JP2003159063A - Ｇａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法 - Google Patents

Ｇａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法

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JP2003159063A JP2001357821A JP2001357821A JP2003159063A JP 2003159063 A JP2003159063 A JP 2003159063A JP 2001357821 A JP2001357821 A JP 2001357821A JP 2001357821 A JP2001357821 A JP 2001357821A JP 2003159063 A JP2003159063 A JP 2003159063A
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤ
ＮＡのGatewayエントリークローンを選択的に作製する
技術を提供する。 【解決手段】 ２ステップアダプターＰＣＲにおいて、
鋳型ｃＤＮＡを増幅する第１ステップのＰＣＲを、アダ
プターaを含む５末端プライマーＡを用い、又アダプタ
ーｂを含む３’末端プライマーＢ及びＢ’を混合して行
い、第２ステップのＰＣＲを、第１ステップでの増幅産
物を鋳型として、配列ａｔｔＢ１を持つアダプターｃを
含む５’末端共通プライマーＣを用い、３’末端のＰＣ
Ｒプライマーとしてプラスミドへの接続部位となる配列
ａｔｔＢ２を含むアダプターｄを持つプライマーＤを用
いてそれぞれ増幅を行い、両末端に異なる接続塩基配列
を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡ
を作製し、得られたｃＤＮＡをａｔｔＰプラスミドに組
み込みこれをコンピテントセルに導入するGatewayエン
トリークローンの作製方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学の分野
に属する。特に本発明は、遺伝子の組換え技術に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】Gatewayクローニングテクノロジーは、
ｃＤＮＡやＰＣＲ ＤＮＡの機能解析、たんぱく質発現
やクローニング／サブクローニングのための迅速で高効
率な汎用クローニングシステムである（ＵＳＰ５，８８
８，７３２）。このGatewayシステムは、部位特異的Ｄ
ＮＡ組換え反応を利用して、異なるベクター間でのイン
サートＤＮＡの載せ換えを、制限酵素やリガーゼなし
で、短時間にin vitroで行う技術であり、基本となるエ
ントリークローンを構築して、多種類の発現クローンを
迅速かつ容易に作製することを可能とした技術である。
【０００３】該システムでは、目的とする遺伝子ＤＮＡ
を、まずエントリーベクターに入れてエントリークロー
ンを作製する。該エントリークローンは、ＰＣＲ、制限
酵素消化、リガーゼ接続でも作ることができ、Gateway
ベクターで構築されたｃＤＮＡライブラリーからの部位
特異的組み換え反応でも作製できることが知られてい
る。ａttサイトと呼ばれる組み換え部位に接続された目
的ＤＮＡを、適切なデスティネーションベクター及びCL
ONASE酵素ミックスと混合することにより、attサイト間
の部位特異的組換えによって生成した中間体（co-integ
rate）分子が２個の分子に分解し、このうち１個は目的
ＤＮＡを含む新しいベクター分子（発現クローン）が作
製される。もう１個の分子は陰性選択(ccdB)遺伝子を含
むため、宿主菌が殺され、この陽性、陰性選択により、
目的とするクローンを効率よく（９０％以上）回収でき
るものである。
【０００４】該エントリークローンの作製におけるＰＣ
Ｒ法は、まず、５'末端に配列表の配列番号３に記載の2
5bpのattＢ1の組換え配列を、３’末端に配列番号５に
記載の25bpのattＢ2の組換え配列をそれぞれアダプター
として持つ２種類のプライマーによって目的の遺伝子Ｄ
ＮＡをＰＣＲ増幅し、アダプターＰＣＲ産物を得る。こ
の目的遺伝子ＤＮＡをattPプラスミドに移し換える場合
に、in vitroのＢＰ反応（Gatewayクローニングテクノ
ロジー(2000)，五島直樹，木須康智，今本文男，実験医
学，18(19)2716-2717）によって目的遺伝子の方向性を
維持したまま移すことができる。
【０００５】該ＰＣＲ法による該エントリークローンの
作製における高効率化は、該Gatewayシステムの有効性
を高めるための重要な課題である。中でも、融合たんぱ
く質の発現クローンを選択的に得ることは、該システム
の汎用性と応用範囲の拡大を図る重要な技術としてその
開発が要請されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ネイティブ
型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのGatewayエント
リークローンを選択的に作製する技術を提供することを
その課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の課
題を解決するために鋭意検討をした結果、本発明を完成
するに至った。即ち、本発明によれば、以下に示す方法
