JPH10500853A - 大腸菌においてヌクレアーゼ遺伝子を直接クローン化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、制限エンドヌクレアーゼのようなヌクレアーゼ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中で直接クローニングする新規な方法を開示する。さらに、該方法の適用を容易にする新規な株も提供する。本発明方法は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むエンドヌクレアーゼをコードする多くの遺伝子のクローン化に用いられて成功をおさめている。

Description

【発明の詳細な説明】 大腸菌においてヌクレアーゼ遺伝子を 直接クローン化する方法 発明の背景 ヌタレアーゼは一本鎖または二本鎖ＤＮＡを分解もしくは切断する酵素である 。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子中の特定のヌクレオチド配列（「認識 配列」）を認識し、これに結合する一群の重要なヌクレアーゼである。上記のよ うに結合した制限エンドヌクレアーゼは、認識配列の内部またはその一端におい てＤＮＡ分子の両鎖を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配 列を認識する。今までに試験された何百もの細菌種の中から１８０を越える種類 の、独自の特異性を有する制限エンドヌクレアーゼが同定されている。 自然界では制限エンドヌクレアーゼは、細菌細胞を無事であるように保護する 役割を果たすと考えられる。制限エンドヌクレアーゼによって細菌は、前記酵素 が存在しなければ細菌を破壊するかまたは細菌に寄生するであろうウイルス及び プラスミドのような外来ＤＮＡ分子への感染に耐性であり得る。この耐性は、適 当な認識配列が存在する場 合に制限エンドヌクレアーゼが侵入した外来ＤＮＡ分子を切断することによって もたらされる。前記切断によって感染遺伝子の多くは無力化され、ＤＮＡは非特 異的エンドヌクレアーゼによって更に分解される。 上記のような細菌保護系の第二の構成要素に修飾メチラーゼが有る。この酵素 は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、細菌が細菌自体のＤＮＡを切断から 保護し、かつ外来の感染ＤＮＡと区別することを可能にする手段を提供する。修 飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識ヌクレオチド配列 を認識してこれに結合するが、ＤＮＡを切断する替わりに配列内のいずれかのヌ クレオチドをメチル基の付加によって化学的に修飾する。メチル化された認識配 列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって結合も切断もされない。細菌細胞の ＤＮＡは修飾メチラーゼの活性により、常に完全に修飾されている。従って、細 菌細胞のＤＮＡは内在制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に非感受性で ある。制限エンドヌクレアーゼによる認識及び切断に感受性であるのは、修飾さ れない、従って確実に外来性であるＤＮＡのみである。 遺伝子操作技術の出現に伴い、遺伝子をクローン化し、 当該遺伝子がコードするタンパク質及び酵素を通常の精製技術によって得られる よりも大量に生産することが可能となった。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のク ローンを単離する鍵は、このクローンが１０^-3〜１０^-4といった低い頻度で発生 する場合に複雑な「ライブラリー」、即ち「ショットガン」操作によって得られ るクローン集団内で該クローンを同定する簡単でかつ確実な方法を開発すること である。 タイプII制限−修飾系はますます頻繁にクローン化されるようになっている。 最初にクローン化された系には、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または 選択する手段としてバクテリオファージ感染が用いられた（ＥｃｏＲII： Ｋｏ ｓｙｋｈ等， Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １７８， ｐｐ．７１ ７−７１９， １９８０； ＨｈａII： Ｍａｎｎ等， Ｇｅｎｅ ３， ｐｐ ．９７−１１２， １９７８； ＰｓｔＩ： Ｗａｌｄｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８， ｐｐ．１５０３−１５０７ ， １９８１）。細菌は制限−修飾系を有することによってバクテリオファージ による感染に耐性となり得るので、クローン化 された制限−修飾遺伝子を持つ細胞は原則として、ファージに曝露したライブラ リーから生存細胞として選択的に単離し得る。しかし、この方法の価値は限られ ていることが判明した。特に、クローン化された制限−修飾遺伝子は選択的生存 を実現するのに十分なファージ耐性を常に示すわけではないことが明らかとなっ た。 別のクローニング法では、最初にプラスミド保持型（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒ ｎｅ）であると特徴付けられた系を大腸菌クローニングプラスミドに挿入する（ ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｌｄ．Ｒｅｓ． １２， ｐｐ．３６５９−３６７６， １９８４； ＰａｅＲ７： Ｇｉｎｇｅ ｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ ＳＡ８０， ｐｐ．４０２−４０６， １９８３； Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ及びＲ ｏｙ， Ｇｅｎｅ １９， ｐｐ．３５５−３５９， １９８２； ＰｖｕII： Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ等， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６４， ｐｐ． ５０１−５０９， １９８５）。 次第に多数の系のクローニングに用いられてきている第三の方法では、活性な メチラーゼ遺伝子を選択することに よってクローニングを行なう。例えば米国特許第５，２００，３３３号、及びＢ ｓｕＲＩに関してはＫｉｓｓ等，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． １３， ｐｐ．６４０３−６４２１， １９８５を参照されたい。制限遺伝子と修飾遺伝 子とはしばしば近接して連結されているので、両遺伝子を同時にクローン化する ことがしばしば可能である。しかし、このような選択は常に完全な制限系をもた らすとは限らず、メチラーゼ遺伝子のみをもたらす場合も有る（ＢｓｐＲＩ： Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ等， Ｇｅｎｅ１０， ｐｐ．２１９−２２５， １９８ ０； ＢｃｎＩ： Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ等， Ｇｅｎｅ ２０， ｐｐ．１９ ７−２０４， １９８２， ＢｓｕＲＩ： Ｋｉｓｓ及びＢａｌｄａｕｆ， Ｇ ｅｎｅ ２１， ｐｐ．１１１−１１９， １９８３； 並びにＭｓｐＩ： Ｗ ａｌｄｅｒ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８，ｐｐ．１２３５−１ ２４１， １９８３）。 第四のクローニング法（「メチラーゼインジケーター」法）では、メチル化依 存制限系ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣ及びＭｒｒ（Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３， ｐ ｐ．９０７０−９０７４， １９８６； Ｈｅｉｔｍａｎ及びＭｏｄｅｌ， Ｇ ｅｎｅ １０３， ｐｐ．１−９，１９９１； Ｋｅｌｌｅｈｒ及びＲａｌｅｉ ｇｈ， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７３， ｐｐ．５２２０−５２２３， １９９１）並びにｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺオペロン融合体を用いて、メチラーゼ 遺伝子を含むクローンをスクリーニングする。ｄｉｎＤ１遺伝子座は、大腸菌に おいて紫外線処理、マイトマイシン処理、またはメチル化ＤＮＡへのＭｃｒＡ、 ＭｃｒＢＣもしくはＭｒｒ制限エンドヌクレアーゼの作用などにより「ＳＯＳ応 答」が誘起されると発現するＤＮＡ損傷誘導性遺伝子である（その開示が本明細 書に参考として含まれるＫｅｎｙｏｎ及びＷａｌｋｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７， ｐｐ．２８１９−２８２３， １ ９８０； Ｈｅｉｔｍａｎ及びＭｏｄｅｌ，上掲誌，１９９１； Ｈｅｉｔｍａ ｎ及びＭｏｄｅｌ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９， ｐｐ．３２３４ −３２５０，１９８９； 並びにＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚ等， Ｊ．Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ． １７３， ｐｐ．１５０−１５５，１９９１）。ｍｃｒＡ、ｍｃｒ ＢＣ及びｍｒｒの温度感受 性突然変異体、並びにｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺ融合体を有する株を構築し、これ を大腸菌以外の細菌供給源から得たメチラーゼ遺伝子の大腸菌中への直接クロー ニングに用いることが行なわれた（その開示が本明細書に参考として含まれるＰ ｉｅｋａｒｏｗｉｃｚ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． １９， ｐｐ ．１８３１−１８３５，１９９１）。連結したゲノム−ベクターＤＮＡで上記の ような株を形質転換すると、上記メチル化依存制限系のうちのいずれかに対する 感受性をもたらすメチラーゼを発現する遺伝子を有する形質転換体が、ＳＯＳ ＤＮＡ修復誘導及びβ−ガラクトシダーゼ発現を惹起するメチル化依存制限の結 果としてＸｇａｌインジケータープレート上に４２℃において白色のコロニー、 ３０℃において青色のコロニーを形成する。ほとんどの制限酵素遺伝子と同種（ ｃｏｇｎａｔｅ）メチラーゼ遺伝子とが近接して連結されているので、適当な大 きさのＤＮＡ断片中のメチラーゼ遺伝子をクローン化すれば同種エンドヌクレア ーゼ遺伝子を共にクローン化することになり得る。 標準的な方法が実用的でないか、または好ましい成果をもたらさない場合には 代替方法として、制限エンドヌクレ アーゼなどのヌクレアーゼを直接クローン化する方法を設計することが望ましい 。発明の概要 本発明は、大腸菌において制限エンドヌクレアーゼ遺伝子などのヌクレアーゼ 遺伝子を直接クローン化する新規な方法を提供する。本発明はまた、上記方法の 適用を容易にする新規な株も提供する。本発明の方法は、ＢｓｏＢＩ、Ｔｔｈ１ １１Ｉ、ＴａｑＩ及びＥｃｏ０１９１などの制限エンドヌクレアーゼを含めたヌ クレアーゼをコードする幾つかの遺伝子のクローニングに首尾よく適用できた。 従って本発明は、上記のようなヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ、並びにそ れらのヌクレアーゼの発現に用いるベクター及び形質転換宿主細胞も提供する。 本発明は特に、（ｉ）制限系を総て欠く（ＥｃｏＫＲ^-、ＭｃｒＡ^-、ＭｃｒＢ Ｃ^-、Ｍｒｒ^-）、ｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺ融合体を有する新規な大腸菌株、（ｉ ｉ）ｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺ融合体などの、ＤＮＡ損傷誘導プロモーターとイン ジケーター／レポーター遺伝子との融合体を含む株を用いる、大腸菌においてヌ クレアーゼ遺伝子を直接クローン化する方法、並びに（ｉｉｉ）本発明の方法で ク ローン化した、或る種のヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡに係わる。大脳菌 においてＴ７．３エンドヌクレアーゼ、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ制限酵素に よって導入されたＤＮＡの切れ目（ｂｒｅａｋｓ）もしくはニックがＳＯＳ応答 を誘起することが判明しているので（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ及びＦｏｎｔａｉ ｎｅ， Ｊ． Ｂｊｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６０， ｐｐ．