CN113030471B - 一种酶联比色法测定磷脂酶d酶活性的优化方法 - Google Patents
一种酶联比色法测定磷脂酶d酶活性的优化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113030471B CN113030471B CN202110254896.6A CN202110254896A CN113030471B CN 113030471 B CN113030471 B CN 113030471B CN 202110254896 A CN202110254896 A CN 202110254896A CN 113030471 B CN113030471 B CN 113030471B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reaction
- enzyme
- choline
- solution
- enzyme activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 162
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 162
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 116
- 102000011420 Phospholipase D Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 108090000553 Phospholipase D Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000005457 optimization Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 155
- 229960001231 choline Drugs 0.000 claims abstract description 61
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 61
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims abstract description 56
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 claims abstract description 49
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 49
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 49
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 claims abstract description 49
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 45
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 96
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 41
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 18
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 claims description 17
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 claims description 17
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 claims description 17
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 13
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 13
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 13
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 10
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 7
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010000659 Choline oxidase Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 4
- JQWAHKMIYCERGA-UHFFFAOYSA-N (2-nonanoyloxy-3-octadeca-9,12-dienoyloxypropoxy)-[2-(trimethylazaniumyl)ethyl]phosphinate Chemical compound CCCCCCCCC(=O)OC(COP([O-])(=O)CC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC JQWAHKMIYCERGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 17