が提供される。 （１）２ステップアダプターＰＣＲにおいて、鋳型ｃＤ
ＮＡを増幅する第１ステップのＰＣＲを、アダプターａ
を含む５'末端プライマーＡを用い、アダプターｂを含
み、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする部
位の塩基配列が異なる３'末端プライマーＢ及びＢ'を混
合して行い、第２ステップのＰＣＲを、第１ステップで
の増幅産物を鋳型として、５’末端にプラスミドへの接
続部位となる配列attＢ1を持つアダプターｃを含む５’
末端共通プライマーＣを用い、３'末端のＰＣＲプライ
マーとしてプラスミドへの接続部位となる配列attＢ2を
含むアダプターｄを持つネイティブ型共通プライマーＤ
又はＣ末端融合型共通プライマーＤ'を用いてそれぞれ
増幅を行い、両末端に異なる接続塩基配列を持つネイテ
ィブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡを作製し、得
られたｃＤＮＡをattＰプラスミドに組み込み、これを
コンピテントセルに導入することを特徴とするGateway
エントリークローンの作製方法。 （２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を有する前
記（１）に記載のＰＣＲプライマーＣ。 （３）該プライマーＢは、その停止コドンにハイブリダ
イズする塩基配列がＡＴＴであり、該プライマーＢ'
は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡ
ＴＡであり、該プライマーＤは、配列番号７に記載の塩
基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号８に記載
の塩基配列であることを特徴とする前記（１）に記載の
Gatewayエントリークローンの作製方法。 （４）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を有する前
記（１）又は（３）に記載のＰＣＲプライマーＤ。 （５）配列表の配列番号８に記載の塩基配列を有する前
記（１）又は（３）に記載のＰＣＲプライマーＤ'。 （６）該プライマーＢは、その停止コドンにハイブリダ
イズする塩基配列がＡＣＴであり、該プライマーＢ'
は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡ
ＣＡであり、該プライマーＤは、配列番号９に記載の塩
基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号１０に記
載の塩基配列であることを特徴とする前記（１）に記載
のGatewayエントリークローンの作製方法。 （７）配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有する前
記（１）又は（６）に記載のＰＣＲプライマーＤ。 （８）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列を有する
前記（１）又は（６）に記載のＰＣＲプライマーＤ'。 （９）該プライマーＢは、その停止コドンにハイブリダ
イズする塩基配列がＡＣＴであり、該プライマーＢ'
は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＣ
ＣTであり、該プライマーＤは、配列番号９に記載の塩
基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号１１に記
載の塩基配列であることを特徴とする前記（１）に記載
のGatewayエントリークローンの作製方法。 （１０）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列を有す
る前記（１）又は（９）に記載のＰＣＲプライマー
Ｄ'。 （１１）前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の該エ
ントリークローンの作製方法により作製されたネイティ
ブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのGatewayエン
トリークローン。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）による、ネイティブ型ｃＤＮＡ及び融合型ｃ
ＤＮＡのGatewayエントリークローンを選択的に効率良
く作製する独創的な方法に関する。好ましい態様におい
て、本発明では、目的とする遺伝子ｃＤＮＡを含むＤＮ
Ａ断片からネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤ
ＮＡのGatewayエントリークローン作製の前駆体であ
る、５'末端に該attＢ1の組換え配列を、３’末端に該a
ttＢ2の組換え配列をそれぞれアダプターとして持つそ
れぞれのｃＤＮＡのＰＣＲ産物を構築するために、２ス
テップアダプターＰＣＲを用いる。
【０００９】本発明による該２ステップアダプターＰＣ
Ｒにおいては、目的とする鋳型ｃＤＮＡを増幅する第１
ステップのＰＣＲを、該アダプターaを含む５'末端プラ
イマーＡを用い、該アダプターｂを含み、鋳型ｃＤＮＡ
の停止コドンにハイブリダイズする部位の塩基配列が異
なる３'末端プライマーＢ及びＢ'を混合して行い、第２
ステップのＰＣＲを、第１ステップでの増幅産物を鋳型
として、５’末端にプラスミドへの接続部位となる該配
列attＢ1を持つアダプターｃを含む該５’末端共通プラ
