação de rotina. Exemplos de modificação de componentes genéticos incluem, mas sem limitação, regiões promotoras, líderes não traduzidos 5’, íntrons, genes, regiões não traduzidas 3’ e outras sequências reguladoras ou sequências que afetam a transcrição ou tradução de uma ou mais sequências de ácido nucleico.
[0092] “Planta” inclui referência a plantas inteiras, órgãos vegetais, tecidos vegetais, sementes e células vegetais e sua progênie. As células vegetais incluem, mas sem limitação, células de sementes, culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos.
[0093] São fornecidas plantas que são dicotiledôneas. Os termos “dicotiledônea” e “planta dicotiledônea” são usados de forma intercambiável no presente documento. Uma dicotiledônea da presente revelação inclui as seguintes famílias: Brassicaceae, Leguminosae e Solanaceae.
[0094] Em um aspecto, os métodos da presente revelação podem ser usados para aumentar a eficiência de edição de polinucleotídeos endógenos e heterólogos introduzidos anteriormente e para aprimorar a frequência e eficiência de reparo direcionado à homologia de sítios de ruptura de fita dupla de qualquer espécie de planta, incluindo, mas sem limitações, monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo, mas sem limitações, milho, alfafa, sorgo, arroz, milheto, soja, trigo, algodão, girassol, cevada, aveias, centeio, linhaça, cana-de-açúcar, banana, mandioca, feijão comum, feijão-frade, tomate, batata, beterraba, uva, Eucalípto, choupo, pinha, douglásia, citrinos, mamão, cacau, pepino, maçã, Capsicum, bambu, Triticale, melão e Brassica. Em um aspecto, as monocotiledôneas incluem, porém, sem limitações, cevada, milho, milheto (por exemplo, milheto pérola (Pennisetum glaucum), milheto proso (Panicum miliaceum), milheto tipo rabo de raposa (Setaria italica), milheto tipo dedo (Eleusine coracana)), aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, triticale ou trigo ou culturas de folha e caule, incluindo, porém, sem limitações, bambu, grama marram, poa dos prados, juncos, azevém, cana de açúcar; gramados, gramíneas ornamentais e outras gramíneas como painço amarelo e relva. Alternativamente, as plantas dicotiledôneas usadas na presente revelação incluem, porém, sem limitações, couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da- Índia, alfafa, feijão-fava, tomate, amendoim, mandioca, soja, canola, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão.
[0095] Em aspectos específicos, plantas em que os métodos da presente revelação são úteis para aumentar a eficiência de edição de polinucleotídeos endógenos e heterólogos introduzidos anteriormente e para aprimorar a frequência e a eficiência de reparo direcionado à homologia de sítios de ruptura de fita dupla são plantas de cultura (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, arroz, sorgo, trigo, milheto, tabaco, etc.).
[0096] São fornecidas plantas de progênie. “Progênie” compreende qualquer geração subsequente de uma planta e pode incluir progênie F1, progênie F2, progênie F3, e assim por diante.
[0097] Várias alterações no fenótipo são de interesse incluindo, mas sem limitações, modificar a composição de ácido graxo em uma planta, semente ou óleo extraído da mesma, alterar o perfil de ácido graxo de uma semente de planta, alterar as quantidades de ácidos graxos em uma semente de planta em óleo de semente e similares conforme revelado no presente documento. As plantas que têm um fenótipo desejável e composições de semente e óleo que têm um perfil de ácido graxo conforme revelado no presente documento podem ser geradas modulando a supressão de FAD2 e FAD3, por exemplo, modulando a supressão de múltiplos alelos de FAD2 e FAD3, como um, dois, três ou todos os alelos de FAD2-1A, FAD2-1B, FAD-3a e FAD3b. Os sítios- alvo dentro dos alelos de FAD2 e FAD3 podem ser usados para gerar deleções curtas e modificações como descrito na Tabela
1. Em uma concretização, as plantas e sementes modificadas conforme revelado no presente documento, contêm apenas sequência genômica modificada, sem DNA heterólogo ou estranho restante na planta a partir da modificação ou na região genômica da modificação ou no sítio-alvo. Os exemplos de sítios-alvo em soja incluem GM-FAD2-1 CR1 (SEQ ID NO: 7) em Gm10:50014185..50014166 e Gm20:35317773..35317754 e GM-FAD3 CR2 (SEQ ID NO: 8) em Gm14:45939600..445939618 e Gm02:41423563..41423581.
[0098] São fornecidas sementes, como sementes de soja, que podem ser processadas para produzir óleos, e os óleos produzidos a partir das mesmas, que contêm qualquer combinação de ácido oleico, ácido linolênico, ácido linoleico, ácido erúcico (C:22:1) e ácidos graxos saturados como ácido esteárico e ácido palmítico nas quantidades reveladas no presente documento. Outros ácidos graxos saturados nas sementes de soja e óleos que podem ser aumentados ou reduzidos em comparação com uma planta de controle, semente ou óleo incluem ácido mirístico (C:14:0) e ácido araquídico de ácidos graxos saturados de cadeia longa (C20:0), ácido beênico (C22:0) e ácido lignocérico (C24:0).
[0099] São fornecidas sementes, como sementes de soja, que podem ser processadas para produzir óleos, e os óleos produzidos a partir das mesmas, que têm pelo menos ou pelo menos cerca de 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 ou 90 por cento de ácido oleico (C 18:1) dos ácidos graxos totais em peso e menos que ou menos que cerca de 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 76, 75, 74, 73, 72, 71 ou 70 por cento de ácido oleico dos ácidos graxos totais em peso.
[0100] São fornecidas sementes, como sementes de soja, que podem ser processadas para produzir óleos, e os óleos produzidos a partir das mesmas, que têm pelo menos ou pelo menos cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, ou 3,0 por cento de ácido linolênico (C 18:3) dos ácidos graxos totais em peso e menos que ou menos que cerca de 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0, 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1 ou 2,0 por cento de ácido linolênico dos ácidos graxos totais em peso.
[0101] São fornecidas sementes de soja que podem ser processadas para produzir óleos, e os óleos produzidos a partir das mesmas, que têm pelo menos ou pelo menos cerca de 0,5, 1, 2,3, 4, 5, 6 ou 7 por cento de ácido linoleico (C 18:2) dos ácidos graxos totais em peso e menos que ou menos que cerca de 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ou 3 por cento de ácido linoleico dos ácidos graxos totais em peso.
[0102] São fornecidas sementes, como sementes de soja, que podem ser processadas para produzir óleos, e os óleos produzidos a partir das mesmas, que têm pelo menos ou pelo menos cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, ou 3,0 por cento de ácido esteárico (C 18:0) dos ácidos graxos totais em peso e menos que ou menos que cerca de 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0, 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1 ou 2,0 por cento de ácido esteárico dos ácidos graxos totais em peso.
[0103] São fornecidas sementes, como sementes de soja, que podem ser processadas para produzir óleos, e os óleos produzidos a partir das mesmas, que têm pelo menos ou pelo menos cerca de 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ou 7,0 por cento de ácido palmítico (C 16:0) dos ácidos graxos totais em peso e menos que ou menos que cerca de 12, 11,5, 11,0, 10,5, 10,0, 9,5, 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5, ou 1,0 por cento de ácido palmítico dos ácidos graxos totais em peso.
[0104] São fornecidas sementes, como sementes de soja, que podem ser processadas para produzir óleos, e os óleos produzidos a partir das mesmas, que têm pelo menos ou pelo menos cerca de 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, ou 11,0 por cento de ácidos graxos totais saturados dos ácidos graxos totais em peso e menos que ou menos que cerca de 16, 15,5, 15, 14,5, 14, 13,5, 13,0, 12,5, 12,0, 11,5, 11,0, 10,5, 10,0, 9,5, 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5 ou 2,0 por cento de ácidos graxos totais saturados dos ácidos graxos totais em peso.
[0105] Em um aspecto, as sementes, como sementes de soja, que podem ser processadas para produzir óleos, e os óleos produzidos a partir das mesmas, contêm ácido oleico elevado e ácido linolênico reduzido conforme descrito no presente documento, e opcionalmente outras quantidades modificadas de outros ácidos graxos conforme descrito no presente documento.
[0106] Em um aspecto, esta revelação se refere a células hospedeiras compreendendo os construtos de DNA recombinantes da revelação conforme descrito no presente documento ou polinucleotídeos isolados da revelação conforme descrito no presente documento. Os exemplos de células hospedeiras que podem ser usados para praticar a revelação incluem, mas sem limitações, levedura, bactérias e plantas. Em um aspecto, são fornecidas células hospedeiras de Ochrobactrum compreendendo os construtos de DNA recombinantes da revelação conforme descrito no presente documento para aprimorar ou melhorar a edição de polinucleotídeos endógenos e heterólogos introduzidos anteriormente e para aprimorar ou melhorar a frequência e eficiência de reparo direcionado à homologia de sítios de ruptura de fita dupla.
[0107] Um modelo de modificação de polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula por um método conhecido na técnica, como, mas sem limitações, métodos de introdução transitória, transfecção, transformação, eletroporação, microinjeção, entrega mediada por partícula, aplicação tópica, entrega mediada por capilaridades, entrega por meio de peptídeos de penetração celular ou entrega direta mediada por nanopartícula de sílica mesoporosa (MSN). Em um aspecto, um cassete de modelo de modificação de polinucleotídeo é introduzido em uma célula por transformação mediada por Ochrobactrum.
[0108] O modelo de modificação de polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula como uma molécula de polinucleotídeo de fita única, uma molécula de polinucleotídeo de fita dupla ou como parte de um DNA circular (DNA de vetor). O molde de modificação polinucleotídica pode também ser ligado ao RNA-guia e/ou à endonuclease Cas. Os DNAs ligados podem permitir a colocalização de DNA-alvo e modelo, útil na edição de genoma e regulação de genoma direcionada, e também podem ser úteis no direcionamento de células pós-mitóticas, em que se espera que a função de maquinário de HR endógeno seja altamente reduzida (Mali et al. 2013 Nature Methods Vol. 10: 957 a 963.) O modelo de modificação de polinucleotídeo pode estar presente transitoriamente na célula ou pode ser introduzido por meio de um replicon viral.
[0109] Um “nucleotídeo modificado” ou “nucleotídeo editado” refere-se a uma sequência nucleotídica de interesse que compreende pelo menos uma alteração em comparação à sua sequência nucleotídica não modificada. Tais “alterações” incluem, por exemplo: (i) substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii).
[0110] O termo "modelo de modificação de polinucleotídeo" inclui um polinucleotídeo que compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo em comparação com a sequência de nucleotídeos a ser editada. Uma modificação nucleotídica pode ser pelo menos uma substituição, adição ou deleção nucleotídica. Opcionalmente, o modelo de modificação de polinucleotídeo pode compreender ainda sequências homólogas de nucleotídeos flanqueando a pelo menos uma modificação de nucleotídeo, em que as sequências homólogas de nucleotídeos de flanqueamento fornecem homologia suficiente à sequência de nucleotídeos desejada a ser editada.