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 8
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 8
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 4
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 4
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- NQMRYBIKMRVZLB-UHFFFAOYSA-N methylamine hydrochloride Chemical compound [Cl-].[NH3+]C NQMRYBIKMRVZLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 2
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SOBFHRCMEARKSQ-UHFFFAOYSA-L 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C[N+](C)(C)CCO.C[N+](C)(C)CCO SOBFHRCMEARKSQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000013494 PH determination Methods 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N methane;hydrate Chemical compound C.O VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，一是通过反应体系充分反应，得到待测样品溶液；二是使用全波长酶标仪对待测样品溶液进行吸光度进行检测，得到样品溶液的吸光度值；三是以氯化胆碱物质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并以样品溶液的吸光度值对照标准曲线得到对应胆碱物质的量；四是通过定义酶活并通过公式计算得到酶活数据。本发明中优化了磷脂酶D酶活性测定方法，解决了现有的酶联比色法中关于底物溶解、反应条件、终止反应、以及数据取得的问题，利用该方法测定磷脂酶D的酶活性用时短、操作简便、灵敏度高、重复性好、实用性强，并且确定了反应中所用试剂组成，有望进一步开发形成商品化试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于酶活测定研究领域，涉及一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法。
背景技术
磷脂酶D(phospholipase D，PLD)是催化磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine；PC)生成磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)的酶，该酶属于磷脂酶超家族成员，来源广泛，自然界中许多动植物和微生物如：植物中的大豆和卷心菜、微生物中的链霉菌和酵母等都能产生少量的磷脂酶D；研究表明PS是大脑中调控细胞膜关键蛋白功能状态的磷脂，具有改善大脑机能、帮助恢复脑疲劳的功能，2010年我国已将PS列入新资源食品。
磷脂酶D酶活性的测定一般是依据其催化原理，通过测定磷脂酰胆碱水解反应生成胆碱的量，来定义磷脂酶D的酶活，生成的胆碱可直接或间接测定；其中磷脂酶D催化的机理主要是通过其磷酸二酯酶活性，使特定磷脂发生水解和转酯两种反应；在该酶催化下，磷脂酰胆碱的磷酸酯键可水解生成胆碱和磷脂酸，也可发生转酯反应生成磷脂酰丝氨酸等稀有磷脂。
上述的直接测定方法是利用色谱法定量检测目标物，需要专门的色谱分析仪器和标准品，且操作复杂、费时、费力；而间接测定方法是以胆碱为底物，发生一系列酶联反应后生成颜色物质，然后通过比色法间接测定生成的胆碱量，虽然该方法较为灵敏，但报道的反应体系、反应条件不一，计算方法模糊，重复性较差；而一些商品化试剂盒的价格普遍较高，且对样品的适应性不强，限制了其应用。
因此，研究开发一种方便、准确、高效的磷脂酶D酶活性测定方法成为必要，以酶联比色法测定磷脂酶D酶活性为研究基础，其反应原理如图7所示，在研究过程中发现如下问题：
(1)底物溶解不佳，影响结果准确性，卵磷脂是混合物，其作为底物除参与反应的磷脂酰胆碱外，还包含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和胆碱等物质；在反应过程中选择的溶剂以及溶剂浓度都会影响底物的溶解，并且考虑到酶联反应的特殊性，需要研究溶剂在保证能完全溶解底物的同时须兼顾后续反应的发生，对体系中其它的反应物也要有较好的溶解度的问题。
(2)反应条件需要控制，上述反应原理其中包含了酸性的催化反应体系酸性和碱性的显色反应体系碱性，那么温度、PH、不同金属离子对酶活测定反应均有影响。
(3)磷脂酶D水解反应需要严格控制反应时间，因此需要及时终止反应。常见终止酶促反应方法有沸水浴、高盐失活、酶抑制剂等；沸水浴使酶失活，但同时产生钙盐沉淀，且胆碱在高热下易分解，会影响后续显色反应；酶抑制剂可以抑制酶促反应，但抑制剂的加入量无法确定，过少不能完全终止，过量又会抑制显色反应。