３１７３−３１７７， １９８５； Ｈｅｉｔｍａｎ及びＭｏｄｅｌ，上掲誌，１９９１； Ｘｕ及び Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， ｐｐ． ４４２５−４４２９， １９９１）、本発明者は、先に述べた制限系を総て欠く ｄｊｎＤ１：：ｌａｃＺなどのインジケーター株に連結ゲノムＤＮＡ断片及びベ クターを導入し、形質転換体をＸｇａｌプレート上で平板培養すれば、ヌクレア ーゼ保有クローンを青色コロニーの選出（ｐｉｃｋｉｎｇ）によって直接発見で きるのではないかと推論した。制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子のク ローニングに本発明を用いる場合、メチラーゼ選択法の時とは異なり、メチラー ゼ遺伝子が宿主染色体を完全に保護する必要は無い。実際のところ、メチラーゼ 遺伝子が全く存在しなくともよいこ とも有る。このことは特に、形質転換体を本発明により比較的低温、即ち約３０ 〜３７℃で増殖させる場合の熱安定酵素の場合に該当する。上記のような低温で は熱安定性の制限エンドヌクレアーゼはさほど活性でなく、形質転換宿主細胞は 保護的メチル化を一部にしか、更には全く受けていなくとも生存し得る。 即ち、本発明の方法によれば、好ましい大腸菌細胞（ｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺ 、ＥｃｏＫＲ^-、ＭｃｒＡ^-、ＭｃｒＢＣ^-、Ｍｒｒ^-）などの宿主細胞を連結ゲノ ム−ベクターＤＮＡで形質転換し、形質転換体をＸｇａｌプレート上で平板培養 すると、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有する細胞は青色のコロニーを形成し 、なぜなら制限酵素はｉｎ ｖｉｖｏでＤＮＡを損傷し、ＳＯＳ ＤＮＡ修復応 答を誘起するからである。この方法（「エンドヌクレアーゼインジケーター法」 ）はＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚ等，上掲誌，１９９１に記載された「メチラーゼイ ンジケーター法」と、後者の従来方法がエンドヌクレアーゼではなくメチラーゼ の発現を検出する点において相違する。上記従来方法は、特異的なメチル化配列 に作用する内在制限酵素（ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣまたはＭｒｒ）のＤＮＡ損傷作 用 に依拠していた。適当な外来メチラーゼの発現によって、上記メチル化特異的エ ンドヌクレアーゼのうちの一つ以上に感受性である配列が創出され得、その結果 ＳＯＳ応答の誘起と青色の発色とが生起する。メチラーゼ遺伝子は同種エンドヌ クレアーゼをコードする遺伝子を伴っても伴わなくてもよい。本発明のエンドヌ クレアーゼインジケーター法はエンドヌクレアーゼのみを検出してメチラーゼは 検出せず、なぜなら関連するメチル化依存制限系が宿主細胞に存在しないからで ある。本発明の方法によって熱安定制限酵素ＴａｑＩ（５′ＴＣＧＡ３′； 配 列番号１）及びＴｔｈ１１１Ｉ（５′ＧＡＣＮＮＮＧＴＣ３′； 配列番号２） をコードする遺伝子を、大腸菌において首尾よくクローン化した。メチラーゼ選 択法（Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ等，上掲誌，１９８０）と「エンドヌクレアーゼイ ンジケーター法」とを組み合わせて制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローン化 することも可能である。これら２方法の組み合わせによって、制限エンドヌクレ アーゼコーディング遺伝子ｅｃｏＯ１０９ＩＲをクローン化した。図面の簡単な説明 図１はＴｔｈ１１１Ｉをコードする遺伝子であるｔｔｈ １１１ＩＲ遺伝子の大腸菌におけるクローニングの説明図である。 図２は大腸菌によって産生されたクローン化ＴａｑＩ及びＴｔｈ１１１Ｉ制限 酵素のＤＮＡ切断パターンを示す。 図３はＢｓｏＢＩ活性アッセイの結果を示す。５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び１ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液中 で１μｇのλＤＮＡ基質を１０μｌの細胞抽出物と共に６５℃で１時間インキュ ベートした。ＤＮＡ消化産物を０．８％アガロースゲル中で分離させ（ｒｅｓｏ ｌｖｅｄ）、エチジウムブロミド染色によって検出した。単離物＃１６から得ら れた細胞抽出物はＢｓｏＢＩヌクレアーゼ活性を有することが判明した。最初の レーンはＢｓｏＢＩ陽性対照である。各レーン上の数字は単離物番号を示す。 図４−１〜図４−４はＢｓｏＢＩ制限及びメチラーゼ遺伝子の配列である（配 列番号３、４、５及び６）。 図５はＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ挿入部分の制限 マップである。挿入部分の大きさは約８．０ｋｂである。挿入部分はＳａｕ３Ａ Ｉで部分消化したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ ｌｕｓゲノムＤＮＡから得、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位へクローン化した。発明の詳細な説明 本発明はその一形態によって、ヌクレアーゼ遺伝子を直接クローン化する新規 な方法を提供する。本発明の方法は通常次のステップを含むが、当業者には理解 されるように、これらのステップの変形も結果に悪影響を及ぼさずに可能である 。 １） ヌクレアーゼ産生株からゲノムＤＮＡを調製し、これを完全に、または部 分的に切断して約５００〜２０，０００ｂｐのクローン化可能なＤＮＡ断片を生 じさせる。このような断片は、例えば制限酵素を用いたり、音波処理で切り取っ たりして取得し得る。得られた断片はその後、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡ ＣＹＣ１８７、ｐＳＣ１０１、またはこれらの誘導体中の相容性の付着端または 平滑末端を持つクローニングベクターに連結する。 ２） 連結ＤＮＡ混合物を、好ましくはｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ融合体などの、イ ンジケーター／レポーターと融合したＤＮＡ損傷性プロモーターを有し、かつメ チル化依存制限系を欠く細菌株（ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ、ｈｓｄＲ、ｍ ｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）に移入する。好ましい株の一つに大腸菌ＥＲ１９ ９２（ＮＥＢ ＃９０７）が有り、この株の標本はブダペスト条約の約定に基づ き１９９４年５月２４日付でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｒｕｅ Ｃ ｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、ＡＴＣＣ受託番号第５５５８２号の下に寄託してある。 用い得る他のＤＮＡ損傷誘導プロモーターにはｄｉｎＡ（Ｍ． Ｉｗａｓａｋｉ 等，Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２， ｐｐ．６２６８−６２７３， １ ９９０）及びｄｉｎＧ（Ｌ． Ｋ． Ｌｅｗｉｓ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ． １７４， ｐｐ．５１１０−５１１６， １９９２）が含まれ、前記文献の 開示は本明細書に参考として含まれる。上記プロモーターのうちのいずれかと融 合し得る他のインジケーター／レポーター遺伝子には、アルカリホスファターゼ （ｐｈｏＡ； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２， ｐｐ．５１０７−５１１１， １９８５）、ルシフェラーゼ（ｌｕｘ； Ｊ． Ｅｎｇｅｌｒｅｃｈｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７， ｐｐ．１３４５−１３ ４７， １９８５）、β−グルクロニダーゼ（Ｗ．Ｗ． Ｍｅｔｃａｌｆｅ， Ｇｅｎｅ １２９， ｐｐ． １７−２５， １９９３）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｊ． Ｍ． Ｗａｒｄ等， Ｍｏｌ．Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０３， ｐｐ．４ ６８−４７８， １９８６）及びエンドグルカナーゼ（Ｗ． Ｗ．Ｂｉｎｇｌｅ 等， Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９， ｐｐ．７０−８０， １ ９９３）が含まれ、前記文献の開示は本明細書に参考として含まれる。 大腸菌ＥＲ１９９２の形質転換後、細胞を、Ｘｇａｌ及び適当な抗生物質を含 有するインジケータープレート上で平板培養し、約３０〜４２℃で一晩インキュ ベートする。クローン化するべき特定の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子またはヌ クレアーゼ遺伝子次第では、宿主のメチル化依存制限系の全部または一部を不活 性化しなくともよい場合が有る。上記制限系が常に欠けている必要は無いが、修 飾塩基（異常なＣ⁵シトシン、Ｎ⁴シトシンまたはＮ⁶アデニン）が未知である場 合の制限−修飾系のクローニングには総てのメチル化依存系を欠くｄｉｎＤ：： ｌａｃＺ株を用いることが好ましい。 ３） 個々の中青色（ｍｅｄｉｕｍ ｂｌｕｅ）／暗青色コロニーを選出し、適 当な抗生物質を加えたＬＢ培地（１ ０〜１０００ｍｌ）に接種して約３０〜４２℃で一晩振盪する。 ４） 細胞を遠心によって回収し、溶菌酵素を加えた音波処理緩衝液中に再懸濁 させ、細胞溶解を音波処理によって完了させる。細胞破片及び不溶性構成要素を 遠心によって除去する。 ５） クローン化するべきヌクレアーゼ遺伝子が熱安定性の細菌に由来する場合 は溶解物を約６５℃で、大腸菌天然タンパク質の変性に十分な時間（例えば３０ 分間）加熱する。このステップによって、天然の大腸菌ヌクレアーゼを効率的に 不活性化する。 ６） 上清（細胞抽出物）を適当な緩衝液中で３７〜６８℃において、ｐＵＣ１ ９、ｐＢＲ３２２、Ｍ１３ｍｐ１８／１９複製形態もしくは一本鎖ＤＮＡまたは λＤＮＡといった適当なＤＮＡ基質に対するヌクレアーゼ活性に関してアッセイ する。 ７） ＤＮＡ消化パターンもしくは断片をアガロースゲル電気泳動またはＰＡＧ Ｅによって分離させ、エチジウムブロミド染色によって検出する。 上述の方法は、ｔａｑＩＲ遺伝子、ｔｔｈ１１１ＩＲ遺 伝子、及びＴｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ由来のＤＮＡヌクレアーゼを コードする遺伝子を含めた幾つかのヌクレアーゼ遺伝子のクローニングに首尾よ く用いることができた。先に指摘したように、本発明の方法は特に、Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＥＢ ＃８８２）由来のＢ ｓｏＢＩなどの熱安定ヌクレアーゼを含めた上記以外のヌクレアーゼのクローニ ングに有用である。ＢｓｏＢＩは、ＣＰｙＣＧＰｕＧ（配列番号７）を認識する ＡｖａＩのアイソシゾマーである。 本発明は別の形態によって、上述のエンドヌクレアーゼインジケーター法で用 い得る新規な株を提供する。この株、即ち大腸菌ＥＲ１９９２はｄｉｎＤ：：ｌ ａｃＺ融合体を有し、かつ総ての制限系を欠いている（ＥｃｏＫＲ^-、ＭｃｒＡ^- 、ＭｃｒＢＣ^-及びＭｒｒ^-）。 大腸菌ＥＲ１９９２［Ｆ^- λ^- Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）Ｕ１６９ ｓｕｐＥ ４４ ｅ１４^- ｄｉｎＤ１：：Ｍｕ ｄｌ１７３４（Ｋａｎ^R，ＬａｃＺ⁺） ｒｆｂＤ１？ ｒｅｌＡ１？ ｅｎｄＡ１ ｓｐｏＴ１？ ｔｈｉ−１ Δ（ｍ ｃｒ−Ｃ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０］は、（ｉ）ＮＫ６９９３由来のΔ（ａ ｒｇＦ−ｌａｃ）Ｕ１６ ９に連結したｐｒｏＣ：：Ｔｎ５での形質導入、Ｋａｎ^Rの選択、及びＬａｃ^-Ｐ ｒｏ^-のスクリーニングによりＥＲ１９８４を得ることによってＥＲ１８２１の Ｌａｃ^-誘導体を取得し、（ｉｉ）前記誘導体をＥＲ１５７８からの形質導入に よりＰｒｏ⁺Ｋａｎ^SとしてＥＲ１９９１を得、（ｉｉｉ）ＪＨ１４０［ｄｉｎＤ １：：μｄｌ１７３４（Ｋａｎ^R，ＬａｃＺ⁺）である大腸菌株； Ｊ． Ｈｅｉ ｔｍａｎ等，上掲誌，１９９１）からの形質導入、ＫａｎＲの選択、及びｄｉｎ Ｄ融合体によって媒介されるβ−ガラクトシダーゼのナリジキシン酸誘導性発現 のスクリーニングによってｄｊｎＤ１：：μｄｌ１７３４（Ｋａｎ^R，ＬａｃＺ⁺ ）を導入する３ステップで構築した。