JPWO2002053569A1 - リゾホスホリパーゼd活性測定方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、一般式(I)(式中、R1とR2は互いに異なり、その一方は飽和又は不飽和の炭素数8から22の脂肪酸残基であり、その一方は水素原子またはアセチル基であり、Xは発色基である)で表わされるリゾリン脂質、および当該リン脂質を基質として用いることを特徴とするリゾホスホリパーゼDの活性測定方法、リゾホスホリパーゼDの活性を阻害する物質のスクリーニング方法ならびにそれらの方法に有用な試薬、試薬キットを提供し、本発明の新規リゾリン脂質を基質として使用することにより、特異的、且つ高感度のリゾホスホリパーゼD活性測定が可能となる。また、安全で簡易に検出可能な発色基を使用することにより、多数の試料を迅速に測定することが可能となる。
Description
技術分野
本発明は、新規リゾリン脂質、当該リゾリン脂質を含有するリゾホスホリパーゼD活性測定用試薬、および当該リゾリン脂質を用いることを特徴とするリゾホスホリパーゼD活性の測定方法に関する。さらに本発明は該方法を利用するリゾホスホリパーゼD活性を阻害する物質のスクリーニング方法ならびにその為のキットに関する。
背景技術
ホスホリパーゼD(以下PLDともいう)は、リン脂質のリン酸ジエステル結合のうちグリセロール骨格とは反対側の結合を切断する酵素である。PLDの中で、特にリゾリン脂質を基質とするものは、リゾホスホリパーゼD(以下LPLDともいう)と呼ばれ区別されている。以前から動物の組織中にLPLDが存在することが報告されており(Wykle RLら、Arch.Biochem.Biophys.184,149−155,1977;Kawasaki T.ら、Biochim.Biophys.Acta 920,85−93,1987)、さらには組織だけでなく、ラットの血漿(Tokumura A.ら、Lipids 33,1009−1015,1998)、ヒト血清(徳村彰ら、脂質生化学研究42,41−44,2000)においてもその存在が報告されている。しかしながらこれまでLPLDの精製ならびにクローニングに成功したという報告はなかった(Liscovitch M.ら、Biochem.J.345,401−415,2000)。
LPLDは、生体内において主にリゾホスファチジルコリン(以下LPCともいう)等を基質とし、リゾホスファチジン酸(以下LPAともいう)の生成に寄与すると考えられている。近年、LPAは、細胞増殖の促進、平滑筋収縮、癌細胞の浸潤促進等、様々な生理活性を有することが示されている(板東浩二ら、実験医学18,184−191,2000)。またLPAは、卵巣癌、子宮体癌、子宮頸癌(Xu Y.ら、JAMA 280,719−723,1998)、動脈硬化性疾患(Siess W.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,6931−6936,1999)等の診断マーカーとして注目されており、その産生を担うLPLDの活性を測定することは、これらの疾患の診断において極めて重要であると考えられる。さらに、LPAレセプターの阻害が、アテローム性動脈硬化性疾患や心臓血管性疾患を予防および治療するための一つの手段になることが示唆されている(Siess W.ら、上述、1999)。このことは、LPAを産生するLPLDを阻害する物質(LPLD活性阻害剤)もまた当該疾患の予防および治療に用いられるという可能性を示すものである。
これまでLPLDの活性測定法としては、放射標識したLPCを試料と混合し、一定時間反応後、脂質を抽出、薄層クロマトグラフィーにて分離し、そのバンドの放射活性を測定する方法が知られているが、実用的なものではなかった。
一方、基質反応部位に発色基を付加し、酵素分解により遊離した発色性化合物を測る酵素活性測定法としては、p−ニトロフェニルリン酸を基質としたアルカリホスファターゼ活性測定法、ホスファチジル−p−ニトロフェノールを基質としたホスホリパーゼD活性測定法(Arrigo P.D’ら、Analytica Chimica Acta 304,249−254,1995、米国特許第5011964号公報)等が知られているが、リゾホスホリパーゼD活性測定法については未だ報告されていない。
発明の開示
本発明の目的は、試料中のリゾホスホリパーゼD(LPLD)活性を、特異的かつ簡便に測定する方法、および当該測定に有用な基質を提供することにある。さらに本発明の別の目的は当該測定方法を利用してLPLD活性を阻害する物質をスクリーニングすることであり、かかるスクリーニングに有用な試薬やキットを提供することである。
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、発色基を付加した基質を用い、遊離した発色性化合物の発色を指標としてLPLD活性を測定する方法を見出した。また、今まで報告のなかったLPLDに関する分子生物学的知見を得ることに成功し、かかる知見をもとに当該活性測定方法ならびにスクリーニング方法の有用性を確認して本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
(1)一般式(I)
(式中、R1とR2は互いに異なり、その一方は飽和又は不飽和の炭素数8から22の脂肪酸残基であり、その一方は水素原子またはアセチル基であり、Xは発色基である)で表わされるリゾリン脂質。
(2)当該脂肪酸残基がリノール酸残基、オレイン酸残基、パルミチン酸残基およびミリスチン酸残基からなる群より選択されるものである、上記(1)記載のリゾリン脂質。
(3)発色基がp−ニトロフェニル基またはα−ナフチル基である、上記(1)または(2)に記載のリゾリン脂質。
(4)上記(1)に記載のリゾリン脂質を有効成分として含有する、リゾホスホリパーゼD活性測定用試薬。
(5)試料中のリゾホスホリパーゼDの活性を測定する方法であって、試料に上記(1)記載のリゾリン脂質を添加し、当該リゾリン脂質と試料中のリゾホスホリパーゼDとを反応させることにより遊離する発色性化合物の量を比色定量することを特徴とする測定方法。
(6)試料が、全血、血清、血漿、尿および唾液からなる群より選択されるものである、上記(5)記載の測定方法。
(7)卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、乳癌および動脈硬化性疾患からなる群より選択される、少なくとも1種の疾患の診断に利用することを特徴とする、上記(6)記載の測定方法。
(8)上記(1)記載のリゾリン脂質を含む、試料中のリゾホスホリパーゼD活性測定用キット。
(9)試料が、全血、血清、血漿、尿および唾液からなる群より選択されるものである、上記(8)記載の測定用キット。
(10)卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、乳癌および動脈硬化性疾患からなる群より選択される、少なくとも1種の疾患の診断用である、上記(8)記載の測定用キット。
(11)以下の(a)または(b)のDNAからなる遺伝子。
(a)配列表配列番号1に記載の塩基配列からなる、リゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質をコードするDNA
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つリゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質をコードするDNA
(12)以下の(a)または(b)の蛋白質。
(a)配列表配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる、リゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質
(b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つリゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質
(13)上記(11)記載の遺伝子を含む組換えベクター。
(14)上記(11)記載の遺伝子を機能的に含む発現ベクター。
(15)上記(13)または(14)記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
(16)上記(14)記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を蛋白質の発現が可能な条件下で培養し、得られる培養物からリゾホスホリパーゼD活性を有する物質を採取することを含むリゾホスホリパーゼDの製造方法。
(17)上記(16)記載の製造方法によって製造されるリゾホスホリパーゼD。
(18)リゾホスホリパーゼDが上記(11)記載の遺伝子によりコードされる蛋白質である、上記(4)記載のリゾホスホリパーゼD活性測定用試薬。
(19)リゾホスホリパーゼDが上記(12)記載の蛋白質である、上記(4)記載のリゾホスホリパーゼD活性測定用試薬。
(20)上記(11)記載の遺伝子によってコードされる蛋白質を血清に添加してなる、リゾホスホリパーゼD活性測定用の管理血清。
(21)上記(12)記載の蛋白質を血清に添加してなる、リゾホスホリパーゼD活性測定用の管理血清。
(22)リゾホスホリパーゼDの活性を阻害する物質をスクリーニングするための方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法;
(1)リゾホスホリパーゼDを含有する試料に被検物質を添加する工程、
(2)リゾホスホリパーゼDを含有する試料に上記(1)記載のリゾリン脂質を添加する工程、
(3)当該リゾリン脂質と試料中のリゾホスホリパーゼDとを反応させることにより遊離する発色性化合物の量を比色定量する工程、および
(4)発色の程度によって示されるリゾホスホリパーゼD活性を被検物質未添加の場合と比較する工程。
(23)リゾホスホリパーゼDが上記(11)記載の遺伝子によってコードされている蛋白質である、上記(22)記載のスクリーニング方法。
(24)リゾホスホリパーゼDが上記(12)記載の蛋白質である、上記(22)記載のスクリーニング方法。
(25)上記(1)に記載のリゾリン脂質とリゾホスホリパーゼDを含有する試料とを含む、リゾホスホリパーゼDの活性を阻害する物質のスクリーニング用キット。
(26)リゾホスホリパーゼDが上記(11)記載の遺伝子によってコードされている蛋白質である、上記(25)記載のキット。
(27)リゾホスホリパーゼDが上記(12)記載の蛋白質である、上記(25)記載のキット。
発明の詳細な説明
本発明においてLPLDとは、リゾリン脂質のリン酸ジエステル結合のうちグリセロール骨格とは反対側の結合を切断する酵素である。具体的には、以下の(a)または(b)のDNAからなる遺伝子によってコードされた蛋白質、あるいは以下の(c)または(d)の蛋白質である。
(a)配列表配列番号1に記載の塩基配列からなる、リゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質をコードするDNA
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つリゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質をコードするDNA
(c)配列表配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(d)(c)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つリゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質
特に、本発明のLPLDは、以下の3つのアミノ酸配列を有する蛋白質であることが好ましい。
本発明においてリゾホスホリパーゼDは、リゾホスホリパーゼD活性を有する限りその由来に特に限定はなく、天然に存在する生物起源のものの他、自然もしくは人工の突然変異体、外来のリゾホスホリパーゼD遺伝子を導入して得られる形質転換体由来のものも全て包含される。
人工的に突然変異体を作製する方法としては、例えば、部位特異的突然変異誘発が挙げられる。より具体的には当該方法を用いて配列表配列番号1に示される塩基配列に任意の変異をもたらすことにより、変異リゾホスホリパーゼDを得ることができる。かくして得られる変異リゾホスホリパーゼDは、リゾリン脂質のリン酸ジエステル結合のうちグリセロール骨格とは反対側の結合を切断するというリゾホスホリパーゼD活性を有している。
本発明のリゾホスホリパーゼDは、(1)該酵素を産生する細胞または組織の培養物を原料として、あるいは全血、血清、血漿、尿および唾液等の生体試料から単離精製する方法、(2)化学的に合成する方法または(3)遺伝子組換え技術等によりリゾホスホリパーゼDを発現するように操作された細胞から精製する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。
本発明のリゾホスホリパーゼDの単離精製は、例えば以下のようにして行うことができる。すなわち適当な液体培地中で、リゾホスホリパーゼDを発現している細胞を培養し、得られる培養物から公知の方法で抽出、精製される。当該抽出、精製の方法は目的生成物の存在する画分に応じて適宜公知の手法が用いられる。
具体的には次のようにして行なわれる。まず、培養物をそのまま濾過又は遠心分離等の常法に付して細胞又は上清を回収する。細胞中に該酵素が蓄積されている場合には、当該回収した細胞を適当な緩衝液中に懸濁して、さらに界面活性剤を適当な濃度で加えて膜を可溶化する。次いで得られる粗抽出液を、必要ならば界面活性剤の存在下で、一般に用いられる方法を適宜組み合わせることによって該酵素を単離精製する。
該酵素が培養培地中に存在する場合には、まず培養物を濾過又は遠心分離に付して沈澱物(細胞等の固形物)を除去することにより、溶液部分のみを得、それを一般に用いられる方法を適宜組み合わせることによって目的物質を単離精製する。塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、SDS−PAGE等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。より具体的には、例えば、減圧濃縮、凍結乾燥、常用の溶媒による抽出、pH調整、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等の常用の吸着剤による処理、結晶化、再結晶化等の慣用の方法によって分離、精製することができる。
