DE3802040A1 - System zur positiven selektion rekombinanter dna-molekuele - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein System zur positiven Selektion rekombinanter DNA-Moleküle.

Ein wesentliches Element gentechnologischer Verfahren ist die Konstruktion und Isolierung rekombinanter DNA-Moleküle. Rekombinante DNA-Moleküle werden konstruiert, indem ein Vektor, d. h. ein Phage, wie λ oder M13, oder ein Plasmid, wie pBR322, zunächst mit einer Restriktionsendonuclease gespalten und sodann ein DNA-Fragment, meist mit Hilfe einer DNA-Ligase, eingesetzt wird. Dabei entstehen neben den gewünschten rekombinanten DNA-Molekülen auch unerwünschte DNA-Moleküle, beispielsweise Religierungsprodukte des Vektors, die keine Insertion aufweisen, da sie entweder nicht gespalten wurden oder kein DNA-Fragment aufgenommen haben.

Zur Isolierung der gewünschten rekombinanten DNA-Moleküle ist deshalb ein geeignetes Selektionssystem erforderlich.

Die bekannten Selektionssysteme lassen sich zwei Gruppen zuordnen.

Die negativen Selektionssysteme basieren im wesentlichen darauf, daß der Vektor durch die Insertion eines DNA-Fragments seine Fähigkeit verliert, auf den Wirtsorganismus eine genetische Information zu übertragen, die für das Überleben unter bestimmten Kulturbedingungen erforderlich ist. Beispielsweise überträgt das "Wildtyp"-Plasmid pBR322 die genetische Information für Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenz auf das Wirtsbakterium. Beim Clonieren von DNA-Fragmenten in pBR322 geht entweder die genetische Information für die Tetracyclin- oder für die Ampicillin-Resistenz verloren. Der Nachteil dieser Selektionssysteme besteht darin, daß ihre Durchführung aufgrund des erforderlichen Vergleichs von Phänotypen unter verschiedenen Kulturbedingungen relativ umständlich und zeitaufwendig ist.

Die positiven Selektionsbedingungen basieren im wesentlichen darauf, daß der Vektor durch die Insertion eines DNA-Fragments seine Fähigkeit verliert, die genetische Information für ein eine Farbreaktion hervorrufendes Enzym auf den Wirtsorganismus zu übertragen, das Wachstum des transformierten Wirtsorganismus zu hemmen oder gar den transformierten Wirtsorganismus abzutöten. Der Vorteil dieser positiven Selektionssysteme gegenüber den vorstehend erläutert negativen Selektionssystemen besteht darin, daß die mit rekombinanten Vektoren transformierten Wirtszellen unter gleichen Kulturbedingungen von den mit "Wildtyp"-Vektoren transformierten Wirtszellen unterscheidbar sind. Daher sind positive Selektionssysteme weniger zeitaufwendig und begehrter als negative Selektionssysteme.

Es wurde bereits eine Reihe von DNA-Systemen in der Literatur beschrieben, die die Identifikation oder positive Selektion von rekombinanten DNA-Molekülen ermöglichen. Jedoch weist jedes der beschriebenen Systeme bemerkenswerte Nachteile auf.

Einige der beschriebenen positiven Selektionssysteme beruhen auf der Inaktivierung der alpha-Komplementation der beta- Galactosidase-Aktivität. Beispiele sind die Plasmide der pUC- Reihe; vgl. Yanish-Perron et al., Gene 33 (1985), Seiten 103 bis 119. Bei diesem System werden blaue und weiße Kolonien auf Kulturplatten enthaltend IPTG (Isopropylthiogalactosid) und XGal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-Galactopyranosid) unterschieden, die nicht-rekombinante bzw. rekombinante Plasmide enthalten. Der Nachteil dieser Systeme besteht darin, daß zu ihrer Durchführung die genannten Verbindungen IPTG und XGal unbedingt erforderlich sind. Diese Verbindungen sind jedoch teuer. Außerdem ist die Anwendung dieser Systeme auf spezielle Wirtsstämme beschränkt, die zur α-Komplementation der β-Galactosidaseaktivität in der Lage sind.

Andere der beschriebenen positiven Selektionssysteme beruhen auf der Inaktivierung einer genetischen Information, die für die transformierte Wirtszelle letal ist. Diese Systeme lassen sich aufgrund ihrer unterschiedlichen Selektionsverfahren drei Kategorien zuordnen.

Die erste Kategorie bilden Systeme, bei denen auf einem Plasmid enthaltende Gene inaktiviert werden, deren Produkte für den transformierten Wirtsorganismus letal sind. Beispiele sind Plasmide, die Restriktionsendonuclease-Gene, Phagen-kil-Gene, Colicin-Gene oder eine Reihe anderer Gene tragen, deren Expression unter geeigneten Selektionsbedingungen für den transformierten Wirtsorganismus letal ist.

Die zweite Kategorie bilden Systeme, bei denen auf Plasmiden befindliche Repressor-Gene inaktiviert werden, deren Produkt die Expression eines Gens verhindert, das für das Überleben des transformierten Wirtsorganismus unter geeigneten Selektionsbedingungen essentiell ist.