この大腸菌株を、上記ＤＮＡ損傷物質を収 容したウェルを中央に設けたＸｇａｌプレート上で試験した。精製した形質導入 体を、ウェルから放射状に画線培養した。暗青色にグラデーションの有る培養を 大腸菌ＥＲ１９９２と名付けた。この株は一切のＤＮＡ損傷を受けず、Ｘｇａｌ 上で淡青色を示した。 以下の実施例を、現段階で好ましく実施される本発明の具体例を説明するため に示す。これらの実施例は説明用で あり、本発明は添付の請求の範囲に記されている事以外では前記実施例に限定さ れないと考えるべきであることは理解されよう。 実施例１ ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする ｂｓｏＢＩＲ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ中でのクローニング 細菌ＤＮＡの精製：５ｇのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ ｉｌｕｓ（ＮＥＢ＃８８２）細胞を、２５％スクロース、５０ｍＭ トリス−Ｈ Ｃｌ，ｐＨ８．０を含む緩衝液２５ｍｌに再懸濁した。該細胞懸濁液に、５ｍｌ の０．５ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び６ｍｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を 加えた。室温で１０分間インキュベートした後、３６ｍｌの溶菌緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６２ｍＭ ＥＤＴＡ）及び５ｍｌの１０％ ＳＤＳを加えて、細胞を完全に溶解した。フ ェノール−ＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃で２回抽出してタンパク質を取り出した 。１／１０容量の３．５Ｍ 酢酸ナトリウム及び等量のイソプロパノールを添加 し、１５，０００ｒｐｍ／分で遠心して、ゲノムＤＮＡを沈降させた。ＤＮＡペ レットを５０ｍ ｌの７０％エタノールで洗浄し、真空下に乾燥した。ＤＮＡペレットを１０ｍｌ のＴＥ緩衝液に再懸濁し、２リットルのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ 、ｐＨ７．８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中４℃で一晩透析した。 ゲノムＤＮＡの部分消化：５０μｇのゲノムＤＮＡを、それぞれ、２単位、１ 単位、０．５単位、０．２５単位、０．１２５単位のＳａｕ３ＡＩで３０分間３ ７℃で消化した。消化ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃で２回 抽出し、エタノールで沈降させて精製した。ベクターｐＵＣ１９ ＤＮＡをＢａ ｍＨＩ制限酵素により直鎖状にし、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で 脱リン酸化した。ＣＩＰ処理した後、ベクターＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ₃ で２回、ＣＨＣｌ₃で２回抽出し、エタノールで沈降させて精製した。 連結及び形質転換：Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した１０μｇのゲノムＤＮＡを、 ＢａｍＨＩ切断及びＣＩＰ処理したｐＵＣ１９ ＤＮＡ１μｇと一晩１６℃で連 結させた。等量のＴＥ緩衝液を加えて連結ＤＮＡを希釈し、ＥＲ１９９２（ｄｉ ｎＤ１::ｌａｃＺ⁺、ｈｓｄＲ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）コンピテント 細胞の形質転換に用いた。 形質転換細胞をアンピシリン（Ａｐ）＋Ｘｇａｌプレート（５−ブロモ−４−ク ロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｘｇａｌ、０．０１６％ｗ／ ｖ）上で平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした。１０，０００個の形質 転換細胞中に２４のブルーコロニーが見出された。各ブルーコロニーを１０ｍｌ のＬＢｆＡｐに接種し、振盪機中３７℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心 して収穫し、１ｍｌの音波処理緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８ 、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）に再懸 濁した。３０秒間の音波処理を２回行って細胞の溶菌を完了した。不溶成分を遠 心して除去し、上清を捕集して、以下のようなエンドヌクレアーゼ活性アッセイ に用いた：１μｇのλＤＮＡ基質を、１０μｌの細胞抽出物と共に、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ を含む緩衝液中６５℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡフラグメントを０． ８％アガロースゲル中で分離し、臭化エチジウム染色により検出した。１つの分 離物からの細胞抽出物は、ＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼ活性を含むことが判明 した（図３、分離物＃１６参照）。この株から プラスミドＤＮＡを抽出し、ＢｓｏＢＩ制限インドヌクレアーゼで消化して耐性 を調べた。該プラスミドＤＮＡはＢｓｏＢＩで切断されたが、これは、ＢｓｏＢ Ｉメチラーゼ遺伝子が挿入物中に存在しないか、又は該メチラーゼ遺伝子が全く 発現されないことを示している。ＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（Ｂｓｏ ＢＩＲ）を有するプラスミドをｐＢｓｏＲ１と命名した。ＢｓｏＢＩクローンの 安定性を測定するために、ＥＲ１９９２［ｐＢｓｏＲ１］細胞を３７℃で増殖さ せ、プラスミドＤＮＡを細胞から分離し、ＥＲ１９９２コンピテント細胞への再 形質転換に用いた。再形質転換実験では、さらなる突然変異を最小限にするべく 、形質転換細胞を３０℃で平板培養した。形質転換細胞の６７％がブルーコロニ ーを形成する（５２８個の形質転換細胞中３５６のブルーコロニー）のに対し、 他の３３％はホワイトコロニーを形成する（５２８個の形質転換細胞中１７２の ホワイトコロニー）ことが知見された。プラスミドＤＮＡをホワイトコロニーか ら分離し、制限消化により分析すると、該ＤＮＡが広範囲の欠失を示すことが見 出された。ＥＲ１９９２［ｐＢｓｏＲ１］細胞は３７℃ではあまり安定ではない という結論を得た。ｐＢｓｏＲ１を有 するブルーコロニーを３７℃の代わりに３０℃で一晩インキュベートすると、Ｅ Ｒ１９９２［ｐＢｓｏＲ１］細胞はより安定になる。３０℃培養物から分離した プラスミドＤＮＡを用いて再形質転換すると、形質転換細胞の９９．６％が３０ ℃でブルーコロニーを形成する（４８０のブルーコロニー、２つのホワイトコロ ニー）。ｐＢｓｏＲ１（ＮＥＢ＃９５１）の試料は、ブダペスト条約の条項に基 づき、１９９４年１２月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号７５９６６の元に受託さ れた。 ＡｖａＩ制限−修飾系をコードする遺伝子は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ ｏｌａｂｓでクローン化された。ＡｖａＩ及びＢｓｏＢＩは同一の認識配列５′ ＣＰｙＣＧＰｕＧ３′（配列番号７）を共有している。ＡｖａＩメチラーゼ遺伝 子（ａｖａＩＭ）を有する１．８ｋｂのｐｓｔＩフラグメントをｐＡｖａＩＲＭ １２から消化し、ｐＲ９７６ベクター（ｐＡＣＹＣ１８４誘導体、Ｔｃ^R）にク ローン化した。プラスミドｐＲ９７６−ＡｖａＩＭ⁺をＥＲ１９９２（ｄｉｎＤ: :ｌａｃＺ）細胞に形質転換して、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体を予備修飾した。次いで 、ＢｓｏＢＩ エンドヌクレアーゼ遺伝子を有する第２のプラスミド、ｐＢｓｏＲ１をｐＲ９７ ６−ＡｖａＩＭ⁺を含む細胞に導入し、Ｘｇａｌインジケータープレート上で平 板培養した。該形質転換細胞はまだブルーコロニーを形成することが知見された が、これは、ＡｖａＩメチラーゼがＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼ損傷に対して Ｅ．ｃｏｌｉ染色体を保護しないことを示唆している。 プラスミドミニ調製手順：１．５ｍｌの一晩培養物を１４，０００ｒｐｍ／分 で３分間ペレット化した。上清を流し出し、細胞ペレットを２００ｍｌのＳＴＥ Ｔ緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０． ５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、８％スクロース）に再懸濁した。該細胞懸濁液 に５０μｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。溶解した細胞を沸騰水中 で１分間沸騰させ、沈降物を１４，０００ｒｐｍ／分で１０分間スピンした。２ ００μｌの上清を捕集し、１００μｌの７．５Ｍ ＮＨ₃Ａｃ及び６００ｍｌの ９５％エタノールと混合した。室温で１０分間１４，０００ｒｐｍ／分で遠心し てＤＮＡを沈降させた。ＤＮＡペレットを１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、 真空下に１５分間乾燥した。乾燥し たペレットを１００μｌのＴＥ緩衝液＋５μｌのＲＮアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍｌ ）に再懸濁した。 挿入物の制限マッピング：プラスミドＤＮＡｐＢｓｏＲ１を種々の制限酵素で 消化し、消化ＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。制限マップ を図５に示した。 ｂｓｏＢＩＲ遺伝子を、欠失マッピングにより８ｋｂのゲノムＤＮＡ挿入物中 の１．４ｋｂのＥｃｏＮＩ／ＸｂａＩフラグメント内にマッピングした。全ｂｓ ｏＢＩＲ遺伝子を、サブクローン及び欠失クローン（ＳｓｐＩフラグメントサブ クローン、ＡｖｒII／ＸｂａＩサブクローン、ＮｌａIIIフラグメントサブクロ ーン、Ｓａｕ３ＡＩフラグメントサブクローン、ＥｃｏＮＩ／ＡｖｒIIサブクロ ーン、ＡｖｒII／ＸｈｏＩ）並びに「プライマーウォーキング」から配列決定し た。精製ＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼのＮ末端タンパク質配列は開始コドンの 後の予測タンパク質配列〔（Ｍ）ＮＴＱＫＰＦＥＮＨＬＫＳＶＤＤＬ（配列番号 ６の１−１７アミノ酸に対応する）〕とマッチするので、ｂｓｏＢＩＲ遺伝子の 開始コドンをＴＴＧコドンと定めた。ｂｓｏＢＩＲ遺伝子の両側のＤＮＡも配列 決定して、８． ０ｋｂのＤＮＡフラグメントにクローン化されているシトシンメチラーゼ遺伝子 の一部が存在するかどうかを測定した。ｂｓｏＢＩＭ遺伝子又は該遺伝子の一部 は、保存されたメチラーゼモチーフに基づいて同定し得る。ｂｓｏＢＩＲ遺伝子 の後のＤＮＡ領域を配列決定し、６つのフレーム全てについて翻訳すると、保存 されたＮ４シトシンメチラーゼモチーフが１個見つかった。この配列は、ＤＰＦ ＬＧＳＧＴＴ（配列番号５の１０６−１１４アミノ酸に対応する）である。ｂｓ ｏＢＩＭ遺伝子の７２７ｐｂのみが元の８．０ｋｂ挿入物上に存在していた。従 って、逆ＰＣＲを用いてメチラーゼ遺伝子の残りの部分をクローン化した。Ｈａ ｅII及びＮｌａIII切断／自己連結したゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ産物のクローニ ング及び配列決定により、別の保存メチラーゼモチーフＴＳＰＰＹ（配列番号５ の３１９−３２３アミノ酸に対応する）が見出された、メチラーゼ遺伝子の別の ９０２ｂｐを得た。全メチラーゼ遺伝子（１６２９ｂｐ）をゲノムＤＮＡからｌ ａｃ^Rにより増幅し、ｐＳＸ３３ｌａｃＩ^qにクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ １コンピテント細胞に形質転換して、宿主を予備修飾した。ｂｓｏＢＩＲ遺伝子 を含むＢｂｓＩ／ＸｂａＩフラグメン トを発現ベクターｐＲＲＳにクローン化して過産生構築物Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１ （ｐＳＸ３３ｌａｃＩ^q−ＢｓｏＢＩＭ⁺、ｐＲＲＳ−ＢｓｏＢＩＲ⁺）を得た。 ｂｓｏＢＩＭ及びｂｓｏＢＩＲ遺伝子の配列をそれぞれ図４−１〜図４−４に示 す。 