イマーＣを用い、３'末端のＰＣＲプライマーとしてプ
ラスミドへの接続部位となる該配列attＢ2を含む該アダ
プターｄを持つネイティブ型共通プライマーＤ又はＣ末
端融合型共通プライマーＤ'を用いてそれぞれ増幅を行
い、５'末端にattＢ1配列を、３'末端にattＢ2配列を持
つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰ
ＣＲ産物をそれぞれ効率良く得ることができる。その概
略図を図１に示す。
【００１０】該第１ステップのＰＣＲで、その停止コド
ンにハイブリダイズする塩基配列において、ＡＴＴ及び
ＡＴＡ（なお、図１ではこの組み合わせの場合のみを例
示してある）、ＡＣＴ及びＡＣＡあるいはＡＣＴ及びＣ
ＣＴであるそれぞれ２種類組み合わせの該プライマーＢ
及び該プライマーＢ'を混合して用いて増幅された該ｃ
ＤＮＡの３'末端が、それぞれＴＡＡ及びＴＡＴ、ＴＧ
Ａ及びＴＧＴあるいはＴＧＡ及びＧＧＡである２種類の
ＤＮＡが増幅されるが、得られた第１ステップのＰＣＲ
産物を鋳型とした第２ステップでのＰＣＲに際して、該
３'末端のＰＣＲプライマーとして、それぞれＡＴＴあ
るいはＡＣＴの配列を３’末端に持つ、配列番号７ある
いは９に記載の該ネイティブ型共通プライマーＤ及びそ
れぞれＡＴＡ、ＡＣＡあるいはＣＣＴの配列を３’末端
に持つ配列番号８、１０あるいは１１に記載の該Ｃ末端
融合型共通プライマーＤ'を用いることにより、停止コ
ドンによる読みとりを停止するネイティブ型ｃＤＮＡ及
び停止コドンが破壊されＣ末端を読み繋ぐＣ末端融合型
ｃＤＮＡを選択的に且つ効率良く、それぞれ作製するこ
とができる。
【００１１】第２ステップでのＰＣＲを、該アダプター
ｃを含む該５’末端の該共通プライマーＣを用い、３'
末端のＰＣＲプライマーとして、該アダプターｄを含む
該ネイティブ型共通プライマーＤ及び該Ｃ末端融合型共
通プライマーＤ'の２種類を用いて行うことにより、５'
末端にattＢ1配列を、３'末端にattＢ2は配列を持つネ
イティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ
産物を、それぞれ得ることができ、得られたｃＤＮＡを
attPプラスミドに組み込み、これをコンピテントセルに
導入することでGatewayエントリークローンを作製する
ことができる。
【００１２】本発明による該第１ステップＰＣＲにおい
て、用いられる５'末端側プライマーＡ中のアダプター
ａの塩基配列は、配列表の配列番号１に記載の配列を用
いることができる。３'末端側プライマーＢ及びＢ'中の
アダプターｂの塩基配列は、配列番号２を用いることが
できる。
【００１３】本発明では、該第２ステップでのＰＣＲに
おける５’末端のアダプターを含む共通プライマーＣが
用いられるが、該プライマーＣにおけるアダプターｃの
塩基配列は、配列番号３に記載の配列を持つアダプター
を用いることができ、該プライマーＣは、配列番号４に
記載の塩基配列を持つものを用いることができる。３'
末端側はアダプターを含む該ネイティブ型共通プライマ
ーＤ及び該Ｃ末端融合型共通プライマーＤ'の２種類を
用いて行うが、両共通プライマーにおけるアダプターｄ
の塩基配列は、配列番号６に記載の配列を持つアダプタ
ーを用いることができる。
【００１４】本発明では、ＲＮＡを逆転写して得られる
全長ｃＤＮＡポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を
用いる。該ＤＮＡ断片は、ウイルス、細菌、酵母、糸状
菌、植物、昆虫、及びヒトを含む動物など自然の材料か
ら由来することができる。また、あらゆるＲＮＡ材料か
ら調製することもできる。
【００１５】本発明によるＰＣＲ過程においては、多様
なＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。好ましく
は、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）
(Taq)、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophi
lus）(Tth)及びパイロコカスフリオサス（Pyrococcus f
uriosus)(Pfu)を含む様々な細菌から得られるような熱
安定的な該ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１６】本発明によるＰＣＲ過程においては、エン
ハンサー溶液（インビトロジェン社製）を用いることに
より反応効率を上げることができる。該エンハンサー溶
液を加える場合には、ＰＣＲ反応溶液組成中に、５〜１
５％であり、好ましくは８〜１２％である。
【００１７】本発明による該第１ステップＰＣＲにおい
ては、ＰＣＲの反応プログラムのサイクル数は３〜１０
が好ましく、さらに好ましくは４〜６である。該第２ス
テップＰＣＲにおいては、ＰＣＲの反応プログラムのサ
イクル数は５〜２０が好ましく、さらに好ましくは８〜
１２である。
【００１８】本発明における第１ステップＰＣＲの反応
条件の一例として、反応溶液組成を表１に、反応プログ
ラムを表２にそれぞれ示した。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】本発明における第２ステップＰＣＲの反応
条件の一例として、反応溶液組成を表３に、反応プログ
ラムを表４にそれぞれ示した。
【００２２】
【表３】
【００２３】
【表４】
【００２４】表１〜表４のＰＣＲの反応条件は一例であ