化学合成による本発明のリゾホスホリパーゼDの製造は、例えば配列表配列番号2に示されるアミノ酸配列を基にして、該アミノ酸をペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。
さらに本発明において、LPLDは、天然に存在する、全血、血清および血漿などの生体試料を精製過程に付すことによっても得ることができる。例えば、LPLDを含有する試料を、以下の工程に付すことによって得られ得る。
工程1:ポリエチレングリコール沈殿
工程2:ブルーセファロース6FFカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
工程3:コンカナバリンAセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー
工程4:BioAssistQカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
工程5:HiTrap Heparinカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
工程6:RESOURCE PHEカラムを用いる疎水性クロマトグラフィー
工程7:Econo−Pac CHT−IIカートリッジを用いるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
各工程における精製の程度は、HPLCで検出されるピークの数や強さ、SDS−PAGEで検出されるバンドの数、濃さ等で蛋白質として確認することができ、また、LPLD活性を指標に確認することもできる。
LPLD活性の測定は、例えば、LPLDがリゾホスファチジルコリンを基質としてリゾホスファチジン酸とコリンを生成する反応を利用して、リゾホスファチジルコリンを各工程で得られた各分画で処理して、産生されるコリンの量を測定することにより実施される。さらに、後述する本願発明のLPLD活性測定方法を用いてもよい。
リゾホスホリパーゼD遺伝子のクローニングは、通常、以下の方法により行なわれる。まず、リゾホスホリパーゼDを含む試料から、通常の方法に従って該酵素を完全または部分精製しN末端アミノ酸配列をエドマン法により決定する。決定された部分アミノ酸配列に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーまたはプローブとして用いて、既存のリゾホスホリパーゼDを産生する細胞または組織より調製されたcDNAまたはゲノミックDNAライブラリーからクローニングする。
あるいは、完全または部分精製されたリゾホスホリパーゼDの全部または一部を抗原として該酵素またはそのサブユニットに対する抗体を常法に従って作製し、リゾホスホリパーゼDを産生する細胞または組織より調製されたcDNAまたはゲノミックDNAライブラリーから、抗体スクリーニングにより該酵素をコードするDNAをクローニングすることもできる。
さらに、上述の方法とは別に、本発明のリゾホスホリパーゼDをコードするDNAは、PCR法を用いて直接クローニングすることもできる。すなわち、該酵素活性を有する細胞または組織由来のゲノミックDNAまたはcDNA(もしくはmRNA)を鋳型とし、増幅断片がリゾホスホリパーゼDのコード領域をカバーするような適当なオリゴヌクレオチドの対をプライマーとして用いて、常法に従ってPCRを行うことにより当該酵素のコード領域を含むDNA断片を増幅することができる。
得られたDNAインサートの塩基配列は、マキサム・ギルバート法やジデオキシターミネーション法等の公知のシークエンス技術を用いて決定することができる。
本発明のリゾホスホリパーゼDをコードする遺伝子は、配列表配列番号1に示される塩基配列から実質的になるDNAの、全部または一部を含むものである。ここで「実質的になるDNA」とは、上記特定の塩基配列からなるDNAに加えて、ストリンジェントな条件(本発明では、塩基配列において約60%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上の相同性を有するDNAがハイブリダイズし得る条件をいい、ストリンジェンシーはハイブリダイズ反応や洗浄の際の温度、塩濃度等を適宜変化させることにより調節することができる)において、上記の特定塩基配列からなるDNAとハイブリダイズし得る塩基配列からなるDNAを意味する。
本発明の遺伝子はいかなる方法で得られるものであってもよい。例えば、mRNAから調製される相補DNA(cDNA)、ゲノミックライブラリーから調製されるゲノミックDNA、化学的に合成されるDNA、RNA又はDNAを鋳型としてPCR法により増幅させて得られるDNA及びこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるDNA等が含まれる。
本発明はまた、上記のいずれかの遺伝子を含有する組換えベクターに関する。本発明の組換えベクターは、原核細胞および/または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当分野において入手可能なクローニングベクターまたは発現ベクターに上記のいずれかのDNAを適当な制限酵素部位を利用して挿入することによって調製することができる。
特に、本発明の組換えベクターはリゾホスホリパーゼDをコードする遺伝子を機能的に含む発現ベクターである。ここで「機能的に」とは、そのベクターに適合する宿主細胞内で該遺伝子(DNA)が転写され、それにコードされる蛋白質が産生され得るように該遺伝子が配置されていることを意味する。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、リゾホスホリパーゼDをコードする遺伝子、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列された発現カセットを有するベクターである。本発明の組換えベクターは、原核細胞および/または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター等が包含される。
当該組換えベクターは、簡便には当分野において入手可能な発現ベクターに本発明のリゾホスホリパーゼDをコードするDNAを常法により機能的に連結することによって調製することができる。用いる発現ベクターとしては、原核細胞および/または真核細胞の各種の宿主内でリゾホスホリパーゼDを発現し、生産する機能を有するものであれば特に制限されないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子を含有することが好ましい。例えば哺乳動物細胞を形質転換する場合、動物ウイルス、例えばSV40、RSV、MMLV等のプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが制限酵素部位、好ましくはマルチクローニング部位を介して連結したプラスミドに、pSV2−neo、pSV2−dhfr等のプラスミド由来の選択マーカー遺伝子(ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素等)を挿入したプラスミドが使用できる。
本発明の形質転換細胞は上述のリゾホスホリパーゼDをコードするDNAを含有する発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。宿主細胞は使用する発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞或いは人工的に樹立された組換え細胞等種々の細胞が利用できる。具体的には、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母等の真菌類、動物細胞または昆虫細胞等が例示される。好ましくは哺乳動物細胞、特にラット由来細胞、ハムスター由来細胞(CHO、BHK等)、マウス由来細胞(COP、L、C127、Sp2/0、NS−1、NIH T3等)、サル由来細胞(COS1、COS3、COS7、CV1、Velo等)およびヒト由来細胞(Hela、2倍体線維芽細胞由来細胞、ミエローマ細胞、Namalwa等)が挙げられる。
発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、哺乳動物細胞に導入する場合、リン酸カルシウム共沈澱法、プロトプラスト融合法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リソソーム法等が挙げられる。
本発明のリゾホスホリパーゼDは上記のごとく調製される発現ベクターを含む形質転換体を培養することによっても製造することができる。培地は、宿主細胞(形質転換体)の生育に必要な炭素源、無機もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性デンプン、ショ糖等が、窒素源としては、例えばアンモニウム塩、硝酸塩、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、馬鈴薯抽出液等が例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩(塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等)、ビタミン類、抗生物質(テトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、アンピシリン等)〕を含んでいてもよい。
培養は当分野において知られている方法により行われる。培養条件は蛋白質の発現が可能な条件であって、例えば温度、培地のpHおよび培養時間は当該酵素が大量に生産されるように適宜選択される。
例えば、宿主が動物細胞である場合、培地としては例えば約5〜20%のウシ胎児血清(FCS)を含む最小必須培地(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、RPMI−1640培地、199培地等を用いることができる。培地のpHは約6〜8であることが好ましく、培養は通常30〜40℃で約15〜72時間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
本発明のリゾホスホリパーゼDは上記培養により得られる培養物から、前述のリゾホスホリパーゼDを発現している細胞の培養物からの単離・精製と同様にして採取することができる。
かくして得られた精製LPLDあるいは組換えLPLDは、例えば表1に記載されるような基質特異性を有する。
反応生成物の中でも特にリゾホスファチジン酸(LPA)は、細胞増殖の促進や平滑筋収縮、癌細胞の浸潤促進等の生理活性を有し、スフィンゴシン1−リン酸は、癌細胞の走化性運動調節や細胞増殖等の生理活性を有する、生体内で重要な物質である。
さらに精製LPLDあるいは組換えLPLDを免疫抗原として用いて当業者は常法に従って抗体を作成することができる。また、配列表配列番号2に記載のアミノ酸配列をもとにして、部分アミノ酸配列に対応するペプチド抗体を作成することも可能である。
免疫抗原は好ましくはアジュバントと混合させて調製する。該抗原の免疫性が低い場合は、該抗原にウシ血清アルブミン(BSA)等のキャリアタンパクを結合させたものを用いることが好ましい。免疫化の対象として用いられる動物は例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、マウス等の哺乳動物が使用される。免疫にはこれらの哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フットパット内あるいは腹腔内に1乃至数回注射することにより行われる。通常、初回免疫から約1〜2週間毎に1〜4度免疫を行いさらに約1〜4週間後に最終免疫を行って、最終免疫より数日後に免疫感作された動物から、特異抗体を抗血清として得る。マウスやモルモット等に免疫して、従来公知の方法を用いてモノクローナル抗体を作製することもできる。該抗体は必要に応じて適宜精製して用いることが好ましい。精製方法としては具体的には、硫酸アンモニウム沈澱法、プロテインAを用いた方法および抗原ポリペプチドおよび/またはペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いる方法等が例示される。
得られた特異抗体は、LPLDのさらなる精製やLPLDと、LPLDが関与していると考えられている種々の疾患、現象を研究するツールとして有用である。
本発明のLPLD活性測定方法ならびにLPLDの活性を阻害する物質のスクリーニング方法において基質として使用するリゾリン脂質は、下記一般式(I)
(式中、R1とR2は互いに異なり、その一方は飽和又は不飽和の炭素数8から22の脂肪酸残基であり、その一方は水素原子またはアセチル基であり、Xは発色基である)によって表される。
本発明において、「飽和又は不飽和の炭素数8から22の脂肪酸残基」とは、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸等の飽和脂肪酸の残基、およびマッコウ酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、α−エレオステアリン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の不飽和脂肪酸の残基等が例示され、好ましくはリノール酸残基、オレイン酸残基、パルミチン酸残基、ミリスチン酸残基である。
一般式(I)中、Xにおける「発色基」とは、当該リゾリン脂質から遊離することにより、可視可能な光線又は紫外線を吸収する物質又は蛍光を発する物質(以下発色性化合物ともいう)あるいはその前駆体となり得る残基を意図する。ここで前駆体とは、さらに別の発色用試薬と反応させることにより可視可能な光線又は紫外線を吸収する物質又は蛍光を発する物質となるものをいう。