実施例２ Ｔａｑ／Ｒ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ中でのクローニング 細菌ＤＮＡの精製を以下のように行った：５ｇのＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔ ｉｃｕｓ ＹＴ−１（ＡＴＣＣ ２５１０４）細胞を、２５％スクロース、５０ ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む２５ｍｌの緩衝液中に懸濁した。該細 胞懸濁液に、５ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び６ｍｌのリゾチーム （１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。室温で１０分間インキュベートした後、３６ｍｌ の溶菌緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、 ｐＨ８．０、６２ｍＭ ＥＤＴＡ）及び５ｍｌの１０％ＳＤＳを加えて細胞を完 全に溶解した。フェノール−ＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃で２回抽出してタンパ ク質を取り出し、１／１０容量の３．５Ｍ酢酸ナトリウム及び等量のイソプロパ ノールを加え、１５，０００ｒｐ ｍ／分で遠心してゲノムＤＮＡを沈降させた。ＤＮＡペレットを５０ｍｌの７０ ％エタノールで洗浄し、真空下に乾燥した。ＤＮＡを１０ｍｌのＴＥ緩衝液に再 懸濁し、２リットルのＴＥ緩衝液中４℃で一晩透析した。５０μｇのゲノムＤＮ Ａを、１単位、０．５単位、０．２５単位、０．１２５単位のＳａｕ３ＡＩで３ ０分間３７℃で消化した。消化ＤＮＡをフェノールＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃ で２回抽出し、エタノールで沈降させて精製した。ベクターｐＢＲ３２２ ＤＮ ＡをＢａｍＨＩ制限酵素で直鎖状とし、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ ）で脱リン酸化した。ベクターＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣ ｌ₃で２回抽出し、エタノールで沈降させて再度精製した。 Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩで切断し、ＣＩＰ処 理したｐＢＲ３２２ ＤＮＡと連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２（ｄｉｎ Ｄ１::ｌａｃＺ、ｈｓｄＲ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）コンピテント細胞 及び連結ＤＮＡを混合して、１回の形質転換実験から合計して約４，０００のコ ロニーを得、形質転換細胞をＡｐ＋Ｘｇａｌプレート上で平板培養する。１０の ブ ルーコロニーが見出された。各コロニーを１０ｍｌのＬＢ＋Ａｐに接種し、振盪 機中３７℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心して収穫し、１ｍｌの音波処 理緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ β−メルカプト エタノール）＋リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁した。音波処理により 細胞の溶菌を完了した。６５℃で３０分間溶解物をインキュベートして、Ｅ．ｃ ｏｌｉタンパク質を熱変性させた。不溶成分を遠心して除去し、上清をエンドヌ クレアーゼ活性アッセイに用いた。λ又はｐＢＲ３２２ ＤＮＡ基質を５μｌの 細胞抽出物と共に６５℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡフラグメントを０ ．８％アガロースゲル中で分離し、臭化エチジウム染色により検出した。細胞抽 出物をｐＢＲ３２２基質上でエンドヌクレアーゼ活性について調べたが、２つの 株はＴａｑＩエンドヌクレアーゼを産生することがわかった（図２）。これら２ つの株からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＴａｑＩエンドヌクレアーゼ消化にかけ た。１方のプラスミドはＴａｑＩ消化に対して部分的に耐性であり、他方は完全 に消化された。上記結果から、一方のクローンはＴａｑＩメチラーゼ遺伝子を含 み、他方のクローンは該遺伝子を含んで いないものと推論された。 ＴａｑＩエンドヌクレアーゼ収率を予測するために、１リットルの細胞培養物 を３７℃にし、細胞抽出物をその活性についてアッセイした。両株とも、湿潤細 胞１ｇ当たり５×１０⁴単位のＴａｑＩを産生した。細胞抽出物は以下のように 調製した：１リットルのＬＢ＋Ａｐに５ｍｌの一晩細胞を接種し、３７℃で一晩 振盪した。細胞を遠心し、細胞ペレットを２０ｍｌの音波処理緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）中に再懸濁し、３０ 秒バーストで１０回音波処理し、１５，０００ｒｐｍ／分で３０分間遠心して、 細胞破片を除去した。上清を、ＴａｑＩ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍ Ｍ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中６５℃で１時間エンドヌクレア ーゼ活性についてアッセイした。 実施例３ Ｔｔｈ１１１ＩＲ遺伝子のクローニング Ｔｔｈ１１１Ｉ制限酵素を産生するＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ ｓ １１１（ＮＥＢ＃２４９）株からゲノムＤＮＡを形成した。５ｇの細胞を、 ２５％スクロース、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を含む２ ５ｍｌの緩衝液に再懸濁した。該細胞懸濁液に５ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐ Ｈ８．０及び６ｍｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。室温で１０分間 インキュベートした後、３６ｍｌの溶菌緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ 、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６２ｍＭ ＥＤＴＡ）及び５ｍｌの １０％ＳＤＳを加えて、細胞を完全に溶解させた。フェノール−ＣＨＣｌ₃で２ 回、ＣＨＣｌ₃で２回抽出してタンパク質を取り出し、１／１０容量の３．５Ｍ 酢酸ナトリウム及び等量のイソプロパノールを加え、１５，０００ｒｐｍ／分 で遠心してゲノムＤＮＡを沈降させた。ＤＮＡペレットを５０ｍｌの７０％エタ ノールで洗浄し、真空下に乾燥した。ＤＮＡを１０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し 、２リットルのＴＥ緩衝液中４℃で一晩透析した。５０μｇのゲノムＤＮＡを、 １単位、０．５単位、０．２５単位、０．１２５単位のＳａｕ３ＡＩで３０分間 ３７℃で消化した。消化ＤＮＡをフェノールＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃で２回 抽出し、エタノールで沈降させて精製した。ベクターｐＢＲ３２２ ＤＮＡをＢ ａｍＨＩ制限酵素で直鎖状とし、ＣＩＰで脱リン酸化した。ベクターＤＮＡをフ ェノール−ＣＨＣｌ₃で２回、Ｃ ＨＣｌ₃で２回抽出し、エタノールで沈降させて再精製した。Ｓａｕ３ＡＩで部 分消化したゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理したｐＢＲ３２２ Ｄ ＮＡと連結した。該ＤＮＡ連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２（ｄｉｎＤ １::ｌａｃＺ、ｈｓｄＲ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）コンピテント細胞に 形質転換した。８，０００個の形質転換細胞中に４０のブルーコロニーが見出さ れた。これら４０の株をエンドヌクレアーゼ活性について調べた。１４の株はＴ ｔｈ１１１Ｉエンドヌクレアーゼを産生した（図２）。Ｔｔｈ１１１Ｉ産生株か らプラスミドＤＮＡを作成し、Ｔｔｈ１１１Ｉ制限消化にかけた。１２のプラス ミドはＴｔｈ１１１Ｉエンドヌクレアーゼにより直鎖状となった。これは、メチ ラーゼ遺伝子が同一フラグメント中には含まれていないか、又は３７℃では発現 されないことを示唆している。３つのプラスミドはＴｔｈ１１１Ｉに対して部分 的に耐性であり、これは、クローン化フラグメント上に同種メチラーゼ遺伝子が 存在することを示している。 実施例４ メチラーゼ選択法とブルーコロニースクリーニング法の組合わせによるＥｃｏＯ１０９ＩＲ遺伝子のクローニング この実施例においては、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするた めにメチラーゼ選択法とエンドヌクレアーゼインジケーター法を組合わせる可能 性をテストした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ７０９ｃ（ＮＥＢ＃３６１）のゲノムＤＮＡ を実施例２に記載のように作成した。ＤＮＡを実施例２に記載のようにＳａｕ３ ＡＩで部分的に切断し、１６℃で一晩ｐＢＲ３２２（ＢａｍＨＩで直鎖状にし、 ＣＩＰ処理した）に連結した。該連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＲＲ１コンピ テント細胞を形質転換した。合計１０５個の形質転換細胞をプールし、５００ｍ ｌのＬＢ培地に接種した。細胞培養物を一晩３７℃で振盪した。細菌細胞を遠心 して収穫し、２０ｍｌの緩衝液Ｐ１（１００μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＡ、５０ｍ Ｍ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。２０ｍ ｌの緩衝液Ｐ２（１００ｍＭ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を添加した後、室温で５ 分間インキュベートし、２０ｍｌの緩衝液Ｐ３（２．５５Ｍ ＫＡｃ、ｐＨ４． ８）を加えた。４℃で３０分間遠心（１５，０００ｒｐｍ／分）して沈降物を除 去した。上清を、緩衝液ＱＢＴ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ ０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５％エタノール、ｐＨ７．０、０．１５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で予備平衡化した２つのＱｉａｇｅｎ中型カラムに装入した。プラ スミドＤＮＡを２０ｍｌの緩衝液ＱＣ（１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、 １５％エタノール，ｐＨ７．０）で洗浄し、５ｍｌの緩衝液ＱＦ（１．２５ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５％エタノール、ｐＨ８．２）で溶離した 。プラスミドＤＮＡを等量のイソプロパノールで沈降させ、４℃で３０分間遠心 した。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、真空下に乾燥、１ｍｌのＴ Ｅ緩衝液に溶解した。プラスミドライブラリーからの１０μｇのプラスミドＤＮ Ａを１００単位のＥｃｏＯ１０９Ｉ制限酵素で３時間３７℃で消化した。消化プ ラスミドＤＮＡを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２（ｄｉｎＤ１::ｌａｃＺ 、ｈｓｄＲ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）を形質転換し、細胞をＸｇａｌ＋ Ａｐプレート上で平板培養した。１２０個の形質転換細胞中に１４のブルーコロ ニーが見出された。１４の株それぞれから１０ｍｌの細胞培養物を調製し、細胞 抽出物を作成してλＤＮＡ基質上でＥｃｏＯ１０９Ｉエンドヌクレアーゼ活性に ついてアッセイした。８つの株がＥｃｏ Ｏ１０９Ｉ制限エンドヌクレアーゼを産生することが判明した。メチラーゼ選択 法とエンドヌクレアーゼインジケーター法を組み合わせることにより、メチラー ゼ遺伝子のみを含むか又はチャレンジ後に切断部位を欠失したクローンは排除す るが、エンドヌクレアーゼ遺伝子を単独で有するか又はエンドヌクレアーゼ遺伝 子とメチラーゼ遺伝子とを共に有するクローンを同定し得る。 実施例５ 熱安定性ＤＮＡヌクレアーゼ（ＴＦヌクレアーゼ）を コードする遺伝子のクローニング 実施例２に記載のようにして、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ株から ゲノムＤＮＡを作成した。