Die dritte Kategorie bilden Systeme, bei denen DNA-Strukturen desintegriert werden, die eine Plasmid-DNA destabilisieren und dadurch ihre Transformations-Aktivität drastisch reduzieren. Obwohl die meisten der positiven Selektionssysteme dieser drei Kategorien anscheinend die Selektion rekombinanter DNA-Moleküle mit verhältnismäßig guter Ausbeute gestatten, wird keines davon weit verbreitet angewendet. Dafür gibt es mehrere Gründe. Die meisten dieser Systeme weisen lediglich eine oder nur wenige Restriktionsspaltstellen auf, in die sich gewünschte DNA-Fragmente clonieren lassen. Bei vielen dieser Systeme müssen besondere Wirts-Stämme oder spezielle Verbindungen verwendet werden. Außerdem weisen manche dieser Systeme nur eine begrenzte Aufnahmekapazität für DNA-Fragmente auf. Schließlich sind die bei diesen Systemen konstruierten rekombinanten DNA-Moleküle bisweilen instabil.

Deshalb liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein System zur positiven Selektion rekombinanter DNA-Moleküle zu schaffen, bei dem keine speziellen, teuren Substanzen und keine speziellen Wirtsorganismen benötigt werden, das einfach durchführbar und effizient ist, ein breites Spektrum potentieller Clonierungs- bzw. Spaltstellen aufweist, die Clonierung größerer DNA-Fragmente gestattet, und dessen konstruierte rekombinante DNA-Moleküle stabil sind.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen beschriebenen Ausführungsformen gelöst.

Das erfindungsgemäße System zur positiven Selektion weist die folgenden Merkmale auf:

• (1) eine DNA-Sequenz 1, die für ein Protein 1 codiert, das eine DNA-modifizierende Aktivität hat;
• (2) eine DNA-Sequenz 2, die für ein Protein 2 codiert, das selektiv durch Protein 1 modifizierte DNA inaktiviert.
• (3) das zu clonierende DNA-Fragment läßt sich in die DNA-Sequenz 1 oder 2, vorzugsweise in die DNA-Sequenz 1, inserieren.

Wenn das gewünschte, zu clonierende DNA-Fragment in die DNA- Sequenz 1 inseriert werden soll, verläuft die positive Selektion nach folgendem Schema:

Falls die Insertion erfolglos war und der Wirtsorganismus beispielsweise lediglich mit dem religierten Vektor transformiert ist, modifiziert das durch die DNA-Sequenz 1 codierte Protein die Vektor DNA und die DNA des Wirtsorganismus. Diese Modifikation wird vom Protein 2 erkannt, das somit die modifizierte DNA inaktiviert. Dadurch wird die Wirtszelle abgetötet.

Falls die Insertion des gewünschten DNA-Fragments in die DNA- Sequenz 1 erfolgreich war, wird der Wirtsorganismus mit rekombinanter Vektor-DNA transformiert. Aufgrund der Insertion des DNA-Fragments in die DNA-Sequenz 1 unterbleibt die Modifikation der Vektor-DNA und der DNA des Wirtsorganismus. Daher findet das Protein 2 keine Erkennungsstellen vor. Infolgedessen erfolgt auch keine Inaktivierung dieser DNA-Moleküle durch das Protein 2. Der Wirt überlebt.

In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die DNA-Sequenz 1 auf einem Vektor, beispielsweise dem Plasmid pBR322, pBR328 oder dem Phagen M13, und die DNA-Sequenz 2 im Genom der Wirtszelle.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform befinden sich die DNA-Sequenz 1 und die DNA-Sequenz 2 auf einem Vektor. In einer ersten Alternative dieser Ausführungsform befinden sich beide DNA-Sequenzen auf demselben Vektor, während sie sich in einer zweiten Alternative auf unterschiedliche Vektoren befinden.

Bevorzugt werden auch Ausführungsformen, in denen das Protein 1 eine DNA-Methyltransferase, vorzugsweise eine chimäre, von den B. subtilis-Phagen Φ3T und SPR abgeleitete Methyltransferase ist. Ferner werden Ausführungsformen bevorzugt, bei denen das Protein 2 eine Nuclease ist, vorzugsweise die Nuclease rglA, rglB oder mrr aus E. coli.

Eine chimäre, von den B. subtilis-Phagen Φ3T und SPR abgeleitete Methyltransferase wurde bereits von Balganesh et al., EMBO J. 6 (1987), Seiten 3543-3549, beschrieben. Sie methyliert Cytosin-Reste in 5-Stellung in den DNA-Sequenzen GGCC und CCGG.

Die E. coli-Nucleasen rglA und rglB spalten 5-Methylcytosinhaltige DNA (Noyer-Weidner et al., Mol. Gen. Genet. 205 (1986), Seiten 469 bis 475; Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), Seiten 9070 bis 9074). Die E. coli- Nuclease mrr spaltet N6-Methyladenin-haltige DNA (Heitmann und Model, J. Bact. 169 (1983), Seiten 3243-3250).