[0111] O processo de edição de uma sequência genômica que combina DSB e moldes de modificação compreende em geral: fornecer, a uma célula hospedeira, um agente de indução de DSB, ou um ácido nucleico que codifique um agente de indução de DSB, que reconhece uma sequência-alvo na sequência cromossômica e tem capacidade para induzir uma DSB na sequência genômica, e pelo menos um molde de modificação polinucleotídica que compreende pelo menos uma alteração nucleotídica em comparação à sequência nucleotídica a ser editada. O molde de modificação polinucleotídica pode compreender, ainda, sequências nucleotídicas que flanqueiam a pelo menos uma alteração nucleotídica, em que as sequências flanqueadoras são substancialmente homólogas à região cromossômica que flanqueia a DSB.
[0112] A endonuclease pode ser fornecida a uma célula por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, porém sem limitação, métodos de introdução transiente, transfecção, microinjeção e/ou aplicação tópica ou indiretamente por meio de construtos de recombinação. A endonuclease pode ser fornecida como uma proteína ou como um complexo de polinucleotídeo guiado diretamente a uma célula ou indiretamente por meio de construtos de recombinação. Em um aspecto, a endonuclease compreende um cassete de endonuclease e é introduzida em uma célula por transformação mediada por Ochrobactrum. A endonuclease pode ser introduzida em uma célula de maneira transiente ou pode ser incorporada no genoma da célula hospedeira com o uso de qualquer método conhecido na técnica. No caso de um sistema de CRISPR-Cas, a absorção da endonuclease e/ou do polinucleotídeo guiado na célula pode ser facilitada com um Peptídeo de Penetração Celular (CPP) conforme descrito na Publicação de Patente no U.S. 20170035300, incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0113] Como usado no presente documento, uma “região genômica” é um segmento de um cromossomo no genoma de uma célula que está presente em qualquer lado do sítio-alvo ou, alternativamente, também compreende uma porção do sítio-alvo. A região genômica pode compreender pelo menos 5-10, 5-15, 5- 20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5- 50, 5-55, 5-60, 5-65, 5- 70, 5-75, 5-80, 5-85, 5-90, 5-95, 5-100, 5-200, 5-300, 5-400, 5-500, 5-600, 5-700, 5-800, 5-900, 5-1000, 5-1100, 5-1200, 5- 1300, 5-1400, 5-1500, 5-1600, 5-1700, 5-1800, 5-1900, 5-2000, 5-2100, 5-2200, 5-2300, 5-2400, 5-2500, 5-2600, 5-2700, 5-
2800. 5-2900, 5-3000, 5-3100 ou mais de bases de modo que a região genômica tenha homologia suficiente para ser submetida à recombinação homóloga com a região correspondente de homologia.
[0114] As nucleases efetoras TAL (TALEN) são uma classe de nucleases específicas para sequências que podem ser usadas para realizar quebras de fita dupla em sequências-alvo específicas no genoma de uma planta ou outro organismo (Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143 a 148).
[0115] As nucleases de dedo de zinco (ZFN) são agentes de indução de quebra de fita dupla modificados compreendidos por um domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco e um domínio de agente de indução de quebra de fita dupla.
[0116] A edição de genoma usando agentes de indução de DSB, como complexos de Cas9-gRNA, foi descrita, por exemplo, nas Publicações de Patente nos U.S. 20150082478 A1, 20150059010 A1, 20170306349 A1 e 20170226533 A1, todas as quais são incorporadas no presente documento a título de referência em suas totalidades.
[0117] O termo "gene de Cas" no presente documento se refere a um gene que é geralmente acoplado, associado ou perto de, ou nas proximidades de loci de CRISPR de flanqueamento em sistemas bacterianos. Os termos “gene de Cas”, “gene associado a CRISPR (Cas)” são usados de forma intercambiável no presente documento. O termo “endonuclease Cas” no presente documento se refere a uma proteína codificada por um gene de Cas. Uma Cas endonuclease no presente documento, quando em complexo com um componente de polinucleotídeo adequado, é capaz de reconhecer, ligação a, e opcionalmente, cortar ou clivar toda ou parte de uma sequência-alvo de DNA específico. Uma endonuclease Cas descrita no presente documento compreende um ou mais domínios de nuclease. As Cas endonucleases da revelação incluem aquelas que têm um domínio de nuclease de HNH ou tipo HNH e/ou um domínio de nuclease de RuvC ou tipo RuvC. Uma Cas endonuclease da revelação inclui uma proteína de Cas9, uma proteína de Cpf1, uma proteína de C2c1, uma proteína de C2c2, uma proteína de C2c3, Cas3, Cas 5, Cas7, Cas8, Cas10, ou complexos das mesmas.
[0118] Conforme usados no presente documento, os termos “complexo de polinucleotídeo-guia/endonuclease Cas”, “sistema de polinucleotídeo-guia/endonuclease Cas”, “ complexo de polinucleotídeo-guia/Cas”, “sistema de polinucleotídeo-
guia/Cas”, “sistema de Cas guiado” são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a pelo menos um polinucleotídeo-guia e pelo menos uma endonuclease Cas que têm capacidade para formar um complexo, em que o dito complexo de polinucleotídeo-guia/endonuclease Cas pode direcionar a endonuclease Cas a um sítio-alvo de DNA, que permite que a endonuclease Cas reconheça, se ligue a, e opcionalmente corte ou clive (introduza uma quebra de fita simples ou dupla) o sítio-alvo de DNA.
Um complexo de polinucleotídeo- guia/endonuclease Cas no presente documento pode compreender proteína(s) Cas e componente(s) polinucleotídico(s) adequado(s) de qualquer um dos quatro sistemas CRISPR conhecidos (Horvath e Barrangou, 2010, Science 327:167 a 170), tal como um sistema de CRISPR de tipo I, II ou III.
Uma endonuclease Cas desenrola o dúplex de DNA na sequência-alvo e, opcionalmente, cliva pelo menos uma fita de DNA, conforme mediado por reconhecimento da sequência-alvo por um polinucleotídeo (tal como, mas não se limitando a, um crRNA ou RNA-guia) que está no complexo com a proteína Cas.
Tal reconhecimento e corte de uma sequência-alvo por uma endonuclease Cas ocorre tipicamente se o motivo adjacente ao protoespaçador (PAM, do inglês “protospacer-adjacent motif”) correto estiver localizado na, ou adjacente à, extremidade 3' da sequência-alvo de DNA.
Alternativamente, uma proteína de Cas no presente documento pode ser desprovida de atividade de clivagem ou corte de DNA, mas ainda pode se ligar especificamente a uma sequência-alvo de DNA quando complexada com um componente de RNA adequado. (Consultar ainda o Pedido de Patente de no U.S. 2015-0082478 A1, publicado em 19 de março de 2015 e no U.S. 2015-0059010 A1, publicado em 26 de fevereiro de 2015, ambos aqui incorporados em sua totalidade a título de referência).
[0119] Um complexo de polinucleotídeo-guia/Cas endonuclease pode clivar uma ou ambas as fitas de uma sequência-alvo de DNA. Um complexo de polinucleotídeo-guia/Cas endonuclease que pode clivar ambas as fitas de uma sequência- alvo de DNA tipicamente compreende uma proteína de Cas que tem todos os seus domínios de endonuclease em um estado funcional (por exemplo, domínios de endonuclease de tipo selvagem ou variantes dos mesmos retendo alguma ou toda a atividade em cada domínio de endonuclease). Os exemplos não limitantes de Cas9 nicases adequadas para uso no presente documento são revelados na Publicação de Patente de no U.S. 20140189896 A1, que é incorporada no presente documento a título de referência.
[0120] Outros sistemas de Cas endonuclease foram descritos na Publicação de Patente no U.S. 20180258417 A1, incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0121] “Cas9" (anteriormente chamada de Cas5, Csn1 ou Csx12) no presente documento se refere a uma Cas endonuclease de um sistema de CRISPR tipo II que forma um complexo com um crNucleotídeo e um tracrNucleotídeo, ou com um polinucleotídeo-guia único, para reconhecer especificamente e clivar toda ou parte de uma sequência-alvo de DNA. A proteína de Cas9 compreende um domínio de RuvC nuclease e um domínio de HNH (H-N-H) nuclease, sendo que cada um deles pode clivar uma fita de DNA única em uma sequência-alvo (a ação concertada de ambos os domínios leva à clivagem de fita dupla, enquanto a atividade de um domínio leva a um corte). Em geral, o domínio de RuvC compreende os subdomínios I, II e III, em que o domínio
I está localizado próximo à terminação N de Cas9 e os subdomínios II e III estão localizados no meio da proteína, flanqueando o domínio HNH (Hsu et al, Cell 157:1.262 a 1.278). Um sistema de CRISPR do tipo II inclui um sistema de clivagem de DNA que utiliza uma endonuclease Cas9 em complexo com pelo menos um componente polinucleotídico. Por exemplo, uma Cas9 pode estar em complexo com um CRISPR RNA (crRNA) e um CRISPR RNA de transativação (tracrRNA). Em um outro exemplo, uma Cas9 pode estar em um complexo com um RNA-guia único.
[0122] Qualquer endonuclease guiada pode ser usada nos métodos divulgados no presente documento. Tais endonucleases incluem, mas sem limitações, Cas9 e Cpf1 endonucleases. Muitas endonucleases foram descritas até o presente momento, as quais podem reconhecer sequências de PAM específicas (consulta, por exemplo –Jinek et al. (2012) Science 337 páginas 816 a 821, pedidos de patente de PCT PCT/US16/32073, depositado em 12 de maio de 2016 e PCT/US16/32028 depositado em 12 de maio de 2016 e Zetsche B et al. 2015. Cell 163, 1013) e clivar o DNA-alvo em uma posição específica. Entende-se que com base nos métodos e concretizações descritos no presente documento que utilizam um sistema de Cas guiado, um indivíduo pode agora adaptar esses métodos de modo que os mesmos possam utilizar qualquer sistema de endonuclease guiada.
[0123] O polinucleotídeo-guia também pode ser uma molécula única (também chamado de polinucleotídeo-guia único) que compreende uma sequência de crNucleotídeo ligada a uma sequência de tracrNucleotídeo. O polinucleotídeo-guia único compreende um primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (chamado de domínio de Direcionamento Variável ou domínio de VT) que pode hibridizar com uma sequência de nucleotídeos em um DNA-alvo e um domínio de reconhecimento de Cas endonuclease (domínio de CER), que interage com um polipeptídeo de Cas endonuclease.