って、エントリークローン作製のためのｃＤＮＡの長さ
等に対応して、例えば鋳型ＤＮＡの量等その条件は適宜
選択することができる。
【００２５】本発明によれば、該２ステップアダプター
ＰＣＲ法による反応の結果、５'末端にattＢ1配列を、
３'末端にattＢ2は配列を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及
びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を同時に効率良く
得ることができる。エントリークローン作製のための、
第２ステップ（以後、２ｎｄと略記）ＰＣＲ産物のatt
Ｐプラスミドへの組み込みは、ＢＰ反応により容易に行
うことができる。表５にＢＰ反応における、反応溶液組
成の一例を示す。
【００２６】
【表５】
【００２７】該ＢＰ反応は、例えば以下のような操作に
より行うことができる。氷上で表５における２ｎｄＰＣ
Ｒ産物を含まない反応溶液を混合しておき、２ｎｄＰＣ
Ｒ産物を所定量加えて、２５℃で１時間以上インキュベ
ートした後、1μlの10xプロテナーゼＫ（2μg/μl）を
加え、３７℃で１０minインキュベートして反応を停止
する。
【００２８】本発明においては、該ＢＰ反応により得ら
れた産物を、例えば以下の操作によりコンピテントセル
をトランスフォメーションすることで、Gatewayエント
リークローンを作製することができる。即ち、氷上で５
０μlのコンピテントセル溶液に５μlのＢＰ反応産物を
加え、そのまま３０minインキュベートする。その後、
４２℃でセルを３０sec熱ショックを行い、直ちに２min
氷上に置く。続いて、２５０μlのＳＯＣ培地を加え
て、３７℃で１．５時間振とう培養する。選択培地プレ
ート（５０μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地プレー
ト）上にセル１００〜１５０μlを蒔き、３７℃でイン
キュベートする。生えてきたそれぞれのクローンから４
個のコロニーをとり、５０μg/mlのカナマイシンを含む
０．２mlのＴＢ培地中で振とう培養する。その後、８０
％グリセロール溶液に５０μlの培養液を加えて、良く
攪拌し、シールした後−８０℃で保存する。得られたク
ローンについて、目的とするエントリークローンが作製
されていることの確認を行う。
【００２９】本発明における、目的エントリークローン
の生成の確認は、前記クローンから得られ保存したコロ
ニーについて、コロニーＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を
行うことにより可能となる。コロニーＰＣＲの反応条件
の一例として、反応溶液組成を表６に、反応プログラム
を表７にそれぞれ示した。なお、プライマーCの塩基配
列は、配列表の配列番号４に、attＢ2プライマーの塩基
配列は、配列番号１２にそれぞれ記載のものを用いるこ
とができる。
【００３０】
【表６】
【００３１】
【表７】
【００３２】該コロニーＰＣＲにより得られたＰＣＲ産
物は、その反応産物の５μlを１．５％のアガロースゲ
ル上で分離し、所定のエントリークローン作製の確認を
行うことができる。
【００３３】
【実施例】本発明を実施例によってさらに詳細に説明す
るが、本発明はこの実施例によって限定されるものでは
ない。また、実施例で用いた酵素及び試薬は、特記しな
い限りインビトロジェン社又は和光純薬社製の分析レベ
ル及び生化学レベルのものを使用した。
【００３４】実施例１ 第１ステップのＰＣＲに際して、３'末端側のアダプタ
ーｂを持つプライマーとして、鋳型ｃＤＮＡの停止コド
ンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＴＴ及びＡＴＡ
の２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いるG
atewayエントリークローン作製の実施例。
【００３５】ヒト完全長ｃＤＮＡプロジェクトにおいて
見出されたＯＲＦ６２４、１４７３、９１５、１３８
９、４９８、１４１０、３７８及び６７２のそれぞれの
ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を２ステップアダプターＰＣ
ＲによりｃＤＮＡの増幅を行い、Gatewayエントリーク
ローンの作製を行った。第１ステップのＰＣＲ反応は、
プライマーＡ及び配列番号２に記載ののアダプターｂを
持ち、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする
塩基配列が、ＡＴＴ及びＡＴＡの２種類であるプライマ
ーＢ及びＢ'を混合して用いて、基本的には表１の反応
組成溶液により、表２の反応プログラムでＰＣＲ反応を
行った。なお、第１及び第２ステップのＰＣＲ反応にお
いて、ＤＮＡポリメラーゼとしては、表１、表３にある
PLATINUMTaq DNA polymerase High Fidelity（以後、Taq
HiFiと略記）以外にPLATINUM Pfx DNA polymerase（以
後、Pfxと略記）の２種類について検討した。また、Taq
HiFiを用いた場合については、エンハンサー溶液を添加
した時と、添加しないと時について検討を行った。
【００３６】第１ステップＰＣＲ反応は、９６ウエルプ
レートを用いて行い、表８の反応溶液組成（１２４反応
分）を調製し、１２チャンネルピペットを用いて各チュ
ーブに２０μl分注した後、プライマーＡ（10μM）を0.