具体的な発色基としては、例えば置換フェノール部〔例えば、p−ニトロフェノール、5−ヒドロキシ−2−ニトロ安息香酸、2−ヒドロキシ−5−安息香酸、N,N,N−トリメチル−N−(5−ヒドロキシ−2−ニトロフェニル)アンモニウムクロリド、N,N,N−トリメチル−N−(2−ヒドロキシ−5−ニトロフェニル)アンモニウムクロリド、3−アミノ−4−ニトロフェノール、2−アミノ−4−ニトロフェノール、5−ヒドロキシ−2−ニトロベンゼンスルホン酸およびo−ニトロフェノール等〕を含む残基、ナフトールまたはナフトール部〔例えば、α−ナフトール、4−アミノ−1−ナフトール、4−ヒドロキシ−1−トリメチルアンモニウムナフタレンクロリド、4−ヒドロキシ−1−ナフトエ酸、3−アミノ−1−ナフトール、4−ヒドロキシ−2−トリメチルアンモニウムナフタレンクロリド、4−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、8−アミノ−1−ナフトール、8−ヒドロキシ−1−トリメチルアンモニウムナフタレンクロリド、8−ヒドロキシ−1−ナフトエ酸、5−アミノ−1−ナフトール、5−ヒドロキシ−1−トリメチルアンモニウムナフタレンクロリド、5−ヒドロキシ−1−ナフトエ酸および2−ニトロ−1−ナフトール等〕を含む残基、置換ウンベリフェロン部〔4−メチルウンベリフェロン、3−アミノ−4−メチルウンベリフェロン、3−トリメチルアンモニウム−4−メチルウンベリフェロンクロリド、4−メチル−5−アミノウンベリフェロン、4−メチル−6−アミノウンベリフェロン、5−トリメチルアンモニウム−4−メチルウンベリフェロンクロリド、6−トリメチルアンモニウム−4−メチルウンベリフェロンクロリド、4−メチルウンベリフェロン−5−スルホン酸、4−メチルウンベリフェロン−6−スルホン酸、3−トリメチルアンモニウム−4−メチルウンベリフェロン−5−スルホン酸エステル、3−トリメチルアンモニウム−4−メチルウンベリフェロン−5−カルボン酸クロリドおよび3−トリメチルアンモニウム−4−メチルウンベリフェロンクロリド等〕を含む残基等が挙げられる。
置換フェノール部を含む残基として、好ましくはp−ニトロフェニル基であり、p−ニトロフェニル基が結合した本発明のリゾリン脂質を酵素分解することによって発色性化合物であるp−ニトロフェノールが遊離される。p−ニトロフェノールは400nm付近(好ましくは405nm)に吸収極大を有する。
ナフトールまたはナフトール部を含む残基として、好ましくはα−ナフチル基であり、α−ナフチル基が結合した本発明のリゾリン脂質を酵素分解することによって発色性化合物前駆体であるα−ナフトールが遊離される。α−ナフトールはジアゾ化により発色性化合物となり得る。
置換ウンベリフェロン部を含む残基として、好ましくは4−メチルウンベリフェリル基であり、4−メチルウンベリフェリル基が結合した本発明のリゾリン脂質を酵素分解することによって発色性化合物である4−メチルウンベリフェロンが遊離される。4−メチルウンベリフェロンは蛍光性化合物であり、分光蛍光光度計等によってその蛍光を定量することができる。
測定の容易性から、発色基として好ましくは、p−ニトロフェニル基またはα−ナフチル基である。
本発明の一般式(I)で表されるリゾリン脂質は、公知の方法を適宜組み合わせて好適に製造することができる。後述の合成例で詳細が説明されるが、例えば商業的に入手可能なリン脂質を出発原料として用い、当該出発原料をホスホリパーゼCで酵素分解し、得られるジグリセリドと、商業的に入手可能な発色基を有する化合物とを、溶媒中、縮合剤の存在下で反応させることによって発色基が結合したリン脂質が得られる(当該リン脂質の合成方法としては、他にAnalytica.Chimica.Acta.304,249−254,1995に記載された方法に準じた方法を用いることもできる)。当該リン脂質をホスホリパーゼAやリパーゼにより酵素分解し、本発明のリゾリン脂質を得ることができる。より具体的には以下のような方法が例示される。
市販の大豆由来のホスファチジルコリン又は卵黄由来のホスファチジルコリンを出発原料として用い、これらの出発原料をホスホリパーゼC(例えばウェルッシュ菌由来)で酵素分解し、得られる大豆由来又は卵黄由来のジグリセリドと市販の4−ニトロフェニルホスホロジクロライドを無水ピリジン等の溶媒中、トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロライド等の縮合剤と反応させることによって、大豆由来又は卵黄由来ホスファチジル−p−ニトロフェノールが得られる。かくして得られた化合物からホスホリパーゼA2(例えばコブラ毒由来)による酵素分解により、本発明の新規な大豆由来又は卵黄由来の1−アシルホスファチジル−p−ニトロフェノールを、また、リパーゼ(例えばクモノスカビ由来)による酵素分解により、本発明の新規な大豆由来又は卵黄由来の2−アシルホスファチジル−p−ニトロフェノールを得ることができる。
別法として、市販の大豆由来ホスファチジルコリンを出発原料として、ホスホリパーゼA2又はリパーゼにより酵素分解によって得られる大豆由来1−アシルホスファチジルコリン又は大豆由来2−アシルホスファチジルコリンと無水酢酸をクロロホルム等の溶媒中、4−ジメチルアミノピリジン及びN,N−ジイソプロピルアミン等の触媒の存在下反応させ、大豆由来1−アシル−2−アセチル−ジグリセリド又は大豆由来1−アセチル−2−アシル−ジグリセリドを得る。これらの化合物に前記と同様の方法により、p−ニトロフェニル基を導入し、本発明の新規な大豆由来1−アシル−2−アセチル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール又は大豆由来1−アセチル−2−アシル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールが得られる。
本発明は、上記リゾリン脂質を有効成分として含有する、LPLD活性測定用試薬を提供する。当該測定用試薬は、後述のLPLD活性を阻害する物質のスクリーニング方法においても、その活性を測定する際に使用することができる。当該測定用試薬には基質としてのリゾリン脂質に加え、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、防腐剤等の添加剤を含んでいてもよく、さらに必要に応じて酵素の活性化剤や夾雑物質の影響緩和剤を配合することもできる。本発明の測定用試薬の形態は、乾燥粉末状、液状等特に制限されるものではない。また、乾燥粉末状に製した場合等、使用時に溶解、希釈等の処理が必要な場合には、当該処理に必要な要素(例えば緩衝液等)を後述する本発明のLPLD活性測定用キットあるいはLPLD活性を阻害する物質のスクリーニング用キットに含めておいてもよい。溶解、希釈等の処理に必要な溶液は、基質の溶解性に応じて選択され、緩衝液等の水系のものであっても、有機溶媒系であってもかまわない。また、第1反応試薬と第2反応試薬との組み合わせのように、反応液中への添加時期が異なる2種類以上の試薬を適宜組み合わせたものでもよいし、1試薬系であってもよい。
さらに、本発明は、上述の発色基を有するリゾリン脂質を基質として用いることを特徴とするLPLDの活性を測定する方法、ならびにLPLDの活性を阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。当該測定方法ならびにスクリーニング方法は共通して以下の工程を有する。
(1)試料に一般式(I)で表されるリゾリン脂質(上述)を添加し、当該リゾリン脂質と試料中のLPLDとを反応させる。
(2)上記(1)の工程により遊離した発色性化合物の量を比色定量する。
但し、当該発色性化合物がその前駆体として遊離された場合には、適当な発色用試薬を用いて発色性化合物に変換した後、当該化合物の量を比色定量する。
本発明のLPLDの活性を阻害する物質のスクリーニング方法では、上記工程に加え、当該LPLDを含有する試料に、被検物質を添加する工程、および当該被検物質を添加した場合に遊離する発色性化合物の量と、被検物質未添加の場合に遊離する発色性化合物の量とを比較する工程を含む。この比較する工程は、それぞれの場合に観察される発色の程度を比色定量する(後述)ことによって実施される。
「被検物質」とは、LPLD活性に及ぼす影響を調べようとする対象全てを意図し、既知であっても、新規なものであってもよい。また、合成されたものであっても天然に存在するものであっても構わない。その態様もLPLDとリゾリン脂質との反応を阻害しない限りは特に限定されず、化合物として精製されたものであっても未精製の組成物の状態でもよく、また、固体状であっても液状であってもよい。液状の場合、その溶媒は特に限定されない。
「試料」とは、LPLDの存在の有無ならびにその活性の程度を測定する対象すべてを意味し、LPLDが存在する可能性がある各種生体試料をはじめ、当該測定のための標準試料や対照試料、LPLD不含の各種緩衝液も包含される。より具体的には、例えば全血、血清、血漿、尿、唾液、腹水、髄液等の臨床検査で用いられる体液成分、動物や植物の細胞抽出液といった基礎研究で使用されるもの等が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法で用いられる「LPLDを含有する試料」としては、上記「試料」に準じたものが挙げられる。既知量のLPLDを含有する試料に加え、本発明では、被検物質未添加の場合とその活性の程度を比較することによりスクリーニングを行うので、LPLDを含有する同一の試料であれば、そこに含まれるLPLDの絶対量について特に定める必要はなく、かかる試料も本発明のスクリーニング方法において使用可能である。
好ましくは該「LPLDを含有する試料」としては、既知量の高度に精製されたLPLDを含有する試料、より好ましくは既知量の組換えLPLDを含有する試料が用いられる。特に試料が血清の場合、既知量の高度に精製されたLPLDを含有する血清あるいは既知量の組換えLPLDを含有する血清は、本願発明の活性測定方法ならびにスクリーニング方法の対照試料、標準試料として有用な管理血清として用いることができる。
既知量の高度に精製されたLPLDを含有する試料は、上述のようにLPLDを含有する試料を、精製過程に付すことによって得ることができる。より詳細な手順は実施例に後述する。あるいはLPLD不含のまたはLPLD含有量が既知の試料に既知量の高度の精製されたLPLDを添加することによって調製することができる。
既知量の組換えLPLDを含有する試料は、既知量の組換えLPLD(上述)を試料に添加することによって得ることができる。
基質であるリゾリン脂質と試料との反応条件は、使用する基質や試料の種類、状態により適宜好適に設定されるが、通常、以下の通りである。
反応温度
当該基質が安定であり、且つLPLDの活性を維持し得る温度であれば特に限定されないが、測定の容易性、自動化等を考慮すれば、通常25〜40℃、好ましくは35〜40℃程度で測定する。
反応時間
本発明は遊離した発色性化合物の量を比色定量することを含むものであり、吸光度の経時的変化を測定することによって実施される。従って、リゾリン脂質と試料との反応開始後ただちにモニタリングを開始する。基質から発色性化合物を遊離するには、その基質の種類や、他の反応条件によっても異なるが、通常5分〜数時間で反応を行う。従って本発明では好ましくは5分〜1時間吸光度の変化をモニタリングする。
反応pH
LPLDが当該基質と反応し、その酵素反応を測定し得るpHであれば特に限定されない。また、用いる発色基によっては、LPLD活性のpHと発色反応のpHが異なっていてもよい。例えば、発色基としてp−ニトロフェニル基を用いた場合、LPLD反応によって遊離したp−ニトロフェノールは、アルカリ条件下でのみ発色する(金島才二ら、臨床検査41、1025−1028、1997)。よって、LPLD活性の至適pHが酸性域、あるいは中性付近である場合にはLPLDを含んだ試料と、当該基質とを一定時間反応させた後、アルカリ条件下で発色反応を行うことが可能である。ただし、LPLD活性の至適pHがアルカリ域である際には、LPLD反応と発色反応を同一pHにて同時に行うことができる。
基質濃度
基質濃度は、その基質の種類や、他の反応条件によっても異なるが、夾雑成分の影響を受けにくく、且つ、試料中のLPLDと十分に反応し得る量であれば特に限定されず、好適な量が適宜設定される。具体的には最終濃度1mmol/L以上、好ましくは2mmol/L〜10mmol/L、特に好ましくは2mmol/L〜5mmol/L程度である。1mmol/Lよりも少ないと、ブランクとの差が小さく有意な値が得にくい。
遊離した発色性化合物は比色定量することによってその量を測定する。当該比色定量の方法は発色性化合物の種類によって適宜選択され、当分野で公知の手法によって実施される。例えば発色性化合物がp−ニトロフェノールの場合、得られる黄色の発色を400nm付近の吸光度の変化として分光光度計等によって測定する。発色性化合物が4−メチルウンベリフェロンの場合、分光蛍光光度計等によってその蛍光を測定する。α−ナフトールの場合、ジアゾ化剤を用いてカップリング反応を行うことにより、発色性化合物、即ちアゾ化合物とし、当該化合物の発色を分光光度計等によって測定する。ジアゾ化剤としては、例えばFast Red TR、p−ジアゾベンゼンスルホン酸等が挙げられる。ジアゾ化剤等、さらなる発色用試薬が必要な場合には、当該試薬を後述の本発明のLPLD活性測定用キット、LPLDの活性を阻害する物質のスクリーニング用キットに含めておいてもよい。
本発明のスクリーニング方法において、被検物質および基質である本発明のリゾリン脂質の試料中への添加の時期は、被検物質のLPLD活性に及ぼす影響が十分に反映されるように適宜設定される。例えば、当該影響が速やかに現れる場合には、被検物質と基質であるリゾリン脂質の添加をほぼ同時に行うことができるが、通常、被検物質と試料中のLPLDとをあらかじめ十分に反応させた後、基質である本発明のリゾリン脂質を添加し、本発明のLPLD活性測定を実施する。
本発明においては、本発明のLPLD活性測定あるいはLPLDの活性を阻害する物質のスクリーニングに必要とされる各成分をまとめて梱包しキットとしてもよい。
かかるキットには、基質となるリゾリン脂質に加えて、必要に応じて溶解溶液や、発色用試薬等の反応に必要な要素が含まれる。好ましくは、標準溶液および対照溶液が含められる。さらに、当該測定に必要な要素の他に、反応用容器や、マニュアル等も併せて梱包しておくことも、簡便性という観点から好ましい。LPLD活性を阻害する物質のスクリーニング用キットには、LPLDを含有する試料を含めることが好ましい。該「LPLDを含有する試料」としては、好ましくは「既知量の高度に精製されたLPLDを含有する試料」であり、特に好ましくは「既知量の組換えLPLDを含有する試料」である。当該キットにLPLDを含有する試料をあらかじめ含めておくことで、同一試料を用いて、被検物質添加時および未添加時のLPLD活性の変化を測定することができる。
本発明のスクリーニング方法によって得られるLPLD活性を阻害する物質は、当該LPLD阻害作用によりLPAの産生を抑制することができ、LPAの過剰な、あるいは異常な産生に起因すると考えられる種々の疾患に好適に使用することができる。例えば、動脈硬化症の予防、治療に用いることができる。