[0124] Em um aspecto, o polinucleotídeo-guia pode ser introduzido em uma célula de modo transitório, como polinucleotídeo de fita única ou um polinucleotídeo de fita dupla, usando qualquer método conhecido na técnica como, mas sem limitações, bombardeamento de partícula, transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por Ochrobactrum, transformação mediada por Rhizobiaceae ou aplicações tópicas. Em um aspecto, o polinucleotídeo-guia também pode ser introduzido indiretamente em uma célula introduzindo uma molécula de DNA recombinante (por meio de métodos como, mas sem limitações, bombardeamento de partícula, transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por Ochrobactrum, transformação mediada por Rhizobiaceae ou aplicações tópicas) compreendendo um fragmento de ácido nucleico heterólogo codificando um polinucleotídeo-guia, operacionalmente ligado a um promotor específico que é capaz de transcrever o RNA-guia na dita célula. O promotor específico pode ser, mas sem limitações, um promotor de RNA polimerase III, que permite a transcrição de RNA com extremidades 5' e 3' não modificadas precisamente definidas (DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. 41: 4.336 a 4.343; Ma et al., Mol. Ther. Nucleic Acids 3:e161) conforme descrito no documento WO2016025131, publicado em 18 de fevereiro de 2016, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0125] Os termos "sítio-alvo", "sequência-alvo", "sequência de sítio-alvo, "DNA-alvo", "locus-alvo", "sítio- alvo genômico", "sequência-alvo genômica", "locus-alvo genômico" e "protoespaçador" são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a um polinucleotídeo sequência como, mas sem limitações, uma sequência de nucleotídeos em um cromossomo, epissomo ou qualquer outra molécula de DNA no genoma (incluindo DNA cromossômico, cloroplástico, mitocondrial, DNA de plasmídeo) de uma célula, em que um complexo de polinucleotídeo-guia/Cas endonuclease pode reconhecer, se ligar e opcionalmente cortar ou clivar.
O sítio-alvo pode ser um sítio endógeno no genoma de uma célula, ou alternativamente, o sítio-alvo pode ser heterólogo à célula e, assim, não ser de ocorrência natural no genoma da célula, ou o sítio-alvo pode ser encontrado em uma localização genômica heteróloga em comparação com onde ocorre na natureza.
Conforme usados no presente documento, os termos “sequência-alvo endógena” e “sequência-alvo nativa” são usados de modo intercambiável no presente documento e referem-se a uma sequência-alvo que é endógena ou nativa do genoma de uma célula e está na posição endógena ou nativa dessa sequência-alvo no genoma da célula.
As células incluem, mas sem limitações, células humanas, não humanas, animais, bacterianas, fúngicas, de inseto, levedura, levedura não convencional e de planta, assim como plantas e sementes produzidas pelos métodos descritos no presente documento.
Um “sítio-alvo artificial” ou “sequência-alvo artificial” são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência-alvo que foi introduzida no genoma de uma célula.
Tal sequência-alvo artificial pode ter sequência idêntica a uma sequência-alvo endógena ou nativa no genoma de uma célula, mas estar localizada em uma posição diferente (isto é, uma posição não endógena ou não nativa) no genoma de uma célula.
[0126] São fornecidas plantas e sementes que contêm um sítio-alvo ou sequência alterado ou modificado. Um “sítio-alvo alterado”, “sequência-alvo alterada”, “sítio-alvo modificado” e “sequência-alvo modificada” são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência-alvo, conforme revelado no presente documento, que compreende pelo menos uma alteração em comparação com uma sequência-alvo não alterada. Tais “alterações” incluem, por exemplo: (i) substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii).
[0127] Os métodos para “modificar um sítio-alvo” e “alterar um sítio-alvo” são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a métodos para produzir um sítio-alvo alterado.
[0128] O comprimento da sequência de DNA-alvo (sítio- alvo) pode variar, e inclui, por exemplo, sítios-alvo que têm pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais nucleotídeos em comprimento. É possível ainda que o sítio-alvo possa ser palindrômico, isto é, a sequência em uma fita é lida igual na direção oposta na fita complementar. O sítio de corte/clivagem pode estar dentro da sequência-alvo ou o sítio de corte/clivagem pode estar fora da sequência-alvo. Em outra variação, a clivagem poderia ocorrer em posições nucleotídicas imediatamente opostas uma à outra para produzir um corte de extremidade cega ou, em outros casos, as incisões poderiam ser escalonadas para produzir projeções de fita simples, também chamadas de “extremidades coesivas”, que podem ser projeções 5' ou projeções 3'. As variantes ativas de sítios-alvo genômicos também podem ser usadas. Tais variantes ativas podem compreender pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com o dado sítio-alvo, em que as variantes ativas retêm atividade biológica e, portanto, são capazes de ser reconhecidas e clivadas por uma Cas endonuclease. Ensaios para medir a ruptura de fita única ou dupla de um sítio-alvo por uma endonuclease são conhecidos na técnica e geralmente medem a atividade e especificidade gerais do agente nos substratos de DNA contendo sítios de reconhecimento.
[0129] Os termos "direcionar", "direcionamento de gene" e "direcionamento de DNA" são usados de modo intercambiável no presente documento. No presente documento, o direcionamento de DNA pode ser a introdução específica de um knockout, edição ou knockin em uma sequência de DNA específica, tal como em um cromossomo ou plasmídeo de uma célula. Em geral, o direcionamento de DNA pode ser realizado no presente documento por clivagem de uma ou de ambas as fitas em uma sequência específica de DNA em uma célula com uma endonuclease associada a um componente polinucleotídico adequado. Tal clivagem de DNA, se for uma ruptura de fita dupla (DSB), pode induzir processos de NHEJ ou HDR que podem levar a modificações no sítio-alvo.
[0130] Um método de direcionamento no presente documento pode ser realizado de tal modo que dois ou mais sítios-alvo de DNA sejam direcionados no método, por exemplo. Tal método pode ser opcionalmente caracterizado como um método multiplex. Dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais sítios-alvo podem ser direcionados ao mesmo tempo em certas concretizações. Um método multiplex é tipicamente realizado por um método de direcionamento no presente documento no qual múltiplos componentes diferentes de RNA são fornecidos, cada um concebido para guiar um complexo de polinucleotídeo- guia/endonuclease Cas para um sítio-alvo de DNA exclusivo.
[0131] Em um aspecto, são fornecidas plantas e sementes em que uma sequência funcional foi submetida a knock out. Os termos "knockout", "gene knockout" e "knockout genético" são usados de modo intercambiável no presente documento. Um knockout representa uma sequência de DNA de uma célula que foi tornada parcial ou completamente inoperante direcionando-se esta com uma proteína Cas; uma tal sequência de DNA antes do knockout poderia ter codificado uma sequência de aminoácidos, ou poderia ter tido uma função reguladora (por exemplo, promotor), por exemplo. Um knock-out pode ser produzido por uma indel (inserção ou deleção de bases nucleotídicas em uma sequência de DNA-alvo através de NHEJ), ou por meio de remoção específica de uma sequência que reduz ou destrói completamente a função da sequência no, ou próximo ao, sítio-alvo.
[0132] O sistema de polinucleotídeo-guia/endonuclease Cas pode ser usado em combinação com um molde polinucleotídico de modificação coentregue para permitir a edição (modificação) de uma sequência nucleotídica genômica de interesse. (Consultar, Publicações de Patente nos U.S. 20150082478 A1 e 20150059010 A1, ambas as quais são aqui incorporadas no presente documento a título de referência em suas totalidades.)
[0133] São fornecidas plantas e sementes em que uma sequência funcional foi submetida a knockin. Os termos "knockin", "knockin de gene”, "inserção de gene" e "knockin genético" são usados de modo intercambiável no presente documento. Um knockin representa a substituição ou inserção de uma sequência de DNA em uma sequência de DNA específica na célula direcionando com uma proteína de Cas (por HR, em que um polinucleotídeo de DNA de doador adequado também é usado). Os exemplos de knockin são uma inserção específica de uma sequência codificante de aminoácidos heteróloga em uma região codificante de um gene, ou uma inserção específica de um elemento regulador transcricional em um loco genético.
[0134] A similaridade estrutural entre uma dada região genômica e a região correspondente de homologia encontrada no DNA de doador pode ser qualquer grau de identidade de sequência que permita que a recombinação homóloga ocorra. Por exemplo, a quantidade de homologia ou identidade de sequência compartilhada pela "região de homologia" do DNA doador e a "região genômica" do genoma de organismo pode ser de pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência, de modo que as sequências sofram recombinação homóloga
[0135] A região de homologia no DNA doador pode ter homologia para qualquer sequência que flanqueia o sítio-alvo. Embora em algumas concretizações as regiões de homologia compartilhem homologia de sequência significativa com a sequência genômica flanqueando imediatamente o sítio-alvo, é reconhecido que as regiões de homologia podem ser projetadas para terem homologia suficiente com regiões que podem ser adicionalmente 5' ou 3' ao sítio-alvo. Ainda em outras concretizações, as regiões de homologia também podem ter homologia com um fragmento do sítio-alvo juntamente com regiões genômicas a jusante. Em uma concretização, a primeira região de homologia compreende ainda um primeiro fragmento do sítio- alvo e a segunda região de homologia compreende um segundo fragmento do sítio-alvo, em que o primeiro e o segundo fragmentos são dissimilares.
[0136] Como usado no presente documento, “recombinação homóloga” inclui a troca de fragmentos de DNA entre duas moléculas de DNA nos sítios de homologia.
[0137] Usos adicionais para sistemas de RNA-guia/Cas endonuclease foram descritos (consultar Publicações de Patente nos U.S. 20150082478 A1, 20150059010 A1, 20170306349 A1 e 20170226533 A1, todas as quais são incorporadas no presente documento a título de referência em suas totalidades) e incluem, mas sem limitações, modificação ou substituição de sequências de nucleotídeos de interesse (como elementos reguladores), inserção de polinucleotídeos de interesse, knockout de gene, knockin de gene, modificação de sítios de splicing e/ou introdução de sítios de splicing alternados, modificações de sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína de interesse, fusões de aminoácido e/ou proteína e silenciamento de gene por expressão de uma repetição invertida em um gene de interesse.
[0138] Os métodos para transformar dicotiledôneas, por uso de transformação mediada por Ochrobactrum revelados na Publicação de Patente no U.S. 20180216123 incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade, transformação mediada por Rhizobiaceae (consultar o documento no U.S. 9.365.859 incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade), e transformação mediada por
Agrobacterium, e obtenção de plantas transgênicas foram publicados.
[0139] Há uma variedade de métodos para a regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais. O método particular de regeneração dependerá do tecido de planta de partida e da espécie de planta particular a ser regenerada.
[0140] Em um aspecto, esta revelação também se refere a métodos para aumentar a eficiência de edição de um sítio- alvo de um traço de interesse ou uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma planta que compreendem: (a) fornecer a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar ao sítio-alvo do traço ou nucleotídeo de interesse, um cassete de modelo de modificação de traço ou nucleotídeo de interesse, em que o cassete de modelo de modificação de traço ou nucleotídeo de interesse compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo do traço ou nucleotídeo de interesse, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza uma ruptura de fita dupla no sítio-alvo do traço ou nucleotídeo de interesse e o cassete de modelo de modificação de traço ou nucleotídeo de interesse é capaz de realizar pelo menos uma modificação de nucleotídeo no sítio- alvo do traço ou nucleotídeo de interesse; (b) identificar pelo menos uma célula vegetal de (a) que tem uma modificação no sítio-alvo do traço ou nucleotídeo de interesse, em que a modificação inclui pelo menos uma deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos no sítio-alvo do traço ou nucleotídeo de interesse; e (c) regenerar uma planta da pelo menos uma célula vegetal de (b) que tem a modificação no sítio-alvo do traço ou nucleotídeo de interesse que tem eficiência de edição aumentada em comparação com uma planta de controle que tem uma modificação no sítio-alvo do traço ou nucleotídeo de interesse fornecido por uma planta de controle T-DNA de edição, em que a planta de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar ao sítio-alvo e em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem no sítio-alvo.