(4)最终酶活数据的取得，需要确定的计算公式进行，而现有的酶活定义公式无法快速、准确的计算出酶活数据，因此需要对磷脂酶D酶活性进行定义，进而标曲绘制及公式计算。
发明内容
本发明的目的在于研究建立一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，并对其测定条件、测定步骤进行优化，使得方法可复制，以及数据准确，解决酶联比色法测定中底物溶解效果差，反应条件控制不佳对反应影响大，终止反应限制不明以及数据取得准确性不高的问题，同时为开发酶活测定试剂盒形成科研雏形，并为确定且配套的试剂盒使用方法奠定科研基础。
本发明采用的技术方案如下：
一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，具体包括如下步骤：
步骤一，反应体系充分反应，
催化反应：反应液A中加入200μL试剂A，37℃、200rpm摇床预混合5min，加入30-100μL稀释后的待测酶液继续反应10-30min；催化反应的反应液总量为500μL,以反应液A补足；
终止催化反应：加200μL反应终止液C至催化反应体系，70℃水浴15min，4℃、10000rpm离心取上清；
显色反应：取2.2mL反应液B加入650μL离心后上清并混匀，加入100μL试剂B，50μL试剂C，2U胆碱氧化酶，2U过氧化氢酶，放入摇床37℃、200rpm反应60min，待显色反应稳定，制得待测样品溶液；显色反应的反应液总量为3mL。
步骤二，吸光度的检测，
使用全波长酶标仪进行吸光度进行检测；取0.1mL步骤一所得的待测样品溶液加入96孔酶标板在500nm波长处检测吸光度值，每个样品做3组平行，并计算均值和方差；
步骤三，标准曲线的绘制，
制备1mg/mL氯化胆碱母液，分别取不同体积的该母液加去离子水配成0-2μmol的标准溶液；同时以去离子水为空白对照；以氯化胆碱物质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程；
步骤四，酶活计算，
酶活力即酶促反应的转化速率，可以用单位时间内单位体积中底物的减少量和产物的增加量来表示；
酶活力计算如下式所示：
酶活力(U/mL)＝D×n胆碱/(t×V酶液)
式中：D为酶液稀释倍数；
n胆碱为标曲吸光度所对应氯化胆碱物质的量；
t为磷脂酶D水解时间；
V酶液为所取酶液体积。
步骤一中所用的试剂A、试剂B、试剂C、反应液A、反应液B以及反应终止液C为试剂盒雏形，具体组成如下：
其中，所述试剂A具体是90％以上的蛋黄卵磷脂用80％的乙醇充分溶解制得。
步骤一中反应体系的反应条件为优化成果，即在37℃，pH5.5，10mmol CaCl2条件下进行催化反应，加入反应终止液终止催化反应，在37℃，pH8.0进行显色反应。
步骤二吸光度检测中，通过适当调整步骤一中反应液B的体积，从而改变显色反应体系，使得该体系对应的标准曲线测得的最大吸光度值在1附近，并且是吸光度不再变化的临界点，该临界点对应的氯化胆碱物质的量为催化反应生成胆碱的最大量，此时达到对胆碱显色反应检测的上限；若检测过程中出现吸光度值为1的情况，应稀释待测样品酶液，重新检测。
步骤四中的计算方法是通过定义在特定温度和PH下，磷脂酶D每min催化卵磷脂水解生成1μmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位；
得到酶活力定义如式(1)所示：
酶活力/(U/mL)＝(m氯化胆碱×1000×D)/(M氯化胆碱×t×V酶液)(1)
式中：m氯化胆碱为氯化胆碱的质量/mg；M氯化胆碱为氯化胆碱的摩尔质量139.9g/mol；D为稀释倍数；t为催化反应的反应时间/min；V酶液为酶液体积/mL；
在结合实际操作得到计算如式(2)所示：
酶活力(U/mL)＝D×n胆碱/(t×V酶液)(2)
式中：D为酶液稀释倍数；n胆碱为标曲吸光度所对应氯化胆碱物质的量；t为磷脂酶D水解时间；V酶液为所取酶液体积。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中优化了磷脂酶D酶活性测定方法，解决了现有的酶联比色法中关于底物溶解、反应条件、终止反应、以及数据取得的问题，确定了酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的最佳参数，即将纯度为90％以上的蛋黄卵磷脂用80％的乙醇充分溶解，在37℃，pH5.5，10mmol CaCl2条件下进行催化反应，通过加入反应终止液终止反应，在37℃，pH8.0进行显色反应；以稳定的氯化胆碱做出标准曲线，并根据标准曲线吸光度值的临界点调整显色体系总量及试剂用量，进而确定最佳检测反应体系；避免了因吸光度值超出科学检测范围而不可信，保证了数据的稳定性和准确性，从而保证了计算的准确性和实验的重复性。
2、利用该方法测定磷脂酶D的酶活性用时短、操作简便、灵敏度高、重复性好、实用性强，并且确定了反应中试剂A、试剂B、试剂C、反应液A、反应液B以及反应终止液C的试剂组成，准备便捷且使用方便，有望进一步开发形成商品化试剂盒。
3、本发明中对底物溶解进行了优化研究，确定了用80％乙醇对90％以上的高纯度卵磷脂做底物，底物选择和溶剂的选择使得底物在反应中充分反应，进而保证了后续数据的准确性。
4、本发明中对反应条件进行了优化研究，主要针对磷脂酶D催化卵磷脂水解生成胆碱的反应进行优化分析，最优结果是在37℃，PH为5.5条件下进行催化反应，同时加入10mmol的CaCl2作为金属离子助剂，可达到最佳反应效果。