該ＤＮＡを実施例２に記載のようにＳａｕ３ＡＩで部 分的に切断し、１６℃で一晩ｐＢＲ３２２（ＢａｍＨＩで直鎖状にし、ＣＩＰ処 理した）に連結した。連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２コンピテ ント細胞を形質転換し、Ｘｇａｌ、Ａｐプレート上で平板培養した。１回の形質 転換実験から合計８，０００個の形質転換細胞を得た。これらの形質転換細胞中 に２３のブルーコロニーが見出された。２３のブルー分離物それぞれから、１０ ｍｌの細胞培養物を 作製し、細胞抽出物を（実施例２に記載のように）調製して、ｐＢＲ３２２ Ｄ ＮＡ基質上でＤＮＡヌクレアーゼ活性についてアッセイした。１つの分離物（＃ １７）からの細胞抽出物は、ｐＢＲ３２２二本鎖ＤＮＡ上６８℃のインキュベー ション温度でＤＮＡニック活性を示した。ヌクレアーゼ活性をさらにテストする ために、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ形態（二本鎖ＤＮＡ）及び一本鎖形態を基質として 用いた。この場合も、該ヌクレアーゼは二本鎖基質上でＤＮＡニック活性を示す 。該ヌクレアーゼを加えて一本鎖ＤＮＡを分解した。二本鎖ＤＮＡ（λＤＮＡ又 はＭ１３ＲＦ形態）をヌクレアーゼと共に長時間（１２時間）インキュベートす ると、ＤＮＡも分解した。従って、Ｔｆヌクレアーゼに好ましい基質は一本鎖Ｄ ＮＡであるとの結論を得た。さらに、テストにより、該ヌクレアーゼは二本鎖Ｄ ＮＡをエキソヌクレアーゼIIIで消化した後のような一方向欠失の適用に用い得 、残りの一本鎖ＤＮＡはＴｆヌクレアーゼにより除去し得ることも判明した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年３月１９日 【補正内容】図面の簡単な説明 図１はＴｔｈ１１１Ｉをコードする遺伝子であるｔｔｈ１１１ＩＲ遺伝子の大 腸菌におけるクローニングの説明図である。 図２は大腸菌によって産生されたクローン化ＴａｑＩ及びＴｔｈ１１１Ｉ制限 酵素のＤＮＡ切断パターンを示す。細胞抽出物のＴａｑＩ及びＴｔｈ１１１Ｉエ ンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。レーン１は切断していないｐＢＲ３２２ ＤＮＡ、レーン２はＴａｑＩエンドヌクレアーゼを含有する細胞抽出物で切断 したｐＢＲ３２２、レーン３は精製ＴａｑＩで切断したｐＢＲ３２２、レーン４ はＢＳｔＥII切断λＤＮＡ寸法標準、レーン５は切断していないλＤＮＡ、レー ン６はＴｔｈ１１１Ｉエンドヌクレアーゼを含有する細胞抽出物で切断したλＤ ＮＡ、レーン７は精製Ｔｔｈ１１１Ｉエンドヌクレアーゼで切断したλＤＮＡで ある。ＴａｑＩ及びＴｔｈ１１１Ｉ制限消化は６５℃で１時間行なった。 図３はＢｓｏＢＩ活性アッセイの結果を示す。５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び１ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液中 で１μｇのλＤ ＮＡ基質を１０μｌの細胞抽出物と共に６５℃で１時間インキュベートした。Ｄ ＮＡ消化産物を０．８％アガロースゲル中で分離させ（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）、エ チジウムブロミド染色によって検出した。単離物＃１６から得られた細胞抽出物 はＢｓｏＢＩヌクレアーゼ活性を有することが判明した。最初のレーンはＢｓｏ ＢＩ陽性対照である。各レーン上の数字は単離物番号を示す。 図４ＡはＢｓｏＢＩメチラーゼ遺伝子である（配列番号３）。図４ＢはＢｓｏ ＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子である（配列番号４）。図４ＣはＢｓｏＢＩ メチラーゼ遺伝子に対応するアミノ酸配列である（配列番号５）。図４ＤはＢｓ ｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子に対応するアミノ酸配列である（配列番号 ６）。 図５はＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ挿入部分の制限 マップである。挿入部分の大きさは約８．０ｋｂである。挿入部分はＳａｕ３Ａ Ｉで部分消化したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲ ノムＤＮＡから得、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位へクローン化した。発明の詳細な説明 本発明はその一形態によって、ヌクレアーゼ遺伝子を直接クローン化する新規 な方法を提供する。本発明の方法は通常次のステップを含むが、当業者には理解 されるように、これらのステップの変形も結果に悪影響を及ぼさずに可能である 。 １） ヌクレアーゼ産生株からゲノムＤＮＡを調製し、これを完全に、または部 分的に切断して約５００〜２０，０００ｂｐのクローン化可能なＤＮＡ断片を生 じさせる。このような断片は、例えば制限酵素を用いたり、音波処理で切り取っ たりして取得し得る。得られた断片はその後、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡ ＣＹＣ１８７、ｐＳＣ１０１、またはこれらの誘導体中の相容性の付着端または 平滑末端を持つクローニングベクターに連結する。 ２） 連結ＤＮＡ混合物を、好ましくはｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ融合体などの、イ ンジケーター／レポーターと融合したＤＮＡ損傷性プロモーターを有し、かつメ チル化依存制限系を欠く細菌株（ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ、ｈｓｄＲ、ｍＣｒＡ、 ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）に移入する。好ましい株の一つに大腸菌ＥＲ１９９２（Ｎ ＥＢ ＃９０７）が有り、この株の標本はブダペスト条約の約定に基づき１９９ ４年 ５月２４日付でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｒｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎに、ＡＴＣＣ受託番号第５５５８２号の下に寄託してある。用い得る他の ＤＮＡ損傷誘導プロモーターにはｄｉｎＡ（Ｍ． Ｉｗａｓａｋｉ等，Ｊ． Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２， ｐｐ．６２６８−６２７３， １９９０）及び ｄｉｎＧ（Ｌ． Ｋ． Ｌｅｗｉｓ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４， ｐｐ．５１１０−５１１６， １９９２）が含まれ、前記文献の開示は本明細 書に参考として含まれる。上記プロモーターのうちのいずれかと融合し得る他の インジケーター／レポーター遺伝子には、アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ｐｐ．５ １０７−５１１１， １９８５）、ルシフェラーゼ（ｌｕｘ； Ｊ． Ｅｎｇｅ ｌｒｅｃｈｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７， ｐｐ．１３４５−１３４７， １ ９８５）、β−グルクロニダーゼ（Ｗ． Ｗ． Ｍｅｔｃａｌｆｅ， Ｇｅｎｅ １２９， ｐｐ．１７−２５， １９９３）、アミノグリコシドホスホトラン スフェラーゼ（Ｊ． Ｍ． Ｗａｒｄ等， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０３， ｐｐ．４６８−４７ ８， １９８６）及びエンドグルカナーゼ（Ｗ． Ｗ． Ｂｉｎｇｌｅ等， Ｃ ａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９， ｐｐ．７０−８０， １９９３） が含まれ、前記文献の開示は本明細書に参考として含まれる。 大腸菌ＥＲ１９９２の形質転換後、細胞を、Ｘｇａｌ及び適当な抗生物質を含 有するインジケータープレート上で平板培養し、約３０〜４２℃で一晩インキュ ベートする。クローン化するべき特定の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子またはヌ クレアーゼ遺伝子次第では、宿主のメチル化依存制限系の全部または一部を不活 性化しなくともよい場合が有る。上記制限系が常に欠けている必要は無いが、修 飾塩基（異常なＣ⁵シトシン、Ｎ⁴シトシンまたはＮ⁶アデニン）が未知である場 合の制限一修飾系のクローニングには総てのメチル化依存系を欠くｄｉｎＤ：： ｌａｃＺ株を用いることが好ましい。 ３） 個々の中青色（ｍｅｄｉｕｍ ｂｌｕｅ）／暗青色コロニーを選出し、適 当な抗生物質を加えたＬＢ培地（１０〜１０００ｍｌ）に接種して約３０〜４２ ℃で一晩振盪する。 ４） 細胞を遠心によって回収し、溶菌酵素を加えた音波 処理緩衝液中に再懸濁させ、細胞溶解を音波処理によって完了させる。細胞破片 及び不溶性構成要素を遠心によって除去する。 ５） クローン化するべきヌクレアーゼ遺伝子が熱安定性の細菌に由来する場合 は溶解物を約６５℃で、大腸菌天然タンパク質の変性に十分な時間（例えば３０ 分間）加熱する。このステップによって、天然の大腸菌ヌクレアーゼを効率的に 不活性化する。 ６） 上清（細胞抽出物）を適当な緩衝液中で３７〜６８℃において、ｐＵＣ１ ９、ｐＢＲ３２２、Ｍ１３ｍｐ１８／１９複製形態もしくは一本鎖ＤＮＡまたは λＤＮＡといった適当なＤＮＡ基質に対するヌクレアーゼ活性に関してアッセイ する。 ７） ＤＮＡ消化パターンもしくは断片をアガロースゲル電気泳動またはＰＡＧ Ｅによって分離させ、エチジウムブロミド染色によって検出する。 上述の方法は、ｔａｑＩＲ遺伝子、ｔｔｈ１１１ＩＲ遺伝子、及びＴｈｅｒｍ ｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ由来のＤＮＡヌクレアーゼをコードする遺伝子を含 めた幾つかのヌクレアーゼ遺伝子のクローニングに首尾よく用いること ができた。先に指摘したように、本発明の方法は特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔ ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＥＢ ＃８８２）由来のＢｓｏＢＩなど の熱安定ヌクレアーゼを含めた上記以外のヌクレアーゼのクローニングに有用で ある。ＢｓｏＢＩは、ＣＰｙＣＧＰｕＧ（配列番号７）を認識するＡｖａＩのア イソシゾマーである。 本発明は別の形態によって、上述のエンドヌクレアーゼインジケーター法で用 い得る新規な株を提供する。この株、即ち大腸菌ＥＲ１９９２はｄｉｎＤ：：ｌ ａｃＺ融合体を有し、かつ総ての制限系を欠いている（ＥｃｏＫＲ^-、ＭｃｒＡ^- 、ＭｃｒＢＣ^-及びＭｒｒ^-）。 大腸菌ＥＲ１９９２［Ｆ^- λ^- Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）Ｕ１６９ ｓｕｐＥ ４４ ｅ１４^- ｄｉｎＤ１：：Ｍｕ ｄｌ１７３４（Ｋａｎ^R，ＬａｃＺ⁺） ｒｆｂＤ１？ ｒｅｌＡ１？ ｅｎｄＡ１ ｓｐｏＴ１？ ｔｈｉ−１ Δ（ｍ ｃｒＣ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０］は、（ｉ）ＮＫ６９９３由来のΔ（ａｒ ｇＦ−ｌａｃ）Ｕ１６９に連結したｐｒｏＣ：：Ｔｎ５での形質導入、Ｋａｎ^R の選択、及びＬａｃ^-Ｐｒｏ^-のスクリーニングによりＥＲ１９８４を得ることに よってＥＲ１８２１のＬａｃ^-誘 導体を取得し、（ｉｉ）前記誘導体をＥＲ１５７８からの形質導入によりＰｒｏ⁺ Ｋａｎ^SとしてＥＲ１９９１を得、（ｉｉｉ）ＪＨ１４０［ｄｉｎＤ１：：μｄ ｌ１７３４（Ｋａｎ^R，ＬａｃＺ⁺）である大脳菌株； Ｊ． Ｈｅｉｔｍａｎ等 ，上掲誌，１９９１）からの形質導入、ＫａｎＲの選択、及びｄｉｎＤ融合体に よって媒介されるβ−ガラクトシダーゼのナリジキシン酸誘導性発現のスクリー ニングによってｄｉｎＤ１：：μｄｌ１７３４（Ｋａｎ^R，ＬａｃＺ⁺）を導入す る３ステップで構築した。この大腸菌株を、上記ＤＮＡ損傷物質を収容したウェ ルを中央に設けたＸｇａｌプレート上で試験した。精製した形質導入体を、ウェ ルから放射状に画線培養した。暗青色にグラデーションの有る培養を大腸菌ＥＲ １９９２と名付けた。この株は一切のＤＮＡ損傷を受けず、Ｘｇａｌ上で淡青色 を示した。 以下の実施例を、現段階で好ましく実施される本発明の具体例を説明するため に示す。これらの実施例は説明用であり、本発明は添付の請求の範囲に記されて いる事以外では前記実施例に限定されないと考えるべきであることは理解されよ う。 