[0141] Em um aspecto, esta revelação também se refere a métodos para aumentar a eficiência de alteração do perfil de ácido graxo na semente de uma planta que compreendem: (a) fornecer a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, um cassete de modelo de modificação de polinucleotídeo, em que o cassete de modelo de modificação de polinucleotídeo compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo de uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA- guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza uma ruptura de fita dupla na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas e o cassete de modelo de modificação de polinucleotídeo possibilita pelo menos uma modificação de nucleotídeo da sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, da sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou a combinação das mesmas; (b) obter uma planta da célula vegetal de (a); (c) avaliar a planta de (b) quanto à presença da pelo menos uma modificação de nucleotídeo; (d) selecionar uma planta de progênie de (c) tendo um perfil de ácido graxo alterado; e
(e) obter semente da planta de progênie de (d) que tem eficiência de edição aumentada em comparação com uma semente de controle de uma planta que tem uma modificação da sequência genômica de FAD2, da sequência genômica de FAD3, ou a combinação das mesmas fornecida por uma semente de controle T- DNA de edição, em que a semente de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo codificando um RNA-guia, e em que o RNA-guia é complementar ao sítio-alvo e em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem no sítio-alvo. O exame adicional de uma planta de progênie de (c) que tem um perfil de ácido graxo alterado pode ser realizado para obter uma planta de progênie que também é desprovida do RNA-guia e da Cas endonuclease.
[0142] Em um aspecto, esta revelação também se refere a métodos para aumentar a eficiência de edição de um sítio- alvo em uma planta, o método compreendendo: (a) fornecer a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável em uma orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar ao sítio-alvo, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA- guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem no sítio-alvo; (b) identificar pelo menos uma célula vegetal dentre (a) que tem uma modificação no sítio-alvo, em que a modificação inclui pelo menos uma deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos no sítio-alvo; e (c) regenerar uma planta a partir da pelo menos uma célula vegetal dentre (b) que tem a modificação no sítio-alvo que tem eficiência de edição aumentada em comparação com uma planta de controle que tem uma modificação no sítio-alvo fornecida por uma planta de controle T-DNA de edição, em que a planta de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA- guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo codificando um RNA-guia, em que o RNA- guia é complementar ao sítio-alvo, e em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem no sítio-alvo.
[0143] Em um aspecto, esta revelação também se refere a métodos para aumentar a eficiência da alteração do perfil de ácido graxo na semente de uma planta, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta ou uma combinação das mesmas, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA- guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas; (b) obter uma planta da célula vegetal de (a); (c) avaliar a planta de (b) quanto à presença da pelo menos uma modificação de nucleotídeo; (d) selecionar uma planta de progênie de (c) tendo um perfil de ácido graxo alterado; e (e) obter semente da planta de progênie de (d) que tem eficiência de edição aumentada em comparação com uma semente de controle de uma planta que tem uma modificação da sequência genômica de FAD2, da sequência genômica de FAD3, ou a combinação das mesmas fornecida por uma semente de controle T- DNA de edição, em que a semente de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo codificando um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas.
[0144] Em um aspecto, esta revelação também se refere a métodos para aumentar a eficiência da alteração do perfil de ácido graxo na semente de uma planta, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta ou uma combinação das mesmas, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA- guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas; (b) obter uma planta da célula vegetal de (a); (c) avaliar a planta de (b) quanto à presença da pelo menos uma modificação de nucleotídeo; (d) realizar uma triagem de uma planta de progênie de (c) que tem um perfil de ácido graxo alterado que é desprovido do RNA-guia e da Cas endonuclease; e (e) obter semente da planta de progênie de (d) que tem eficiência de edição aumentada em comparação com uma semente de controle de uma planta que tem uma modificação da sequência genômica de FAD2, da sequência genômica de FAD3, ou a combinação das mesmas fornecida por uma semente de controle T- DNA de edição, em que a semente de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo codificando um RNA-guia, e em que o RNA-guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas.
[0145] Em um aspecto, esta revelação também se refere a métodos para aumentar a eficiência de introdução de um nucleotídeo de interesse em um sítio-alvo no genoma de uma planta, o método compreendendo: (a) fornecer a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável em uma orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA- guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease clive no sítio-alvo; (b) colocar a célula vegetal de (a) em contato com um DNA de doador compreendendo o polinucleotídeo de interesse; (c) identificar pelo menos uma célula vegetal de (b) compreendendo em seu genoma o polinucleotídeo de interesse integrado no sítio-alvo; e (d) regenerar uma planta da pelo menos uma célula vegetal que tem em seu genoma o polinucleotídeo de interesse integrado no sítio-alvo que tem eficiência aumentada de introdução do polinucleotídeo de interesse no sítio-alvo no genoma da célula vegetal em comparação com uma planta de controle que tem uma introdução do polinucleotídeo de interesse no sítio-alvo no genoma da célula vegetal fornecida por uma planta de controle
T-DNA de edição, em que a planta de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease clive no sítio-alvo.
[0146] Em um aspecto, o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia. Em um aspecto, o cassete de expressão de RNA-guia do T-DNA de edição é adjacente à borda direita e pode ser separado da borda direita por um ou mais elementos espaçadores e opcionalmente pode ser separado da borda direita por um ou mais elementos que facilitam análise de PCR. Os exemplos não limitantes de T- DNAs de edição úteis na presente revelação são mostrados da Figura 8 à Figura 16. Consulta, ainda, a Figura 1A e a Figura 1C.
[0147] Em um aspecto, a planta de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável, em orientação de uma borda esquerda para uma borda direita, um cassete de expressão de RNA-guia. Em um aspecto, o cassete de expressão de RNA-guia do T-DNA de edição é adjacente à borda esquerda e pode ser separado da borda esquerda por um ou mais elementos espaçadores e opcionalmente pode ser separado da borda direita por um ou mais elementos que facilitam análise de PCR. Consultar a Figura 1B e a Figura 1D.
[0148] A transformação e seleção podem ser alcançadas usando métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica incluindo, mas sem limitações, os métodos descritos no presente documento.
[0149] As sementes de soja podem ser processadas para produzir óleo e proteína. São fornecidos métodos para processar as sementes de soja para produzir óleo e proteína que incluem uma ou mais etapas de descascamento das sementes, trituração das sementes, aquecimento das sementes, tal como com vapor, extração do óleo, torrefação e extrusão. O processamento e a extração de óleo podem ser realizados com o uso de solventes ou extração mecânica.
[0150] Produtos formados após o processamento incluem, sem limitação, nozes de soja, leite de soja, tofu, proteína de soja texturizada, óleo de soja, flocos de proteína de soja, proteína de soja isolada. Óleo brito ou parcialmente degomado pode ser adicionalmente processado por uma ou mais dentre degomagem, tratamento alcalino, absorção com sílica, clarificação a vácuo, hidrogenação, interesterificação, filtração, desodorização, refinamento físico, refracionamento e mesclagem opcional para produzir óleo refinado, clarificado e desodorizado (RBD).
[0151] O óleo e a proteína podem ser usados em ração animal e em produtos alimentícios para consumo humano. São fornecidos produtos alimentares e alimento animal compreendendo óleos, proteína e composições descritos no presente documento. Os produtos alimentares e alimento animal podem compreender nucleotídeos compreendendo um ou mais dos alelos modificados revelados no presente documento.
[0152] São fornecidos métodos para detectar os polinucleotídeos modificados. Os métodos para extrair DNA modificado de uma amostra ou detectar a presença de DNA correspondente às sequências genômicas modificadas compreendendo deleções de FAD2-1 e FAD3, como apresentado da Figura 3A à Figura 3B, Figura 4A à Figura 4B e Figura 5A à Figura 5B podem ser executados. Tais métodos compreendem colocar uma amostra compreendendo DNA genômico de soja em contato com um conjunto de iniciador de DNA, que, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), com DNA genômico extraído de soja produz um amplicon que é diagnóstico para a presença ou ausência dos alelos de FAD2-1A e FAD3 modificados. Os métodos incluem as etapas de realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo, assim, o amplicon e detectando o amplicon.
[0153] Em algumas concretizações, um dentre o par de moléculas de DNA compreende a sequência de tipo selvagem em que a modificação ocorre com a segunda dentre o par estando a montante ou a jusante, conforme apropriado, e adequadamente em proximidade da sequência de tipo selvagem em que a modificação ocorre, de modo que um amplicon seja produzido quando o alelo de tipo selvagem esteja presente, porém, nenhum amplicon seja produzido quando o alelo modificado estiver presente. Os iniciadores e as sondas adequados para uso em reações para detectar a presença dos alelos de FAD2-1A (por exemplo, SEQ ID NOs: 11, 12 e 13 e fragmentos funcionais das mesmas), FAD2-1B (por exemplo, SEQ ID NOs: 14, 12 e 15 e fragmentos funcionais das mesmas), FAD3a (por exemplo, SEQ ID NOs: 16, 17 e 18 e fragmentos funcionais das mesmas) e FAD3b (por exemplo, SEQ ID NOs: 19, 17 e 18 e fragmentos funcionais das mesmas) são fornecidos na Tabela 3 e descritos no Exemplo 4. No contexto dos métodos, em proximidade significa suficientemente perto, de modo que a distância entre a primeira e a segunda do par de moléculas de DNA facilite a produção de um amplicon quando incluído em uma reação de amplificação de DNA compreendendo DNA genômico de soja. Por exemplo, o segundo iniciador pode se ligar em uma localização começando em, dentro ou menos que 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 16, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3500, 4000, 4500 ou 5000 nucleotídeos a montante ou a jusante da extremidade do sítio de ligação da primeira molécula de iniciador de DNA.
[0154] São fornecidos sondas e iniciadores que têm comprimento de nucleotídeos suficiente para se ligarem especificamente à sequência de DNA-alvo sob condições de reação ou hibridização. As sondas e os iniciadores adequados têm pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento, e menos que 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 2,5 2,4 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, ou 12 nucleotídeos de comprimento. Tais sondas e iniciadores podem ser hibridizar especificamente a uma sequência-alvo sob condições de hibridização de alta estringência. De preferência, sondas e iniciadores têm similaridade de sequência de DNA completa ou de 100% de nucleotídeos contíguos com a sequência-alvo, embora sondas que difiram da sequência de DNA-alvo, mas retenham a capacidade para se hibridizarem à sequência de DNA-alvo, também possam ser usadas. Complementos reversos dos iniciadores e sondas revelados no presente documento também são fornecidos e podem ser usados nos métodos e composições descritos no presente documento.