5、本发明中对终止反应液C进行了优化，选用了EDTA用作钙离子的螯合剂，磷脂酶D水解反应需要钙离子的存在，故而可以用于终止反应；16-烷基-3甲基氯化铵用作阳离子表面活性剂，与钙离子有良好的配伍性，可以更有效地抑制磷脂酶D水解反应，并且反应温和，不会影响后续的显色反应。
6、本发明中对磷脂酶D酶活性进行了定义，通过标曲绘制确定了检测上限，并且依照计算公式的优化，使得根据测定方法操作后，能够快速的计算出酶活数值，具体是结合测定方法中测定的吸光度值，对比标准曲线得到产生胆碱物质的量，并以胆碱物质的量进行计算，进而提高了酶活测定的科学性和准确性。
附图说明
图1为溶剂中乙醇含量与相对酶活力变化折线图；
图2为不同来源及纯度的卵磷脂与相对酶活力关系柱状图；
图3为不同温度对酶活测定反应的影响折线图；
图4为不同PH对酶活测定反应的影响折线图；
图5为不同金属离子对酶活测定反应的影响折线图；
图6为以氯化胆碱含量绘制标准曲线示意图；
图7为酶联比色法测定磷脂酶D酶活性反应原理示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，具体包括如下步骤：
步骤一，反应体系充分反应：
催化反应：反应液A中加入200μL试剂A，37℃、200rpm摇床预混合5min，加入30-100μL稀释后的待测酶液继续反应10-30min；催化反应的反应液总量为500μL,以反应液A补足。
终止催化反应：加200μL反应终止液C至催化反应体系，70℃水浴15min，4℃、10000rpm离心取上清。
显色反应：取2.2mL反应液B加入650μL离心后上清并混匀，加入100μL试剂B，50μL试剂C，2U胆碱氧化酶，2U过氧化氢酶，放入摇床37℃、200rpm反应60min，待显色反应稳定，制得待测样品溶液；显色反应的反应液总量为3mL。
其中所用的试剂A、试剂B、试剂C、反应液A、反应液B以及反应终止液C为试剂盒雏形，具体组成如下表所示：
上表中的试剂A作为反应体系中底物溶剂，是通过多种溶剂和多种底物的筛选所得的，是优选试剂。
上表中的反应液A是优化了催化反应的反应条件，得到的优化成果；具体的，反应条件的优化结果是在37℃，pH5.5，10mmol CaCl2条件下进行催化反应。
上表中的反应液B是保证显色反应的碱性条件，而添加的pH调节试剂。
上表中的反应液C是优化了终止反应的手段，得到的优化成果。
步骤二，吸光度的检测：
使用全波长酶标仪进行吸光度进行检测；取0.1mL步骤一所得的待测样品溶液加入96孔酶标板在500nm波长处检测吸光度值，每个样品做3组平行，并计算均值和方差。
由于试剂来源和检测设备的差异，应根据具体情况对显色反应体系大小进行适当调整，在吸光度检测中，通过适当调整步骤一中反应液B的体积，从而改变显色反应体系，使得该体系对应的标准曲线测得的最大吸光度值在1附近，并且这里是吸光度不再变化的临界点，该临界点对应的氯化胆碱物质的量为催化反应生成胆碱的最大量，此时达到对胆碱显色反应检测的上限；若检测过程中出现吸光度值为1的情况，应稀释待测样品酶液，重新检测。
步骤三，标准曲线的绘制，
制备1mg/mL氯化胆碱母液，分别取不同体积的该母液加去离子水配成0-2μmol的标准溶液；同时以去离子水为空白对照；以氯化胆碱物质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程。
以步骤二测得的吸光度值带入到图6的标准曲线进行对比，即可得到标曲吸光度所对应氯化胆碱物质的量。
胆碱作为定义磷脂酶D酶活性的产物，是整个酶联反应的关键，但由于胆碱极易吸收二氧化碳和水，且遇热分解，在酸性的反应体系中会生成更稳定的氯化胆碱；因此，最终选择氯化胆碱代替胆碱绘制标准曲线。
步骤四，酶活计算，
酶活力即酶促反应的转化速率，可以用单位时间内单位体积中底物的减少量和产物的增加量来表示；
根据酶活力的定义，结合上述步骤得到酶活力计算如下式所示：
酶活力(U/mL)＝D×n胆碱/(t×V酶液)
式中：D为酶液稀释倍数；
n胆碱为标曲吸光度所对应氯化胆碱物质的量；
t为磷脂酶D水解时间；
V酶液为所取酶液体积。
通过本实施例中共四个步骤的测定方法，能够保证磷脂酶D的催化反应完全，终止催化反应迅速，且不会影响后续的显色反应；并且将参与反应体系的物质组成形成进行了细化和区分，方便提前准备，可视为酶活测定试剂盒雏形，利于反应体系重复操作而结果统一；本实施例中的操作方法、试剂用量以及反应条件均采用效果最优处理，以方便吸光度测定，并确定了该体系的理论检测上限，并根据检测上限确定了反应体系中反应液用量，同样保证了测定吸光度值的准确；本实施例中以氯化胆碱量进行标准曲线的绘制，可避免胆碱分解等不稳定因素，用于标准曲线确定测定吸光度值对应的氯化胆碱物质的量，并用于计算。
实施例1
根据总述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，选取重组链霉菌在培养基中发酵所得的磷脂酶D酶液作为样品，其中酶液样品不稀释直接备用，按照步骤进行具体操作。
步骤一，反应体系充分反应，
催化反应：270μL反应液A中加入200μL试剂A，37℃、200rpm摇床预混合5min，直接加入30μL酶液样品继续反应30min。
终止催化反应：加200μL反应终止液C至催化反应体系，70℃水浴15min，4℃、10000rpm离心取上清。
显色反应：取2.2mL反应液B加入650μL离心后上清并混匀，加入100μL试剂B，50μL试剂C，2U胆碱氧化酶，2U过氧化氢酶，放入摇床37℃、200rpm反应60min，待显色反应稳定，制得待测样品溶液。
步骤二，吸光度的检测，
取0.1mL步骤一所得的待测样品溶液，使用全波长酶标仪在500nm波长处检测吸光度值，做3组平行，并计算均值为和方差，得到准确测定的吸光度值为0.57；