実施例
以下、本発明を実施例にて具体的且つ詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。また、特に断りのない限り、以下の実施例で使用する試薬等の各材料は、商業的に入手可能であり、添付のマニュアルに基づいて使用することができる。
実施例1:1−アシルリゾホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成(1)大豆由来1−リノレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール:
(1)大豆由来1,2−ジリノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成
大豆由来のジリノレオイルグリセロール2.68g(4.3mmol)と4−ニトロフェニルホスホロジクロライド0.916g(3.6mmol)をP2O5上で約2時間乾燥させた後、無水ピリジン10mLを添加し十分に懸濁後、塩化2,4,6−トリイソプロピルベンゼンスルホニル2.71g(8.95mmol)を加えて室温下一晩反応させた。この反応液に水を入れて混合、攪拌し、さらにエタノール、トルエンを加えて、減圧濃縮乾固した。得られた乾固物にジエチルエーテルを加えて、不溶部分を除去し、可溶部分を得て、これを少量のクロロホルムに溶解し、同溶媒系で活性化したシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付してクロロホルム−メタノール系の溶出液を用いて精製を行い、黄色油状物1.45gを得た。
(2)大豆由来1−リノレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール
上記(1)で得られた黄色油状物564mgをジエチルエーテル20mLに溶解し、次いでホスホリパーゼA2(コブラ毒由来;和光純薬工業株式会社)100mgをpH6.5の0.1mol/Lホウ酸−リン酸緩衝液10mL及び1mol/L塩化カルシウム0.1mLに溶解した後、お互いを混合し、48時間反応させた。反応後ジエチルエーテル画分を減圧濃縮し、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、クロロホルム−メタノール系の溶出液を用いて精製を行い、黄色油状物として表題化合物252mgを得た。
ESI−MS(Negative)m/z 554[m−H]−
NMR(溶媒CDCl3)
1H−NMR:0.87−0.92(m,3H),1.27−1.48(m,20H),2.05−2.11(m,4H),2.76−2.79(m,2H),3.55−4.07(m,4H),4.53(s,1H),5.33−5.41(m,2H),7.32−7.35(d,2H),8.06−8.09(d,2H)
13C−NMR:13.52(methyl),22.04−33.42(methylenes,10signals),62.05(methylenes),74.96(methyne),119.58 and 124.89(aroma),127.36,127.65,129.37 and 129.74(vinyl C),142.98 and 156.94(aroma),173.54(C=0)
実施例2:1−アシルリゾホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成(2)
卵黄由来1−オレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール:
(1)卵黄由来ジアシルホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成
卵黄由来のジアシルグリセロール1.75g(2.95mmol)と4−ニトロフェニルホスホロジクロライド0.686g(2.68mmol)ならびに塩化2,4,6−トリイソプロピルベンゼンスルホニル2.02g(6.7mmol)を用いて実施例1(1)に準じて合成、精製を行うことにより黄色油状物1.41gを得た。
(2)卵黄由来1−オレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール
上記(1)で得られた黄色油状物573mgをホスホリパーゼA2(コブラ毒由来;和光純薬工業株式会社)123mgを用いて、実施例1(2)に準じて加水分解し、精製を行うことにより黄色油状物として表題化合物221mgを得た。
ESI−MS(Negative)m/z 556[m−H]−
NMR(溶媒CDCl3)
1H−NMR:0.87−0.91(m,3H),1.28−1.48(m,22H),2.02−2.11(m,4H),2.78−2.79(m,2H),3.55−4.06(m,4H),4.52(s,1H),5.33−5.36(m,2H),7.32−7.35(d,2H),8.07−8.10(d,2H)
13C−NMR:13.56(methyl),22.15−33.43(methylenes,10signals),62.40(methylenes),75.02(methyne),119.59 and 124.91(aroma),127.64,129.07 and 129.57(vinyl C),143.00 and 157.03(aroma),173.55(C=0)
実施例3:2−アシルリゾホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成(1)
大豆由来1−ヒドロキシ−2−リノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール:
実施例1(1)で得られた化合物1.45gをジエチルエーテル50mLに溶解し、次いでリパーゼ(クモノスカビ由来:生化学工業株式会社)1gをpH6.5の0.1mol/Lホウ酸−リン酸緩衝液14mL及び1mol/L塩化カルシウム0.1mLに溶解した後、お互いを混合し、48時間反応させた。反応後ジエチルエーテル画分を減圧濃縮し、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、クロロホルム−メタノール系の溶出液を用いて精製を行い、黄色油状物として表題化合物568mgを得た。
ESI−MS(Negative)m/z 554[m−H]−
NMR(溶媒CDCl3)
1H−NMR:0.87−0.92(m,3H),1.23−1.47(m,20H),2.04−2.17(m,4H),2.75−2.79(m,2H),3.62−4.12(m,4H),4.96−4.98(m,1H),5.32−5.41(m,2H),7.27−7.31(d,2H),8.01−8.04(d,2H)
13C−NMR:13.52(methyl),22.04−33.66(methylenes,10signals),59.74 and 64.31(methylenes),72.12(methylene),119.50 and 124.86(aroma),127.36,127.64,129.37 and 129.74(vinyl C),142.94 and 156.83(aroma),173.40(C=0)
実施例4:2−アシルリゾホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成(2)
卵黄由来1−ヒドロキシ−2−オレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール:
実施例2(1)で得られた化合物714mgをリパーゼ700mgを用いて、実施例3に準じて加水分解し、精製を行うことにより表題化合物374mgを得た。
ESI−MS(Negative)m/z 556[m−H]−
NMR(溶媒CDCl3)
1H−NMR:0.87−0.91(m,3H),1.24−1.47(m,22H),2.02−2.17(m,4H),2.77−2.83(m,2H),3.63−4.12(m,4H),4.97(s,1H),5.36(m,2H),7.32−7.31(d,2H),8.02−8.04(d,2H)
13C−NMR:13.55(methyl),22.14−33.66(methylenes,11signals),59.77 and 64.32(methylenes),72.05(methylene),119.57 and 124.88(aroma),127.35,127.65,129.04 and 129.57(vinyl C),143.02 and 156.79(aroma),173.43(C=0)
実施例5:活性測定1(反応pH)
(1)試薬の調製
試薬A:N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−3−プロパンスルホン酸(200mmol/L)、トリトンX−100(0.02%)
試薬B:試薬Aを分取し、それぞれpH7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6に調整した後、2倍に希釈して、pHの異なる試薬Bを調製した。
試薬C:pH4.5
クエン酸1水和物(10mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)、上記実施例で調製した1−ヒドロキシ−2−リノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例3;10mmol/L)
(2)試料
市販の管理血清2種類、それぞれ検体1(コンセーラ:日水製薬株式会社製)および検体2(リピッドセーラムII:栄研化学株式会社製)、さらに血清中のアルブミン画分における活性を調べるために、5%ヒト血清アルブミン(脂肪酸フリー:シグマ社製)溶液を用いた。
(3)測定
マイクロプレートに、各試料10μLおよび試薬B150μLを分注し、37℃で約5分間加温した。これに試薬Cを50μL添加した後、経時的に主波長405nm、副波長540nmの吸光度を測定し、LPLDの作用によって遊離したp−ニトロフェノールに依存する、1分間あたりの吸光度変化量からLPLD活性を求めた。活性は、反応液1mLあたり、1分間に遊離したp−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図1に示す。pHがアルカリ側の方が活性は強いが、ヒト血清アルブミン画分中の活性も上昇する。よってpH8以下ではよりアルブミンの影響を少なくした活性測定が可能となる。
実施例6:活性測定2(基質)
(1)試薬の調製
試薬A:pH8.0
2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(100mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬B:pH4.5
クエン酸1水和物(10mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬C:上記実施例で調製した、大豆由来1−ヒドロキシ−2−リノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例3;基質A)、大豆由来1−リノレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例1;基質B)、卵黄由来1−ヒドロキシ−2−オレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例4;基質C)、卵黄由来1−オレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例2;基質D)の100mmol/L相当の溶液を、それぞれ試薬Bで10倍希釈し、試薬Cとして使用した。
(2)試料
試料として、ヒト血清を用い、血清中のアルブミン画分における活性を調べるために、5%ヒト血清アルブミン(脂肪酸フリー:シグマ社製)溶液を、さらにホスホリパーゼD(PLD)との反応性を調べるため、ストレプトマイセス属由来のPLD(商品略号PLDP:旭化成工業株式会社)の5U/mL溶液を使用した。
(3)測定
マイクロプレートに、各試料10μLおよび試薬A150μLを分注し、37℃で約5分間加温した。これに試薬Cを50μL添加した後、経時的に主波長405nm、副波長540nmの吸光度を測定し、LPLDの作用によって遊離したp−ニトロフェノールに依存する、1分間あたりの吸光度変化量からLPLD活性を求めた。活性は、反応液1mLあたり、1分間に遊離したp−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図2に示す。ヒト血清アルブミンに対する応答性は基質BやDといった、1−アシル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノールの方が、基質AやCといった1−ヒドロキシ−2−アシル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールよりも高いのに対し、ヒト血清に対する応答性は1−ヒドロキシ−2−アシル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールの方が1−アシル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノールよりも高い。このことから、特に1−ヒドロキシ−2−アシル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールを基質として用いた場合に、アルブミンの影響をより少なくしてLPLD活性を測定することができる。
またこれらの基質は、反応の強弱はあるものの、すべてストレプトマイセス属由来のPLDの基質となり得ることがわかった。PLDが正常ヒト血清中に存在するという報告はないが、PLDが試料中に混在している場合には、上記基質のうち、基質Aまたは基質Bを使用することが好ましい。
実施例7:活性測定3(基質濃度)
(1)試薬の調製
試薬A:pH8.0
2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(100mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬B:pH4.5