[0155] Em algumas concretizações, uma dentre o par de moléculas de DNA compreende a modificação ou atravessa a junção de modificação como as junções de deleção representadas nas Figuras 1 a 3, com a segunda molécula de DNA do par estando a montante ou a jusante da sequência genômica, conforme apropriado, de modo que um amplicon seja produzido quando o alelo modificado estiver presente, porém, nenhum amplicon é produzido quando o alelo de tipo selvagem está presente. Os iniciadores adequados para uso em reações para detectar a presença dos alelos modificados podem ser projetados com base nas sequências de junção representadas da Figura 3A à Figura 3B, Figura 4A à Figura 4B e Figura 5A à Figura 5B para os alelos modificados.
[0156] Por exemplo, para a SEQ ID NO: 55, a junção de deleção ocorre entre as posições 27 e 28; um iniciador pode ser projetado, o qual começa (ou inclui, se começara antes da posição 1) na posição 1 através da posição 27 e termina (ou inclui, se terminar após a posição 55) na posição 29 a 55, desde que o iniciador seja de comprimento suficiente para funcionar na reação de amplificação. O complemento reverso de tal iniciador também é fornecido.
[0157] Por exemplo, para a SEQ ID NO: 56, a junção de deleção ocorre entre as posições 23 e 24; um iniciador pode ser projetado, o qual começa (ou inclui, se começara antes da posição 1) na posição 1 através da posição 23 e termina (ou inclui, se terminar após a posição 55) na posição 24 a 55, desde que o iniciador seja de comprimento suficiente para funcionar na reação de amplificação. O complemento reverso de tal iniciador também é fornecido.
[0158] Por exemplo, para a SEQ ID NO: 47, a junção de deleção ocorre entre as posições 27 e 28; um iniciador pode ser projetado, o qual começa (ou inclui, se começara antes da posição 1) na posição 1 através da posição 27 e termina (ou inclui, se terminar após a posição 57) na posição 28 a 57, desde que o iniciador seja de comprimento suficiente para funcionar na reação de amplificação. O complemento reverso de tal iniciador também é fornecido.
[0159] Por exemplo, para a SEQ ID NO: 61, a junção de deleção ocorre entre as posições 27 e 28; um iniciador pode ser projetado, o qual começa (ou inclui, se começara antes da posição 1) na posição 1 através da posição 27 e termina (ou inclui, se terminar após a posição 55) na posição 29 a 55, desde que o iniciador seja de comprimento suficiente para funcionar na reação de amplificação. O complemento reverso de tal iniciador também é fornecido.
[0160] Por exemplo, para a SEQ ID NO: 70, a junção de deleção ocorre entre as posições 20 e 21; um iniciador pode ser projetado, o qual começa (ou inclui, se começara antes da posição 1) na posição 1 através da posição 20 e termina (ou inclui, se terminar após a posição 60) na posição 22 a 60, desde que o iniciador seja de comprimento suficiente para funcionar na reação de amplificação. O complemento reverso de tal iniciador também é fornecido.
[0161] Por exemplo, para a SEQ ID NO: 74, a junção de deleção ocorre entre as posições 20 e 21; um iniciador pode ser projetado, o qual começa (ou inclui, se começara antes da posição 1) na posição 1 através da posição 20 e termina (ou inclui, se terminar após a posição 58) na posição 21 a 58, desde que o iniciador seja de comprimento suficiente para funcionar na reação de amplificação. O complemento reverso de tal iniciador também é fornecido.
[0162] Por exemplo, para a SEQ ID NO: 77, a junção de deleção ocorre entre as posições 20 e 21; um iniciador pode ser projetado, o qual começa (ou inclui, se começara antes da posição 1) na posição 1 através da posição 20 e termina (ou inclui, se terminar após a posição 60) na posição 22 a 60, desde que o iniciador seja de comprimento suficiente para funcionar na reação de amplificação. O complemento reverso de tal iniciador também é fornecido.
[0163] De acordo com outro aspecto da invenção, métodos para detectar a presença de uma molécula de DNA correspondendo aos alelos de FAD2-1 e FAD3 modificados em uma amostra, incluem colocar a amostra compreendendo DNA extraída de uma planta, célula ou semente de soja em contato com uma molécula de sonda de DNA que hibridiza sob condições de hibridização rigorosas com DNA genômico de uma soja compreendendo os alelos de FAD2-1 ou FAD3 modificados e não hibridiza sob condições de hibridização rigorosas com um DNA de planta de soja de controle. A amostra e sonda são submetidas às condições de hibridização rigorosas e hibridização da sonda ao DNA a partir da planta, célula ou semente de soja compreendendo o FAD2-1 ou FAD3 modificado.
[0164] Em algumas concretizações, os iniciadores e sondas se ligam e atravessam a modificação, como uma junção de deleção, no DNA genômico e têm uma sequência após a modificação ou junção na direção de 5' a 3’ que tem menos que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 nucleotídeos de comprimento e pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos de comprimento.
EXEMPLOS
[0165] A presente divulgação é adicionalmente definida nos seguintes Exemplos, nos quais partes e porcentagens estão em peso e graus estão em Celsius, a menos que afirmado de outro modo. Deve-se entender que esses exemplos, embora indiquem concretizações da invenção, são dados apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e desses Exemplos, um especialista na técnica pode determinar as características essenciais da presente divulgação, e sem se afastar do espírito e escopo da mesma, pode realizar várias alterações e modificações na divulgação para adaptá-la às várias utilizações e condições. Tais modificações também se destinam a ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas. EXEMPLO 1 Cassetes de expressão otimizado de soja para modificação de genoma em plantas de soja baseada em RNA-guia/Cas endonuclease
[0166] Para usar o sistema de RNA-guia/Cas endonuclease em soja, o gene de Cas9 de Streptococcus pyogenes M1 GAS (SF370) foi o códon de soja otimizado por técnicas padrão conhecidas na técnica. Para facilitar a localização nuclear da proteína de Cas9 em células de soja, o sinal de AT- NLS de localização nuclear amino terminal monopartido do gene At3g04980 de Arabidopsis (aminoácido 3118-3124) (PKKKRKV, SEQ ID NO: 2) e o sinal de localização nuclear carboxil terminal de endonuclease de borda de T-DNA de VirD2 bipartido de Agrobacterium tumefaciens (KRPRDRHDGELGGRKRAR, SEQ ID NO: 3)
foram incorporados nos terminais carboxil e amino da fase de leitura aberta de Cas9, respectivamente. O gene de Cas9 otimizado com soja foi operacionalmente ligado a um promotor constitutivo de soja como o promotor constitutivo de soja GM- EF1A2 revelado na Publicação de Patente no U.S. 20090133159, incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade (SEQ ID NO: 4) por técnicas biológicas moleculares padrão.
[0167] O segundo componente necessário para formar um sistema funcional de RNA-guia/endonuclease Cas para aplicações de modificação genética do genoma é um duplex das moléculas de crRNA e tracrRNA ou uma fusão sintética das moléculas de crRNA e tracrRNA, um RNA-guia. Para conferir uma expressão eficiente de RNA-guia (ou expressão do crRNA e tracrRNA duplexados) na soja, o promotor U6 da polimerase III e o terminador U6 da polimerase III de soja foram usados.
[0168] A sequência genômica de DNA de aproximadamente 0,5 kb a montante do primeiro nucleotídeo G de um gene U6 foi selecionada para ser usada como um promotor de RNA polimerase III, por exemplo, promotor GM-U6-13.1 (SEQ ID NO:5) ou promotor GM-U6-9.1 (SEQ ID NO:6), para expressar RNA-guia para direcionar Cas9 nuclease ao sítio genômico designado. A sequência codificante de RNA-guia teve 76 pb de comprimento e compreendeu um domínio de direcionamento variável de 20 pb a partir de um sítio-alvo genômico de soja escolhido na extremidade 5’ e um vestígio de 4 ou mais resíduos T como um terminador de transcrição na extremidade 3’. O primeiro nucleotídeo do domínio de direcionamento variável de 20 pb foi um resíduo G a ser usado por RNA polimerase III para a transcrição. Outros promotores de genes U6 homólogos de soja foram similarmente clonados e usados para expressão de RNA pequeno.
[0169] Visto que a endonuclease Cas9 e o RNA-guia precisam formar um complexo de proteína/RNA para mediar a clivagem de fina dupla de DNA sítio-específica, a endonuclease Cas9 e o RNA-guia precisam ser expressos nas mesmas células. Para melhorar sua coexpressão e presença, os cassetes de expressão de RNA-guia e endonuclease Cas9 foram ligados em um único construto de DNA. EXEMPLO 2 Seleção de sítios-alvo de FAD2 e FAD3 de soja a serem clivados pelo sistema de RNA-guia/Cas endonuclease A. Projeto de sítio-alvo de RNA-guia/Cas9 endonuclease nos genes de FAD2-1 e FAD3 de soja.
[0170] Há dois genes de FAD2-1 preferidos de semente em soja (FAD2-1A para Glyma.10g278000 e FAD2-1B para Glyma.20g111000). Um sítio-alvo de RNA-guia/Cas9 endonuclease (GM-FAD2-1 CR1) foi projetado para direcionar ambos os genes de FAD2-1 (Tabela 2). Também há dois genes de FAD3 principais em soja (FAD3a para Glyma.14g194300 e FAD3b para Glyma.02g227200). O sítio de GM-FAD3 CR2 foi projetado para direcionar ambos os genes de FAD3 (Tabela 2). Tabela 2. Sítios-alvo de RNA-guia/Cas9 endonuclease em genes de FAD2-1 de soja e genes de FAD3 Sequência- Nome do sítio-alvo alvo de Cas de gRNA- endonuclease Localização física endonuclease Cas9 (SEQ ID NO:) Gm10:50014185..50014166 GM-FAD2-1 CR1 7 Gm20:35317773..35317754
Gm14:45939600..445939618 GM-FAD3 CR2 8 Gm02:41423563..41423581 B. Cassetes de expressão de RNA-guia, cassetes de expressão de Cas9 endonuclease e knockout dos genes de FAD2-1 e de FAD3 de soja.