Außerdem spalten die Nucleasen rglA und rglB Hyroxymethylcytosin- haltige DNA (Revel et al. in "Bacteriophage T4", Matthews, Kutter, Mosig und Berget, Herausgeber, American Society for Microbiology, Washington (1983), Seiten 156 bis 165.

Die Nucleasen rglA und rglB werden von verschiedenen Bereichen des E. coli-Genoms codiert. Mutationen, die zum rglA^--Phänotyp führen, wurden im Bereich von 25,5 Minuten und solche, die zum rglB^--Phänotyp führen, in der Nähe des hsd-Bereichs bei 98,5 Minuten der E. coli K12-Chromosomenkarte gefunden (Revel et al., a.a.O.; Noyer-Weidner et al., a.a.O.). Die Nucleasen rglA und rglB weisen eine Spezifität für unterschiedliche Erkennungsstellen auf. Die Nuclease rglA erkennt CCGG-spezifisch methylierte DNA, d. h. Methylierungen an HpaII-Restriktionsspaltstellen, während die Nuclease rglB eine Reihe von Cytosin- spezifischen Modifikationen erkennt, z. B. CCGG- oder GGCC- spezifisch methylierte DNA (Noyer-Weidner et al., a.a.O., Raleigh und Wilson, a.a.O.).

Besonders bevorzugt werden Ausführungsformen, in denen das erfindungsgemäße System zur positiven Selektion rekombinanter DNA-Moleküle die Kombination einer chimären, von den B. subtilis- Phagen Φ3T und SPR abgeleitete Methyltransferase (Protein 1 bzw. entsprechende DNA-Sequenz 1) mit der rglB-Nuclease aus E. coli (Protein 2 bzw. entsprechende DNA-Sequenz 2) aufweist.

Dabei ist jedoch zu beachten, daß das bei der zum Einsetzen des DNA-Fragments erfolgenden Ligierung anfallende Gemisch aus nicht-rekombinanten und rekombinanten Vektor-DNA-Molekülen vor der Durchführung der positiven Selektion in einem rglB⁺-Stamm von E. coli in einem rglB^--Stamm von E. coli repliziert wird. Andernfalls sind nicht-rekombinante Vektor-DNA-Moleküle bei der positiven Selektion nicht von rekombinanten Vektor-DNA-Molekülen unterscheidbar. Zwar ist bei den rekombinanten DNA-Molekülen die Methyltransferase-Aktivität nicht mehr vorhanden, so daß keine neue Methylierungen mehr erfolgen, jedoch weist die Vektor-DNA noch Methylierungen auf. Diese stammen aus der Präparation der "Wildtyp"-Vektor-DNA, während der die Methyltransferase noch aktiv war. Durch den vorstehend erwähnten Schritt der Replikation in einem rglB^--Stamm gehen diese zunächst noch vorhandenen Methylierungen rekombinanter Vektoren nach und nach verloren.

Aufgrund der noch einfacheren technischen Handhabung werden daher Ausführungsformen besonders bevorzugt, bei denen die Methyltransferase temperatursensitiv ist, d. h. entweder bei niedrigeren oder bei höheren Temperaturen keine biologische Aktivität aufweist.

Ein Beispiel einer temperatursensitiven Methyltransferase ist eine, die bei etwa 42°C inaktiv und bei etwa 30°C aktiv ist. Damit kann auf die als Zwischenschritt erfolgende Replikation der Vektor-DNA in einem rglB^--Wirtsorganismus verzichtet werden. Vielmehr wird zunächst 5-Methylcytosin-freie Vektor-DNA durch eine Züchtung des Wirtsorganismus bei 42°C erhalten. Nach der in vitro Konstruktion rekombinanter Vektor-DNA-Moleküle, die das inserierte DNA-Fragment innerhalb des Methylase- Gens enthalten, werden Wirtsorganismen transformiert und bei 30°C gezüchtet. Dabei überleben nur Wirtsorganismen, die die rekombinanten Vektor-DNA-Moleküle enthalten. Mit religierten "Wildtyp"-Vektor-DNA-Molekülen transformierte Wirtszellen werden eliminiert. Bei 30°C ist die von diesen "Wildtyp"-Vektor- DNA-Molekülen codierte Methylase nämlich aktiv und methyliert die Vektor-DNA und die DNA des Wirtsorganismus. Daraufhin erfolgt eine Inaktivierung der methylierten DNA durch die zweite Komponente des erfindungsgemäßen positiven Selektionssystems, die Nuclease.

Temperatursensitive Methyltransferasen bzw. ihre Gene lassen sich wie nachstehend beschrieben, unter Verwendung des erfindungsgemäßen Selektionssystems herstellen und selektieren. In gleicher Weise lassen sich kältesensitive Methyltransferasen bzw. deren Gene herstellen und selektieren, die im positiven Selektionssystem der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden können.

Erfindungsgemäß werden Ausführungsformen bevorzugt, bei denen der Vektor eines der Plasmide pBN70, pBN71, pBN72 oder pBN73 und die Wirtszelle ein rglB⁺-Stamm, vorzugsweise von E. coli K12, ist.