クエン酸1水和物(10mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬C:基質として上記実施例で調製した大豆由来1−ヒドロキシ−2−リノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例3)を用い、それぞれ0,0.5,1.0,2.0,3.0,5.0,10,20,30,50mmol/Lとなるように試薬Bで希釈し、試薬Cとした。
(2)試料
試料として、ヒト血清を用い、血清中のアルブミンの反応を調べるために、5%ヒト血清アルブミン(脂肪酸フリー:シグマ社製)溶液を使用した。
(3)測定
マイクロプレートに、各試料10μLおよび試薬A150μLを分注し、37℃で約5分間加温した。これに試薬Cを50μL添加した後、経時的に主波長405nm、副波長540nmの吸光度を測定し、LPLDの作用によって遊離したp−ニトロフェノールに依存する、1分間あたりの吸光度変化量からLPLD活性を求めた。活性は、反応液1mLあたり、1分間に遊離したp−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図3に示す。基質の終濃度として、5mmol/L以上の添加が望ましい。
実施例8:活性測定4(試料の希釈直線性)
(1)試薬の調製
試薬A:pH8.0
2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(100mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬B:pH4.5
クエン酸1水和物(10mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)、
大豆由来1−ヒドロキシ−2−リノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例3;20mmol/L)
(2)試料
試料として、ヒト血清を生理食塩水にて5段階希釈したものを使用した。
(3)測定
マイクロプレートに、各試料10μLおよび試薬A150μLを分注し、37℃で約5分間加温した。これに試薬Bを50μL添加した後、経時的に主波長405nm、副波長540nmの吸光度を測定し、LPLDの作用によって遊離したp−ニトロフェノールに依存する、1分間あたりの吸光度変化量からLPLD活性を求めた。活性は、反応液1mLあたり、1分間に遊離したp−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図4に示す。図4に示すように原点を通過する良好な直線が得られた。このことは、本発明の活性測定法が、ヒト血清中のLPLD活性を、定量的に測定し得ることを示している。
実施例9:リゾホスホリパーゼDの精製(ウシリゾホスホリパーゼD)
以下の工程は、(3)の溶出時以外、全て4℃で行った。
(1)ポリエチレングリコール(PEG)沈殿
原料となるウシ胎児血清(FCS)2Lに対して50%PEGをゆっくりと添加し、PEG終濃度5%とした。10分間攪拌した後、20,400gで60分間遠心し、その上清を回収した。さらに終濃度が10%になるまで50%PEGをゆっくりと添加した後、20,400gで60分間遠心し、得られた沈殿物を緩衝液A(20mMTris−HCl(pH7.4))400mLに懸濁させた。
(2)ブルーセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー
前記懸濁液を、緩衝液Aで平衡化したブルーセファロース6FF(ファルマシア社、カラムサイズ、50mL)に添加し、緩衝液Aで洗浄した。緩衝液A中でのNaClの直線濃度勾配(0−2M)により、LPLDを自然落下にて溶出させ、LPLD活性を示す画分を集めた。
(3)コンカナバリンA(ConA)セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー
前記活性画分を、緩衝液B(500mMのNaClを含む緩衝液A)で平衡化したConAセファロース(ファルマシア社、カラムサイズ、3mL)に添加し、緩衝液Bで洗浄した。これを室温にて緩衝液C(5mMのα−メチルマンノシドを含む緩衝液B)により、LPLDを自然落下にて溶出させ、LPLD活性を示す画分を集め、緩衝液Aにて透析した。
(4)BioAssistQカラムを用いる陰イオン交換クロマトグラフィー
前記透析物を緩衝液D(20mMTris−HCl(pH8.0))で平衡化したBioAssistQ(東ソー社、カラムサイズ0.8mL)に添加し、緩衝液Dで洗浄した。緩衝液D中でのNaClの直線濃度勾配(0−2M)により、LPLDを1.0mL/分にて溶出させ、LPLD活性を示す画分を集めた。
(5)ヘパリンカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
前記活性画分を緩衝液E(10%グリセロールを含む緩衝液A)にて10倍希釈したものを、緩衝液Eで平衡化したHiTrap Heparinカラム(ファルマシア社、カラムサイズ、1mL)に添加し、緩衝液Eで洗浄した。緩衝液E中でのNaClの直線濃度勾配(0−2M)により、LPLDを0.5mL/分にて溶出させ、LPLD活性を示す画分を集めた。
(6)RESOURCE PHEカラムを用いる疎水性クロマトグラフィー
前記活性画分に5M NaClを添加し、NaCl終濃度が2Mになるようにした。これを緩衝液F(2M NaClを含む緩衝液A)で平衡化したRESOURCE PHE(ファルマシア社、カラムサイズ、1mL)に添加し、緩衝液Fで洗浄した。これを1mM EDTAによりLPLDを1.0mL/分にて溶出させ、LPLD活性を示す素通り画分を集めた。
(7)ハイドロキシアパタイト(HAT)を用いる非特異的吸着
前記活性画分を緩衝液G(10%グリセロールを含む1mM NaH2PO4−NaOH(pH7.4))により10倍希釈したものを、緩衝液Gで平衡化したHAT(Bio−Rad社製、カラムサイズ1ml)に添加し、緩衝液Gで洗浄した。緩衝液G中でのNaH2PO4−NaOHの直線濃度勾配(1−150mM)により、LPLDを0.8mL/分にて溶出させた後、LPLD活性を示す画分を集め、ウシホスホリパーゼDの部分精製品を得た。
(8)各画分のリゾホスホリパーゼD活性の測定
原料であるFCS、ならびに上記(1)〜(7)で得られた各画分のそれぞれについてリゾホスホリパーゼD活性を測定することにより精製の程度を確認した。
各画分のリゾホスホリパーゼDの活性の測定は、反応混合液(100mMトリス塩酸(pH9.0)、500mM塩化ナトリウム、5mM塩化マグネシウム、0.05%トリトンX−100、1mMリゾホスファチジルコリン)中で行った。前記反応混合液に試料(FCS、(1)〜(7)で得られた各画分のいずれか)を加え100μLとし、37℃で60分間加温した。その内、15μLを測定試液(100mMトリス塩酸(pH8.0)、0.375mM N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、0.25mM 4−アミノアンチピリン、0.01% トリトンX−100、7.5U/mLパーオキシダーゼ、2.5U/mL コリンオキシダーゼ)200μLと10分間反応させた後、550nmにおける吸光度を測定した。測定値は前記反応混合液の代わりに、50μMの塩化コリンを用いた際の吸光度を基準に換算した。
結果を精製表として表2に示す。
実施例10:ウシリゾホスホリパーゼDの部分アミノ酸配列の決定
実施例9で得られたウシリゾホスホリパーゼDの部分精製品中の蛋白質を、10%トリクロロ酢酸を用いて沈殿させることによりウシリゾホスホリパーゼDを濃縮し、10%アクリルアミドSDS−PAGEによって蛋白質を分画した。CBB染色後、リゾホスホリパーゼD活性とよい相関性を示した分子量約100KDaの蛋白質のバンドをアクリルアミドゲルから切り出し、リジルエンドペプチダーゼ酵素処理を行った。さらに、得られたペプチド断片をC4逆相カラムクロマトグラフィーにより分画した。これらのペプチドのうち、3本について、エドマン法によりアミノ酸配列を決定した。
得られた部分アミノ酸配列について、BLAST−Tプログラムを用い、ホモロジー検索を行ったところ、得られた全ての配列がヒト、マウス、ラットのautotaxin(配列表配列番号2)と極めて高い相同性を示した。autotaxinは、癌細胞の運動性促進因子として知られ、ヌクレオチドピロホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ活性を有し、様々なヌクレオチド化合物に作用することが報告されている蛋白質であるが、当該蛋白質ならびにそれに類似する蛋白質がLPLD活性を有し、リン脂質に作用するという報告はない。
実施例11:組換え宿主細胞におけるLPLD活性の発現
実施例10の結果より、autotaxinにLPLD活性があることが予測されたため、ラットのautotaxinのcDNAを用いて形質転換体を作成し、該形質転換体のLPLD活性の発現について調べた。
報告されているラットautotaxinの配列(配列表配列番号1)から、逆転写酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法により、ラットautotaxinをコードするcDNAを単離した。鋳型としては、ラット肝臓由来のRNAから逆転写酵素で合成したcDNAを使用した。
得られたcDNAを発現ベクターpcDNA3のBamH I/Xho I部位に挿入し、cDNAのC末にはmycタグを導入した。得られたcDNAをリポフェクトアミンを用いてCHO−K1細胞へ一過的に導入した。
48時間後、培養上清を回収し、抗mycタグ抗体を用いたウエスタンブロットにより発現を確認し、また上述のLPLD活性測定法を用いて、当該組換え宿主細胞がLPLDを発現していることを確認した。
実施例12:精製LPLDおよび本願発明の基質を用いたLPLD活性の測定
(1)1−ミリストイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成
(i)1,2−ジミリストイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成
ジミリストイルグリセロール2.02gと4−ニトロフェニルホスホロジクロライド1.00gをP2O5上、約2時間室温で乾燥させた後、無水ピリジン12mLを加えて十分に懸濁させた。そこに塩化2,4,6−トリイソプロピルベンゼンスルホニル1.13gを加えて室温にて一晩反応させた。この反応液に水を加えて混合攪拌し、さらにエタノールおよびトルエンを加えて減圧濃縮乾固した。得られた乾固物にクロロホルム−メタノール(2:1)100mLを加えて溶解後、水を20mL加えて分液し、下層を採取した。無水硫酸ナトリウムで水分を乾燥後ろ過し、ろ液を減圧濃縮乾固した。得られた乾固物を少量のクロロホルムに溶解し、同溶媒系で活性化したシリカゲルクロマトグラフィーに付して、クロロホルム−メタノール−水系の溶出液を用いて精製し、白色粉末1.4gを得た。
(ii)1−ミリストイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成
上記(i)で得られた白色粉末600mgクロロホルム40mLに溶解し、ついでホスホリパーゼA2(シグマ社、コブラ毒由来)90mgをpH6.5の0.1Mホウ酸−リン酸緩衝液20mL、および1Mの塩化カルシウム溶液0.1mLに溶解した後、お互いを混合し、35℃で24時間反応させた。反応液をクロロホルム−メタノール(2:1)100mLを加えて分液し、その下層を採取した。無水硫酸ナトリウムで水分を乾燥後ろ過し、ろ液を減圧濃縮乾固した。得られた乾固物をシリカゲルクロマトグラフィーに付して、クロロホルム−メタノール−水系の溶出液を用いて精製し、白色粉末として表題化合物223mgを得た。
ESI−MS(Negative)m/z 503[m−H]−
(2)試薬の調製
試薬A:pH8.0
2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(100mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬B:pH4.5
クエン酸一水和物(10mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬C:1−ミリストイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールを試薬Bにて10mmol/L相当になるように溶解し、試薬Cとした。
(3)測定
測定には生化学用自動分析装置(東芝製:TBA−80FR NEO)を用いた。実施例9で得られた精製LPLD(8μL)と試薬A(240μL)とを37℃で約15分間予備加温し、試薬C(80μL)を添加後、経時的に約15分間、主波長405nm、副波長505nmの吸光度を測定し、LPLDの作用によって遊離したp−ニトロフェノールに依存する、1分間あたりの吸光度変化量からLPLD活性を求めた。活性は反応液1mLあたり、1分間に遊離したp−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図5に示す。図1同様pHがアルカリ側の方が強い活性が見られた。
精製LPLDの代わりに組換えLPLDを用いた場合についても同様にして測定することができる。
産業上の利用分野
本発明の新規リゾリン脂質を基質として使用することにより、特異的、且つ高感度のLPLD活性測定が可能となる。また、安全で簡易に検出可能な発色基を使用することにより、多数の試料を迅速に測定することが可能となる。さらに、本発明の新規リゾリン脂質を基質として使用することにより、LPLD活性を阻害する物質をスクリーニングすることが可能となる。
本出願は、日本で出願された特願2000−403530および特願2001−023784を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、反応pHを種々に変化させ、血清試料および5%血清アルブミン溶液について本発明のLPLD活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。検体1はコンセーラを、検体2はリピッドセーラムIIをそれぞれ示す。
図2は、基質を種々に変化させ、ヒト血清試料、5%血清アルブミン溶液およびPLDの5U/mL溶液について本発明のLPLD活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。
図2−1はヒト血清試料に対して、図2−2は5%血清アルブミン溶液に対して、図2−3はPLD5U/mL溶液についての結果を示す。