[0171] O promotor de RNA nuclear pequeno de U6 de soja GM-U6-13.1 (SEQ ID NO: 5) ou promotor de GM-U6-9.1 (SEQ ID NO:6), foi usado para expressar RNAs-guia para direcionar Cas9 nuclease para sítios-alvo genômicos designados. Um Cas9 otimizado com códon de soja endonuclease com um cassete de expressão de ST-LS1 Intron2 de batata (SEQ ID NO: 1) e um ou dois cassetes de expressão de RNA-guia foram ligados nos plasmídeos binários. No total, 4 vetores binários foram feitos (Figura 1A a Figura 1D). No construto de RV019927 (SEQ ID NO.9) e construto de RV019928 (SEQ ID NO.31), o cassete de expressão de gRNA de GM-FAD2-1 CR1 e o cassete de expressão de Cas9 foi feito para direcionar ambos os genes de FAD2-1A e FAD2-1B simultaneamente. De modo similar, o construto de RV019929 (SEQ ID NO.10) e o construto de RV019930 (SEQ ID NO.32) foram feitos para direcionar os genes de FAD2-1A, FAD2-1B, FAD3a e Fad3b ao mesmo tempo. Os vetores binários, como o RV019927 ou RV019928, ou RV019929 ou RV019930 foram transformados em cepa de Ochrobactrum haywardense H1-8 que tem um plasmídeo auxiliar RV005393 (SEQ ID NO.30) para transformação de soja. EXEMPLO 3 Entrega do DNA de sistema de RNA-guia/Cas9 endonuclease para soja por transformação estável de Ochro-EA
[0172] A transformação de eixo geométrico embrionário mediada por Ochrobactrum foi feita essencialmente conforme descrito na Publicação de Patente no U.S. 2018/0216123,
incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade. As sementes secas maduras de cultivar de soja 93Y21 foram desinfectadas usando gás de cloro e embebidas em meio semissólido contendo 5 g/l de sacarose e 6 g/l de ágar à temperatura ambiente no escuro. Após uma incubação de um dia para o outro, a semente foi embebida em água destilada durante 3 a 4 h adicionais à temperatura ambiente no escuro. O eixo geométrico embrionário intacto foi isolado da cotiledônea usando uma lâmina de bisturi em água estéril destilada. Os explantes de eixo geométrico embrionário foram transferidos para a placa profunda com 15 ml de Ochrobactrum haywardense H1-8 contendo um vetor auxiliar PHP85634 (RV005393) com o vetor binário RV019927 ou RV019928, ou RV019929 ou RV019930 com suspensão a OD600 = 0,5 em meio de infecção contendo 200 µM de acetosiringona. As placas foram vedadas com parafilme ("Parafilm M" VWR no de cat. 52858), então, sonicadas (Sonicador-VWR modelo 50T) por 30 segundos. Após a sonicação, os explantes de eixo geométrico embrionário foram transferidos para uma única camada de papel de filtro estéril autoclavado (VWR no 415/no de catálogo 28320-020). As placas foram vedadas com fixa de Microporos (No de catálogo 1530-0, 3M, St. Paul, MN)) e incubadas sob luz fraca (5 a 10 µE/m2/s, lâmpadas fluorescentes brancas frias) por 16 h a 21 °C por 3 dias.
[0173] Após a cocultura, os explantes de eixo geométrico embrionário foram cultivados em meio de indução de broto solidificado com 0,7% de ágar na ausência de seleção. A base do explante (isto é, radical de raiz de eixo geométrico embrionário) foi embutida no meio. A indução de broto foi executada em uma Incubadora Biológica Percival a 26 °C com um fotoperíodo de 18 h e uma intensidade de luz de 40 a 70 µE/m2/s.
6 a 7 semanas após a transformação, os brotos alongados (>1 a 2 cm) foram isolados e transferidos para meio de enraizamento contendo um agente de seleção. As plântulas transgênicas foram transferidas para vasos de solo e foram cultivadas na estufa. EXEMPLO 4 Detecção de mutações específicas de sítio com NHEJ mediado pelo sistema de RNA-guia/Cas9 em soja estavelmente transformada
[0174] O DNA genômico foi extraído a partir de amostras embrionárias somáticas e analisadas por PCR quantitativa usando um sistema de PCR em tempo real 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) com iniciadores específicos de sítio-alvo e uma sonda de fluorescência marcada com FAM para verificar as alterações de número de cópia dos sítios-alvo. A análise de qPCR foi feita em reações de duplex com um gene de proteína induzida por siringolídeo (SIP), como o controle endógeno e uma amostra de DNA genômico de 93Y21 de tipo selvagem que contém uma cópia do sítio-alvo com 2 alelos como o calibrador de cópia única. A sonda de controle endógeno SIP- T foi marcada com VIC (2'-cloro-7'fenil-1,4-dicloro-6-carboxi- fluoresceína) e as sondas específicas de gene FAD2-T1, FAD2- T2 e FAD3-T2 foram marcadas com FAM (Fluoresceína) (Tabela 3) para a detecção simultânea de ambas as sondas fluorescentes (Applied Biosystems). Os dados de reação de PCR foram capturados e analisados usando o software de detecção de sequência dotado do sistema de PCR em tempo real 7500 e dos números de cópia de gene foram calculados usando a metodologia de quantificação relativa (Applied Biosystems). Tabela 3. Iniciadores/sondas usadas em análises de qPCR de eventos de soja transgênica.
Sítio-alvo Nome de Sequências SEQ ID NOs: Iniciador/Sonda FAD2-1A FAD2-F1 TCGTGTGGCCAAAGTGGA 11
A FAD2-R1 TTTGTGTTTGGAACCCTT 12
GAGA FAD2-T1 (FAM- TTCAAGGGAAGAAGCC 13 MGB) FAD2-1B FAD2-F2 CCGTGTGGCCAAAGTTGA 14
A FAD2-R1 TTTGTGTTTGGAACCCTT 12
GAGA FAD2-T2 (FAM- TTCAGCAGAAGAAGCC 15 MGB) FAD3a FAD3-F1 TAATGGATACCAAAAGGA 16
AGC FAD3-R2 CAAGCACATCCCTGAGAA 17
CATAAC FAD3-T2 (FAM- AATCCATGGAGATCCCT 18 MGB) FAD3b FAD3-F2 ATACCAACAAAAGGGTTC 19
TTC FAD3-R2 CAAGCACATCCCTGAGAA 17
CATAAC FAD3-T2 (FAM- AATCCATGGAGATCCCT 18 MGB) SIP SIP-130F TTCAAGTTGGGCTTTTTC 20
AGAAG
SIP-198R TCTCCTTGGTGCTCTCAT 21
CACA SIP-170T (VIC- CTGCAGCAGAACCAA 22 MGB)
[0175] Visto que o DNA genômico de 93Y21 de tipo selvagem com dois alelos do sítio-alvo foi usado como o calibrador de cópia única, eventos sem nenhuma alteração do sítio-alvo seriam detectados como uma cópia no presente documento chamada de Wt-Homo (valor de qPCR > = 0,7), eventos com um alelo alterado, que não é mais detectável pela qPCR específica de sítio-alvo, seriam detectados como meia cópia no presente documento chamadas de NHEJ-Hemi (valor de qPCR entre 0,1 e 0,7), enquanto os eventos com ambos os alelos alterados seriam detectados como nulos no presente documento denominados NHEJ-Null (valor de qPCR = < 0,1).
[0176] No total, quatro experimentos de transformação de soja foram executados com os vetores mostrados na Figura 1A à Figura 1D. Em RV019927 e RV019929, os cassetes de gRNA estavam perto da borda direita e colocados a montante dos cassetes de expressão de Cas9 nos vetores binários. Em contraste, em RV019928 e RV019930, os cassetes de expressão de gRNA estavam perto da borda esquerda e colocados a jusante dos cassetes de expressão de Cas9 nos vetores binários. Como mostrado na Tabela 4, Tabela 5 e Figura 2, para os dois experimentos para realizar knockout apenas dos dois genes de FAD2-1, o gRNA perto da borda direita e colocado a montante do projeto de configuração de Cas9 forneceu muito mais eficiência de knockout de gene em comparação com o projeto com o gRNA perto da borda esquerda e colocado a jusante de Cas9. Por exemplo, a eficiência de knockout bialélico (NHEJ-Null)
alcançou 63% para o gene de FAD2-1A e 56% para o gene de FAD2- 1B (Tabela 4) com o vetor de RV019927. A eficiência de knockout bialélico (NHEJ-Null) foi apenas 7% para o gene de FAD2-1 e 10% para o gene de FAD2-1B (Tabela 5) com o vetor de RV019928. A população de WT constituiu apenas cerca de 2 a 3% no experimento com o vetor de RV019927, em comparação com 37 a 44% no experimento com o vetor de RV019928.
[0177] No terceiro e quarto experimentos, os vetores binários de RV019929 ou RV019930 foram usados para realizar knockout dos dois genes de FAD2-1 e os dois genes de FAD3. Como mostrado na Tabela 4, Tabela 5 e Figura 2, estes dois experimentos também demonstraram o projeto de vetor de RV019929, com o cassete de expressão de gRNA perto da borda direita e a montante do cassete de expressão de Cas9, forneceram eficiência de knockout de gene de quadros muito superior em comparação com o vetor binário de RV019930 nos genes FAD2-1A, FAD2-1B, FAD3a e FAD3b. Estes resultados inesperados demonstraram as configurações diferentes de gRNA/cassete de expressão de Cas9 nos vetores binários apresentaram efeitos dramáticos na eficiência de edição de gene-alvo. Vetores com cassetes de gRNA perto da borda direita e colocados a montante dos cassetes de expressão de Cas9 aumentaram a eficiência de edição do sítio-alvo. Tabela 4. Mutações de Sítio-Alvo de FAD2-1 pelo Sistema de RNA-Guia/Cas9 em 93Y21 com RV019927. Números indicam o no de eventos (números em parênteses são %). Eventos Wt-Homo NHEJ-Hemi NHEJ-Null Sítio-alvo totais (%) (%) (%) FAD2-1A 2 (2%) 37 (35%) 67 (63%) 106 FAD2-1B 3 (3%) 44 (42%) 59 (56%)
Tabela 5. Mutações de Sítio-Alvo de FAD2-1 pelo Sistema de RNA-Guia/Cas9 em 93Y21 com RV019928. Números indicam o no de eventos (números em parênteses são %). Evento Wt-Homo NHEJ-Hemi NHEJ-Null Sítio-alvo total (%) (%) (%) FAD2-1A 15 (37%) 23 (56%) 3 (7%) 41 FAD2-1B 18 (44%) 19 (46%) 4 (10%)
Tabela 6. Mutações de Sítio-alvo de FAD2-1 e FAD3 pelo sistema de RNA-Guia/Cas9 em 93Y21 com RV019929. Os números indicam no de eventos (números em parênteses são % dos eventos analisados totais). Evento Wt-Homo NHEJ-Hemi NHEJ-Null Sítio-alvo total (%) (%) (%) FAD2-1A 0 (0%) 11 (41%) 16 (59%) FAD2-1B 1 (4%) 12 (44%) 14 (52%) 27 FAD3a 1 (4%) 6 (22%) 20 (74%) FAD3b 1 (4%) 4 (15%) 22 (81%)
Tabela 7. Mutações de Sítio-alvo de FAD2-1 e FAD3 pelo sistema de RNA-Guia/Cas9 em 93Y21 com RV019930. Os números indicam no de eventos (números em parênteses são % dos eventos analisados totais). Evento Wt-Homo NHEJ-Hemi NHEJ-Null Sítio-alvo total (%) (%) (%) FAD2-1A 20 (48%) 17 (40%) 5 (12%) FAD2-1B 7 (17%) 32 (76%) 3 (7%) 42 FAD3a 7 (17%) 32 (76%) 3 (7%) FAD3b 12 (29%) 22 (52%) 8 (19%)
[0178] As regiões-alvo de eventos de NHEJ-Null foram amplificadas por PCR regular das mesmas amostras de DNA genômico usando iniciadores específicos respectivamente aos genes de FAD2-1A, FAD2-1B, FAD3a e FAD3b (Tabela 8). Tabela 8. Iniciadores de PCR para os alvos de gRNA dos genes de FAD2-1 e de FAD3 Sítio- SEQ ID NO: Iniciador Iniciador 1 SEQ ID NO: alvo 2 FAD2-1A WOL1007 23 WOL1009 25 FAD2-1B WOL1008 24 WOL1009 25 FAD3a WOL1100 26 WOL1101 27 FAD3b WOL1102 28 WOL1103 29
[0179] As bandas de PCR foram clonadas em vetor de pCR2.1 usando um kit de clonagem de TOPO-TA (Invitrogen) e múltiplos clones foram sequenciados para verificação quanto a alterações de sequência de sítio-alvo como os resultados de NHEJ. Várias deleções pequenas perto do sítio de clivagem de Cas9, 3 pb a montante da PAM, foram reveladas em todos os quatro sítios-alvo testados, com a maioria dos mesmos resultando em knockouts de deslocamento de quadro (Figura 3A a Figura 3B, Figura 4A a Figura 4B, Figura 5A a Figura 5B). Estas análises de sequência confirmaram a ocorrência de NHEJ mediada pelo sistema de RNA-guia/Cas9 nos sítios-alvo de Cas9 específicos. EXEMPLO 5 Vetores de Soja para SDN2 e SDN3
[0180] Os vetores de T-DNA usados nos experimentos de soja de Cas9 foram Vetores 9 a 17, representados nas Figuras 7A a 7I e Figuras 8 a 16, e fornecidos como SEQ ID NOs: 97 a 105, respectivamente. Os comprimentos dos "braços” de região de homologia (HR1 e HR2) em cada vetor variaram de 591 a 980 nucleotídeos de comprimento. EXEMPLO 6 Transformação de soja
[0181] Os protocolos exemplificativos para transformação mediada por Agrobacterium revelados em Jia et al., 2015, Int J. Mol. Sci. 16:18.552 a 18.543 e no U.S. 20170121722 e incorporados no presente documento a título de referência em suas totalidades), ou transformação mediada por Ochrobactrum, revelada no documento no U.S. 20180216123A1 e incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade, para soja pode ser usada com os métodos da revelação.