步骤三，标准曲线的绘制，
制备1mg/mL氯化胆碱母液，分别取不同体积的该母液加去离子水配成0-2μmol的标准溶液；同时以去离子水为空白对照；以氯化胆碱物质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程，如图6所示；
用步骤二测定的吸光度值0.57；标准曲线的回归方程为y＝0.4618x+0.0428，对应的氯化胆碱物质的量为1.14μmol。
步骤四，酶活计算，
酶活力即酶促反应的转化速率，可以用单位时间内单位体积中底物的减少量和产物的增加量来表示；
酶活力计算如下式所示：
酶活力(U/mL)＝D×n胆碱/(t×V酶液)
式中：D＝1，n胆碱＝1.14μmol，t＝30min,，V酶液＝30uL＝0.03mL
此项酶液样品的酶活力通过计算，具体酶活力数值为0.12U/mL。
实施例2
根据总述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，选取重组链霉菌在培养基中发酵所得的磷脂酶D酶液作为样品，其中酶液样品稀释10倍备用，按照步骤进行具体操作。
步骤一，反应体系充分反应，
催化反应：200μL反应液A中加入200μL试剂A，37℃、200rpm摇床预混合5min，直接加入100μL稀释后的酶液样品继续反应10min。
终止催化反应：加200μL反应终止液C至催化反应体系，70℃水浴15min，4℃、10000rpm离心取上清。
显色反应：取2.2mL反应液B加入650μL离心后上清并混匀，加入100μL试剂B，50μL试剂C，2U胆碱氧化酶，2U过氧化氢酶，放入摇床37℃、200rpm反应60min，待显色反应稳定，制得待测样品溶液。
步骤二，吸光度的检测，
取0.1mL步骤一所得的待测样品溶液，使用全波长酶标仪在500nm波长处检测吸光度值，做3组平行，并计算均值为和方差，得到准确测定的吸光度值为0.63；
步骤三，标准曲线的绘制，
制备1mg/mL氯化胆碱母液，分别取不同体积的该母液加去离子水配成0-2μmol的标准溶液；同时以去离子水为空白对照；以氯化胆碱物质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程，如图6所示；
用步骤二测定的吸光度值0.63；标准曲线的回归方程为y＝0.4618x+0.0428，对应的氯化胆碱物质的量为1.26μmol。
步骤四，酶活计算，
酶活力即酶促反应的转化速率，可以用单位时间内单位体积中底物的减少量和产物的增加量来表示；
酶活力计算如下式所示：
酶活力(U/mL)＝D×n胆碱/(t×V酶液)
式中：D＝10，n胆碱＝1.26μmol，t＝10min,，V酶液＝100μL＝0.1mL
此项酶液样品的酶活力通过计算，具体酶活力数值为12.6U/mL。
实施例3
根据总述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，选取重组链霉菌在培养基中发酵所得的磷脂酶D酶液作为样品，其中酶液样品稀释20倍备用，按照步骤进行具体操作。
步骤一，反应体系充分反应，
催化反应：200μL反应液A中加入200μL试剂A，37℃、200rpm摇床预混合5min，直接加入100μL稀释后的酶液样品继续反应15min。
终止催化反应：加200μL反应终止液C至催化反应体系，70℃水浴15min，4℃、10000rpm离心取上清。
显色反应：取2.2mL反应液B加入650μL离心后上清并混匀，加入100μL试剂B，50μL试剂C，2U胆碱氧化酶，2U过氧化氢酶，放入摇床37℃、200rpm反应60min，待显色反应稳定，制得待测样品溶液。
步骤二，吸光度的检测，
取0.1mL步骤一所得的待测样品溶液，使用全波长酶标仪在500nm波长处检测吸光度值，做3组平行，并计算均值为和方差，得到准确测定的吸光度值为0.32；
步骤三，标准曲线的绘制，
制备1mg/mL氯化胆碱母液，分别取不同体积的该母液加去离子水配成0-2μmol的标准溶液；同时以去离子水为空白对照；以氯化胆碱物质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程，如图6所示；
用步骤二测定的吸光度值0.32；标准曲线的回归方程为y＝0.4618x+0.0428，对应的氯化胆碱物质的量为0.6μmol。
步骤四，酶活计算，
酶活力即酶促反应的转化速率，可以用单位时间内单位体积中底物的减少量和产物的增加量来表示；
酶活力计算如下式所示：
酶活力(U/mL)＝D×n胆碱/(t×V酶液)
式中：D＝20，n胆碱＝0.6μmol，t＝15min,，V酶液＝100μL＝0.1mL
此项酶液样品的酶活力通过计算，具体酶活力数值为8U/mL。
实施例4
在总述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法中提到底物溶剂是优化后的最佳方式，优选使用80％乙醇对底物溶解效果最好，优选使用蛋黄来源的90％以上的高纯度卵磷脂做底物，其中底物溶剂优化的具体方式如下：
一是溶剂的优化：
选择不同的有机试剂作溶剂配制底物溶液，再分别进行酶活测定实验，观察溶解情况及反应颜色变化，得到的结果如下表所示。
分析上表发现简单醇类对卵磷脂溶解度较好，甲醇、乙醇、乙醇水溶液这3种溶剂对卵磷脂溶解情况最佳，颜色变化也相对更明显。由于反应在水相中进行，而卵磷脂，胆碱，苯醌，都能溶于乙醇，因此考虑选择乙醇水溶液作为底物溶剂。
对其中效果较好的乙醇溶液进一步优化：以乙醇含量为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的乙醇溶液作溶剂进行酶活测定，每组测3个平行，规定最高酶活力为100％，以相对酶活力作图，如图1所示。