基質A:大豆由来1−ヒドロキシ−2−リノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール
基質B:大豆由来1−リノレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール
基質C:卵黄由来1−ヒドロキシ−2−オレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール
基質D:卵黄由来1−オレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール
図3は、基質濃度を種々に変化させ、ヒト血清試料および5%血清アルブミン溶液について本発明のLPLD活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。
図4は、試料としてヒト血清を段階的に希釈したものを用い、本発明のLPLD活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。
図5は、反応pHを種々に変化させ、試料として精製LPLD(LPLD精製品)を用い、本発明のLPLD活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。基質は、1−ミリストイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールを用いた。
本発明は、新規リゾリン脂質、当該リゾリン脂質を含有するリゾホスホリパーゼD活性測定用試薬、および当該リゾリン脂質を用いることを特徴とするリゾホスホリパーゼD活性の測定方法に関する。さらに本発明は該方法を利用するリゾホスホリパーゼD活性を阻害する物質のスクリーニング方法ならびにその為のキットに関する。
背景技術
ホスホリパーゼD(以下PLDともいう)は、リン脂質のリン酸ジエステル結合のうちグリセロール骨格とは反対側の結合を切断する酵素である。PLDの中で、特にリゾリン脂質を基質とするものは、リゾホスホリパーゼD(以下LPLDともいう)と呼ばれ区別されている。以前から動物の組織中にLPLDが存在することが報告されており(Wykle RLら、Arch.Biochem.Biophys.184,149−155,1977;Kawasaki T.ら、Biochim.Biophys.Acta 920,85−93,1987)、さらには組織だけでなく、ラットの血漿(Tokumura A.ら、Lipids 33,1009−1015,1998)、ヒト血清(徳村彰ら、脂質生化学研究42,41−44,2000)においてもその存在が報告されている。しかしながらこれまでLPLDの精製ならびにクローニングに成功したという報告はなかった(Liscovitch M.ら、Biochem.J.345,401−415,2000)。
LPLDは、生体内において主にリゾホスファチジルコリン(以下LPCともいう)等を基質とし、リゾホスファチジン酸(以下LPAともいう)の生成に寄与すると考えられている。近年、LPAは、細胞増殖の促進、平滑筋収縮、癌細胞の浸潤促進等、様々な生理活性を有することが示されている(板東浩二ら、実験医学18,184−191,2000)。またLPAは、卵巣癌、子宮体癌、子宮頸癌(Xu Y.ら、JAMA 280,719−723,1998)、動脈硬化性疾患(Siess W.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,6931−6936,1999)等の診断マーカーとして注目されており、その産生を担うLPLDの活性を測定することは、これらの疾患の診断において極めて重要であると考えられる。さらに、LPAレセプターの阻害が、アテローム性動脈硬化性疾患や心臓血管性疾患を予防および治療するための一つの手段になることが示唆されている(Siess W.ら、上述、1999)。このことは、LPAを産生するLPLDを阻害する物質(LPLD活性阻害剤)もまた当該疾患の予防および治療に用いられるという可能性を示すものである。
これまでLPLDの活性測定法としては、放射標識したLPCを試料と混合し、一定時間反応後、脂質を抽出、薄層クロマトグラフィーにて分離し、そのバンドの放射活性を測定する方法が知られているが、実用的なものではなかった。
一方、基質反応部位に発色基を付加し、酵素分解により遊離した発色性化合物を測る酵素活性測定法としては、p−ニトロフェニルリン酸を基質としたアルカリホスファターゼ活性測定法、ホスファチジル−p−ニトロフェノールを基質としたホスホリパーゼD活性測定法(Arrigo P.D’ら、Analytica Chimica Acta 304,249−254,1995、米国特許第5011964号公報)等が知られているが、リゾホスホリパーゼD活性測定法については未だ報告されていない。
発明の開示
本発明の目的は、試料中のリゾホスホリパーゼD(LPLD)活性を、特異的かつ簡便に測定する方法、および当該測定に有用な基質を提供することにある。さらに本発明の別の目的は当該測定方法を利用してLPLD活性を阻害する物質をスクリーニングすることであり、かかるスクリーニングに有用な試薬やキットを提供することである。
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、発色基を付加した基質を用い、遊離した発色性化合物の発色を指標としてLPLD活性を測定する方法を見出した。また、今まで報告のなかったLPLDに関する分子生物学的知見を得ることに成功し、かかる知見をもとに当該活性測定方法ならびにスクリーニング方法の有用性を確認して本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
(1)一般式(I)
(式中、R1とR2は互いに異なり、その一方は飽和又は不飽和の炭素数8から22の脂肪酸残基であり、その一方は水素原子またはアセチル基であり、Xは発色基である)で表わされるリゾリン脂質。
(2)当該脂肪酸残基がリノール酸残基、オレイン酸残基、パルミチン酸残基およびミリスチン酸残基からなる群より選択されるものである、上記(1)記載のリゾリン脂質。
(3)発色基がp−ニトロフェニル基またはα−ナフチル基である、上記(1)または(2)に記載のリゾリン脂質。
(4)上記(1)に記載のリゾリン脂質を有効成分として含有する、リゾホスホリパーゼD活性測定用試薬。
(5)試料中のリゾホスホリパーゼDの活性を測定する方法であって、試料に上記(1)記載のリゾリン脂質を添加し、当該リゾリン脂質と試料中のリゾホスホリパーゼDとを反応させることにより遊離する発色性化合物の量を比色定量することを特徴とする測定方法。
(6)試料が、全血、血清、血漿、尿および唾液からなる群より選択されるものである、上記(5)記載の測定方法。
(7)卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、乳癌および動脈硬化性疾患からなる群より選択される、少なくとも1種の疾患の診断に利用することを特徴とする、上記(6)記載の測定方法。
(8)上記(1)記載のリゾリン脂質を含む、試料中のリゾホスホリパーゼD活性測定用キット。
(9)試料が、全血、血清、血漿、尿および唾液からなる群より選択されるものである、上記(8)記載の測定用キット。
(10)卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、乳癌および動脈硬化性疾患からなる群より選択される、少なくとも1種の疾患の診断用である、上記(8)記載の測定用キット。
(11)以下の(a)または(b)のDNAからなる遺伝子。
(a)配列表配列番号1に記載の塩基配列からなる、リゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質をコードするDNA
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つリゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質をコードするDNA
(12)以下の(a)または(b)の蛋白質。
(a)配列表配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる、リゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質
(b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つリゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質
(13)上記(11)記載の遺伝子を含む組換えベクター。
(14)上記(11)記載の遺伝子を機能的に含む発現ベクター。
(15)上記(13)または(14)記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
(16)上記(14)記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を蛋白質の発現が可能な条件下で培養し、得られる培養物からリゾホスホリパーゼD活性を有する物質を採取することを含むリゾホスホリパーゼDの製造方法。
(17)上記(16)記載の製造方法によって製造されるリゾホスホリパーゼD。
(18)リゾホスホリパーゼDが上記(11)記載の遺伝子によりコードされる蛋白質である、上記(4)記載のリゾホスホリパーゼD活性測定用試薬。
(19)リゾホスホリパーゼDが上記(12)記載の蛋白質である、上記(4)記載のリゾホスホリパーゼD活性測定用試薬。
(20)上記(11)記載の遺伝子によってコードされる蛋白質を血清に添加してなる、リゾホスホリパーゼD活性測定用の管理血清。
(21)上記(12)記載の蛋白質を血清に添加してなる、リゾホスホリパーゼD活性測定用の管理血清。
(22)リゾホスホリパーゼDの活性を阻害する物質をスクリーニングするための方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法;
(1)リゾホスホリパーゼDを含有する試料に被検物質を添加する工程、
(2)リゾホスホリパーゼDを含有する試料に上記(1)記載のリゾリン脂質を添加する工程、
(3)当該リゾリン脂質と試料中のリゾホスホリパーゼDとを反応させることにより遊離する発色性化合物の量を比色定量する工程、および
(4)発色の程度によって示されるリゾホスホリパーゼD活性を被検物質未添加の場合と比較する工程。
(23)リゾホスホリパーゼDが上記(11)記載の遺伝子によってコードされている蛋白質である、上記(22)記載のスクリーニング方法。
(24)リゾホスホリパーゼDが上記(12)記載の蛋白質である、上記(22)記載のスクリーニング方法。
(25)上記(1)に記載のリゾリン脂質とリゾホスホリパーゼDを含有する試料とを含む、リゾホスホリパーゼDの活性を阻害する物質のスクリーニング用キット。
(26)リゾホスホリパーゼDが上記(11)記載の遺伝子によってコードされている蛋白質である、上記(25)記載のキット。
(27)リゾホスホリパーゼDが上記(12)記載の蛋白質である、上記(25)記載のキット。
発明の詳細な説明
本発明においてLPLDとは、リゾリン脂質のリン酸ジエステル結合のうちグリセロール骨格とは反対側の結合を切断する酵素である。具体的には、以下の(a)または(b)のDNAからなる遺伝子によってコードされた蛋白質、あるいは以下の(c)または(d)の蛋白質である。
(a)配列表配列番号1に記載の塩基配列からなる、リゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質をコードするDNA
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つリゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質をコードするDNA
(c)配列表配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(d)(c)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つリゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質
特に、本発明のLPLDは、以下の3つのアミノ酸配列を有する蛋白質であることが好ましい。
本発明においてリゾホスホリパーゼDは、リゾホスホリパーゼD活性を有する限りその由来に特に限定はなく、天然に存在する生物起源のものの他、自然もしくは人工の突然変異体、外来のリゾホスホリパーゼD遺伝子を導入して得られる形質転換体由来のものも全て包含される。
人工的に突然変異体を作製する方法としては、例えば、部位特異的突然変異誘発が挙げられる。より具体的には当該方法を用いて配列表配列番号1に示される塩基配列に任意の変異をもたらすことにより、変異リゾホスホリパーゼDを得ることができる。かくして得られる変異リゾホスホリパーゼDは、リゾリン脂質のリン酸ジエステル結合のうちグリセロール骨格とは反対側の結合を切断するというリゾホスホリパーゼD活性を有している。
本発明のリゾホスホリパーゼDは、(1)該酵素を産生する細胞または組織の培養物を原料として、あるいは全血、血清、血漿、尿および唾液等の生体試料から単離精製する方法、(2)化学的に合成する方法または(3)遺伝子組換え技術等によりリゾホスホリパーゼDを発現するように操作された細胞から精製する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。
本発明のリゾホスホリパーゼDの単離精製は、例えば以下のようにして行うことができる。すなわち適当な液体培地中で、リゾホスホリパーゼDを発現している細胞を培養し、得られる培養物から公知の方法で抽出、精製される。当該抽出、精製の方法は目的生成物の存在する画分に応じて適宜公知の手法が用いられる。
具体的には次のようにして行なわれる。まず、培養物をそのまま濾過又は遠心分離等の常法に付して細胞又は上清を回収する。細胞中に該酵素が蓄積されている場合には、当該回収した細胞を適当な緩衝液中に懸濁して、さらに界面活性剤を適当な濃度で加えて膜を可溶化する。次いで得られる粗抽出液を、必要ならば界面活性剤の存在下で、一般に用いられる方法を適宜組み合わせることによって該酵素を単離精製する。