Erfindungsgemäß werden außerdem Ausführungsformen bevorzugt, bei denen der Vektor das Plasmid pBN74 und die Wirtszelle ein rglB⁺- oder rglB^--Stamm von E. coli K12, E. coli B, E. coli C oder E. coli D, vorzugsweise von E. coli K12, ist. Besonders bevorzugt wird ein rglB^--Stamm von E. coli K12 als Wirtszelle. Das Plasmid pBN74 enthält ein temperatursensitives, chimäres, von den B. subtilis-Phagen Φ3T und SPR abgeleitetes Methyltransferase-Gen; ein 2,6 kb-Fragment aus E. coli K12, das ein Protein mit der biologischen Aktivität der E. coli K12 rglB-Nuclease codiert; sowie das Ampicillinresistenz-Gen aus pBR328.

Somit verläuft die erfindungsgemäße positive Selektion nach dem in der nachfolgenden Tabelle I zusammengefaßten Prinzip:

Tabelle I

Koloniebildung

Die Genealogie der erfindungsgemäßen Plasmide läßt sich wie folgt zusammenfassen: Zunächst wurde das Plasmid pBN70 konstruiert, das die genetische Information für eine temperatursensitive Methyltransferase trägt. Daraus läßt sich durch Deletion eines NruI-Fragments das Plasmid pNN71 erhalten. Durch Elimination der EcoRI-Restriktionsspaltstelle am 3′- Ende des Methyltransferase-Gens von pBN71 wird pBN72 erhalten. Durch den Einbau einer BglII- und einer KpnI-Restriktionsspaltstelle in pBN72 wird pBN73 erhalten. Schließlich wird in pBN73 ein 2,6 kb StuI/HpaII-Fragment aus dem Plasmid pBN99 eingebaut, das die rglB-Nuclease von E. coli K12 codiert; pBN99 besteht aus pBN70 und einen in dessen HpaI-Spaltstelle inserierten 4,3 kb HpaI-DNA-Fragment, das sich von pBg6 ableitet und für die rglB-Nuclease codiert. Das Plasmid pBg6 wurde von Sane und Murray in Mol. Gen. Genet. 180 (1980), Seiten 35-46, beschrieben. Bei dieser Ligierung stumpfer Enden werden die PvuII-, StuI- und HpaII-Restriktionsspaltstellen eliminiert. Es wird das Plasmid pBN74 erhalten.

Somit lassen sich die erfindungsgemäßen Plasmide ausgehend von den Plasmiden pBN70 und pBN99 konstruieren, die am 18. 1. 1988 bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Braunschweig, nach den Vorschriften des Budapester Vertrages unter der Hinterlegungsnummer DSM 4364 bzw. DSM 4363 hinterlegt worden sind.

Aus der nachstehend beschriebenen Abb. 1 ist die Vielzahl der Spaltstellen im Methyltransferase-Gen der erfindungsgemäßen Plasmide ersichtlich, in die sich DNA-Fragmente inserieren lassen.

Durch übliche Techniken, wie gezielte Mutagenese oder den Einbau von Oligonucleotiden in das chimäre, von den B. subtilis- Phagen Φ3T und SPR abgeleitete Methyltransferase-Gen, ohne dabei STOP-Codons zu schaffen oder das Leseraster zu stören, lassen sich weitere, zur Clonierung geeignete Spaltstellen in den erfindungsgemäßen Plasmiden generieren.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1: Restriktionskarten von relevanten Plasmiden. A: pBR328 Derivate pBB20, pBN70, pBN71, pBN72, pBN73 und pBN74, die während der Entwicklung eines auf rglB basierenden Vektorsystems konstruiert wurden. B: pBR322-Derivat pBg6, das als Quelle des rglB codierenden Bereichs dient. Bereiche der Plasmide pBR322 oder pBR328 sind durch einzelne Linien dargestellt, Mtase und rglB codierenden Bereiche als weißer bzw. schraffierter Balken. Relevante Gene sind durch Pfeile bezeichnet. Die Pfeilspitzen geben die Transkriptionsrichtung an. Spaltstellen für die folgenden Enzyme werden angegeben: Ac = AccI. Av = AvaI, Ba = BamHI, Bg = BglII, E = EcoRI, Hi = HindIII, Hp = HpaI, K = KpnI, N = NruI, P = PvuII, Sa = SacI, St = StuI, Xm = XmaIII. Der mit "∆" bezeichnete Bereich ist das 0,8 kb NruI-Fragment, das bei der Konstruktion von pBN71 aus pBN70 deletiert wurde. Die mit "*" bezeichnete EcoRI-Spaltstelle ist die bei der Konstruktion von pBN72 aus pBN71 eliminierte.

Fig. 2: Spaltung von pBB20 und pBN70 mit der Restriktionsendonuclease HaeIII. Die Plasmid-DNAs wurden aus bei den angegebenen Temperaturen gezüchteten Wirtsorganismus gewonnen. Als Molekulargewichtsstandard (MWS) dient mit EcoRI gespaltene SPP1 DNA (Ratcliff et al., Mol. Gen. Genet. 168 (1979), Seiten 165-172).