[0182] A transformação de soja foi feita essencialmente conforme descrito no documento no U.S. 20180216123A1 e no U.S. 20170121722 e incorporado no presente documento a título de referência em suas totalidades ou conforme descrito por Paz et al. ((2006) Plant Cell Rep 25:206 a 213) e Patente no U.S. 7.473.822 e incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. A semente madura de linhagens de soja foi esterilizada em superfície por 16 h com o uso de gás cloro, produzido misturando-se 3,5 ml de 12 N de HCl com 100 ml de ácido comercial (5,25% de hipoclorito de sódio), conforme descrito por Di et al. ((1996) Plant Cell Rep 15:746 a 750). As sementes desinfetadas foram embebidas em água destilada estéril à temperatura ambiente por 16 h (100 sementes em uma placa de petri de 25×100 mm).
[0183] Um volume de 10 ml de Depósito B-67078 de Ochrobactrum haywardense H1 NRRL, revelado no documento no U.S. 20180216123A1 e incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade, contendo, ainda, o vetor PHP70365 (SEQ ID NO: 108) a OD600=0,5 em meio de infecção que contém 300 µM de acetosseringona foi adicionado às sementes embebidas. As sementes foram, então, divididas cortando longitudinalmente ao longo do hilo para separar as cotiledôneas, e os revestimentos de semente, brotos primários e eixo geométricos embrionários foram removidos da suspensão de Depósito B-67078 de Ochrobactrum haywardense H1 NRRL, gerando, assim, explantes de meia semente.
[0184] Os explantes de meia semente foram colocados com o lado plano para baixo em uma placa profunda com 4 ml de meio de Ochrobactrum/infecção fresco sem sobreposição de cotiledôneas. As placas foram vedadas com parafilme ("Parafilm M" VWR no de cat. 52858), então, sonicadas (Sonicador-VWR modelo 50T) por 30 segundos. Após a sonicação, os explantes de meia semente foram transferidos a uma camada única de papel de filtro estéril autoclavado (VWR no 415/no de catálogo 28320- 020) para o meio sólido de cocultivo (18 a 22 explantes por placa; lado plano para baixo). As placas foram vedadas com fixa de Microporos (No de catálogo 1530-0, 3M, St. Paul, MN)) e incubadas sob luz fraca (5 a 10 µE/m2/s, lâmpadas fluorescentes brancas frias) por 16 h a 21 °C por 5 dias. EXEMPLO 7 Regeneração de Soja
[0185] Os métodos foram executados de acordo com aqueles revelados no documento no U.S. 20180216123A1, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. Após o cocultivo, os explantes de meia semente foram lavados em meio de indução de broto de líquido (SI) uma vez, então, os explantes foram cultivados em meio de indução de broto solidificado com 0,7% de ágar na ausência de seleção (Tabela 10 do documento no U.S. 20180216123A1, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). A base do explante (isto é, a parte do explante a partir da qual o eixo geométrico embrionário foi removido) foi incorporado ao meio, voltado para cima. A indução de broto foi executada em uma Incubadora Biológica Percival a 24 °C com um fotoperíodo de 18 h e uma intensidade de luz de 130 a 160 µE/m2/s. Após 14 dias, os explantes foram transferidos para meio de indução de broto fresco contendo 3 mg/l de bialafos (Tabela 10 do documento no U.S. 20180216123A1, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Os explantes de meia semente foram transferidos para o meio fresco a cada duas semanas. Após as quatro semanas de cultura no meio de indução de broto, explantes foram transferidos para meio de alongamento de broto (SE) contendo 5 mg/l de bialafos (Tabela 10 do documento no U.S. 20180216123A1, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Seis a fez semanas depois, brotos alongados (> 1 a 2 cm) foram isolados e transferidos para meio de enraizamento (Tabela 10 do documento no U.S. 20180216123A1, incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade) contendo 1 mg/l de bialafos. EXEMPLO 8 Análise de frequência de HDR SDN3 de Soja
[0186] Transformação mediada por Ochrobactrum e Agrobacterium e regeneração de planta foram realizadas conforme descrito nos Exemplos 6 e 7. Vários experimentos de teste rápidos foram conduzidos para avaliar a viabilidade destes métodos de SDN3 aprimorados em soja. Eixo geométrico embrionário de soja infectado com Ochrobactrum contendo doador de SDN3 em vetores de transformação, Vetor 9 (Figura 7A, Figura 8 e Figura 17A) e Vetor 10 (Figura 7B, Figura 9 e Figura 18A), foram amostrados após 7 dias para extração de DNA. A PCR de gotícula digital (ddPCR) para a junção de HR2 revelou um sinal positivo para HDR usando Vetor 9 e Vetor 10 enquanto nenhum sinal de HDR foi detectado do vetor de controle (Figuras 17B a 17C e 18B a 18C, respectivamente).
[0187] As plantas de soja T0 transgênicas para o Vetor 12 (Figura 11 e Figura 20) foram regeneradas usando o gene de Espectinomicina (SPCN) como um marcador selecionável e analisado por qPCR de junção para inserção de SDN3 direcionada. Os eventos positivos de 2xHDR foram adicionalmente analisados por sequenciamento para avaliar o tamanho e a integridade da inserção. Tabela 9 mostra os resultados. Tabela 9. As frequências de edições de modificação de polinucleotídeo de SDN3 direcionado facilitado por HDR em um sítio-alvo em soja. As frequências são calculadas com base no número total de plantas analisadas em cada experimento. Plantas 2X HDR Frequência analisadas Lote 1 222 7 3,2% Lote 2 244 5 2% Total 466 12 2,6%
[0188] Os explantes de folha de soja de plântulas de dois genótipos diferentes foram infectados e cocultivados por 3 dias com Agrobacterium contendo doador de SDN3 em vetores de transformação, Vetor 14 (Figura 7F, Figura 13) e Vetor 15 (Figura 7G, Figura 14). As amostras de folha foram amostradas após 7 dias para extração de DNA. A PCR de gotícula digital (ddPCR) para a junção de HR2 revelou sinal positivo para HDR de ambos os vetores (Figura 21 para o Vetor 14; Figura 22 para o Vetor 15). SDN2 de Soja
[0189] As plantas de soja T0 transgênica para Vetor 13 (Figura 7E, Figura 12 e Figura 19A) foram regeneradas usando o gene de Espectinomicina (SPCN) como um marcador selecionável e analisado por qPCR de junção para inserção de SDN2 direcionada. Os eventos positivos de 2xHDR foram adicionalmente analisados por sequenciamento para avaliar o tamanho e a integridade da inserção. Dentre 1.358 plantas analisadas, 8 demonstraram edição, por uma frequência de 0,6%. As Figuras 19C e 19D mostram verificação de sequência das edições. Os resultados são mostrados na Tabela 10. Tabela 10. As frequências de edições de modificação de polinucleotídeo de SDN2 direcionado facilitado por HDR em um sítio-alvo em soja. As frequências são calculadas com base no número total de plantas analisadas em cada experimento. Plantas Editadas Frequência analisadas 1358 8 0,6%
[0190] Estes exemplos demonstraram sistemas de SDN2 e SDN3 robustos mediados por Ochrobactrum e Agrobacterium em soja com cassete de DNA de doador flanqueando com sítios-alvo resultando na liberação da molécula de DNA de doador do T-DNA. Os avanços tecnológicos em sistemas de SDN2 e SDN3 foram feitos sem usar um gene de marcador selecionável dentro do modelo de doador. Outros tipos de modificações de genoma, como edição de nucleotídeo direcionada e substituição de gene (troca), também se beneficiarão desta abordagem. EXEMPLO 9 Métodos adicionais
[0191] A liberação eficiente do polinucleotídeo de DNA de doador pode ser promovida por vários métodos. Em um método, uma pluralidade (n) de conjuntos de sequências podem ser incorporados flanqueando o cassete de DNA de doador (uma representação para n = 2 é representada na Figura 6), o que permite múltiplas oportunidades para clivagem de um complexo de Cas endonuclease/RNA-guia. Em alguns aspectos, dois conjuntos de sequências flanqueiam o cassete de DNA de doador. Em alguns aspectos, três conjuntos de sequências flanqueiam o cassete de DNA de doador. Em alguns aspectos, quatro ou mais conjuntos de sequências flanqueiam o cassete de DNA de doador. O número de conjuntos para a pluralidade pode ser n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou maior que 10.
[0192] Os métodos para aprimorar a frequência de HDR em um sítio-alvo também podem incluir um cassete de doador/modelo que tem um sítio-alvo fora do cassete, em vez de dois sítios flanqueando o cassete. Isso resulta em um fragmento de modelo/doador “pendente” fornecido ao polinucleotídeo-alvo no sítio de ruptura de fita dupla ou próximo ao mesmo.
[0193] A revelação supracitada foi descrita em detalhes por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza e compreensão. Como é prontamente evidente a um versado na técnica, o supracitado consiste em apenas alguns dos métodos e composições que ilustram as concretizações da revelação supracitada. Ficará evidente àqueles de habilidade comum na técnica que variações, mudanças, modificações e alterações podem ser aplicadas às composições e/ou métodos descritos no presente documento sem que se afaste do verdadeiro espírito, conceito e escopo da revelação.
[0194] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são incorporados a título de referência no presente documento para o propósito citado como se cada um fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado a título de referência no presente documento.