图1的结果显示，在底物溶剂的实验中，去离子水作为溶剂效果并不好，以30％乙醇溶液为最低浓度，随着乙醇占比增高，酶活也逐渐增高，在80％乙醇溶液处最高点后又逐渐下降。
二是底物来源及纯度优化：
选择不同纯度的卵磷脂配制底物溶液进行酶活测定，即1、2、3组分别是磷脂酰胆碱含量为70％、80％、90％的卵磷脂，每组测3个不同来源的平行，这3个平行项目分别为大豆来源、蛋黄来源以及链霉菌来源，规定最高酶活力为100％，以相对酶活力作图，如图2所示。
图2为不同来源、不同纯度的卵磷脂对酶活测定的影响结果，其中磷脂酰胆碱含量为70％、80％、90％，其中链霉菌属来源的卵磷脂酶活力最高，大豆来源的最低；比较发现含量为90％的磷脂酰胆碱都有较理想的效果；而70％、80％纯度则相对误差较大，其中蛋黄来源的低纯度酶活水平变化并不明显，高纯度酶活水平与链霉菌属接近且有价格优势。综合考虑选择蛋黄来源的、90％以上的高纯度卵磷脂做底物。
实施例5
在总述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法中提到反应条件的优化方法，主要针对磷脂酶D催化卵磷脂水解生成胆碱的反应进行优化，反应条件包括温度、PH、不同金属离子，最优结果是在37℃，PH为5.5条件下进行催化反应，同时加入10mmol的CaCl2作为金属离子助剂，可达到最佳反应效果。
反应最适温度测定：分别设置30、37、44、51、58、65、72℃为反应温度进行酶活力测定；每组测3个平行，规定最高酶活力为100％，以相对酶活力作图，如图3所示，温度在37℃时酶活力最佳。
反应最适PH测定：将磷脂酶D在不同的PH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)下进行酶活力测定；每组测3个平行，规定最高酶活力为100％，以相对酶活力作图，如图4所示，PH为5.5时酶活力最佳。
金属离子的影响：分别加入终浓度为10mmol/L的金属离子盐溶液，分别为FeCl3、FeSO4、CuCl2、ZnCl2、NaCl、KCl、MnCl2、MgCl2、CaCl2进行酶活力测定；每组测3个平行，规定最高酶活力为100％，以相对酶活力作图，如图5所示，优选CaCl2作为金属离子助剂。
实施例6
在总述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法中提到终止反应手段的优化方式，具体是选用了EDTA用作钙离子的螯合剂，磷脂酶D水解反应需要钙离子的存在，故而可以用于终止反应；16-烷基-3甲基氯化铵用作阳离子表面活性剂，与钙离子有良好的配伍性，可以更有效地抑制磷脂酶D水解反应，并且反应温和，不会影响后续的显色反应。
另外显色反应需要在碱性条件下进行，确定终止反应液用量为0.1mol/L、PH8.0的Tris-HCl；10mmol/L EDTA和1％(W/V)16-烷基-3-甲基氯化铵。
实施例7
另外在总述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法中还进行了关于磷脂酶D酶活性定义、标曲绘制及公式计算的优化，具体是按照如下方式进行：
定义在特定温度和PH下，磷脂酶D每min催化卵磷脂水解生成1μmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
酶活力定义如式(1)所示：
酶活力/(U/mL)＝(m氯化胆碱×1000×D)/(M氯化胆碱×t×V酶液)(1)
式中：m氯化胆碱为氯化胆碱的质量/mg；M氯化胆碱为氯化胆碱的摩尔质量139.9g/mol；D为稀释倍数；t为催化反应的反应时间/min；V酶液为酶液体积/mL。
根据酶活力定义内容，结合实际操作得到计算如式(2)所示：
酶活力(U/mL)＝D×n胆碱/(t×V酶液)(2)
式中：D为酶液稀释倍数；n胆碱为标曲吸光度所对应氯化胆碱物质的量；t为磷脂酶D水解时间；V酶液为所取酶液体积。
本实施例通过定义酶活，使得酶活数据统一，并且给出了酶活的计算方法，可更好的适用于实施例1的规定反应量的反应体系，从而配合实施例1中的试剂盒雏形和体系中的操作方法，精准的获取酶活数据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤一，反应体系充分反应，
催化反应：反应液A中加入200μL试剂A，37℃、200rpm摇床预混合5min，加入30-100μL稀释后的待测酶液继续反应10-30min；催化反应的反应液总量为500μL,以反应液A补足；
终止催化反应：加200μL反应终止液C至催化反应体系，70℃水浴15min，4℃、10000rpm离心取上清；
显色反应：取2.2mL反应液B加入650μL离心后上清并混匀，加入100μL试剂B，50μL试剂C，2U胆碱氧化酶，2U过氧化氢酶，放入摇床37℃、200rpm反应60min，待显色反应稳定，制得待测样品溶液；显色反应的反应液总量为3mL；
步骤二，吸光度的检测，
使用全波长酶标仪进行吸光度进行检测；取0.1mL步骤一所得的待测样品溶液加入96孔酶标板在500nm波长处检测吸光度值，每个样品做3组平行，并计算均值和方差；
步骤三，标准曲线的绘制，
制备1mg/mL氯化胆碱母液，分别取不同体积的该母液加去离子水配成0-2μmol的标准溶液；同时以去离子水为空白对照；以氯化胆碱物质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程；
步骤四，酶活计算，
酶活力即酶促反应的转化速率，可以用单位时间内单位体积中底物的减少量和产物的增加量来表示；