該酵素が培養培地中に存在する場合には、まず培養物を濾過又は遠心分離に付して沈澱物(細胞等の固形物)を除去することにより、溶液部分のみを得、それを一般に用いられる方法を適宜組み合わせることによって目的物質を単離精製する。塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、SDS−PAGE等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。より具体的には、例えば、減圧濃縮、凍結乾燥、常用の溶媒による抽出、pH調整、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等の常用の吸着剤による処理、結晶化、再結晶化等の慣用の方法によって分離、精製することができる。
化学合成による本発明のリゾホスホリパーゼDの製造は、例えば配列表配列番号2に示されるアミノ酸配列を基にして、該アミノ酸をペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。
さらに本発明において、LPLDは、天然に存在する、全血、血清および血漿などの生体試料を精製過程に付すことによっても得ることができる。例えば、LPLDを含有する試料を、以下の工程に付すことによって得られ得る。
工程1:ポリエチレングリコール沈殿
工程2:ブルーセファロース6FFカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
工程3:コンカナバリンAセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー
工程4:BioAssistQカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
工程5:HiTrap Heparinカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
工程6:RESOURCE PHEカラムを用いる疎水性クロマトグラフィー
工程7:Econo−Pac CHT−IIカートリッジを用いるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
各工程における精製の程度は、HPLCで検出されるピークの数や強さ、SDS−PAGEで検出されるバンドの数、濃さ等で蛋白質として確認することができ、また、LPLD活性を指標に確認することもできる。
LPLD活性の測定は、例えば、LPLDがリゾホスファチジルコリンを基質としてリゾホスファチジン酸とコリンを生成する反応を利用して、リゾホスファチジルコリンを各工程で得られた各分画で処理して、産生されるコリンの量を測定することにより実施される。さらに、後述する本願発明のLPLD活性測定方法を用いてもよい。
リゾホスホリパーゼD遺伝子のクローニングは、通常、以下の方法により行なわれる。まず、リゾホスホリパーゼDを含む試料から、通常の方法に従って該酵素を完全または部分精製しN末端アミノ酸配列をエドマン法により決定する。決定された部分アミノ酸配列に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーまたはプローブとして用いて、既存のリゾホスホリパーゼDを産生する細胞または組織より調製されたcDNAまたはゲノミックDNAライブラリーからクローニングする。
あるいは、完全または部分精製されたリゾホスホリパーゼDの全部または一部を抗原として該酵素またはそのサブユニットに対する抗体を常法に従って作製し、リゾホスホリパーゼDを産生する細胞または組織より調製されたcDNAまたはゲノミックDNAライブラリーから、抗体スクリーニングにより該酵素をコードするDNAをクローニングすることもできる。
さらに、上述の方法とは別に、本発明のリゾホスホリパーゼDをコードするDNAは、PCR法を用いて直接クローニングすることもできる。すなわち、該酵素活性を有する細胞または組織由来のゲノミックDNAまたはcDNA(もしくはmRNA)を鋳型とし、増幅断片がリゾホスホリパーゼDのコード領域をカバーするような適当なオリゴヌクレオチドの対をプライマーとして用いて、常法に従ってPCRを行うことにより当該酵素のコード領域を含むDNA断片を増幅することができる。
得られたDNAインサートの塩基配列は、マキサム・ギルバート法やジデオキシターミネーション法等の公知のシークエンス技術を用いて決定することができる。
本発明のリゾホスホリパーゼDをコードする遺伝子は、配列表配列番号1に示される塩基配列から実質的になるDNAの、全部または一部を含むものである。ここで「実質的になるDNA」とは、上記特定の塩基配列からなるDNAに加えて、ストリンジェントな条件(本発明では、塩基配列において約60%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上の相同性を有するDNAがハイブリダイズし得る条件をいい、ストリンジェンシーはハイブリダイズ反応や洗浄の際の温度、塩濃度等を適宜変化させることにより調節することができる)において、上記の特定塩基配列からなるDNAとハイブリダイズし得る塩基配列からなるDNAを意味する。
本発明の遺伝子はいかなる方法で得られるものであってもよい。例えば、mRNAから調製される相補DNA(cDNA)、ゲノミックライブラリーから調製されるゲノミックDNA、化学的に合成されるDNA、RNA又はDNAを鋳型としてPCR法により増幅させて得られるDNA及びこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるDNA等が含まれる。
本発明はまた、上記のいずれかの遺伝子を含有する組換えベクターに関する。本発明の組換えベクターは、原核細胞および/または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当分野において入手可能なクローニングベクターまたは発現ベクターに上記のいずれかのDNAを適当な制限酵素部位を利用して挿入することによって調製することができる。
特に、本発明の組換えベクターはリゾホスホリパーゼDをコードする遺伝子を機能的に含む発現ベクターである。ここで「機能的に」とは、そのベクターに適合する宿主細胞内で該遺伝子(DNA)が転写され、それにコードされる蛋白質が産生され得るように該遺伝子が配置されていることを意味する。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、リゾホスホリパーゼDをコードする遺伝子、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列された発現カセットを有するベクターである。本発明の組換えベクターは、原核細胞および/または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター等が包含される。
当該組換えベクターは、簡便には当分野において入手可能な発現ベクターに本発明のリゾホスホリパーゼDをコードするDNAを常法により機能的に連結することによって調製することができる。用いる発現ベクターとしては、原核細胞および/または真核細胞の各種の宿主内でリゾホスホリパーゼDを発現し、生産する機能を有するものであれば特に制限されないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子を含有することが好ましい。例えば哺乳動物細胞を形質転換する場合、動物ウイルス、例えばSV40、RSV、MMLV等のプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが制限酵素部位、好ましくはマルチクローニング部位を介して連結したプラスミドに、pSV2−neo、pSV2−dhfr等のプラスミド由来の選択マーカー遺伝子(ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素等)を挿入したプラスミドが使用できる。
本発明の形質転換細胞は上述のリゾホスホリパーゼDをコードするDNAを含有する発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。宿主細胞は使用する発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞或いは人工的に樹立された組換え細胞等種々の細胞が利用できる。具体的には、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母等の真菌類、動物細胞または昆虫細胞等が例示される。好ましくは哺乳動物細胞、特にラット由来細胞、ハムスター由来細胞(CHO、BHK等)、マウス由来細胞(COP、L、C127、Sp2/0、NS−1、NIH T3等)、サル由来細胞(COS1、COS3、COS7、CV1、Velo等)およびヒト由来細胞(Hela、2倍体線維芽細胞由来細胞、ミエローマ細胞、Namalwa等)が挙げられる。
発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、哺乳動物細胞に導入する場合、リン酸カルシウム共沈澱法、プロトプラスト融合法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リソソーム法等が挙げられる。
本発明のリゾホスホリパーゼDは上記のごとく調製される発現ベクターを含む形質転換体を培養することによっても製造することができる。培地は、宿主細胞(形質転換体)の生育に必要な炭素源、無機もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性デンプン、ショ糖等が、窒素源としては、例えばアンモニウム塩、硝酸塩、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、馬鈴薯抽出液等が例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩(塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等)、ビタミン類、抗生物質(テトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、アンピシリン等)〕を含んでいてもよい。
培養は当分野において知られている方法により行われる。培養条件は蛋白質の発現が可能な条件であって、例えば温度、培地のpHおよび培養時間は当該酵素が大量に生産されるように適宜選択される。
例えば、宿主が動物細胞である場合、培地としては例えば約5〜20%のウシ胎児血清(FCS)を含む最小必須培地(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、RPMI−1640培地、199培地等を用いることができる。培地のpHは約6〜8であることが好ましく、培養は通常30〜40℃で約15〜72時間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
本発明のリゾホスホリパーゼDは上記培養により得られる培養物から、前述のリゾホスホリパーゼDを発現している細胞の培養物からの単離・精製と同様にして採取することができる。
かくして得られた精製LPLDあるいは組換えLPLDは、例えば表1に記載されるような基質特異性を有する。
反応生成物の中でも特にリゾホスファチジン酸(LPA)は、細胞増殖の促進や平滑筋収縮、癌細胞の浸潤促進等の生理活性を有し、スフィンゴシン1−リン酸は、癌細胞の走化性運動調節や細胞増殖等の生理活性を有する、生体内で重要な物質である。
さらに精製LPLDあるいは組換えLPLDを免疫抗原として用いて当業者は常法に従って抗体を作成することができる。また、配列表配列番号2に記載のアミノ酸配列をもとにして、部分アミノ酸配列に対応するペプチド抗体を作成することも可能である。
免疫抗原は好ましくはアジュバントと混合させて調製する。該抗原の免疫性が低い場合は、該抗原にウシ血清アルブミン(BSA)等のキャリアタンパクを結合させたものを用いることが好ましい。免疫化の対象として用いられる動物は例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、マウス等の哺乳動物が使用される。免疫にはこれらの哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フットパット内あるいは腹腔内に1乃至数回注射することにより行われる。通常、初回免疫から約1〜2週間毎に1〜4度免疫を行いさらに約1〜4週間後に最終免疫を行って、最終免疫より数日後に免疫感作された動物から、特異抗体を抗血清として得る。マウスやモルモット等に免疫して、従来公知の方法を用いてモノクローナル抗体を作製することもできる。該抗体は必要に応じて適宜精製して用いることが好ましい。精製方法としては具体的には、硫酸アンモニウム沈澱法、プロテインAを用いた方法および抗原ポリペプチドおよび/またはペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いる方法等が例示される。
得られた特異抗体は、LPLDのさらなる精製やLPLDと、LPLDが関与していると考えられている種々の疾患、現象を研究するツールとして有用である。
本発明のLPLD活性測定方法ならびにLPLDの活性を阻害する物質のスクリーニング方法において基質として使用するリゾリン脂質は、下記一般式(I)
(式中、R1とR2は互いに異なり、その一方は飽和又は不飽和の炭素数8から22の脂肪酸残基であり、その一方は水素原子またはアセチル基であり、Xは発色基である)によって表される。
本発明において、「飽和又は不飽和の炭素数8から22の脂肪酸残基」とは、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸等の飽和脂肪酸の残基、およびマッコウ酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、α−エレオステアリン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の不飽和脂肪酸の残基等が例示され、好ましくはリノール酸残基、オレイン酸残基、パルミチン酸残基、ミリスチン酸残基である。
一般式(I)中、Xにおける「発色基」とは、当該リゾリン脂質から遊離することにより、可視可能な光線又は紫外線を吸収する物質又は蛍光を発する物質(以下発色性化合物ともいう)あるいはその前駆体となり得る残基を意図する。ここで前駆体とは、さらに別の発色用試薬と反応させることにより可視可能な光線又は紫外線を吸収する物質又は蛍光を発する物質となるものをいう。