実施例１ ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする ｂｓｏＢＩＲ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ中でのクローニング 細菌ＤＮＡの精製：５ｇのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ ｉｌｕｓ（ＮＥＢ＃８８２）細胞を、２５％スクロース、５０ｍＭ トリス−Ｈ Ｃｌ，ｐＨ８．０を含む緩衝液２５ｍｌに再懸濁した。該細胞懸濁液に、５ｍｌ の０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び６ｍｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ） を加えた。室温で１０分間インキュベートした後、３６ｍｌの溶菌緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６２ｍ Ｍ ＥＤＴＡ）及び５ｍｌの１０％ ＳＤＳを加えて、細胞を完全に溶解した。 フェノール−ＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃で２回抽出してタンパク質を取り出し た。１／１０容量の３．５Ｍ酢酸ナトリウム及び等量のイソプロパノールを添加 し、１５，０００ｒｐｍ／分で遠心して、ゲノムＤＮＡを沈降させた。ＤＮＡペ レットを５０ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、真空下に乾燥した。ＤＮＡペレ ットを１０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、２リットルのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、 １ｍＭ ＥＤＴＡ）中４℃で一晩透析した。 ゲノムＤＮＡの部分消化：５０μｇのゲノムＤＮＡを、それぞれ、２単位、１ 単位、０．５単位、０．２５単位、０．１２５単位のＳａｕ３ＡＩで３０分間３ ７℃で消化した。消化ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃で２回 抽出し、エタノールで沈降させて精製した。ベクターｐＵＣ１９ ＤＮＡをＢａ ｍＨＩ制限酵素により直鎖状にし、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で 脱リン酸化した。ＣＩＰ処理した後、ベクターＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ₃ で２回、ＣＨＣｌ₃で２回抽出し、エタノールで沈降させて精製した。 連結及び形質転換：Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した１０μｇのゲノムＤＮＡを、 ＢａｍＨＩ切断及びＣＩＰ処理したｐＵＣ１９ ＤＮＡ１μｇと一晩１６℃で連 結させた。等量のＴＥ緩衝液を加えて連結ＤＮＡを希釈し、ＥＲ１９９２（ｄｉ ｎＤ１::ｌａｃＺ⁺、ｈｓｄＲ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）コンピテント 細胞の形質転換に用いた。形質転換細胞をアンピシリン（Ａｐ）＋Ｘｇａｌプレ ート（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｘ ｇａｌ、０．０１６％ｗ／ｖ）上で平板 培養し、３７℃で一晩インキュベートした。１０，０００個の形質転換細胞中に ２４のブルーコロニーが見出された。各ブルーコロニーを１０ｍｌのＬＢ＋Ａｐ に接種し、振盪機中３７℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心して収穫し、 １ｍｌの音波処理緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）に再懸濁した。３０ 秒間の音波処理を２回行って細胞の溶菌を完了した。不溶成分を遠心して除去し 、上清を捕集して、以下のようなエンドヌクレアーゼ活性アッセイに用いた：１ μｇのλＤＮＡ基質を、１０μｌの細胞抽出物と共に、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ ０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液 中６５℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡフラグメントを０．８％アガロー スゲル中で分離し、臭化エチジウム染色により検出した。１つの分離物からの細 胞抽出物は、ＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼ活性を含むことが判明した（図３、 分離物＃１６参照）。この株からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＢｓｏＢＩ制限イ ンドヌクレアーゼで消化して耐性を調べた。該プラスミドＤＮＡはＢｓｏＢＩで 切断されたが、これは、ＢｓｏＢＩメチラーゼ 遺伝子が挿入物中に存在しないか、又は該メチラーゼ遺伝子が全く発現されない ことを示している。ＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ＢｓｏＢＩＲ）を有 するプラスミドをｐＢｓｏＲ１と命名した。ＢｓｏＢＩクローンの安定性を測定 するために、ＥＲ１９９２［ｐＢｓｏＲ１］細胞を３７℃で増殖させ、プラスミ ドＤＮＡを細胞から分離し、ＥＲ１９９２コンピテント細胞への再形質転換に用 いた。再形質転換実験では、さらなる突然変異を最小限にするべく、形質転換細 胞を３０℃で平板培養した。形質転換細胞の６７％がブルーコロニーを形成する （５２８個の形質転換細胞中３５６のブルーコロニー）のに対し、他の３３％は ホワイトコロニーを形成する（５２８個の形質転換細胞中１７２のホワイトコロ ニー）ことが知見された。プラスミドＤＮＡをホワイトコロニーから分離し、制 限消化により分析すると、該ＤＮＡが広範囲の欠失を示すことが見出された。Ｅ Ｒ１９９２［ｐＢｓｏＲ１］細胞は３７℃ではあまり安定ではないという結論を 得た。ｐＢｓｏＲ１を有するブルーコロニーを３７℃の代わりに３０℃で一晩イ ンキュベートすると、ＥＲ１９９２［ｐＢｓｏＲ１］細胞はより安定になる。３ ０℃培養物から分離したプラスミドＤ ＮＡを用いて再形質転換すると、形質転換細胞の９９．６％が３０℃でブルーコ ロニーを形成する（４８０のブルーコロニー、２つのホワイトコロニー）。ｐＢ ｓｏＲ１（ＮＥＢ＃９５１）の試料は、ブダペスト条約の条項に基づき、１９９ ４年１２月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号７５９６６の元に受託された。 ＡｖａＩ制限−修飾系をコードする遺伝子は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ ｏｌａｂｓでクローン化された。ＡｖａＩ及びＢｓｏＢＩは同一の認識配列５′ ＣＰｙＣＧＰｕＧ３′（配列番号７）を共有している。ＡｖａＩメチラーゼ遺伝 子（ａｖａＩＭ）を有する１．８ｋｂのＰｓｔＩフラグメントをｐＡｖａＩＲＭ １２から消化し、ｐＲ９７６ベクター（ｐＡＣＹＣ１８４誘導体、Ｔｃ^R）にク ローン化した。プラスミドｐＲ９７６−ＡｖａＩＭ⁺をＥＲ１９９２（ｄｉｎＤ: :ｌａｃＺ）細胞に形質転換して、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体を予備修飾した。次いで 、ＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を有する第２のプラスミド、ｐＢｓｏＲ １をｐＲ９７６−ＡｖａＩＭ⁺を含む細胞に導入し、Ｘｇａｌインジケータープ レート上で平板培養した。 該形質転換細胞はまだブルーコロニーを形成することが知見されたが、これは、 ＡｖａＩメチラーゼがＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼ損傷に対してＥ．ｃｏｌｉ 染色体を保護しないことを示唆している。 プラスミドミニ調製手順：１．５ｍｌの一晩培養物を１４，０００ｒｐｍ／分 で３分間ペレット化した。上清を流し出し、細胞ペレットを２００ｍｌのＳＴＥ Ｔ緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０． ５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、８％スクロース）に再懸濁した。該細胞懸濁液 に５０μｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。溶解した細胞を沸騰水中 で１分間沸騰させ、沈降物を１４，０００ｒｐｍ／分で１０分間スピンした。２ ００μｌの上清を捕集し、１００μｌの７．５Ｍ ＮＨ₃Ａｃ及び６００ｍｌの ９５％エタノールと混合した。室温で１０分間１４，０００ｒｐｍ／分で遠心し てＤＮＡを沈降させた。ＤＮＡペレットを１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、 真空下に１５分間乾燥した。乾燥したペレットを１００μｌのＴＥ緩衝液＋５μ ｌのＲＮアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁した。 挿入物の制限マッピング：プラスミドＤＮＡ ｐＢｓｏ Ｒ１を種々の制限酵素で消化し、消化ＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動によ り分析した。制限マップを図５に示した。 ｂｓｏＢＩＲ遺伝子を、欠失マッピングにより８ｋｂのゲノムＤＮＡ挿入物中 の１．４ｋｂのＥｃｏＮＩ／ＸｂａＩフラグメント内にマッピングした。全ｂｓ ｏＢＩＲ遺伝子を、サブクローン及び欠失クローン（ＳｓｐＩフラグメントサブ クローン、ＡｖｒII／ＸｂａＩサブクローン、ＮｌａIIIフラグメントサブクロ ーン、Ｓａｕ３ＡＩフラグメントサブクローン、ＥｃｏＮＩ／ＡｖｒIIサブクロ ーン、ＡｖｒII／ＸｈｏＩ）並びに「プライマーウォーキング」から配列決定し た。精製ＢｓｏＢＩエンドヌクレアーゼのＮ末端タンパク質配列は開始コドンの 後の予測タンパク質配列〔（Ｍ）ＮＴＱＫＰＦＥＮＨＬＫＳＶＤＤＬ（配列番号 ６の１−１７アミノ酸に対応する）〕とマッチするので、ｂｓｏＢＩＲ遺伝子の 開始コドンをＴＴＧコドンと定めた。ｂｓｏＢＩＲ遺伝子の両側のＤＮＡも配列 決定して、８．０ｋｂのＤＮＡフラグメントにクローン化されているシトシンメ チラーゼ遺伝子の一部が存在するかどうかを測定した。ｂｓｏＢＩＭ遺伝子又は 該遺伝子の一部は、保存され たメチラーゼモチーフに基づいて同定し得る。ｂｓｏＢＩＲ遺伝子の後のＤＮＡ 領域を配列決定し、６つのフレーム全てについて翻訳すると、保存されたＮ４シ トシンメチラーゼモチーフが１個見つかった。この配列は、ＤＰＦＬＧＳＧＴＴ （配列番号５の１０６−１１４アミノ酸に対応する）である。ｂｓｏＢＩＭ遺伝 子の７２７ｐｂのみが元の８．０ｋｂ挿入物上に存在していた。従って、逆ＰＣ Ｒを用いてメチラーゼ遺伝子の残りの部分をクローン化した。ＨａｅII及びＮｌ ａIII切断／自己連結したゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ産物のクローニング及び配列 決定により、別の保存メチラーゼモチーフＴＳＰＰＹ（配列番号５の３１９−３ ２３アミノ酸に対応する）が見出された、メチラーゼ遺伝子の別の９０２ｂｐを 得た。全メチラーゼ遺伝子（１６２９ｂｐ）をゲノムＤＮＡからｌａｃ^Rにより 増幅し、ｐＳＸ３３ｌａｃＩ^qにクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１コンピテ ント細胞に形質転換して、宿主を予備修飾した。ｂｓｏＢＩＲ遺伝子を含むＢｂ ｓＩ／ＸｂａＩフラグメントを発現ベクターｐＲＲＳにクローン化して過産生構 築物Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１（ｐＳＸ３３ｌａｃＩ^q−ＢｓｏＢＩＭ⁺、ｐＲＲＳ− ＢｓｏＢＩＲ⁺）を得た。ｂｓｏＢＩ Ｍ及びｂｓｏＢＩＲ遺伝子の配列をそれぞれ図４−１〜図４−４に示す。 実施例２ Ｔａｑ／Ｒ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉ中でのクローニング 細菌ＤＮＡの精製を以下のように行った：５ｇのＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔ ｉｃｕｓ ＹＴ−１（ＡＴＣＣ ２５１０４）細胞を、２５％スクロース、５０ ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む２５ｍｌの緩衝液中に懸濁した。該細 胞懸濁液に、５ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び６ｍｌのリゾチーム （１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。