[0195] Conforme usado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente afirme de outro modo. Portanto, por exemplo, referência a “uma planta” inclui uma pluralidade de tais plantas, referência a “uma célula” inclui uma ou mais células e equivalentes das mesmas conhecidas pelos versados na técnica, e assim por diante. A não ser que expressamente afirmado o contrário, “ou” é usado como um termo inclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou presente) e tanto A quanto B são verdadeiros (ou presentes).

Claims (33)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para aumentar a eficiência de edição de um sítio-alvo em uma planta, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer, a uma célula vegetal, um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável em uma orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar ao sítio-alvo, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem no sítio-alvo; (b) identificar pelo menos uma célula vegetal dentre (a) que tenha uma modificação no sítio-alvo, em que a modificação inclui pelo menos uma deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos no sítio-alvo; e (c) regenerar uma planta a partir da pelo menos uma célula vegetal dentre (b) que tenha a modificação no sítio- alvo tendo eficiência de edição aumentada em comparação com uma planta de controle que tem uma modificação no sítio-alvo fornecida por uma planta de controle T-DNA de edição, em que a planta de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo codificando um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar ao sítio-alvo, e em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem no sítio-alvo.
2. Método para aumentar a eficiência de alteração do perfil de ácido graxo na semente de uma planta, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer, a uma célula vegetal, um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta ou uma combinação das mesmas, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas;
(b) obter uma planta da célula vegetal de (a); (c) avaliar a planta de (b) quanto à presença da pelo menos uma modificação de nucleotídeo; (d) selecionar uma planta de progênie de (c) tendo um perfil de ácido graxo alterado; e (e) obter semente da planta de progênie de (d) que tenha eficiência de edição aumentada em comparação com uma semente de controle de uma planta que tem uma modificação da sequência genômica de FAD2, da sequência genômica de FAD3, ou a combinação das mesmas fornecida por uma semente de controle T-DNA de edição, em que a semente de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo codificando um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas.
3. Método para aumentar a eficiência de alteração do perfil de ácido graxo na semente de uma planta, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer, a uma célula vegetal, um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta ou uma combinação das mesmas, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas; (b) obter uma planta da célula vegetal de (a); (c) avaliar a planta de (b) quanto à presença da pelo menos uma modificação de nucleotídeo; (d) realizar uma triagem de uma planta de progênie de (c) que tenha um perfil de ácido graxo alterado que é desprovido do RNA-guia e da Cas endonuclease; e (e) obter semente da planta de progênie de (d) que tenha eficiência de edição aumentada em comparação com uma semente de controle de uma planta que tem uma modificação da sequência genômica de FAD2, da sequência genômica de FAD3, ou a combinação das mesmas fornecida por uma semente de controle T-DNA de edição, em que a semente de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo codificando um RNA-guia, e em que o RNA-guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas.
4. Método para aumentar a eficiência de introdução de um nucleotídeo de interesse em um sítio-alvo no genoma de uma planta, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer a uma célula vegetal um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável em uma orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um
RNA-guia, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease clive no sítio-alvo; (b) colocar a célula vegetal de (a) em contato com um DNA de doador compreendendo o polinucleotídeo de interesse; (c) identificar pelo menos uma célula vegetal de (b) compreendendo em seu genoma o polinucleotídeo de interesse integrado no sítio-alvo; e (d) regenerar uma planta da pelo menos uma célula vegetal que tem em seu genoma o polinucleotídeo de interesse integrado no sítio-alvo que tem eficiência aumentada de introdução do polinucleotídeo de interesse no sítio-alvo no genoma da célula vegetal em comparação com uma planta de controle que tem uma introdução do polinucleotídeo de interesse no sítio-alvo no genoma da célula vegetal fornecida por uma planta de controle T-DNA de edição, em que a planta de controle T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease e um cassete de expressão de RNA-guia em que, o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease clive no sítio-alvo.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende ainda um traço de interesse ou um cassete de modelo de modificação de nucleotídeo, em que o traço de interesse ou cassete de modelo de modificação de nucleotídeo compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo do traço de interesse ou nucleotídeo e o traço de interesse ou cassete de modelo de modificação de nucleotídeo é capaz de realizar ao menos uma modificação de nucleotídeo no sítio-alvo do traço de interesse ou do nucleotídeo.
6, Método, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende ainda um cassete de modelo de modificação, em que o cassete de modelo de modificação compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo de uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, e o cassete de modelo de modificação possibilita a pelo menos uma modificação de nucleotídeo da sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, da sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou a combinação das mesmas.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que o sítio-alvo é selecionado do grupo consistindo em uma sequência de promotor, uma sequência de terminador, uma sequência de elemento regulador, uma sequência de codificação, um sítio de splice, um sítio de poliubiquitinação, um sítio de íntron, um motivo de melhora de íntron, um gene de interesse e um traço de interesse.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que o sítio-alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em um polinucleotídeo que codifica resistência ao marcador selecionável, resistência a doenças, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância à salinidade, tolerância ao metal, tolerância a herbicida, eficiência de uso de água melhorada, utilização de nitrogênio aprimorada, fixação de nitrogênio aprimorada, resistência a pragas, resistência a herbívoros, resistência a patógeno, aprimoramento de rendimento, melhora de saúde, aprimoramento de vigor, aprimoramento de crescimento, aprimoramento de capacidade fotossintética, melhora de nutrição, composição de proteína alterada, composição de óleo alterada, biomassa aumentada, comprimento de broto aumentado, comprimento de raiz aumentado, arquitetura de raiz aprimorada, modulação de um metabólito, modulação do proteoma, peso de semente aumentado, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada, perfil de ácido graxo alterado, composição de proteína de semente alterada, composição de nutriente de semente alterada, fertilidade aprimorada, fecundidade aprimorada, tolerância ambiental aprimorada, vigor aprimorado, resistência aprimorada a doenças, tolerância aprimorada a doenças, tolerância aprimorada a uma molécula heteróloga, adequação aprimorada, característica física aprimorada, massa maior, produção aumentada de uma molécula bioquímica, produção diminuída de uma molécula bioquímica,
regulação crescente de um gene, regulação decrescente de um gene, regulação crescente de um caminho bioquímico, regulação decrescente de um caminho bioquímico, estimulação de reprodução celular e supressão de reprodução celular.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um perfil de ácido graxo alterado.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a planta é uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea é selecionada a partir do grupo consistindo em milho, arroz, sorgo, centeio, cevada, trigo, milheto, aveias, cana-de- açúcar, relva e switchgrass.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dicotiledônea é selecionada dentre o grupo consistindo em soja, canola, alfafa, girassol, algodão, tabaco, amendoim, batata, tabaco, Arabidopsis e cártamo.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o T-DNA de edição fornecido à célula vegetal é fornecido por meio de transformação mediada por Agrobacterium.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o T-DNA de edição fornecido à célula vegetal é fornecido por meio de transformação mediada por Ochrobactrum.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o T-DNA de edição fornecido à célula vegetal é fornecido por meio de transformação mediada por Rhizobiaceae.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o RNA- guia é operacionalmente ligado a um promotor de U6 polimerase III de planta.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a Cas endonuclease é uma Cas9 endonuclease otimizada de planta.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 17, caracterizado pelo fato de que o gene de Cas endonuclease é operacionalmente ligado a um sinal de direcionamento nuclear a montante da região de codificação de Cas e um sinal de localização nuclear a jusante da região de codificação de Cas.
19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sítio-alvo é localizado na sequência genética de um gene de FAD2, um gene de FAD3 ou uma combinação dos mesmos.
20. Planta, célula vegetal ou semente caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
21. Planta que compreende um traço de interesse editado, em que a planta é caracterizada pelo fato de que se origina de uma célula vegetal compreendendo um traço de interesse editado produzido pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o T-DNA de edição compreende ainda um cassete de expressão de marcador selecionável, um cassete de expressão de marcador de cor ou uma combinação dos mesmos.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a Cas endonuclease é expressa pela SEQ ID NO:1.
24. Construto de DNA recombinante para aumentar a edição caracterizado pelo fato de que compreende um T-DNA de edição para um traço ou polinucleotídeo de interesse, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA-guia é complementar ao traço ou polinucleotídeo de interesse e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita a clivagem de Cas endonuclease no traço ou polinucleotídeo de interesse.
25. Construto de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um cassete de modelo de modificação de traço ou polinucleotídeo de interesse, em que o cassete de modelo de modificação de traço ou polinucleotídeo de interesse compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo do traço ou polinucleotídeo de interesse e o cassete de modelo de modificação de traço ou polinucleotídeo de interesse é capaz de realizar pelo menos uma modificação de nucleotídeo no traço ou polinucleotídeo de interesse.
26. Construto de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um cassete de expressão de marcador selecionável, um cassete de expressão de marcador de cor, ou uma combinação dos mesmos.
27. Planta caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos modificados, em que a sequência de nucleotídeos modificados foi produzida fornecendo, a uma célula vegetal, um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA- guia é complementar à sequência de nucleotídeos e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência de nucleotídeos.
28. Planta, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o T-DNA de edição compreende ainda um cassete de modelo de modificação de nucleotídeo, em que o cassete de modelo de modificação de nucleotídeo compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo da sequência de nucleotídeos e o cassete de modelo de modificação de nucleotídeo é capaz de realizar pelo menos uma modificação de nucleotídeo na sequência de nucleotídeos.
29. Planta caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos modificados, em que a sequência de nucleotídeos modificados foi produzida fornecendo, a uma célula vegetal, um T-DNA de edição, em que o T-DNA de edição compreende, em ligação operável na orientação de uma borda direita para uma borda esquerda, um cassete de expressão de RNA-guia, em que o cassete de expressão de RNA-guia compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um RNA-guia, em que o RNA- guia é complementar a uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, a uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta ou uma combinação das mesmas, e um cassete de expressão de Cas endonuclease, em que o cassete de expressão de Cas endonuclease compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma Cas endonuclease, em que o RNA-guia e a Cas endonuclease são capazes de formar um complexo que possibilita que a Cas endonuclease introduza clivagem na sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, na sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas.
30. Planta, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o T-DNA de edição compreende ainda um cassete de modelo de modificação de polinucleotídeo, em que o cassete de modelo de modificação de polinucleotídeo compreende pelo menos uma modificação de nucleotídeo de uma sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, uma sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou uma combinação das mesmas, e o cassete de modelo de modificação de polinucleotídeo possibilita a pelo menos uma modificação de nucleotídeo da sequência genômica de FAD2 no genoma da planta, da sequência genômica de FAD3 no genoma da planta, ou a combinação das mesmas.
31. Planta, de acordo com a reivindicação 27 ou 29, em que a planta é caracterizada pelo fato de que é uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea.
32. Planta, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a monocotiledônea é selecionada dentre o grupo consistindo em milho, arroz, sorgo, centeio, cevada, trigo, milheto, aveias, cana-de- açúcar, relva e switchgrass.
33. Planta, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a dicotiledônea é selecionada dentre o grupo consistindo em soja, canola, alfafa, girassol, algodão, tabaco, amendoim, batata, tabaco, Arabidopsis e cártamo.
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