Fig. 3: Nukleotidsequenz der Mtase codierenden Insertion von pBN72 und pBN73. Die abgebildete angrenzende Sequenz stellt die Sequenz des pBN72 Analogs dar, das für eine nicht mutierte chimäre Φ3T/SPR Mtase codiert. Sie beinhaltet neutrale Mutationen, die von Balganesh et al., EMBO J.6 (1987), Seiten 3543-3549, eingeführt wurden, um einzelne Spaltstellen für Restriktionsenzyme innerhalb des Φ3T und SPR Mtase- Gens zu erzeugen. Der offene Leserahmen des Mtase- Gens ist durch Großbuchstaben angezeigt. Mutationen, die während dieser Studie in das Mtase-Gens eingeführt wurden, um einzelne Spaltstellen für Restriktionsenzyme innerhalb des Φ3T und SPR Mtase- Gens zu erzeugen. Der offene Leserahmen des Mtase- Gens ist durch Großbuchstaben angezeigt. Mutationen, die während dieser Studie in das Mtase-Gens eingeführt wurden, sind unterhalb der Sequenz dargestellt. Dazu gehören die durch einen Punkt dargestellten Hydroxylamin induzierten Mutationen 1, 2 und 3, die für den ts-Phänotyp der pBN72 codierten Mtase verantwortlich sind, und neutrale Mutationen, die durch Oligonukleotidmutagenese eingeführt wurden, um die einzelnen BgIII und KpnI Stellen, die in pBN73 vorhanden sind, zu erzeugen. Einzelne Spaltstellen für relevante Restriktionsenzyme sind durch Klammern angezeigt. Die Nomenklatur der Restriktionsenzyme ist die bei Fig. 1 erläuterte.

Fig. 4: Western-Blot-Analyse von Rohextrakten aus mit den Plasmiden pBN80 bzw. pBN71 transformierten Wirtsorganismen mit anti-SPR-Methyltransferase Antikörpern. pBN80 und pBN71 sind strukturell bis auf die in Fig. 3 angegebenen Punktmutationen identisch, die zur Temperatursensitivität der von pBN71 codierten Methyltransferase führen. Die Rohextrakte wurden aus bei den angegebenen Temperaturen gezüchteten Wirtsorganismen gewonnen. Alle Rohextrakte hatten einen Proteingehalt von etwa 7 mg/ml.

Aufgrund der vorstehend erläuterten Merkmale ist das erfindungsgemäße System zur positiven Selektion den bereits bekannten Systemen überlegen. Beim erfindungsgemäßen System sind keine besonderen Medien oder zusätzliche, teure Verbindungen erforderlich. Durch die große Anzahl von einzeln vorkommenden Restriktionsspaltstellen innerhalb des Methyltransferase- Gens ergibt sich ein weites Spektrum von Clonierungsmöglichkeiten. Im erfindungsgemäßen positiven Selektionssystem lassen sich DNA-Fragmente mit einer Größe von mindestens 8 kb clonieren. Die erfindungsgemäßen Vektoren und die entsprechenden rekombinanten Vektoren sind strukturell stabil. Einige der erfindungsgemäßen positiven Selektionssysteme lassen sich sogar unabhängig vom Genom-Typ des Wirtsorganismus verwenden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Als ergänzende, allgemeine Beschreibung hier verwendeter Clonierungstechniken wird auf T. Maniatis et al., "Molecular Cloning", CSH Laboratory, Cold Spring Habour, New York (1982), verwiesen.

Beispiel 1 Isolierung von pBB20-Derivaten, die für eine temperatursensitive Methyltransferase codieren

Das bei der Konstruktion der chimären Methyltransferase aus den B. subtilis-Phagen Φ3T und SPR geschaffene Plasmid pBB20 (vgl. Balganesh et al., a.a.O.; Fig. 1) wir als Ausgangsmaterial zur Isolierung eines Plasmids verwendet, das eine temperatursensitive Methyltransferase codiert. Das im Plasmid pBB20 enthaltene Methyltransferase-Gen weist bereits eine Reihe von einzelnen Restriktionsendonuclease-Spaltstellen auf, die sich zur Clonierung von DNA-Fragmenten verwenden lassen.

3 µg pBB20 DNA werden in vitro mit Hydroxylamin (HA) mutagenisiert. 1 µg der mutagenisierten DNA wird zur Transformation des rglB^--Stammes E. coli K12 TC600 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten werden bei 42°C selektiert. Unter diesen Bedingungen verlieren Plasmide, die zur dauerhaften oder bedingten Inaktivierung der von pBB20 codierten Methyltransferase führende Mutationen aufweisen, ihre 5-Methylcytosin-Modifikationen. Plasmid-DNA wird aus vereinigten Transformationsreihen von etwa 3 × 10³ Transformanten präpariert. 0,2 µg dieser DNA werden zur Transformation des rglB⁺-Stammes E. coli K12 C600 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten werden nochmals bei 42°C selektiert. Von allen erhaltenen 109 Transformanten werden anschließend Replica- Platten angefertigt, die bei 42°C und bei 30°C inkubiert werden. Neun Kolonien wachsen nur bei 42°C. Dies läßt darauf schließen, daß sie Mutanten des Plasmids pBB20 enthalten, die für eine temperatursensitive Methyltransferase codieren. Aus diesen bei 42°C gezüchteten Transformanten wird Plasmid-DNA präpariert. Diese wird bei der parallelen Transformation der isogenen rglB⁺/^--Stämme E. coli K12 C600 und E. coli K12 TC600 verwendet. Tabelle II zeigt die mit pBN70, dem in den nachfolgenden Beispielen weiter verwendeten Derivat von pBB20, erhaltenen Ergebnisse.