室温で１０分間インキュベートした後、３６ｍｌ の溶菌緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、 ｐＨ８．０、６２ｍＭ ＥＤＴＡ）及び５ｍｌの１０％ＳＤＳを加えて細胞を完 全に溶解した。フェノール−ＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃で２回抽出してタンパ ク質を取り出し、１／１０容量の３．５Ｍ酢酸ナトリウム及び等量のイソプロパ ノールを加え、１５，０００ｒｐｍ／分で遠心してゲノムＤＮＡを沈降させた。 ＤＮＡペレットを５０ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、真空下に乾燥した。Ｄ ＮＡを１０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、２ リットルのＴＥ緩衝液中４℃で一晩透析した。５０μｇのゲノムＤＮＡを、１単 位、０．５単位、０．２５単位、０．１２５単位のＳａｕ３ＡＩで３０分間３７ ℃で消化した。消化ＤＮＡをフェノールＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃で２回抽出 し、エタノールで沈降させて精製した。ベクターｐＢＲ３２２ ＤＮＡをＢａｍ ＨＩ制限酵素で直鎖状とし、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で脱リン 酸化した。ベクターＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃で２回抽 出し、エタノールで沈降させて再度精製した。 Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩで切断し、ＣＩＰ処 理したｐＢＲ３２２ ＤＮＡと連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２（ｄｉｎ Ｄ１::ｌａｃＺ、ｈｓｄＲ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）コンピテント細胞 及び連結ＤＮＡを混合して、１回の形質転換実験から合計して約４，０００のコ ロニーを得、形質転換細胞をＡｐ＋Ｘｇａｌプレート上で平板培養する。１０の ブルーコロニーが見出された。各コロニーを１０ｍｌのＬＢ＋Ａｐに接種し、振 盪機中３７℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心して収穫し、１ｍｌの音波 処理緩衝液（１ ０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール） ＋リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁した。音波処理により細胞の溶菌を 完了した。６５℃で３０分間溶解物をインキュベートして、Ｅ．ｃｏｌｉタンパ ク質を熱変性させた。不溶成分を遠心して除去し、上清をエンドヌクレアーゼ活 性アッセイに用いた。λ又はｐＢＲ３２２ ＤＮＡ基質を５μｌの細胞抽出物と 共に６５℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡフラグメントを０．８％アガロ ースゲル中で分離し、臭化エチジウム染色により検出した。細胞抽出物をｐＢＲ ３２２基質上でエンドヌクレアーゼ活性について調べたが、２つの株はＴａｑＩ エンドヌクレアーゼを産生することがわかった（図２）。これら２つの株からプ ラスミドＤＮＡを抽出し、ＴａｑＩエンドヌクレアーゼ消化にかけた。１方のプ ラスミドはＴａｑＩ消化に対して部分的に耐性であり、他方は完全に消化された 。上記結果から、一方のクローンはＴａｑＩメチラーゼ遺伝子を含み、他方のク ローンは該遺伝子を含んでいないものと推論された。 ＴａｑＩエンドヌクレアーゼ収率を予測するために、１リットルの細胞培養物 を３７℃にし、細胞抽出物をその活 性についてアッセイした。両株とも、湿潤細胞１ｇ当たり５×１０⁴単位のＴａ ｑＩを産生した。細胞抽出物は以下のように調製した：１リットルのＬＢ＋Ａｐ に５ｍｌの一晩細胞を接種し、３７℃で一晩振盪した。細胞を遠心し、細胞ペレ ットを２０ｍｌの音波処理緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ β− メルカプトエタノール）中に再懸濁し、３０秒バーストで１０回音波処理し、１ ５，０００ｒｐｍ／分で３０分間遠心して、細胞破片を除去した。上清を、Ｔａ ｑＩ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂）中６５℃で１時間エンドヌクレアーゼ活性についてアッセイした。 実施例３ Ｔｔｈ１１１ＩＲ遺伝子のクローニング Ｔｔｈ１１１Ｉ制限酵素を産生するＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ ｓ １１１（ＮＥＢ＃２４９）株からゲノムＤＮＡを形成した。５ｇの細胞を、 ２５％スクロース、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を含む２５ｍｌの緩 衝液に再懸濁した。該細胞懸濁液に５ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及 び６ｍｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。室温で１０分間インキュベ ート した後、３６ｍｌの溶菌緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ ト リス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６２ｍＭ ＥＤＴＡ）及び５ｍｌの１０％ＳＤＳを 加えて、細胞を完全に溶解させた。フェノール−ＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃で ２回抽出してタンパク質を取り出し、１／１０容量の３．５Ｍ 酢酸ナトリウム 及び等量のイソプロパノールを加え、１５，０００ｒｐｍ／分で遠心してゲノム ＤＮＡを沈降させた。ＤＮＡペレットを５０ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、 真空下に乾燥した。ＤＮＡを１０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、２リットルのＴ Ｅ緩衝液中４℃で一晩透析した。５０μｇのゲノムＤＮＡを、１単位、０．５単 位、０．２５単位、０．１２５単位のＳａｕ３ＡＩで３０分間３７℃で消化した 。消化ＤＮＡをフェノールＣＨＣｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃で２回抽出し、エタノー ルで沈降させて精製した。ベクターｐＢＲ３２２ ＤＮＡをＢａｍＨＩ制限酵素 で直鎖状とし、ＣＩＰで脱リン酸化した。ベクターＤＮＡをフェノール−ＣＨＣ ｌ₃で２回、ＣＨＣｌ₃で２回抽出し、エタノールで沈降させて再精製した。Ｓａ ｕ３ＡＩで部分消化したゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理したｐＢ Ｒ３２２ ＤＮＡと連結し た。該ＤＮＡ連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２（ｄｉｎＤ１::ｌａｃＺ 、ｈｓｄＲ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）コンピテント細胞に形質転換した 。８，０００個の形質転換細胞中に４０のブルーコロニーが見出された。これら ４０の株をエンドヌクレアーゼ活性について調べた。１４の株はＴｔｈ１１１Ｉ エンドヌクレアーゼを産生した（図２）。Ｔｔｈ１１１Ｉ産生株からプラスミド ＤＮＡを作成し、Ｔｔｈ１１１Ｉ制限消化にかけた。１２のプラスミドはＴｔｈ １１１Ｉエンドヌクレアーゼにより直鎖状となった。これは、メチラーゼ遺伝子 が同一フラグメント中には含まれていないか、又は３７℃では発現されないこと を示唆している。３つのプラスミドはＴｔｈ１１１Ｉに対して部分的に耐性であ り、これは、クローン化フラグメント上に同種メチラーゼ遺伝子が存在すること を示している。 実施例４ メチラーゼ選択法とブルーコロニースクリーニング法の組合わせによるＥｃｏＯ１０９ＩＲ遺伝子のクローニング この実施例においては、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするた めにメチラーゼ選択法とエンドヌク レアーゼインジケーター法を組合わせる可能性をテストした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ ７０９ｃ（ＮＥＢ＃３６１）のゲノムＤＮＡを実施例２に記載のように作成した 。ＤＮＡを実施例２に記載のようにＳａｕ３ＡＩで部分的に切断し、１６℃で一 晩ｐＢＲ３２２（ＢａｍＨＩで直鎖状にし、ＣＩＰ処理した）に連結した。該連 結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＲＲ１コンピテント細胞を形質転換した。合計１ ０５個の形質転換細胞をプールし、５００ｍｌのＬＢ培地に接種した。細胞培養 物を一晩３７℃で振盪した。細菌細胞を遠心して収穫し、２０ｍｌの緩衝液Ｐ１ （１００μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＡ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ Ｅ ＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。２０ｍｌの緩衝液Ｐ２（１００ｍＭ Ｎａ ＯＨ、１％ＳＤＳ）を添加した後、室温で５分間インキュベートし、２０ｍｌの 緩衝液Ｐ３（２．５５Ｍ ＫＡｃ、ｐＨ４．８）を加えた。４℃で３０分間遠心 （１５，０００ｒｐｍ／分）して沈降物を除去した。上清を、緩衝液ＱＢＴ（７ ５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５％エタノール、ｐＨ７．０、０ ．１５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で予備平衡化した２つのＱｉａｇｅｎ中型 カラムに装入した。プラスミドＤＮＡ を２０ｍｌの緩衝液ＱＣ（１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５％エタノ ール，ｐＨ７．０）で洗浄し、５ｍｌの緩衝液ＱＦ（１．２５ｍＭ ＮａＣｌ、 ５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５％エタノール、ｐＨ８．２）で溶離した。プラスミド ＤＮＡを等量のイソプロパノールで沈降させ、４℃で３０分間遠心した。ＤＮＡ ペレットを７０％エタノールで洗浄し、真空下に乾燥、１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶 解した。プラスミドライブラリーからの１０μｇのプラスミドＤＮＡを１００単 位のＥｃｏＯ１０９Ｉ制限酵素で３時間３７℃で消化した。消化プラスミドＤＮ Ａを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２（ｄｉｎＤ１::ｌａｃＺ）ｈｓｄＲ、 ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣ、ｍｒｒ）を形質転換し、細胞をＸｇａｌ＋Ａｐプレート 上で平板培養した。１２０個の形質転換細胞中に１４のブルーコロニーが見出さ れた。１４の株それぞれから１０ｍｌの細胞培養物を調製し、細胞抽出物を作成 してλＤＮＡ基質上でＥｃｏＯ１０９Ｉエンドヌクレアーゼ活性についてアッセ イした。８つの株がＥｃｏＯ１０９Ｉ制限エンドヌクレアーゼを産生することが 判明した。メチラーゼ選択法とエンドヌクレアーゼインジケーター法を組み合わ せることにより、メチラーゼ遺伝子のみ を含むか又はチャレンジ後に切断部位を欠失したクローンは排除するが、エンド ヌクレアーゼ遺伝子を単独で有するか又はエンドヌクレアーゼ遺伝子とメチラー ゼ遺伝子とを共に有するクローンを同定し得る。 実施例５ 熱安定性ＤＮＡヌクレアーゼ（ＴＦヌクレアーゼ）を コードする遺伝子のクローニング 実施例２に記載のようにして、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ株から ゲノムＤＮＡを作成した。該ＤＮＡを実施例２に記載のようにＳａｕ３ＡＩで部 分的に切断し、１６℃で一晩ｐＢＲ３２２（ＢａｍＨＩで直鎖状にし、ＣＩＰ処 理した）に連結した。連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２コンピテ ント細胞を形質転換し、Ｘｇａｌ、Ａｐプレート上で平板培養した。１回の形質 転換実験から合計８，０００個の形質転換細胞を得た。