5μl、プライマーＢ及びＢ'の混合液（10μM）を0.5μl
及び鋳型DNAを5.0μl（50ng〜）をそれぞれのチューブ
に加えて、表２の反応プログラムにより反応を行った。
【００３７】
【表８】
【００３８】第２ステップのＰＣＲ反応は、配列番号６
に記載のプライマーＣ及び配列番号７に記載の配列を持
つプライマーＤあるいは配列番号８に記載の配列を持つ
プライマーＤ'用いて、基本的には表３の反応組成溶液
により、表４の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。
【００３９】第１ステップＰＣＲ反応と同様に、第２ス
テップのＰＣＲ反応においても９６ウエルプレートを用
いて行い、表９の反応溶液組成（１２４反応分）を調製
し、１２チャンネルピペットを用いて各チューブに２０
μl分注した後、第１ステップのＰＣＲ反応溶液5.0μl
をそれぞれのチューブに加えて、表４の反応プログラム
により反応を行った。
【００４０】
【表９】
【００４１】２ステップアダプターＰＣＲ法による反応
の結果、５'末端にattＢ1配列を、３'末端にattＢ2配列
を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡ
のＰＣＲ産物が得られる。エントリークローン作製のた
めの、attＰプラスミドへの組み込みは、ＢＰ反応によ
り行う。ＢＰ反応は、基本的には表５に示した反応溶液
組成により行うが、ＰＣＲ反応と同様に９６ウエルプレ
ートを用いて行い、表１０の反応溶液組成（１２４反応
分）を調製した。
【００４２】
【表１０】
【００４３】ＢＰ反応の操作は、氷上で表１０に示した
反応溶液を混合しておき、各チューブに５μl を分注し
た後、２ｎｄＰＣＲ産物を５μl加えて、２５℃で一晩
インキュベートした後、1μlの10xプロテナーゼＫ（2μ
g/μl）を加え、３７℃で１０minインキュベートして反
応を停止した。
【００４４】ＢＰ反応により得られた産物で、以下の操
作によりコンピテントセルをトランスフォメーション
し、Gatewayエントリークローンを作製した。即ち、氷
上で５０μlのコンピテントセル（ＤＨ５α）溶液に５
μlのＢＰ反応産物を加え、そのまま３０minインキュベ
ートした。その後、４２℃でセルを３０sec熱ショック
し、直ちに２min氷上に置いた。続いて、２５０μlのＳ
ＯＣ培地を加えて、３７℃で１．５時間振とう培養し
た。選択培地プレート（５０μg/mlのカナマイシンを含
むＬＢ培地プレート）上に培養液１００〜１５０μlを
蒔き、３７℃でインキュベートした。
【００４５】以上の実験により、それぞれのクローンに
ついて得られたコロニー数を確認した結果を表１１に示
した。
【００４６】
【表１１】
【００４７】表１１の結果から、２ステップのＰＣＲの
反応条件により各クローンにおいて、充分なコロニー数
が得られることが分かる。生えてきたそれぞれのクロー
ンのコロニーから任意に４個のコロニーを選びとり、５
０μg/mlのカナマイシンを含む０．２mlのＴＢ培地中で
振とう培養した。その後、８０％グリセロール溶液に５
０μlの培地を加えて、良く攪拌し、シールした後−８
０℃で保存した。
【００４８】選別した各クローンのコロニーについて、
目的とするエントリークローンが作製されていることの
確認を行った。即ち、各クローンから得られ、保存した
コロニーについて、コロニーＰＣＲによるｃＤＮＡの増
幅を行った。コロニーＰＣＲは、基本的には反応溶液組
成を表６に示したものを用いて、反応プログラムを表７
に示した方法で行った。
【００４９】第１、第２ステップＰＣＲ反応と同様に、
コロニーＰＣＲ反応においても284ウエルプレートを用
いて行い、表１２の反応溶液組成（４１６反応分）を調
製し、１２チャンネルピペットを用いて各チューブに１
５μl分注した後、各コロニー培養液０．５μlをそれぞ
れのチューブに加えて、表７の反応プログラムにより反
応を行った。
【００５０】
【表１２】
【００５１】コロニーＰＣＲにより確認を行った各クロ
ーンの４個のコロニーについて、停止コドンの塩基配列
についての確認結果を表１３にまとめて示した。２ステ
ップアダプターＰＣＲによる停止コドンの改変を、任意
に選別した４個のコロニー中での目的の配列を持つもの
の数で示した。
【００５２】
【表１３】
【００５３】表１３の結果によれば、本発明による２ス
テップアダプターＰＣＲによるエントリークローンの作
製において、同時に選択性良くネイティブ型及びＣ末端
融合型ｃＤＮＡのクローンができていることが分かる。
特に、Taq HiFiにエンハンサー溶液添加の場合には、ネ
イティブ型、C末端融合型ｃＤＮＡとも１００％の選択
率でクローン化されていることが分かる。
【００５４】実施例２ 第１ステップのＰＣＲに際して、３'末端側のアダプタ
ーｂを持つプライマーとして、鋳型ｃＤＮＡの停止コド
ンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＣＴ及びＡＣＡ
の２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いるG
atewayエントリークローン作製の実施例。
【００５５】実施例１と同様に、ヒト完全長ｃＤＮＡプ
ロジェクトにおいてにおいて見出されたＯＲＦ６２４、
１４７３、９１５、１３８９、４９８、１４１０、３７
８及び６７２のそれぞれのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を
２ステップアダプターＰＣＲによりｃＤＮＡの増幅を行
い、Gatewayエントリークローンの作製を行った。第１