酶活力计算如下式所示：
酶活力(U/mL)＝D×n胆碱/(t×V酶液)
式中：D为酶液稀释倍数；
n胆碱为标曲吸光度所对应氯化胆碱物质的量；
t为磷脂酶D水解时间；
V酶液为所取酶液体积；
步骤一中所用的试剂A、试剂B、试剂C、反应液A、反应液B以及反应终止液C为试剂盒雏形，具体组成如下：
所述试剂A具体是90％以上的蛋黄卵磷脂用80％的乙醇充分溶解制得；
步骤一中反应体系的反应条件为，在37℃，pH5.5，10mmol CaCl2条件下进行催化反应，加入反应终止液终止催化反应，在37℃，pH8.0进行显色反应；
步骤二吸光度检测中，通过适当调整步骤一中反应液B的体积，从而改变显色反应体系，使得该体系对应的标准曲线测得的最大吸光度值在1附近，并且是吸光度不再变化的临界点，该临界点对应的氯化胆碱物质的量为催化反应生成胆碱的最大量，此时达到对胆碱显色反应检测的上限；若检测过程中出现吸光度值为1的情况，应稀释待测样品酶液，重新检测。
2.根据权利要求1所述的一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，其特征在于，步骤四中的计算方法是通过定义在特定温度和PH下，磷脂酶D每min催化卵磷脂水解生成1μmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位；
得到酶活力定义如式(1)所示：
酶活力/(U/mL)＝(m氯化胆碱×1000×D)/(M氯化胆碱×t×V酶液) (1)
式中：m氯化胆碱为氯化胆碱的质量/mg；M氯化胆碱为氯化胆碱的摩尔质量139.9g/mol；D为稀释倍数；t为催化反应的反应时间/min；V酶液为酶液体积/mL；
在结合实际操作得到计算如式(2)所示：
酶活力(U/mL)＝D×n胆碱/(t×V酶液) (2)
式中：D为酶液稀释倍数；n胆碱为标曲吸光度所对应氯化胆碱物质的量；t为磷脂酶D水解时间；V酶液为所取酶液体积。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110254896.6A CN113030471B (zh) | 2021-03-09 | 2021-03-09 | 一种酶联比色法测定磷脂酶d酶活性的优化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110254896.6A CN113030471B (zh) | 2021-03-09 | 2021-03-09 | 一种酶联比色法测定磷脂酶d酶活性的优化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113030471A CN113030471A (zh) | 2021-06-25 |
| CN113030471B true CN113030471B (zh) | 2024-01-26 |
Family
ID=76467203
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110254896.6A Active CN113030471B (zh) | 2021-03-09 | 2021-03-09 | 一种酶联比色法测定磷脂酶d酶活性的优化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113030471B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4135980A (en) * | 1976-04-26 | 1979-01-23 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Choline oxidase |
| CN103102451A (zh) * | 2012-12-11 | 2013-05-15 | 宜兴市军达浆料科技有限公司 | 一种抗老化阳离子接枝高性能淀粉及其制备方法 |
| CN104155291A (zh) * | 2014-05-19 | 2014-11-19 | 上海大学 | 一种磷脂酶Dα活性的测定方法 |
| CN107384844A (zh) * | 2017-07-20 | 2017-11-24 | 江南大学 | 一种产磷脂酶d的重组大肠杆菌及其应用 |
| CN111051505A (zh) * | 2018-12-29 | 2020-04-21 | 邦泰生物工程(深圳)有限公司 | 一种磷脂酶d突变体、其应用及其制备磷酯酰丝氨酸的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2002053569A1 (ja) * | 2000-12-28 | 2004-05-13 | 株式会社アズウェル | リゾホスホリパーゼｄ活性測定方法 |
-
2021
- 2021-03-09 CN CN202110254896.6A patent/CN113030471B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4135980A (en) * | 1976-04-26 | 1979-01-23 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Choline oxidase |
| CN103102451A (zh) * | 2012-12-11 | 2013-05-15 | 宜兴市军达浆料科技有限公司 | 一种抗老化阳离子接枝高性能淀粉及其制备方法 |