これらの形質転換細胞中 に２３のブルーコロニーが見出された。２３のブルー分離物それぞれから、１０ ｍｌの細胞培養物を作製し、細胞抽出物を（実施例２に記載のように）調製して 、ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ基質上でＤＮＡヌクレアーゼ活性についてアッセイした 。１つの分離物（＃１７）からの 細胞抽出物は、ｐＢＲ３２２二本鎖ＤＮＡ上６８℃のインキュベーション温度で ＤＮＡニック活性を示した。ヌクレアーゼ活性をさらにテストするために、Ｍ１ ３ｍｐ１８ＲＦ形態（二本鎖ＤＮＡ）及び一本鎖形態を基質として用いた。この 場合も、該ヌクレアーゼは二本鎖基質上でＤＮＡニック活性を示す。該ヌクレア ーゼを加えて一本鎖ＤＮＡを分解した。二本鎖ＤＮＡ（λＤＮＡ又はＭ１３ＲＦ 形態）をヌクレアーゼと共に長時間（１２時間）インキュベートすると、ＤＮＡ も分解した。従って、Ｔｆヌクレアーゼに好ましい基質は一本鎖ＤＮＡであると の結論を得た。さらに、テストにより、該ヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡをエキソ ヌクレアーゼIIIで消化した後のような一方向欠失の適用に用い得、残りの一本 鎖ＤＮＡはＴｆヌクレアーゼにより除去し得ることも判明した。 請求の範囲 １．ヌクレアーゼをコードするＤＮＡを分離する方法であって、 （ａ）ヌクレアーゼをコードする供給源からＤＮＡライブラリーを形成するステ ップ； （ｂ）適切なクローニングベクターにステップ（ａ）のＤＮＡを連結するステッ プ； （ｃ）ステップ（ｂ）のクローニングベクターにより、（ｉ）インジケーター／ レポーター遺伝子に融合したＤＮＡ損傷誘発プロモーターを含み、（ii）１種以 上のメチル化依存性制限系が欠損している宿主細胞を形質転換するステップ； （ｄ）インジケーター／レポーター遺伝子の発現産物と反応する基質及び適切な 抗生物質を含むインジケータープレート上で、ステップ（ｃ）の形質転換宿主細 胞を平板培養／インキュベートするステップ；及び （ｅ）ステップ（ｄ）の平板培養された形質転換宿主細胞から適切なコロニーを 選択し、発現されたヌクレアーゼの存在についてスクリーニングするステップ を含む前記方法。 ２．インジケーター／レポーター遺伝子に融合したＤＮＡ損傷誘発プロモーター がｄｉｎＤ１::ｌａｃＺである、請求項１に記載の方法。 ３．インジケーター／レポーター遺伝子の発現産物と反応する基質がＸｇａｌで ある、請求項２に記載の方法。 ４．ダークブルーコロニーに対する培地を選抜することによりステップ（ｃ）の 選択を実施する、請求項２に記載の方法。 ５．ヌクレアーゼが制限エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。 ６．宿主細胞が全てのメチル化依存性制限系を欠損している、請求項１に記載の 方法。 ７．ステップ（ｃ）の宿主細胞が大腸菌の株である、請求項１に記載の方法。 ８．宿主細胞が大腸菌ＥＲ１９９２である、請求項１に記載の方法。 ９．インジケーター／レポーター遺伝子に融合したＤＮＡ損傷誘発プロモーター を含み、全てのメチル化依存性制限系が欠損している、ヌクレアーゼをクローン 化するため の宿主細胞。 １０．大腸菌の株である、請求項９に記載の宿主細胞。 １１．大腸菌ＥＲ１９９２である、請求項１０に記載の宿主細胞。 １２．ベクターｐＢｓｏＲ１から得られる、ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ をコードする単離ＤＮＡ。 １３．ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメントが挿入 されたベクターを含む組換えＤＮＡベクター。 １４．請求項１２に記載の単離ＤＮＡを含むクローニングベクター。 １５．請求項１４に記載のクローニングベクターにより形質転換された宿主細胞 。 １６．ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼを産生させる方法であって、該エンド ヌクレアーゼの発現に適した条件下に請求項１４に記載のベクターにより形質転 換された宿主細胞を培養することを含む前記方法。 １７．サーマスフィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）から 得られるＤＮＡヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ。 １８．サーマスフィリホルミス制限エンドヌクレアーゼから得られるＤＮＡヌク レアーゼが挿入されたベクターを含む組換えベクター。 １９．請求項１７に記載の単離ＤＮＡを含む組換えベクター。 ２０．請求項１８又は１９に記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細 胞。 ２１．サーマスフィリホルミスから得られるＤＮＡヌクレアーゼを産生させる方 法であって、該ＤＮＡヌクレアーゼの発現に適した条件下に請求項１８又は１９ に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することを含む前記方法 。 ２２．サーマステルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） から得られる、Ｔｔｈ１１１Ｉ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ 。 ２３．Ｔｔｈ１１１Ｉ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡが挿入された ベクターを含む組換えベクター。 ２４．請求項２２に記載の単離ＤＮＡを含む組換えベクター。 ２５．請求項２３又は２４に記載の組換えベクターにより 形質転換された宿主細胞。 ２６．Ｔｔｈ１１１Ｉ制限エンドヌクレアーゼを産生させる方法であって、該エ ンドヌクレアーゼの発現に適した条件下に請求項２３又は２４に記載のベクター により形質転換された宿主細胞を培養することを含む前記方法。 ２７．大腸菌Ｈ７０９ｃから得られる、ＥｃｏＯ１０９１制限エンドヌクレアー ゼをコードする単離ＤＮＡ。 ２８．ＥｃｏＯ１０９１制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡが挿入され たベクターを含む組換えベクター。 ２９．請求項２７に記載の単離ＤＮＡを含む組換えベクター。 ３０．請求項２８又は２９に記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細 胞。 ３１．ＥｃｏＯ１０９１制限エンドヌクレアーゼを産生させる方法であって、該 エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下に請求項２８又は２９に記載のベクタ ーにより形質転換された宿主細胞を培養することを含む前記方法。 【図２】 【図４】 【図４】 【図４】 【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 ローリ，エリザベス・エイ アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02144、サマビル、バートン・ストリー ト・32 (72)発明者 キユー，シユアン−ヤン アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02173、レキシントン、グレイプバイン・ アベニユー・30

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヌクレアーゼをコードするＤＮＡを分離する方法であって、 （ａ）ヌクレアーゼをコードする供給源からＤＮＡライブラリーを形成するステ ップ； （ｂ）適切なクローニングベクターにステップ（ａ）のＤＮＡを連結するステッ プ； （ｃ）ステップ（ｂ）のクローニングベクターにより、（ｉ）インジケーター／ レポーター遺伝子に融合したＤＮＡ損傷誘発プロモーターを含み、（ii）１種以 上のメチル化依存性制限系が欠損している宿主細胞を形質転換するステップ； （ｄ）インジケーター／レポーター遺伝子の発現産物と反応する基質及び適切な 抗生物質を含むインジケータープレート上で、ステップ（ｃ）の形質転換宿主細 胞を平板培養／インキュベートするステップ；及び （ｅ）ステップ（ｄ）の平板培養された形質転換宿主細胞から適切なコロニーを 選択し、発現されたヌクレアーゼの存在についてスクリーニングするステップ を含む前記方法。 ２．インジケーター／レポーター遺伝子に融合したＤＮＡ損傷誘発プロモーター がｄｉｎＤ１::ｌａｃＺである、請求項１に記載の方法。 ３．インジケーター／レポーター遺伝子の発現産物と反応する基質がＸｇａｌで ある、請求項２に記載の方法。 ４．ダークブルーコロニーに対する培地を選抜することによりステップ（ｃ）の 選択を実施する、請求項２に記載の方法。 ５．ヌクレアーゼが制限エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。 ６．宿主細胞が全てのメチル化依存性制限系を欠損している、請求項１に記載の 方法。 ７．ステップ（ｃ）の宿主細胞が大腸菌の株である、請求項１に記載の方法。 ８．宿主細胞が大腸菌ＥＲ１９９２である、請求項１に記載の方法。 ９．インジケーター／レポーター遺伝子に融合したＤＮＡ損傷誘発プロモーター を含み、全てのメチル化依存性制限系が欠損している、ヌクレアーゼをクローン 化するため の宿主細胞。 １０．大腸菌の株である、請求項９に記載の宿主細胞。 １１．大腸菌ＥＲ１９９２である、請求項１０に記載の宿主細胞。 １２．ベクターｐＢｓｏＲ１から得られる、ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼ をコードする単離ＤＮＡ。 １３．ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメントが挿入 されたベクターを含む組換えＤＮＡベクター。 １４．請求項１２に記載の単離ＤＮＡを含むクローニングベクター。 １５．請求項１４に記載のクローニングベクターにより形質転換された宿主細胞 。 １６．ＢｓｏＢＩ制限エンドヌクレアーゼを産生させる方法であって、該エンド ヌクレアーゼの発現に適した条件下に請求項１４に記載のベクターにより形質転 換された宿主細胞を培養することを含む前記方法。 １７．サーマスフィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）から 得られるＤＮＡヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ。 １８．サーマスフィリホルミス制限エンドヌクレアーゼから得られるＤＮＡヌク レアーゼが挿入されたベクターを含む組換えベクター。 １９．請求項１７に記載の単離ＤＮＡを含む組換えベクター。 ２０．請求項１８又は１９に記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細 胞。 ２１．サーマスフィリホルミスから得られるＤＮＡヌクレアーゼを産生させる方 法であって、該ＤＮＡヌクレアーゼの発現に適した条件下に請求項１８又は１９ に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することを含む前記方法 。 ２２．サーマステルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） から得られる、Ｔｔｈ１１１Ｉ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ 。 ２３．Ｔｔｈ１１１Ｉ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡが挿入された ベクターを含む組換えベクター。 ２４．請求項２２に記載の単離ＤＮＡを含む組換えベクター。 ２５．請求項２３又は２４に記載の組換えベクターにより 形質転換された宿主細胞。 ２６．Ｔｔｈ１１１Ｉ制限エンドヌクレアーゼを産生させる方法であって、該エ ンドヌクレアーゼの発現に適した条件下に請求項２３又は２４に記載のベクター により形質転換された宿主細胞を培養することを含む前記方法。 ２７．大腸菌Ｈ７０９ｃから得られる、ＥｃｏＯ１０９１制限エンドヌクレアー ゼをコードする単離ＤＮＡ。 ２８．ＥｃｏＯ１０９１制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡが挿入され たベクターを含む組換えベクター。 ２９．請求項２７に記載の単離ＤＮＡを含む組換えベクター。 ３０．請求項２８又は２９に記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細 胞。 ３１．ＥｃｏＯ１０９１制限エンドヌクレアーゼを産生させる方法であって、該 エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下に請求項２８又は２９に記載のベクタ ーにより形質転換された宿主細胞を培養することを含む前記方法。