Tabelle II

Transformationsaktivität von pBN70 in isogenen rglB⁺/^--Stämmen

Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß nur Transformanten des rglB^--Stammes E. coli K12 TC600 bei 30°C und bei 42°C heranwachsen. Mit dem rglB⁺-Stamm E. coli K12 C600 werden dagegen nur bei 42°C Transformanten erhalten. Daher ist die temperatursensitive Transformationsaktivität von pBN70 mit dem rglB⁺- Genotyp des transformierten Wirtsorganismus korreliert. Somit beruht sie auf der unterschiedlichen Aktivität der vom Plasmid codierten Methyltransferase. Die Ergebnisse wurden außerdem durch Restriktionsspaltungen von pBN70-DNA bestätigt, die aus bei 42°C bzw. 30°C gezüchteten transformierten Kulturen von E. coli K12 TC600 isoliert wurden. Die Restriktionsspaltung wurde mit HaeIII durchgeführt, das die Sequenz GGCC erkennt. Fig. 2 zeigt die differentielle Sensitivität der pBN70-DNA bei der HaeIII-Restriktionsspaltung. Aus bei 42°C gezüchteten Kulturen gewonnene pBN70-DNA wird durch HaeIII vollständig gespalten. Dagegen weist eine aus bei 30°C gezüchteten Wirtsorganismen isolierte pBN70-DNA eine leichte Teilresistenz gegen die Spaltung mit HaeIII auf. Daraus folgt, daß die Mutation in pBN70 die Aktivität der vom Plasmid codierten Methyltransferase im Vergleich mit pBB20 selbst bei 30°C vermindert. Jedoch ist die bei dieser Temperatur verbleibende Aktivität immer noch ausreichend, um die Transformation eines rglB⁺-Stammes zu verhindern.

pBN70, dessen Restriktionskarte identisch mit der von pBB20 (vgl. Fig. 1) ist, enthält Einzelspaltstellen für vier Restriktionsendonucleasen innerhalb des Methyltransferase- Gens. Dies sind die Restriktionsspaltstellen AccI, HpaI, SacI, und StuI. Um das Spektrum der Clonierungsmöglichkeiten zu erweitern, werden Restriktionsendonuclease-Spaltstellen außerhalb des Methyltransferase-Gens entfernt. Zu diesem Zweck wird das 0,8 kb NruI-Restriktionsfragment am 5′-Ende des Methyltransferase- Gens deletiert und die EcoRI-Restriktionsspaltstelle am 3′-Ende des Methyltransferase-Gens wird eliminiert. Dazu wird pBN71 partiell mit EcoRI gespalten. Linearisierte Moleküle d. h. Moleküle, die nur an einer der beiden EcoRI- Spaltstellen gespalten wurden, werden isoliert. Die 5′ überhängenden Enden werden anschließend unter Verwendung von Desoxynucleotidtriphosphaten und Donor-Polymerase aufgefüllt und religiert. Die religierten Plasmide werden dann in den rglB⁺- Stamm E. coli K12 C600 eingebracht und Transformanten bei 42°C selektiert. Durch Replikaplattierung und Inkubatin der Platten bei 30°C bzw. 42°C wird festgestellt, welche Plasmide nach wie vor für eine ts-DNA-Methyltransferase codieren. Bei ihnen muß die im DNA-Methyltransferase-Gen gelegene EcoRI-Spaltstelle erhalten geblieben sein. Aus einer dieser Transformanten wird pBN72 isoliert, bei dem die 3′ zum DNA-Methyltransferase- Gen gelegene EcoRI-Spaltstelle eliminiert wurde. Durch diese Schritte werden die Plasmide pBN71 bzw. pBN72 erhalten. Außerdem werden die BglII- und die KpnI-Restriktionsspaltstellen in das Gen der temperatursensitiven Methyltransferase durch gezielte Mutagenese eingeführt. Dabei wird das Plasmid pBN73 erhalten (vgl. Fig. 1). Die gezielte Mutagenese unter Verwendung von zwei Oligonucleotiden mit der Sequenz TAGAGAAGATCTGGTTGAAA und CAACTAGGTACCGCACCG läßt die Aminosäuresequenz der Methyltransferase unverändert. Somit weist das Plasmid pBN73 im Bereich des Methyltransferase-Gens neun einzelne Restriktionsendonuclease-Spaltstellen auf. Dazu gehören neben den bereits in pBN70 vorhandenen einzelnen Restriktionsendonuclease-Spaltstellen die BglII-, EcoRI-, HindIII-, KpnI- und die XmaIII-Restriktionsspaltstelle.

Beispiel 2 Charakterisierung der Mutation, die die Temperatursensitivität der von pBN70 und seinen Derivaten codierten Methyltransferase verursacht

Die in pBN70 und seinen Derivaten vorhandene(n) Mutation(en) beeinflußt(en) die Aktivität der Methyltransferase und nicht ihre Expression. Dies läßt sich durch Western Blots nachweisen, in denen anti-SPR-Methyltransferase-Antikörper mit Rohextrakten reagieren, die aus mit pBN71 oder pBN80 transformierten Zellen erhalten werden. pBN80 ist ein dem Plasmid pBN71 entsprechendes Konstrukt, das jedoch das Wildtyp(ts⁺)^-Methyltransferase- Gen trägt (vgl. auch Legende zu Fig. 4).

Eine detaillierte Analyse von aus pBN70 bzw. pBN71 und den entsprechenden Wildtyp-Methyltransferase-Gen-tragenden Plasmiden pBB20 und pBN80 rekonstituierten Plasmiden zeigt, daß der temperatursensitive Phänotyp der mutierten Methyltransferase auf Mutationen in zwei Bereichen beruht. Ein Bereich umfaßt das 669 bp BglII/HpaI-DNA-Fragment von pBN70, das den vom B. subtilis-Phagen Φ3T abgeleiteten NH₂-Terminus der chimären Methyltransferase codiert (vgl. Fig. 1). Der zweite Bereich umfaßt das 366 bp StuI/HindIII-Restriktionsfragment, das einen Teil der chimären Methyltransferase codiert, der vom B. subtilis-Phagen SPR abgeleitet ist (vgl. Fig. 1). Durch Sequenzanalyse konnte gezeigt werden, daß insgesamt drei Mutationen im ts-DNA-Methyltransferase-Gen vorhanden sind. Die Mutationen 1 und 2, die zu Veränderungen von Serin zu Phenylalanin und von Threonin zu Isoleucin an den Aminosäurepositionen 42 und 52 der aus 474 Aminosäuren bestehenden chimären Methyltransferase führen, betreffen den NH₂-terminalen, von Φ3T abgeleiteten Teil des Enzyms. Die Mutation 3, die zu einer Veränderung von Serin zu Phenylalanin an der Aminosäureposition 347 der chimären Methyltransferase führt, betrifft den von SPR abgeleiteten Anteil des Enzyms.

Beispiel 3 rglB-vermittelte positive Selektion rekombinanter DNA-Moleküle mit pBN73 als Vektor

Die vorstehenden Experimente sind die Voraussetzungen zur Etablierung eines Vektors, der die positive Selektion rekombinanter DNA-Moleküle unter Verwendung der Restriktionsaktivität der rglB-Nuclease gestattet. Um die Effizienz dieser Selektion zu testen, wird pBN73 in vitro mit Enzymen gespalten, die im Methyltransferase-Gen schneiden, und in Gegenwart von mit denselben Enzymen gespaltener DNA der Phagen SPP1 (Behrens et al., Mol. Gen. Genet. 175 (1979), Seiten 351 bis 357) oder Φ3T11 (Noyer-Weidner et al., J. Virol. 38 (1981), Seiten 1077 bisa 1080) religiert. Die Ligierungsgemische werden zur Transformation von E. coli K12 C600 verwendet. Ampicillin-resistente Transformaten werden bei 30°C selektiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Die in Tabelle III zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß 74 von insgesamt 80 untersuchten Transformanten rekombinante Derivate von pBN73 enthalten. Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn die Experimente mit pBN72 durchgeführt werden.

Leichte Abweichungen bei der Selektionseffizienz, die in Abhängigkeit vom zur Clonierung verwendeten Restriktionsenzym gefunden werden, können auf Kontaminationen der Enzympräparate mit z. B. unspezifischen Nukleaseaktivitäten zurückzuführen sein.

Bei allen Spaltungen rekombinanter Derivate von pBN73 wird sowohl ein Fragment gefunden, daß in seiner Größe linearisiertem pBN73 entspricht als auch ein Fragment, das sich in den Donor-DNA (SPP1 oder Φ3T11)-Spaltungen nachweisen läßt. Somit sind pBN73 und die davon abgeleiteten rekombinanten Derivate strukturell stabil. Die größten gefundenen Insertionen haben eine Länge von etwa 8 kb.

Beispiel 4 Wirtsorganismus-unabhängige, rglB-vermittelte positive Selektion rekombinanter DNA-Moleküle

Ein eine temperatursensitive Methyltransferase codierendes Plasmid, wie pBN73, gestattet die einfache Clonierung des rglB-Bereichs. Ein Plasmid, das sowohl die temperatursensitive Methyltransferase als auch die rglB-Nuclease codiert, läßt sich in einfacher Weise dadurch identifizieren, daß es das Wachstum von Transformanten eines rglB^--Stammes nur bei 42°C, nicht aber bei 30°C, gestattet. Diese Konstrukte ermöglichen somit die rglB-vermittelte positive Selektion rekombinanter DNA-Moleküle unabhängig vom Genotyp des Wirtsorganismus. Beispielsweise können diese Konstrukte als Clonierungsvektoren verwendet werden, wenn zur Clonierung eines Gens aus bestimmten Gründen ein rglB^--Wirtsorganismus erforderlich ist. Ein weiterer Vorteil dieses Konstrukts ist das Vorliegen des rglB- codierenden Bereichs auf einem Plasmid mit einer hohen Kopienzahl. Dadurch wird der bei der Transformation mit pBN73 erhaltene Hintergrund beseitigt, der auf das Vorkommen spontaner rglB^--Mutanten innerhalb der Population der kompetenten Zellen zurückzuführen ist (Noyer-Weidner et al., a.a.O.). Der rglB- Bereich wird aus dem Plasmid pBN99 erhalten.

pBN99 wurde durch Einbau eines 43, kb HpaI-Fragments von pBg6 (Sane und Murray, a.a.O.), das für die rglB-Nuclease codiert, in die HpaI-Spaltstelle von pBN70 konstruiert.

pBN74 (vgl. Fig. 1) wurde durch Einbau des 2,6 kb HpaI-StuI- Fragments von pBN99, das für die rglB-Nuclease codiert, in die PvuII-Spaltstelle von pNN73 konstruiert.

Das Plasmid pBN74 (vgl. Fig. 1) komplementiert nicht nur die rglB-Defizienz des E. coli K12-Stammes TC600, sondern auch die des Stammes TC410 (Noyer-Weidner et al., a.a.O.). Da in der in pBN74 enthaltenen rglB-Region HindIII- und AccI-Restriktionsspaltstellen enthalten sind, können diese Restriktionsspaltstellen, anders als bei pBN73, nicht mehr zu Clonierung verwendet werden.

Die Effizienz der positiven rglB-vermittelten Selektion rekombinanter DNA-Moleküle mit pBN74 als Vektor läßt sich im wesentlichen wie vorstehend für pBN73 beschrieben, überprüfen. Es wurde außer E. coli K12 C600 auch der rglB^--Stamm E. coli K12 TC600 als Wirtsorganismus bei den Clonierungsexperimenten verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III, siehe oben, zusammengefaßt.

Alle 50 untersuchten Transformanten (10 mit E. coli K12 C600 erhaltene und 40 mit E. coli K12 TC600 erhaltene) enthalten rekombinante Derivate von pBN74. Bei allen Spaltungen wird ein Fragment erhalten, das der Größe von linearisierten pBN74 entspricht und ein Fragment, das sich auch in Donor-DNA-Spaltungen nachweisen läßt. Daraus folgt, daß auch pBN74 ein stabiler Clonierungsvektor ist. Die größte in pBN74 enthaltene Insertion weist eine Länge von etwa 8 kb auf. Dies entspricht dem für pBN73 ermittelten Ergebnis. Aus Tabelle III, oben, ist außerdem ersichtlich, daß bei pBN74 sogar der bei pBN73 noch vorhandene, geringfügige Hintergrund an Transformationsaktivität entfällt.

Claims (11)

1. System zur positiven Selektion rekombinanter DNA-Moleküle, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Merkmale aufweist:

• (1) eine DNA-Sequenz 1 die für ein Protein 1 codiert, das eine DNA modifizierende Aktivität hat;
• (2) eine DNA-Sequenz 2, die für ein Protein 2 codiert, das selektiv durch Protein 1 modifizierte DNA inaktiviert;
• (3) das zu clonierende DNA-Fragment ist in die DNA-Sequenz 1 oder 2 inserierbar.

2. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu clonierende DNA-Fragment in die DNA-Sequenz 1 inserierbar ist und dadurch die Expressin des Protein 1 verhindert und/oder seine DNA-modifizierende Aktivität beseitigt wird.

3. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die DNA-Sequenz 1 auf einem Vektor befindet und die DNA- Sequenz 2 im Genom der Wirtszelle enthalten ist.

4. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die DNA-Sequenz 1 und die DNA-Sequenz 2 auf einem Vektor befinden.

5. System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein 1 eine DNA-Methyltransferase ist.

6. System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein 2 eine Nuclease, wie rglA, rglB oder mrr ist.

7. System nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Methyltransferase eine chimäre, von den B. subtilis-Phagen Φ3T und SPR abgeleitete Methyltransferase und die Nuclease die rglB-Nuclease aus E. coli ist.

8. System nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Methyltransferase temperatursensitiv ist.

9. System nach Anspruch 3 und 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor eines der Plasmide pBN70, pBN71, pBN72 oder pBN73 und die Wirtszelle ein rglB⁺-Stamm von E. coli K12 ist.

10. System nach Anspruch 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor das Plasmid pBN74 und die Wirtszelle ein rglB⁺- oder rglB^--Stamm von E. coli ist.

11. Plasmide pBN70 (DSM 4364), pBN71, pBN72, pBN73 und pBN74.