ステップのＰＣＲ反応は、プライマーＡ及び配列番号２
に記載ののアダプターｂを持ち、鋳型ｃＤＮＡの停止コ
ドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＣＴ及びＡＣ
Ａの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用い
て、基本的には表１の反応組成溶液により、表２の反応
プログラムでＰＣＲ反応を行った。なお、第１及び第２
ステップのＰＣＲ反応において、ＤＮＡポリメラーゼと
しては、表１、表３にあるTaq HiFi以外にPfxの２種類
について検討した。
【００５６】第１ステップＰＣＲ反応は、９６ウエルプ
レートを用いて行い、実施例１と同様に、表８の反応溶
液組成（１２４反応分）を調製し、表２の反応プログラ
ムにより反応を行った。ただし、表８におけるＤＮＡポ
リメラーゼを Taq HiFiを用いた場合、エンハンサー溶
液の無添加の反応は、本実施例では行っていない。
【００５７】実施例１と同様に、第２ステップのＰＣＲ
反応においても９６ウエルプレートを用いて行い、表９
の反応溶液組成（１２４反応分）を調製し、表４の反応
プログラムにより反応を行った。
【００５８】実施例１と同様に、第２ステップのＰＣＲ
反応は、配列番号4に記載のプライマーＣ及び配列番号
９に記載の配列を持つプライマーＤあるいは配列番号１
０に記載の配列を持つプライマーＤ'用いて、基本的に
は表３の反応組成溶液により、表４の反応プログラムで
ＰＣＲ反応を行った。
【００５９】実施例１と同様に、２ステップアダプター
ＰＣＲ法による反応の結果得られたネイティブ型ｃＤＮ
Ａ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物について、エ
ントリークローン作製のための、ＢＰ反応を行った。
【００６０】ＢＰ反応により得られた産物で、実施例１
と同様に、コンピテントセルをトランスフォメーション
し、Gatewayエントリークローンを作製した。以上の実
験により、それぞれのクローンについて得られたコロニ
ー数を確認した結果を表１４に示した。
【００６１】
【表１４】
【００６２】表１４の結果から、２ステップアダプター
ＰＣＲの反応条件により各クローンにおいて、必要なコ
ロニー数が得られることが分かる。実施例１と同様に、
任意に４個のコロニーを選びとり、処理後−８０℃で保
存した。
【００６３】引き続き、実施例１に従って、選別した各
クローンのコロニーについて、目的とするエントリーク
ローンが作製されていることをコロニーＰＣＲにより確
認を行った。
【００６４】コロニーＰＣＲにより確認を行った各クロ
ーンの４個のコロニーについて、停止コドンの塩基配列
についての確認結果を表１５にまとめて示した。２ステ
ップアダプターＰＣＲによる停止コドンの改変を、任意
に選別した４個のコロニー中での目的の配列を持つもの
の数で示した。
【００６５】
【表１５】
【００６６】表１５の結果によれば、本発明による２ス
テップアダプターＰＣＲによるエントリークローンの作
製において、同時に選択性良くネイティブ型及びＣ末端
融合型ｃＤＮＡのクローンができていることが分かる。
【００６７】実施例３ 第１ステップのＰＣＲに際して、３'末端側のアダプタ
ーｂを持つプライマーとして、鋳型ｃＤＮＡの停止コド
ンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＣＴ及びＣＣT
の２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いるG
atewayエントリークローン作製の実施例。
【００６８】実施例１と同様に、ヒト完全長ｃＤＮＡプ
ロジェクトにおいて見出されたＯＲＦ６２４、１４７
３、９１５、１３８９、４９８、１４１０、３７８及び
６７２のそれぞれのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を２ステ
ップアダプターＰＣＲによりｃＤＮＡの増幅を行い、Ga
tewayエントリークローンの作製を行った。第１ステッ
プのＰＣＲ反応は、プライマーＡ及び配列番号２に記載
ののアダプターｂを持ち、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンに
ハイブリダイズする塩基配列が、ＡＣＴ及びＣＣTの２
種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いて、基
本的には表１の反応組成溶液により、表２の反応プログ
ラムでＰＣＲ反応を行った。なお、第１及び第２ステッ
プのＰＣＲ反応において、ＤＮＡポリメラーゼとして
は、表１、表３にあるTaq HiFi以外にPfxの２種類につ
いて検討した。また、Taq HiFiを用いた場合について
は、エンハンサー溶液を添加した時と、添加しないと時
について検討を行った。
【００６９】第１ステップＰＣＲ反応は、９６ウエルプ
レートを用いて行い、実施例１と同様に、表８の反応溶
液組成（１２４反応分）を調製し、表２の反応プログラ
ムにより反応を行った。
【００７０】実施例１と同様に、第２ステップのＰＣＲ
反応は、配列番号4に記載のプライマーＣ及び配列番号
９に記載の配列を持つプライマーＤあるいは配列番号１
１に記載の配列を持つプライマーＤ'用いて、基本的に
は表３の反応組成溶液により、表４の反応プログラムで
ＰＣＲ反応を行った。
【００７１】実施例１と同様に、２ステップアダプター
ＰＣＲ法による反応の結果得られたネイティブ型ｃＤＮ
Ａ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物について、エ
ントリークローン作製のための、ＢＰ反応を行った。
【００７２】ＢＰ反応により得られた産物を、実施例１
と同様の操作によりコンピテントセルをトランスフォメ
ーションし、Gatewayエントリークローンを作製した。
それぞれのクローンについて得られたコロニー数を確認
した結果を表１６に示した。
【００７３】
【表１６】
【００７４】表１６の結果から、２ステップのＰＣＲの
反応条件により各クローンにおいて、充分なコロニー数
が得られることが分かる。それぞれのクローンのコロニ
ーから任意に４個のコロニーを選びとり、処理後−８０
℃で保存した。
【００７５】選別した各クローンのコロニーについて、
目的とするエントリークローンが作製されていること
を、コロニーＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を行うことに
より確認した。コロニーＰＣＲは、実施例１と同様に行
った。
【００７６】コロニーＰＣＲにより確認を行った各クロ
ーンの４個のコロニーについて、停止コドンの塩基配列
についての確認結果を表１７にまとめて示した。２ステ
ップアダプターＰＣＲによる停止コドンの改変を、任意
に選別した４個のコロニー中での目的の配列を持つもの
の数で示した。
【００７７】
【表１７】
【００７８】表１７の結果によれば、本発明による２ス
テップアダプターＰＣＲによるエントリークローンの作
製において、同時に選択性良くネイティブ型及びＣ末端
融合型ｃＤＮＡのクローンができていることが分かる。
特に、ＤＮＡポリメラーゼとしてTaq HiFiをもちいて、
エンハンサー溶液添加の場合には、ネイティブ型及びＣ
末端融合型ｃＤＮＡともほぼ１００％の選択率でクロー
ン化されていることが分かる。
【００７９】
【発明の効果】本発明によるGatewayエントリークロー
ンの作成方法は、多種類の発現クローンを迅速かつ容易
に作製することを可能とした技術である。ｃＤＮＡやＰ
ＣＲＤＮＡの機能解析、たんぱく質発現等が容易とな
り、ヒトゲノムｃＤＮＡ等による医薬品開発などの進展
に寄与する。
【００８０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 独立行政法人産業技術総合研究所 <110> インビトロジェン株式会社 <130> 51624 <160> 12 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> artificial sequence <400> １ GGAGATAGAA CC 12 <210> 2 <211> 11 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 2 GAAAGCTGGG T 11 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 3 ACAAGTTTGT ACAAAAAAGC AGGCT 25 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 4 GGGGACAAGT TTGTACAAAA AAGCAGGCTT CGAAGGAGAT AGAACC 46 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 5 ACCACTTTGT ACAAGAAAGC TGGGT 25 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 6 GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTC 30 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 7 GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTC TTA 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 8 GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTC ATA 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 9 GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTC TCA 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 10 GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTC ACA 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 11 GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTC TCC 33 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <400> 1２ GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGT 29
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による２ステップアダプターＰＣＲによ
るｃＤＮＡの増幅の概略を示したものである。
【符号の説明】
ａ：アダプターａ ｂ：アダプターｂ ｃ：アダプターｃ ｄ：アダプターｄ ＡＴＧ：読み込み開始コドン配列 Ｔｅｒ：停止コドン配列（ＴＧＡ，ＴＡＡ，ＴＡＧを総
称） ＯＲＦ：ｃＤＮＡの翻訳領域
フロントページの続き (72)発明者 野村 信夫 東京都江東区青海２−41−６ 独立行政法 人産業技術総合研究所 臨海副都心センタ ー内 (72)発明者 五島 直樹 東京都江東区青海２−41−６ 独立行政法 人産業技術総合研究所 臨海副都心センタ ー内 (72)発明者 木須 康智 神奈川県横浜市金沢区福浦１−１−１ 横 浜金沢ハイテクセンター・テクノコア４階 インビトロジェン株式会社横浜研究所内 (72)発明者 園 佐紀 神奈川県横浜市金沢区福浦１−１−１ 横 浜金沢ハイテクセンター・テクノコア４階 インビトロジェン株式会社横浜研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 EA04 HA19

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ２ステップアダプターＰＣＲにおいて、
    鋳型ｃＤＮＡを増幅する第１ステップのＰＣＲを、アダ
    プターaを含む５'末端プライマーＡを用い、アダプター
    ｂを含み、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズ
    する部位の塩基配列が異なる３'末端プライマーＢ及び
    Ｂ'を混合して行い、第２ステップのＰＣＲを、第１ス
    テップでの増幅産物を鋳型として、５’末端にプラスミ
    ドへの接続部位となる配列attＢ1を持つアダプターｃを
    含む５’末端共通プライマーＣを用い、３'末端のＰＣ
    Ｒプライマーとしてプラスミドへの接続部位となる配列
    attＢ2を含むアダプターｄを持つネイティブ型共通プラ
    イマーＤ又はＣ末端融合型共通プライマーＤ'を用いて
    それぞれ増幅を行い、両末端に異なる接続塩基配列を持
    つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡを作
    製し、得られたｃＤＮＡをattＰプラスミドに組み込
    み、これをコンピテントセルに導入することを特徴とす
    るGatewayエントリークローンの作製方法。
  2. 【請求項２】 配列表の配列番号４に記載の塩基配列を
    有する請求項１に記載のＰＣＲプライマーＣ。
  3. 【請求項３】 該プライマーＢは、その停止コドンにハ
    イブリダイズする塩基配列がＡＴＴであり、該プライマ
    ーＢ'は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配
    列がＡＴＡであり、該プライマーＤは、配列番号７に記
    載の塩基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号８
    に記載の塩基配列であることを特徴とする請求項１に記
    載のGatewayエントリークローンの作製方法。
  4. 【請求項４】 配列表の配列番号７に記載の塩基配列を
    有する請求項１又は３に記載のＰＣＲプライマーＤ。
  5. 【請求項５】 配列表の配列番号８に記載の塩基配列を
    有する請求項１又は３に記載のＰＣＲプライマーＤ'。
  6. 【請求項６】 該プライマーＢは、その停止コドンにハ
    イブリダイズする塩基配列がＡＣＴであり、該プライマ
    ーＢ'は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配
    列がＡＣＡであり、該プライマーＤは、配列番号９に記
    載の塩基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号１
    ０に記載の塩基配列であることを特徴とする請求項１に
    記載のGatewayエントリークローンの作製方法。
  7. 【請求項７】 配列表の配列番号９に記載の塩基配列を
    有する請求項１又は６に記載のＰＣＲプライマーＤ。
  8. 【請求項８】 配列表の配列番号１０に記載の塩基配列
    を有する請求項１又は６に記載のＰＣＲプライマー
    Ｄ'。
  9. 【請求項９】 該プライマーＢは、その停止コドンにハ
    イブリダイズする塩基配列がＡＣＴであり、該プライマ
    ーＢ'は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配
    列がＣＣTであり、該プライマーＤは、配列番号９に記
    載の塩基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号１
    １に記載の塩基配列であることを特徴とする請求項１に
    記載のGatewayエントリークローンの作製方法。
  10. 【請求項１０】 配列表の配列番号１１に記載の塩基配
    列を有する請求項１又は９に記載のＰＣＲプライマー
    Ｄ'。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれかに記載の該
    エントリークローンの作製方法により作製されたネイテ
    ィブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのGatewayエ
    ントリークローン。
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