| CN104155291A (zh) * | 2014-05-19 | 2014-11-19 | 上海大学 | 一种磷脂酶Dα活性的测定方法 |
| CN107384844A (zh) * | 2017-07-20 | 2017-11-24 | 江南大学 | 一种产磷脂酶d的重组大肠杆菌及其应用 |
| CN111051505A (zh) * | 2018-12-29 | 2020-04-21 | 邦泰生物工程(深圳)有限公司 | 一种磷脂酶d突变体、其应用及其制备磷酯酰丝氨酸的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 蛋白质工程改造磷脂酶 D 提高磷脂酰丝氨酸产量;冯小娜 等;《食品工业科技》;第40卷(第17期);第98-108页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113030471A (zh) | 2021-06-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abdelrazig et al. | Metabolic characterisation of Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 using LC-MS-based metabolite profiling | |
| Bisswanger | Enzyme assays | |
| US3977944A (en) | Enzyme-kinetic determination of the concentration of a substrate | |
| Vazquez et al. | Determination of phosphate in nanomolar range by an enzyme-coupling fluorescent method | |
| CN113030471B (zh) | 一种酶联比色法测定磷脂酶d酶活性的优化方法 | |
| Bell et al. | Characterization of slowly interconvertible states of phosphoribosyladenosine triphosphate synthetase dependent on temperature, substrates, and histidine | |
| CN101403691A (zh) | 一种三聚氰胺或三聚氰酸的测定方法及它的试剂盒或试纸条 | |
| CN1896271B (zh) | 血清钾离子酶法测定试剂 | |
| CN112126674A (zh) | 一种尿素检测试剂盒、其制备方法和使用方法 | |
| EP2460888B1 (en) | Method and kit for measurement of dehydrogenase or substrate for the dehydrogenase | |
| Fossati | Phosphate determination by enzymatic colorimetric assay | |
| JPH02104298A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 | |
| CN105543337A (zh) | 一种5’-核苷酸酶检测试剂盒及其制备方法 | |
| Hamilton et al. | Quantitation of lactate by a kinetic method with an extended range of linearity and low dependence on experimental variables. | |
| FR2540137A1 (fr) | Procede tres sensible d'analyse quantitative enzymatique | |
| Ellis et al. | The interaction of europium (III) ion with nucleotides | |
| Lad et al. | Properties of rabbit muscle phosphofructokinase modified with 7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazole | |
| CN109521013A (zh) | 一种游离脂肪酸检测试剂盒及生产工艺 | |
| SU1449588A1 (ru) | Способ определени активности щелочной фосфатазы | |
| Trinder et al. | The determination of L-aspartate: 2-oxoglutarate aminotransferase in serum | |
| CN111690715A (zh) | 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其测定方法 | |
| CN111534567B (zh) | 一种焦磷酸酶活性检测方法 | |
| CN114624205B (zh) | 一种碱性磷酸酶的检测方法 | |
| JP2618456B2 (ja) | ジヌクレオチドの定量法 | |
| JPH09187295A (ja) | 酵素活性測定方法およびその装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |