JP2005512578A6 - Ｐｃｒをベースとする高効率のポリペプチドスクリーニング - Google Patents
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Abstract
ポリペプチドの高効率スクリーニングよび対応遺伝子コード配列の複製が、最初のポリヌクレオチド鋳型又は鋳型ライブラリーの増幅によって達成される。増幅産物は、対をなすin vitroでの転写及び翻訳のための鋳型として使用される。その後、翻訳産物は、目的の性質、例えば結合特異性、酵素活性、基質特異性などについてスクリーニングされる。所望ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、さらなるスクリーニング、複製、複数回の選択などのために、宿主細胞中に直接形質転換される。最初の鋳型又は鋳型ライブラリーは、スクリーニングのための複数の配列変異体を作製するために、突然変異誘発にかけられてもよい。
Description
発明の背景
in vitroでのタンパク質試験のための大きなライブラリーの作製は、結合性、触媒活性、特異性などのそれらの生物学的特性に基づいて、多数の配列変異体を含むライブラリーを効率的にスクリーニングする好機を提供する。過去数年に渡るゲノミクス及びコンビナトリアルケミストリー手法から得られる、可能性のある新しい標的の数の激増はスクリーニングプログラムに莫大な圧力をかけてきた。有用な変化の同定のための報酬は大きいが、ヒットの割合は典型的に低い。この問題に取り組むために、多くの個々のポリペプチドを試験することができるような、高効率な方法を提供し得るスクリーニング方法が好ましい。
in vitroでのタンパク質試験のための大きなライブラリーの作製は、結合性、触媒活性、特異性などのそれらの生物学的特性に基づいて、多数の配列変異体を含むライブラリーを効率的にスクリーニングする好機を提供する。過去数年に渡るゲノミクス及びコンビナトリアルケミストリー手法から得られる、可能性のある新しい標的の数の激増はスクリーニングプログラムに莫大な圧力をかけてきた。有用な変化の同定のための報酬は大きいが、ヒットの割合は典型的に低い。この問題に取り組むために、多くの個々のポリペプチドを試験することができるような、高効率な方法を提供し得るスクリーニング方法が好ましい。
in vitroでのタンパク質合成は、クローン化又は合成された遺伝物質の研究室規模の発現のための効率的な道具である。近年、in vitroでのタンパク質合成は、細胞発現に関連する欠点のために、従来の組換えDNA技術を大きく強化してきた。in vivoにおいては、タンパク質は、細胞の増殖と共に合成されるいくつかの酵素により分解又は改変され、そして合成後に、グリコシル化、脱アミノ化もしくは酸化などの翻訳後処理により改変されうる。さらに、多くの産物は代謝過程を阻害し、それらの合成は、細胞を再生しその遺伝子情報を保護するのに必要な他の細胞過程と競合する。さらに、in vitroでのタンパク質合成系はin vivo系と比較して柔軟性を加えてきた。例えば、シャペロン、界面活性剤及びコファクターなどのタンパク質の溶解性及び活性を増強することが知られる添加物は、標的ポリペプチドの合成中に容易に関与する。複数のタンパク質の同時発現も無細胞系においてはより容易に達成される。in vitroでの転写及び翻訳の方法は、例えば、米国特許第6,168,931号；同第6,399,323号；Kim及びSwartz (2000) Biotechnol Prog. 16: 385-390；Kim及びSwartz (2000) Biotechnol Lett. 22: 1537-1542; Kim及びChoi (2000) J Biotechnol. 84: 27-32; Kimら、(1996) Eur J Biochem. 239: 881-886; Kim及びSwartz (2001) Biotechnol Bioeng. 74: 309-316; 並びにKim及びSwartz (1999) Biotechnol Bioeng. 66: 180-188に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられるものとする。
in vitroでのタンパク質合成は、都合のよいスクリーニング方式を提供するが、遺伝子配列を変化させるための現在の方法は通常、プラスミドを細菌中で増殖させることによる工程を用いる。突然変異させたタンパク質の産生に導くDNA断片を作製するためにPCRを用いる方法でさえ、重複伸長PCRとして知られる方法に依存する。重複伸長PCR (overlap extension PCR)は、PCR産物を、それが所望の特徴を有するタンパク質をコードすることが見出された後にクローニングする必要があるという欠点を有する。
増幅産物によりコードされるポリペプチドの高効率スクリーニングを簡素化する方法は、新規なポリペプチド剤の開発にとって非常に興味深い。この問題は本発明の目的とするものである。
関係のある参考文献としては、米国特許第5,545,552号；同第5,789,166号；同第5,866,395号；同第5,923,419号；同第5,948,663号；及び同第6,183,997号が挙げられる。他の関係のある刊行物としては、Ohuchiら、(1998) N.A.R. 26: 4339-4346; Garvinら、(2000) Nat. Biotech. 18: 95-97;並びにLee及びCohen (2001) J. Biol. Chem. 276: 23268-23274が挙げられる。米国特許第6,280,977号は重複伸長PCRの方法を記載している。
発明の概要
発現可能なオープンリーディングフレームを含む配列の高効率スクリーニングのための方法を提供する。最初の複製可能な鋳型の発現可能部分を、例えば、PCR増幅により増幅する。そのような発現可能部分は転写及び翻訳のための調節エレメントに作動可能に連結されたオープンリーディングフレームを含む。次いで、得られた増幅産物を、対になったin vitroでの転写及び翻訳による発現のための鋳型として用いる。得られたポリペプチドを、目的の特性、例えば、結合特異性、酵素活性、基質特異性などについてスクリーニングする。目的の翻訳産物をコードする最初の鋳型を直接用いて、クローニング工程を介入させることなく宿主細胞を形質転換する。このようにして、目的のポリペプチドをコードする配列を取得し、複製する方法が簡素化される。
発現可能なオープンリーディングフレームを含む配列の高効率スクリーニングのための方法を提供する。最初の複製可能な鋳型の発現可能部分を、例えば、PCR増幅により増幅する。そのような発現可能部分は転写及び翻訳のための調節エレメントに作動可能に連結されたオープンリーディングフレームを含む。次いで、得られた増幅産物を、対になったin vitroでの転写及び翻訳による発現のための鋳型として用いる。得られたポリペプチドを、目的の特性、例えば、結合特異性、酵素活性、基質特異性などについてスクリーニングする。目的の翻訳産物をコードする最初の鋳型を直接用いて、クローニング工程を介入させることなく宿主細胞を形質転換する。このようにして、目的のポリペプチドをコードする配列を取得し、複製する方法が簡素化される。
本発明の一実施形態においては、最初の鋳型は、反応する物が線状分子であり、その産物が環状分子である、連結反応又は組換え反応の産物である。環状分子の指数的増殖のみを提供するプライマーが選択されてもよい。
本発明の一実施形態においては、増幅プライマーは完全なプロモーター配列とハイブリダイズしない。本発明の別の実施形態においては、増幅プライマーは末端GCクランプ領域を含む。
本発明の一実施形態においては、最初の鋳型はメチル化ヌクレオチドを含み、発現の前に、増幅反応の産物が、メチル化ヌクレオチドに特異的な制限酵素で消化される。
実施形態の詳細な説明
ポリペプチドの簡素化されたかつ高効率のスクリーニング及び対応する遺伝子コード配列の複製のための方法が提供される。本発明の方法においては、最初の複製可能なポリヌクレオチド鋳型又は鋳型のライブラリーの発現可能部分を、図1に示されるように、例えばPCRにより増幅する。最初の鋳型又は鋳型のライブラリーを突然変異誘発して、スクリーニングのための複数の配列変異体を作製することができる。鋳型の発現可能部分は転写及び翻訳のための調節配列に作動可能に連結されたオープンリーディングフレームを含む。この発現可能部分は鋳型の断片を含むことができ、この断片は完全な複製可能分子の全体まででもよいし、また完全な複製可能分子を含んでいてもよい。
ポリペプチドの簡素化されたかつ高効率のスクリーニング及び対応する遺伝子コード配列の複製のための方法が提供される。本発明の方法においては、最初の複製可能なポリヌクレオチド鋳型又は鋳型のライブラリーの発現可能部分を、図1に示されるように、例えばPCRにより増幅する。最初の鋳型又は鋳型のライブラリーを突然変異誘発して、スクリーニングのための複数の配列変異体を作製することができる。鋳型の発現可能部分は転写及び翻訳のための調節配列に作動可能に連結されたオープンリーディングフレームを含む。この発現可能部分は鋳型の断片を含むことができ、この断片は完全な複製可能分子の全体まででもよいし、また完全な複製可能分子を含んでいてもよい。
この増幅産物は、オープンリーディングフレームの産物を発現させるために、対になったin vitroでの転写及び翻訳のための鋳型として用いられる。増幅産物を単離するためのさらなる精製工程の不在下で、増幅反応を発現のために直接用いることができる。次いで、ポリペプチド翻訳産物を目的の特性、例えば、結合特異性、酵素活性、基質特異性などについてスクリーニングする。
次に、目的の特性を有する産物をコードするオープンリーディングフレームを含む最初の鋳型を、介入クローニング工程なしに宿主細胞中に直接形質転換する。用語「介入クローニング工程」は、目的の配列と第2のポリヌクレオチドとの連結又は組換え、例えば、ベクター中へのポリヌクレオチドの連結など、を指すことが意図されている。このようにして、目的のポリペプチドをコードする配列を取得及び複製する方法が簡素化される。
例えば、最初の鋳型が非常に少量で存在し、完全な複製可能分子を形質転換前に増幅させる場合、さらなる増幅工程を必要に応じて実施する。
最初の鋳型は、反応する物が線状分子であり、その産物が環状分子である場合、連結反応又は組換え反応の産物であってもよい。図2に示されるように、環状分子の発現可能部分の指数的増幅のみを提供するプライマーを選択することができる。第1及び第2のプライマーP1及びP2を、線状ベクターにハイブリダイズするが、線状分子上で互いに離れて合成開始するように選択する。従って、線状分子は、複数ラウンドの増幅の間に、複製産物の指数的増加を生じさせることができない。2つのプライマーが互いに向かいあって合成開始するように、それらプライマーとプライマーとの間に「架橋(bridge)」が作られるのは、完全な環状分子が形成される場合のみである。
通常、増幅プライマーの1つは、発現可能部分用のプロモーターの部位又はその上流で最初の鋳型の領域にハイブリダイズする(簡便のため、本明細書ではP1と呼ぶ)。このプライマーは、完全なプロモーター配列にハイブリダイズせず、例えば、該プロモーターの上流にハイブリダイズするか、又は部分的プロモーター配列を含むのが好ましい。そのようなプライマーは、精製工程を介入させることなく増幅反応から直接増幅産物を発現させることが望ましい場合に、特に有用である。P1プライマーは必要に応じて、DNA鋳型を安定化するGCクランプを5'末端に含んでもよい。PCR断片の末端は、例えば転写反応の間にエキソヌクレアーゼにより消化される傾向にある。GCクランプ領域は、標的配列にハイブリダイズしないが、エキソヌクレアーゼ消化から5'末端を保護する。
本発明の一実施形態においては、PCRをベースとする突然変異誘発が、メチル化ヌクレオチドを含む鋳型上で実施される。PCRをベースとする突然変異誘発の後、突然変異誘発反応の産物を、メチル化された親DNAを切断するが突然変異誘発を受けた産物を切断しない、メチル化ヌクレオチドに特異的な制限酵素で消化する。次いで、この突然変異誘発を受けた産物を、本発明の方法に従って増幅及び発現させる。
本発明は、本明細書に記載した特定の方法、プロトコル、細胞系、動物の種又は属、及び試薬に限定されるものではなく、それらは変更しうるものであると理解されるべきである。また、本明細書で用いる用語は特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を制限することを意図するものではないことも理解されるべきである。
本明細書で用いる単数形「一つの(a)」、「及び(and)」、並びに「その(the)」は、特にその内容について明確に断らない限り、複数の指示物を含む。すなわち、例えば、「一つの細胞」への言及は複数のそのような細胞を含むし、また「そのタンパク質」への言及は、1つ以上のタンパク質及び当業者には公知のその等価物に対する言及を含む、などである。本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、特に明確に断らない限り、本発明が属する業界の通常の知識を有する者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
最初のポリヌクレオチド鋳型は複製可能な分子である。本明細書で用いるこの用語は、宿主細胞中に形質転換された場合に複製することができるポリヌクレオチド分子、通常は二本鎖DNA及びしばしば環状分子である。最低限、そのようなポリヌクレオチドは所望の宿主細胞上で活性な複製起点、例えば、細菌細胞中で活性な複製起点、及び動物細胞中で活性な複製起点、酵母細胞などの菌類細胞中で活性な複製起点、植物細胞中で活性な複製起点などを含む。そのようなポリヌクレオチドはさらに、1つ以上の選択可能マーカー、例えば、薬剤耐性、リコンビナーゼ遺伝子の発現、蛍光などで検出可能な遺伝子産物の発現、などを含むことが多い。そのような配列は当業界で公知である。
最初のポリヌクレオチド鋳型はさらに、in vitroでの転写及び翻訳系で発現される配列を含む発現可能部分を含む。発現可能部分のエレメントとしては、プロモーターエレメント、例えばT7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーターなどが挙げられる。哺乳動物プロモーター、例えばCMVプロモーターも有用である。また、リボソーム結合部位、開始コドン、及び目的のコード配列すなわちオープンリーディングフレームも含まれる。必要に応じて含まれるエレメントは、停止コドン及び転写終結配列である。
目的のコード配列を、当業界で周知の任意の様々な起源又は方法から入手することができ、例えば、適当な細胞から単離し、合成技術などを用いて製造することができ、当業界で周知の組換え技術を用いてその構築物を得ることができる。本発明の方法に従う分析にとって望ましい多くの遺伝子産物の配列は公知である。そのような配列は文献に記載されており、GenBankなどの公共の配列データベースから入手可能であるか、又はさもなければ公的に入手可能である。自動化核酸合成装置が利用可能であれば、DNA及びRNAの双方を、そのヌクレオチド配列が公知である場合には直接的に合成するか、又はPCRクローニングにより合成した後、適切な微生物宿主中で増殖させることができる。さらに、所望のポリペプチドのアミノ酸配列が公知である場合、該核酸の適するコード配列を推測することができる。目的の遺伝子産物をコードするDNAが単離されていない場合、これを当業者には周知の様々な標準的なプロトコルにより達成することができる(例えば、Sambrookら、上掲；Suggsら、1981 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6613-6617; 米国特許第4,394,443号を参照されたい。これらはそれぞれ目的の遺伝子産物をコードするDNAの同定及び単離に関して、参照により本明細書に組み入れられるものとする)。
目的の配列としては、例えば、病原体の遺伝子配列；酵素、例えばプロテアーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼなどをコードする遺伝子；抗原をコードする遺伝子；薬剤耐性などに関与する遺伝子；例えば、ウイルス、細菌、原生動物、植物及び動物の遺伝子のコード領域、抗体又は一本鎖抗体のコード配列など、が挙げられる。2つ以上の配列に由来する配列を組換え又はシャッフリングして、ハイブリッド配列を提供することもできる。多数の公表源が、例えば、ヒト、他の哺乳動物、及びヒト病原体の配列などの遺伝子配列の供給源として利用可能である。ヒトゲノムの実質的な部分は配列決定されており、GenBankなどの公共のデータベースを介してアクセスすることができる。入手できるものには、単一遺伝子(uni-gene)セット並びにゲノム配列が含まれる。例えば、Dunhamら、(1999) Nature 402, 489-495、又はDeloukasら、(1998) Science 282, 744-746を参照されたい。例えば、多くのヒト遺伝子配列に対応するcDNAクローンがIMAGE Consortiumから入手可能である。国際IMAGE Consortium研究所は、世界中での利用のためのcDNAクローンを開発し配置している。このクローンは、例えば、Genome Systems, Inc.（St. Louis, MO）から市販されている。DNA配列情報に基づくPCRによる配列のクローニング方法は当業界で公知である。
同様に、発現に必要とされる調節配列を挿入するための技術は当業界で公知である(例えば、Kormalら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 2150-2154, 1987; Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと。これらの文献の各々は、目的の配列の発現のための方法及び組成物に関して、参照により本明細書に組み入れられるものとする)。
最初の鋳型のライブラリーを増幅のために用いることができる。そのようなライブラリーは、当業界で公知のような目的の配列のin vitro突然変異誘発により、あるいはin vivo突然誘発の後、例えば目的の特性についての選択により、取得することができる。配列のシャッフリングを用いて突然変異を作製することもできる。例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとする、米国特許第6,479,652号、「オリゴヌクレオチドを介する核酸の組換え」；米国特許第6,455,253号、「ポリペプチド工学のための方法及び組成物」；米国特許第6,413,745号、「挿入修飾核酸の組換え」；及び米国特許第6,352,859号、「反復配列組換えによる全細胞及び生物の進化」を参照されたい。
「ライブラリー」はポリヌクレオチドの集団又は複数のポリヌクレオチドを指す。特定のライブラリーは、例えば、異なる部位特異的突然変異を含む鋳型、目的のコード配列中の無作為な突然変異の集団、シャッフリングされた配列などを含む。本発明の方法においては、ライブラリー中のポリヌクレオチドは典型的には、例えば、マイクロタイタープレートの1ウエルあたり1個のクローンというように空間的に分離されている。反応、例えば増幅反応、転写及び翻訳反応などを空間的に分離されたライブラリー上で行う場合、通常、同じ反応を該ライブラリーのメンバー毎に別々に行う。
本発明の一実施形態においては、増幅を用いて配列を突然誘発させて配列変異体のライブラリーを作製し、この変異体配列を目的の特徴、例えば、増強された結合性、温度又はpH安定性、特定の光スペクトルの放射、酵素の活性及び特異性などについてスクリーニングする。そのような突然変異誘発は部位特異的なものであるか、もしくは無作為なものであってよく、又は両方の要素を組合せる、すなわち、特定の部位でのヌクレオチドの無作為な導入などであってもよい。
in vitro突然変異誘発のための反応は典型的には、目的の配列を含む核酸鋳型に基づく。この鋳型を用いて変更されたコピーを作製するが、この変更は部位特異的なもの、無作為に配置されたもの、又はその組合せであってよい。鋳型は二本鎖又は一本鎖、線状又は環状であってよく、またDNA、RNA、又はその合成類似体であってもよい。本発明の一実施形態においては、突然変異誘発反応の後、メチル化された残基、例えばDPNIに特異的な酵素(メチル化DNAのみを選択的に切断する)を用いて切断することができるメチル化された鋳型が使用される。突然変異誘発法の概説については、Ling及びRobinson(1997) Anal. Biochem. 254: 157-178(参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
戦略としては、特異的な変異原性プライマーを用いて、所定の部位及び型の突然変異を有する特異的な突然変異体を生じさせる部位特異的突然変異誘発が含まれる。例えば、「スキャニング」突然変異を用いて、タンパク質の長さに沿った、単一のコドン変化、例えばアラニン置換を導入する。標的部位で迅速に複数の変化を作製するためには、縮重プライマーを用いて、1回の反応からの可能性のある突然変異の数を増加させることができる。あるいは、ある領域又は遺伝子全体に渡る無作為な突然変異のセットが望ましい場合、無作為かつ広範囲な突然変異誘発を用いることができる。
突然変異誘発は、プライマー中への特異的な突然変異又は突然変異の組合せの導入を含み、このプライマーは核酸鋳型上の部位とアニーリングするのに十分な相同性を有するが、該プライマーと該鋳型との間には完全な一致がなくてもよく、すなわち、該プライマーは1、2、3又はそれ以上の突然変異誘発された位置を含むことができる。導入された突然変異は、特定の残基を前記配列に導入する場合、予め決定してもよく、又は例えば、プライマー中の1、2、3個以上の位置をヌクレオチドの無作為な混合物を用いて合成する場合、無作為な混合物を含んでもよい。例えば、特定のコドンに対応する3個のヌクレオチドを無作為に突然変異誘発することができる。他の目的の突然変異誘発方法の例としては、コード配列内の任意の位置での挿入又は欠失が挙げられる。
典型的には、前記プライマーはヘアピン、ループ又は直接反復などの強力な2次構造を有さない。不一致の、又は突然変異誘発を受けた残基を、プライマーの末端ではなく、その中央に向けて配置させることが多いが、逆方向PCR及び連結PCRは5'末端に突然変異を置くのが好ましい。
便利には、PCRを用いて突然変異誘発した核酸を作製する。例えば、突然変異誘発を受けた残基を含むプライマーをPCR反応における増幅プライマーとして用いることができる。このプライマーが複数の突然変異を含む場合、突然変異誘発反応は1回の増幅であってよく、又は、次いで、突然変異を受けた産物を突然変異誘発させていないプライマーを用いたさらなる増幅のための鋳型として用いる場合、少ないサイクル数の増幅であってもよい。増幅反応のための酵素の選択は、厳密性に関する要件により決定され、Taqポリメラーゼなどの酵素は典型的にはより多い数の無作為な突然変異を導入し、Pfu、もしくはTgo又はポリメラーゼの混合した組合せなどの酵素は反応の厳密性を増加させる。エラーが多い傾向があるPCRは長い配列に渡って低レベルの点突然変異を無作為に導入する低い厳密性の重合条件を使用する。
前記ポリヌクレオチド配列を化学的な突然変異誘発により変化させることもできる。化学的変異原としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン又はギ酸が挙げられる。ヌクレオチド前駆体の類似体である他の剤としては、ニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、又はアクリジンが含まれる。一般的には、これらの剤をヌクレオチド前駆体の代わりにPCR反応に添加することにより、配列を突然変異させる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどの挿入剤(intercalating agent)を用いることもできる。前記ポリヌクレオチド配列の無作為な突然変異誘発をX線又は紫外線を用いた照射により達成することもできる。
鋳型、プライマー及びヌクレオチドの同様の選択を用いる場合、従来の合成反応においてであるが非PCR反応を突然変異誘発のために用いることもできる。酵素は非PCR突然変異誘発にとって温度不安定であってよく、例えば、Klenow、T7 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼなどが挙げられる。あるいは、突然変異誘発のin vivoでの方法を、例えば、目的の特性のための最初の選択と組み合わせて用いることができる。
最初の鋳型又は鋳型のライブラリーの発現可能部分を増幅させて、転写及び翻訳の分析のために十分なポリヌクレオチドを製造することができる。上に記載したように、増幅プライマーを選択して、図2に示すような連結反応又は組換え反応の線状反応物と環状反応物とを識別することができる。このプライマーは、線状のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、かつ、互いに離間して合成開始するように選択される。従って、この線状分子は増幅のラウンドの過程で複製産物の指数的な増加をもたらすことができない。目的のオープンリーディングフレームをベクター骨格中に組換えるか又は連結する場合、2つのプライマーが互いに向かい合って合成開始するように、それらの間に「架橋」が作られる。
増幅プライマーは、末端GCクランプを含むように選択されてもよい。GCクランプは少なくとも約5から約10以下のGC残基、例えば変化するGC残基又はGもしくはCのいずれかのホモポリマー、を含む。このGCクランプ領域は通常、前記鋳型上に存在する配列にハイブリダイズしない。
コード配列に関して向けた場合、上流又は5'の増幅プライマーは増幅可能部分のプロモーターの部位で又はその上流で最初の鋳型の領域にハイブリダイズするであろう。例えば、その後の対をなした転写／翻訳反応の間のRNAポリメラーゼについての競合を避けるために、プライマーは完全なプロモーター配列を含まず、例えば、それが該プロモーターの上流にハイブリダイズするか、又はそれが部分的なプロモーター配列のみを含むのが好ましい。
ポリヌクレオチドに関する用語「増幅させる」は、ポリヌクレオチドから配列エレメントを複製することによるか、又は第1のポリヌクレオチドから第2のポリヌクレオチドを誘導し、該第2のポリヌクレオチドから配列エレメントを複製することにより、「アンプリコン」もしくは「増幅産物」と呼ばれる複数コピーのポリヌクレオチド断片を作製するための任意の方法を用いることを意味する。アンプリコンのコピーは別のポリヌクレオチドとして存在してもよいし、又は1つのポリヌクレオチドが数コピーのアンプリコンを含んでもよい。増幅の正確な使用は、当業者にとっては文脈から明らかであろう。
好ましい増幅方法はPCRを用いる(Saikiら、(1988) Science 239: 487-4391を参照のこと)。簡単に述べると、現在一般的に実施される方法は、標的配列にフランキングするDNAに相補的なヌクレオチド配列を有するプライマー対を用いるものである。プライマーを、標的DNA(鋳型)、温度安定なDNAポリメラーゼ及び全4種のデオキシヌクレオチド用のデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTPS)を含む溶液と混合する。次いで、この混合物を、DNAの２つの相補鎖を分離するのに十分な温度に加熱する。次に、この混合物を、プライマーを目的の遺伝子又は配列にフランキングする配列に特異的にアニーリングさせるのに十分な温度まで冷却する。次いで、必要に応じて、反応混合物の温度を、温度安定なDNAポリメラーゼがDNA合成(伸長)を進行させるのに最適なものに再設定する。次いで、各増幅サイクルを構成するように温度管理を繰り返す。すなわち、PCRは複数サイクルのDNA融解、アニーリング及び伸長からなる。20回の複製サイクルにより、標的DNA配列の最大100万倍の増幅が得られる。いくつかの用途においては、単一のプライマー配列は標的の両端で合成開始するように機能するが、これは該プライマーの長さが長すぎない場合にのみ効率的に働く。いくつかの用途においては、数個のプライマー対が、複数PCRとして一般的に知られるプロセスにおいて用いられる。
本発明の方法において用いられるPCR法は、標準的な方法を用いて実施される(例えば、McPhersonら、PCR (Basics: From Background to Bench) (2000) Springer Verlag; Dieffenbach及びDveksler (編) PCR Primer: A Laboratory Manual (1995) Cold Spring Harbor Laboratory Press; Erlich, PCR Technology, Stockton Press, New York, 1989; Innisら、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Harcourt Brace Javanovich, New York, 1990; Barnes, W. M. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A, 91, 2216-2220を参照)。本発明の方法において用いられるプライマー及びオリゴヌクレオチドは、DNA及びその類似体、例えば、ホスホロチオエート；非架橋酸素の両方が硫黄で置換されたホスホロジチオエート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステル及びボラノホスフェートであるのが好ましい。アキラルなリン酸誘導体としては、3'-O'-5'-S-ホスホロチオエート、3'-S-5'-O-ホスホロチオエート、3'-CH2-5'-O-ホスホナート及び3'-NH-5'-O-ホスホロアミダートが含まれる。そのような核酸は、標準的な技術を用いて合成することができる。
増幅サイクル数はin vitroでの転写及び翻訳反応におけるアリコートを分析し、必要に応じて、形質転換にとって十分なポリヌクレオチドを提供するのに十分なポリヌクレオチド産物を生成するものである。典型的には、少なくとも約10サイクル、少なくとも約15サイクル、少なくとも約20サイクル、少なくとも約30サイクル又はそれ以上が用いられる。特定の用途のためのサイクル数は、存在する最初の鋳型の量、宿主への形質転換のための要件、タンパク質スクリーニング及び転写／翻訳の効率などにより決定されるであろう。
増幅産物のアリコートを、in vitroでの転写及び翻訳のための鋳型として、好ましくは高効率な方式、例えば、マイクロタイターウェルのアレイなどにおいて用いる。本明細書で用いるin vitro合成とは、生物抽出物及び／又は規定の試薬を含む反応混合物中でのポリペプチドの無細胞合成を指す。この反応混合物は、少なくともATP、エネルギー源；巨大分子、例えば、DNA、mRNAなどの製造のための鋳型；アミノ酸、並びにコファクター、酵素及び合成に必要である他の試薬、例えば、リボソーム、tRNA、ポリメラーゼ、転写因子などを含む。そのような合成反応系は当業界で周知であり、文献に記載されている。この無細胞合成反応を、当業界で公知のような、バッチ式、連続流動式、又は半連続流動式として、好ましくは高効率なバッチ方式で、実施することができる。
本発明の目的のために、生物学的抽出物はタンパク質合成機構の成分を含む任意の調製物、通常は細胞抽出物であり、そのような成分は所望のタンパク質をコードする核酸を発現し得る。従って、細胞抽出物は所望のタンパク質をコードするメッセンジャーリボ核酸(mRNA)を翻訳することができる成分を含み、場合によっては所望のタンパク質をコードするDNAを転写することができる成分を含む。そのような成分としては、例えば、DNA指向性RNAポリメラーゼ(RNAポリメラーゼ)、所望のタンパク質をコードするDNAの転写開始に必要な任意の転写活性化因子、転移リボ核酸(tRNA)、アミノアシル-tRNAシンテターゼ、70Sリボソーム、N10-ホルミルテトラヒドロ葉酸、ホルミルメチオニン-tRNAfMetシンテターゼ、ペプチジルトランスフェラーゼ、IF-1、IF-2及びIF-3などの開始因子、EF-Tu、EF-Tｓ及びEF-Gなどの伸長因子、RF-1、RF-2及びRF-3などの放出因子などが含まれる。
本発明の好ましい実施形態においては、前記反応混合物は生物学的供給源からの抽出物、例えば、当業界で公知の、大腸菌S30抽出物、小麦胚芽抽出物、網状赤血球抽出物などを含む。便宜上、抽出物の供給源として用いられる生物を、供給源生物と呼ぶ。活性な抽出物を製造するための方法は当業界で公知であり、例えば、Pratt(1984), Coupled transcription-translation in prokaryotic cell-free systems, p. 179-209, in Hames, B.D.及びHiggins, S.J.(編), Transcription and Translation: A Practical Approach, IRL Press, New Yorkに見出すことができる。Kudlickiら、(1992) Anal Biochem 206(2): 389-93は、超遠心によりS30からリボソーム画分を回収することによりS30大腸菌無細胞抽出物を改変している。
前記反応は小規模であるのが好ましく、また複数の同時合成を実施するように複合的であるのが好ましい。連続反応は試薬の流れを導入するための供給機構を使用し、プロセスの一部として最終産物を単離することができる。バッチ系も関心のあるものであり、追加の試薬を導入して活発な合成の期間を延長することができる。
無細胞抽出物、遺伝子鋳型、アミノ酸及びエネルギー源などの上記成分に加えて、タンパク質合成に特異的に必要とされる材料を前記反応に添加することができる。これらの材料としては、塩、ポリマー化合物、サイクリックAMP、タンパク質もしくは核酸分解酵素の阻害剤、タンパク質合成の阻害剤もしくは調節因子、酸化／還元調節剤、非変性性界面活性剤、緩衝成分、スペルミン、スペルミジンなどが含まれる。
前記塩は、好ましくは、酢酸もしくは硫酸のカリウム、マグネシウム、アンモニウム及びマンガン塩を含み、これらのうちのいくつかは対応する陰イオンとしてアミノ酸を有してもよい。前記ポリマー化合物はポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチル、四級アミノエチル及びアミノエチルであってもよい。前記酸化／還元調節剤はジチオトレイトール、アスコルビン酸、グルタチオン及び／又はその酸化物であってもよい。また、Triton X-100などの非変性性界面活性剤を0〜0.5 Mの濃度で用いてもよい。スペルミン及びスペルミジンを、タンパク質の合成能力を改良するために用いることができ、cAMPを遺伝子発現の調節因子として用いることができる。好ましくは、前記反応を、pH 5〜10及び20〜50℃の温度の範囲に、より好ましくは、pH 6〜9、25〜40℃の範囲に維持する。
翻訳反応において産生されるタンパク質の量を、様々な方式で測定することができる。ある方法はアッセイの利用率に基づくものであり、これは翻訳される特定のタンパク質の活性を測定する。対をなすin vitroでの転写及び翻訳反応において産生されるタンパク質の量を測定する別の方法は、35S-メチオニン又は3H-ロイシンなどの、既知の量の放射標識されたアミノ酸を用いて反応を実施し、続いて新たに翻訳されたタンパク質中に取り込まれた放射標識アミノ酸の量を測定することである。取込みアッセイは、末端が切断されたタンパク質産物を含むin vitroでの翻訳反応において産生される全タンパク質中での放射標識アミノ酸の量を測定する。放射標識されたタンパク質をタンパク質ゲル上でさらに分離し、該産物が適切な大きさであり、二次的なタンパク質産物が産生されていないことをオートラジオグラフィーにより確認することができる。
翻訳反応において産生されるポリペプチドを、例えば、pH、イオン性、温度、照射などに対する安定性；特異性、例えば基質特異性、受容体結合特異性、リガンド特異性など；酵素活性、例えば触媒速度、生成物など、を含む目的の性質についてスクリーニングする。特異的スクリーニング方式を、ポリペプチド及びその性質に基づいて設計することができる。
反応を液相で行い、反応生成物を未反応の成分から分離し、例えば、遺伝子産物に特異的な固定化抗体又は溶液中で形成される任意の複合体を固定するための試験化合物、及び固定された複合体を検出するための可能性のある複合体の他の成分に特異的な標識抗体を用いて、生成物を検出することができる。
あるいは、前記ポリペプチドを固相表面上に固定し、例えば、結合複合体、反応生成物などのスクリーニング産物を、該固相又は上清上で検出することができる。実際には、マイクロタイタープレートを固相として都合よく用いることができる。固定された成分を、非共有結合又は共有結合により固定化することができる。非共有結合を、前記固相を前記タンパク質の溶液で単純に被覆し、乾燥させることにより達成することができる。あるいは、前記タンパク質に特異的な固定化抗体を用いて、前記固相表面に該タンパク質を固定することができる。非固定化成分を、前記固定成分を含む被覆された表面に添加する。反応が完了した後、未反応の成分を、形成された任意の産物が前記固相表面上に固定化されたままになるような、又は上清中で検出されるような条件下で、(例えば、洗浄により)除去する。
例えば、リガンドへの結合効率が増加したタンパク質をコードするポリヌクレオチドが望ましい場合、集団又はライブラリー中で該ポリヌクレオチドの発現可能部分の各々から発現されるタンパク質を、当業界で公知の方法(すなわち、パンニング、アフィニティークロマトグラフィー)により該リガンドに結合する能力について試験することができる。薬剤耐性が増加したタンパク質をコードするポリヌクレオチドが望ましい場合、集団又はライブラリー中で該ポリヌクレオチドの各々により発現されるタンパク質を、β-ラクタムの切断などの薬剤耐性を付与する能力について試験することができる。所望のタンパク質の知識を有する当業者であれば、前記集団を試験して、該タンパク質に所望の特性を付与するポリヌクレオチドを容易に同定することができるであろう。
目的の発現可能部分、すなわち所望の特性を有するポリペプチドをコードする部分、を含む最初の鋳型は、介入クローニング工程の不在下に、さらなる複製のために宿主中に直接形質転換される。必要に応じて、最初の鋳型の複製可能部分を増幅した後、形質転換する。
一般的には、ポリペプチド発現及びスクリーニングには最初の鋳型のアリコートを使用し、必要に応じて、残余のサンプルを形質転換又はさらなる遺伝子操作のために保持する。形質転換の方法は当業界で周知である。好ましい宿主細胞としては、大腸菌、B. subtilis、S. cerevisiae、バキュロウイルスベクターと組合せた昆虫細胞、又は脊椎動物、特に、哺乳動物などの高等生物の細胞、例えば、COS7細胞、もしくは293細胞が挙げられる。
突然変異誘発、増幅、スクリーニング及び形質転換のいくつかのサイクルを行うことができる。このようにして、より高い結合親和性、酵素活性、増加した溶解性、安定性などさえも有するタンパク質を得ることができる。
本発明の方法において用いられる試薬は、使用説明書をさらに含んでもよいキット中に含め提供することができる。そのようなキットは、例えば、最初の鋳型を作製するのに用いるためのベクター；突然変異誘発のための試薬；増幅のための試薬；in vitroでの転写及び翻訳のための試薬；並びに形質転換のための宿主細胞を含んでもよい。用語「試薬」は、バッファー；酵素；モノマー、例えば、ヌクレオチド三リン酸、アミノ酸など；ポリヌクレオチド配列、例えば、ポリヌクレオチドプライマー、対照用鋳型、ベクター配列などを含んでもよい。前記キット試薬は、並列的な高効率スクリーニングに好適な容器、例えば、96穴プレートなどと共に提供され得る。
本発明は特定の方法、プロトコル、細胞系、動物の種又は属、構築物、及び記載の試薬に限定されるものではなく、勿論、そのようなものは変更し得るものであると理解されるべきである。また、本明細書で用いられる用語は特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を制限することを意図したものではないことも理解されるべきである。
定義について特に断らない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は本発明が属する分野における通常の知識を有する者に一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。本明細書に記載されるものと類似した又は等価な任意の方法、装置及び材料を、本発明の実施又は試験に用いることができるが、好ましい方法、装置及び材料を説明する。
本明細書に記載の全ての刊行物は、例えば、本発明と関連して用いられる刊行物に記載される細胞系、構築物、及び方法を説明し、開示する目的で、参照により本明細書に組み入れられるものとする。上記で考察される刊行物及びその内容全体は、単に本出願の出願日前にその開示が提供されたものである。本発明者らは先発明に基づくそのような開示に先行する権利を与えられてないという承諾として解釈されべきではない。
以下の実施例は、本発明を作製及び使用するための方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するためのものであり、本発明としてみなされる範囲を限定することを意図されるものではない。用いた数(例えば、量、温度、濃度など)に関して正確性を確保するために努力したが、いくらかの実験的な誤差及び変動は許容されるべきである。特に指摘しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力はほぼ大気圧下のものである。
PCRをベースとする突然変異誘発を用いる、被突然変異誘発緑色蛍光タンパク質の作製
緑色蛍光タンパク質を含むプラスミドを、コード配列中に突然変異をもたらすプライマーを用いて増幅し、図3A及び3Bに示されるように、制限部位の欠損に導いた。
緑色蛍光タンパク質を含むプラスミドを、コード配列中に突然変異をもたらすプライマーを用いて増幅し、図3A及び3Bに示されるように、制限部位の欠損に導いた。
突然変異誘発反応を以下のように実施した：
突然変異誘発反応：
5μl 10ｘ反応バッファー＋
2μl 25 ng/μl pIVEX2.3GFP＋
2μl 125 ng GM81(CTACCTGTTCCTTGGCCAACACTTG) +
2μl 125 ng GM82 (CGTGTTGGCCAAGGAACAGGTAG) +
1μl dNTP溶液+
37μl HOH +
1μl PfuTurbo熱安定性DNAポリメラーゼ
50μl総量
実施したPCRサイクル:
15サイクル:95℃にて30秒
55℃にて30秒
68℃にて12分
熱サイクルの後、反応した物を以下のもので希釈した:
20μl バッファーA (RMB)
130μl HOH
200μl総量。
突然変異誘発反応：
5μl 10ｘ反応バッファー＋
2μl 25 ng/μl pIVEX2.3GFP＋
2μl 125 ng GM81(CTACCTGTTCCTTGGCCAACACTTG) +
2μl 125 ng GM82 (CGTGTTGGCCAAGGAACAGGTAG) +
1μl dNTP溶液+
37μl HOH +
1μl PfuTurbo熱安定性DNAポリメラーゼ
50μl総量
実施したPCRサイクル:
15サイクル:95℃にて30秒
55℃にて30秒
68℃にて12分
熱サイクルの後、反応した物を以下のもので希釈した:
20μl バッファーA (RMB)
130μl HOH
200μl総量。
最初の鋳型に由来するバックグラウンドを低減させるために、反応混合物を、メチル化されたDNAに特異的である制限酵素DpnIと合わせた。細菌宿主中で増殖させる最初の鋳型プラスミドはメチル-A残基を含み、この酵素による消化を受け易い。増幅産物はメチル化されていないので、切断されない。
増幅反応した物を、各々約100μlを含む2つのチューブに分割した。チューブ#1には何も添加しなかった。10ユニット(5μl)のDpnIをチューブ#2に添加した。両方のチューブを37℃にて1時間インキュベートした。
発現可能なPCR産物の作製
DpnIで1時間インキュベートした後、5μl又は2μlの反応混合物を以下のバッファー中に希釈した(突然変異誘発反応の残りを-20℃にて凍結した)：
10μl 10ｘバッファー(拡張高忠実性RMB)
2μl dNTP Mix
2μl GM144 (GCGCGCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGAC)
2μl GM147 (GCGCGCGTATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG)
83μl HOH
1μl 拡張高忠実性酵素(expand high fidelity enzyme)。
DpnIで1時間インキュベートした後、5μl又は2μlの反応混合物を以下のバッファー中に希釈した(突然変異誘発反応の残りを-20℃にて凍結した)：
10μl 10ｘバッファー(拡張高忠実性RMB)
2μl dNTP Mix
2μl GM144 (GCGCGCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGAC)
2μl GM147 (GCGCGCGTATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG)
83μl HOH
1μl 拡張高忠実性酵素(expand high fidelity enzyme)。
対照として、pIVEX2.3GFPを該バッファー中に希釈し、同じサイクル条件にかけた。
各反応100μl総量(全部で5つの反応)：
PCRサイクル:
15サイクル:95℃にて30秒
55℃にて30秒
72℃にて1分。
15サイクル:95℃にて30秒
55℃にて30秒
72℃にて1分。
DNA配列が突然変異誘発反応により変化したことの確認
PCRの後、3つの反応(Dpn処理、Dpn未処理及び対照)の各々5μlを、以下のものの中に希釈した：
12μl HOH
2μl 10ｘバッファー H (RMB)
1μl Nco I
20μl 総量。
PCRの後、3つの反応(Dpn処理、Dpn未処理及び対照)の各々5μlを、以下のものの中に希釈した：
12μl HOH
2μl 10ｘバッファー H (RMB)
1μl Nco I
20μl 総量。
制限酵素消化物を37℃にて1時間インキュベートした。制限酵素処理されたPCR産物をアガロースゲル電気泳動にかけて、突然変異の存在(内因性Nco I部位の欠損)を確認した。親プラスミドに由来する未切断のPCR産物を対照として含有させた。
突然変異誘発反応に由来するゲル電気泳動後の最も主要なバンドはNco Iにより切断されない。対照PCR産物はNco Iにより効率良く切断されるため、このことは突然変異誘発反応及びPCRが主に突然変異DNA断片をもたらしたことを示している。図1aを参照されたい。
PCR産物特異的タンパク質産生の確認
2μlの各々制限酵素処理されていないPCR産物を50μlのRTS100 HY反応に添加した。GFP活性を、走査型分光蛍光測定装置を用いてアッセイした。その結果は全てのサンプル間でほとんど同一の活性があることを示している。この突然変異はコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させないため、これは予想されることである。図3bを参照されたい。
2μlの各々制限酵素処理されていないPCR産物を50μlのRTS100 HY反応に添加した。GFP活性を、走査型分光蛍光測定装置を用いてアッセイした。その結果は全てのサンプル間でほとんど同一の活性があることを示している。この突然変異はコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させないため、これは予想されることである。図3bを参照されたい。
クローニングのために遺伝子操作された制限部位を有する11個のPCR産物を、Nco I及びXma Iで消化し、同様に消化されたpIVEXベクター中に連結した。挿入物(insert)を添加しない場合には陰性対照を用いた。
簡単に述べると、反応を以下のように設定した：
1〜3μlの消化された挿入DNA
1〜3μlの消化されたpIVEX DNA
各反応8μlを作るための3〜5μlの滅菌水QES
2μlの5ｘDNA希釈バッファー
この混合された反応させる物に次のものを添加した：
10μl 2ｘバッファー
その後に1μlのT4 DNAリガーゼ。
1〜3μlの消化された挿入DNA
1〜3μlの消化されたpIVEX DNA
各反応8μlを作るための3〜5μlの滅菌水QES
2μlの5ｘDNA希釈バッファー
この混合された反応させる物に次のものを添加した：
10μl 2ｘバッファー
その後に1μlのT4 DNAリガーゼ。
この反応を室温にて5分間進行させた。
5分間のインキュベーションの後、各連結反応物の2μlを、
10μl 10ｘバッファー(拡張高忠実性RMB)
2μl dNTP mix
2μl GM143 GGGGGCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGAC
2μl GM146 GGGGGGGTATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG
81μl滅菌PCR等級水
1μl 拡張高忠実性酵素(RMB)
を含むPCR反応に添加した。
10μl 10ｘバッファー(拡張高忠実性RMB)
2μl dNTP mix
2μl GM143 GGGGGCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGAC
2μl GM146 GGGGGGGTATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG
81μl滅菌PCR等級水
1μl 拡張高忠実性酵素(RMB)
を含むPCR反応に添加した。
PCRを、95℃にて1分／55℃にて1分／72℃にて1分を用いて30サイクル実施した。5μlの各PCRをアガロースゲル電気泳動にかけた。それを図4Aに示す。さらに、10μlの各PCRを無細胞転写／翻訳反応に添加し、30℃にて一晩インキュベートした。次の日、結果を、抗His抗体を用いるウェスタンブロッティングにより分析した(図4Bに示す)。これらのデータは連結反応の鋳型からPCR産物がin vitroで発現されたことを示している。
組換えクローンニング反応を、ゲートウェイ（Gateway）試薬及びλリコンビナーゼ(Invitrogen)を用いて以下のように設定した：
4μl LR反応バッファー
2μl pENTR-CAT
2μl 線状化pIVEX4.0-DEST
6μl TE。
4μl LR反応バッファー
2μl pENTR-CAT
2μl 線状化pIVEX4.0-DEST
6μl TE。
上記試薬を混合した後、4μlのLR Clonase Enzyme Mixを添加し、反応を開始させた。組換え反応を25℃にて1.5時間進行させた。2μlのプロテイナーゼKを添加した。37℃にて10分間、プロテイナーゼKの存在下でインキュベートすることにより、反応を停止させた。
組換え反応の停止直後、1μlの各組換え反応した物を、
10μl 10ｘバッファー(拡張高忠実性RMB)
2μl dNTP mix
2μl GM143 GGGGGCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGAC
2μl GM146 GGGGGGGTATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG
82μl 滅菌PCR等級水
1μl 拡張高忠実性酵素(RMB)
を含むPCR反応に添加した。
10μl 10ｘバッファー(拡張高忠実性RMB)
2μl dNTP mix
2μl GM143 GGGGGCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGAC
2μl GM146 GGGGGGGTATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG
82μl 滅菌PCR等級水
1μl 拡張高忠実性酵素(RMB)
を含むPCR反応に添加した。
5μlの各PCRを、図4Aに示すようなアガロースゲル電気泳動にかけた。さらに、10μlの各PCRを無細胞転写／翻訳反応に添加し、30℃にて一晩インキュベートした。次の日、結果を、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼについてHPLCに基づく活性アッセイにより分析した。組換えクローニング反応に由来するPCR産物の結果を、環状プラスミド鋳型又は環状プラスミド鋳型自体に由来するPCR産物と比較した。活性における有意差は観察されなかった。
Claims (17)
- 簡素化されたかつ高効率のスクリーニング及び複製のための方法であって、
(a) 第1及び第2の増幅プライマーを用いて、複製可能な最初の鋳型の発現可能部分を増幅すること、
(b) in vitroで該発現可能部分を発現させて、ポリペプチドを作製すること、
(c) 目的の特性について該ポリペプチドをスクリーニングすること、
(d) 介入クローニング工程の不在下で、該複製可能な最初の鋳型を用いて宿主細胞を形質転換すること、
を含む前記方法。 - 複製可能な最初の鋳型が、組換え又は連結反応中に存在する、請求項１に記載の方法。
- 第1及び第2のプライマーが、前記組換え又は連結反応の線状反応物を指数的に増幅しない、請求項２に記載の方法。
- 発現可能部分が、前記複製可能な最初の鋳型の断片を含む、請求項１に記載の方法。
- 発現可能部分が、完全な複製可能な最初の鋳型を含む、請求項１に記載の方法。
- 発現可能部分が、T7プロモーター、T3プロモーター及びSP6プロモーターからなる群より選択されるプロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
- 発現可能部分が、転写終結配列を含む、請求項１に記載の方法。
- 発現可能部分が、病原体の遺伝子配列、酵素をコードする遺伝子配列、抗原をコードする遺伝子配列、又は薬剤耐性に関与する遺伝子配列、を含むオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載の方法。
- 複製可能な最初の鋳型が、植物細胞、動物細胞、菌類細胞、又は細菌細胞において活性な複製起点を含む、請求項１に記載の方法。
- 第1のプライマーが、その末端にGCクランプ領域を含む、請求項１に記載の方法。
- GCクランプが、約5〜約10ヌクレオチドの長さである、請求項９に記載の方法。
- 第1のプライマーが、前記発現可能部分用のプロモーターの部位又はその上流で前記最初の鋳型の領域にハイブリダイズし、かつ第1のプライマーが完全なプロモーター配列を含まない、請求項１に記載の方法。
- 前記発現工程を、精製工程の不在下で前記増幅工程からの反応混合物に対して実施する、請求項１２に記載の方法。
- 前記発現工程の前に、前記増幅工程の生成物と、メチル化されたDNAを特異的に切断する酵素とを反応させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 工程(a)〜(d)を、複製可能な最初の鋳型のライブラリー上で平行して実施する、請求項１に記載の方法。
- 複製可能な最初の鋳型のライブラリーを、目的の配列の突然変異誘発により作製する、請求項１５に記載の方法。
- 発現可能部分の増幅のための試薬、in vitroでの転写及び翻訳のための試薬、並びに形質転換のための宿主細胞を含む、簡素化されたかつ高効率のスクリーニング及び複製のためのキット。
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