具体的な発色基としては、例えば置換フェノール部〔例えば、p−ニトロフェノール、5−ヒドロキシ−2−ニトロ安息香酸、2−ヒドロキシ−5−安息香酸、N,N,N−トリメチル−N−(5−ヒドロキシ−2−ニトロフェニル)アンモニウムクロリド、N,N,N−トリメチル−N−(2−ヒドロキシ−5−ニトロフェニル)アンモニウムクロリド、3−アミノ−4−ニトロフェノール、2−アミノ−4−ニトロフェノール、5−ヒドロキシ−2−ニトロベンゼンスルホン酸およびo−ニトロフェノール等〕を含む残基、ナフトールまたはナフトール部〔例えば、α−ナフトール、4−アミノ−1−ナフトール、4−ヒドロキシ−1−トリメチルアンモニウムナフタレンクロリド、4−ヒドロキシ−1−ナフトエ酸、3−アミノ−1−ナフトール、4−ヒドロキシ−2−トリメチルアンモニウムナフタレンクロリド、4−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、8−アミノ−1−ナフトール、8−ヒドロキシ−1−トリメチルアンモニウムナフタレンクロリド、8−ヒドロキシ−1−ナフトエ酸、5−アミノ−1−ナフトール、5−ヒドロキシ−1−トリメチルアンモニウムナフタレンクロリド、5−ヒドロキシ−1−ナフトエ酸および2−ニトロ−1−ナフトール等〕を含む残基、置換ウンベリフェロン部〔4−メチルウンベリフェロン、3−アミノ−4−メチルウンベリフェロン、3−トリメチルアンモニウム−4−メチルウンベリフェロンクロリド、4−メチル−5−アミノウンベリフェロン、4−メチル−6−アミノウンベリフェロン、5−トリメチルアンモニウム−4−メチルウンベリフェロンクロリド、6−トリメチルアンモニウム−4−メチルウンベリフェロンクロリド、4−メチルウンベリフェロン−5−スルホン酸、4−メチルウンベリフェロン−6−スルホン酸、3−トリメチルアンモニウム−4−メチルウンベリフェロン−5−スルホン酸エステル、3−トリメチルアンモニウム−4−メチルウンベリフェロン−5−カルボン酸クロリドおよび3−トリメチルアンモニウム−4−メチルウンベリフェロンクロリド等〕を含む残基等が挙げられる。
置換フェノール部を含む残基として、好ましくはp−ニトロフェニル基であり、p−ニトロフェニル基が結合した本発明のリゾリン脂質を酵素分解することによって発色性化合物であるp−ニトロフェノールが遊離される。p−ニトロフェノールは400nm付近(好ましくは405nm)に吸収極大を有する。
ナフトールまたはナフトール部を含む残基として、好ましくはα−ナフチル基であり、α−ナフチル基が結合した本発明のリゾリン脂質を酵素分解することによって発色性化合物前駆体であるα−ナフトールが遊離される。α−ナフトールはジアゾ化により発色性化合物となり得る。
置換ウンベリフェロン部を含む残基として、好ましくは4−メチルウンベリフェリル基であり、4−メチルウンベリフェリル基が結合した本発明のリゾリン脂質を酵素分解することによって発色性化合物である4−メチルウンベリフェロンが遊離される。4−メチルウンベリフェロンは蛍光性化合物であり、分光蛍光光度計等によってその蛍光を定量することができる。
測定の容易性から、発色基として好ましくは、p−ニトロフェニル基またはα−ナフチル基である。
本発明の一般式(I)で表されるリゾリン脂質は、公知の方法を適宜組み合わせて好適に製造することができる。後述の合成例で詳細が説明されるが、例えば商業的に入手可能なリン脂質を出発原料として用い、当該出発原料をホスホリパーゼCで酵素分解し、得られるジグリセリドと、商業的に入手可能な発色基を有する化合物とを、溶媒中、縮合剤の存在下で反応させることによって発色基が結合したリン脂質が得られる(当該リン脂質の合成方法としては、他にAnalytica.Chimica.Acta.304,249−254,1995に記載された方法に準じた方法を用いることもできる)。当該リン脂質をホスホリパーゼAやリパーゼにより酵素分解し、本発明のリゾリン脂質を得ることができる。より具体的には以下のような方法が例示される。
市販の大豆由来のホスファチジルコリン又は卵黄由来のホスファチジルコリンを出発原料として用い、これらの出発原料をホスホリパーゼC(例えばウェルッシュ菌由来)で酵素分解し、得られる大豆由来又は卵黄由来のジグリセリドと市販の4−ニトロフェニルホスホロジクロライドを無水ピリジン等の溶媒中、トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロライド等の縮合剤と反応させることによって、大豆由来又は卵黄由来ホスファチジル−p−ニトロフェノールが得られる。かくして得られた化合物からホスホリパーゼA2(例えばコブラ毒由来)による酵素分解により、本発明の新規な大豆由来又は卵黄由来の1−アシルホスファチジル−p−ニトロフェノールを、また、リパーゼ(例えばクモノスカビ由来)による酵素分解により、本発明の新規な大豆由来又は卵黄由来の2−アシルホスファチジル−p−ニトロフェノールを得ることができる。
別法として、市販の大豆由来ホスファチジルコリンを出発原料として、ホスホリパーゼA2又はリパーゼにより酵素分解によって得られる大豆由来1−アシルホスファチジルコリン又は大豆由来2−アシルホスファチジルコリンと無水酢酸をクロロホルム等の溶媒中、4−ジメチルアミノピリジン及びN,N−ジイソプロピルアミン等の触媒の存在下反応させ、大豆由来1−アシル−2−アセチル−ジグリセリド又は大豆由来1−アセチル−2−アシル−ジグリセリドを得る。これらの化合物に前記と同様の方法により、p−ニトロフェニル基を導入し、本発明の新規な大豆由来1−アシル−2−アセチル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール又は大豆由来1−アセチル−2−アシル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールが得られる。
本発明は、上記リゾリン脂質を有効成分として含有する、LPLD活性測定用試薬を提供する。当該測定用試薬は、後述のLPLD活性を阻害する物質のスクリーニング方法においても、その活性を測定する際に使用することができる。当該測定用試薬には基質としてのリゾリン脂質に加え、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、防腐剤等の添加剤を含んでいてもよく、さらに必要に応じて酵素の活性化剤や夾雑物質の影響緩和剤を配合することもできる。本発明の測定用試薬の形態は、乾燥粉末状、液状等特に制限されるものではない。また、乾燥粉末状に製した場合等、使用時に溶解、希釈等の処理が必要な場合には、当該処理に必要な要素(例えば緩衝液等)を後述する本発明のLPLD活性測定用キットあるいはLPLD活性を阻害する物質のスクリーニング用キットに含めておいてもよい。溶解、希釈等の処理に必要な溶液は、基質の溶解性に応じて選択され、緩衝液等の水系のものであっても、有機溶媒系であってもかまわない。また、第1反応試薬と第2反応試薬との組み合わせのように、反応液中への添加時期が異なる2種類以上の試薬を適宜組み合わせたものでもよいし、1試薬系であってもよい。
さらに、本発明は、上述の発色基を有するリゾリン脂質を基質として用いることを特徴とするLPLDの活性を測定する方法、ならびにLPLDの活性を阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。当該測定方法ならびにスクリーニング方法は共通して以下の工程を有する。
(1)試料に一般式(I)で表されるリゾリン脂質(上述)を添加し、当該リゾリン脂質と試料中のLPLDとを反応させる。
(2)上記(1)の工程により遊離した発色性化合物の量を比色定量する。
但し、当該発色性化合物がその前駆体として遊離された場合には、適当な発色用試薬を用いて発色性化合物に変換した後、当該化合物の量を比色定量する。
本発明のLPLDの活性を阻害する物質のスクリーニング方法では、上記工程に加え、当該LPLDを含有する試料に、被検物質を添加する工程、および当該被検物質を添加した場合に遊離する発色性化合物の量と、被検物質未添加の場合に遊離する発色性化合物の量とを比較する工程を含む。この比較する工程は、それぞれの場合に観察される発色の程度を比色定量する(後述)ことによって実施される。
「被検物質」とは、LPLD活性に及ぼす影響を調べようとする対象全てを意図し、既知であっても、新規なものであってもよい。また、合成されたものであっても天然に存在するものであっても構わない。その態様もLPLDとリゾリン脂質との反応を阻害しない限りは特に限定されず、化合物として精製されたものであっても未精製の組成物の状態でもよく、また、固体状であっても液状であってもよい。液状の場合、その溶媒は特に限定されない。
「試料」とは、LPLDの存在の有無ならびにその活性の程度を測定する対象すべてを意味し、LPLDが存在する可能性がある各種生体試料をはじめ、当該測定のための標準試料や対照試料、LPLD不含の各種緩衝液も包含される。より具体的には、例えば全血、血清、血漿、尿、唾液、腹水、髄液等の臨床検査で用いられる体液成分、動物や植物の細胞抽出液といった基礎研究で使用されるもの等が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法で用いられる「LPLDを含有する試料」としては、上記「試料」に準じたものが挙げられる。既知量のLPLDを含有する試料に加え、本発明では、被検物質未添加の場合とその活性の程度を比較することによりスクリーニングを行うので、LPLDを含有する同一の試料であれば、そこに含まれるLPLDの絶対量について特に定める必要はなく、かかる試料も本発明のスクリーニング方法において使用可能である。
好ましくは該「LPLDを含有する試料」としては、既知量の高度に精製されたLPLDを含有する試料、より好ましくは既知量の組換えLPLDを含有する試料が用いられる。特に試料が血清の場合、既知量の高度に精製されたLPLDを含有する血清あるいは既知量の組換えLPLDを含有する血清は、本願発明の活性測定方法ならびにスクリーニング方法の対照試料、標準試料として有用な管理血清として用いることができる。
既知量の高度に精製されたLPLDを含有する試料は、上述のようにLPLDを含有する試料を、精製過程に付すことによって得ることができる。より詳細な手順は実施例に後述する。あるいはLPLD不含のまたはLPLD含有量が既知の試料に既知量の高度の精製されたLPLDを添加することによって調製することができる。
既知量の組換えLPLDを含有する試料は、既知量の組換えLPLD(上述)を試料に添加することによって得ることができる。
基質であるリゾリン脂質と試料との反応条件は、使用する基質や試料の種類、状態により適宜好適に設定されるが、通常、以下の通りである。
反応温度
当該基質が安定であり、且つLPLDの活性を維持し得る温度であれば特に限定されないが、測定の容易性、自動化等を考慮すれば、通常25〜40℃、好ましくは35〜40℃程度で測定する。
反応時間
本発明は遊離した発色性化合物の量を比色定量することを含むものであり、吸光度の経時的変化を測定することによって実施される。従って、リゾリン脂質と試料との反応開始後ただちにモニタリングを開始する。基質から発色性化合物を遊離するには、その基質の種類や、他の反応条件によっても異なるが、通常5分〜数時間で反応を行う。従って本発明では好ましくは5分〜1時間吸光度の変化をモニタリングする。
反応pH
LPLDが当該基質と反応し、その酵素反応を測定し得るpHであれば特に限定されない。また、用いる発色基によっては、LPLD活性のpHと発色反応のpHが異なっていてもよい。例えば、発色基としてp−ニトロフェニル基を用いた場合、LPLD反応によって遊離したp−ニトロフェノールは、アルカリ条件下でのみ発色する(金島才二ら、臨床検査41、1025−1028、1997)。よって、LPLD活性の至適pHが酸性域、あるいは中性付近である場合にはLPLDを含んだ試料と、当該基質とを一定時間反応させた後、アルカリ条件下で発色反応を行うことが可能である。ただし、LPLD活性の至適pHがアルカリ域である際には、LPLD反応と発色反応を同一pHにて同時に行うことができる。
基質濃度
基質濃度は、その基質の種類や、他の反応条件によっても異なるが、夾雑成分の影響を受けにくく、且つ、試料中のLPLDと十分に反応し得る量であれば特に限定されず、好適な量が適宜設定される。具体的には最終濃度1mmol/L以上、好ましくは2mmol/L〜10mmol/L、特に好ましくは2mmol/L〜5mmol/L程度である。1mmol/Lよりも少ないと、ブランクとの差が小さく有意な値が得にくい。
遊離した発色性化合物は比色定量することによってその量を測定する。当該比色定量の方法は発色性化合物の種類によって適宜選択され、当分野で公知の手法によって実施される。例えば発色性化合物がp−ニトロフェノールの場合、得られる黄色の発色を400nm付近の吸光度の変化として分光光度計等によって測定する。発色性化合物が4−メチルウンベリフェロンの場合、分光蛍光光度計等によってその蛍光を測定する。α−ナフトールの場合、ジアゾ化剤を用いてカップリング反応を行うことにより、発色性化合物、即ちアゾ化合物とし、当該化合物の発色を分光光度計等によって測定する。ジアゾ化剤としては、例えばFast Red TR、p−ジアゾベンゼンスルホン酸等が挙げられる。ジアゾ化剤等、さらなる発色用試薬が必要な場合には、当該試薬を後述の本発明のLPLD活性測定用キット、LPLDの活性を阻害する物質のスクリーニング用キットに含めておいてもよい。
本発明のスクリーニング方法において、被検物質および基質である本発明のリゾリン脂質の試料中への添加の時期は、被検物質のLPLD活性に及ぼす影響が十分に反映されるように適宜設定される。例えば、当該影響が速やかに現れる場合には、被検物質と基質であるリゾリン脂質の添加をほぼ同時に行うことができるが、通常、被検物質と試料中のLPLDとをあらかじめ十分に反応させた後、基質である本発明のリゾリン脂質を添加し、本発明のLPLD活性測定を実施する。
本発明においては、本発明のLPLD活性測定あるいはLPLDの活性を阻害する物質のスクリーニングに必要とされる各成分をまとめて梱包しキットとしてもよい。
かかるキットには、基質となるリゾリン脂質に加えて、必要に応じて溶解溶液や、発色用試薬等の反応に必要な要素が含まれる。好ましくは、標準溶液および対照溶液が含められる。さらに、当該測定に必要な要素の他に、反応用容器や、マニュアル等も併せて梱包しておくことも、簡便性という観点から好ましい。LPLD活性を阻害する物質のスクリーニング用キットには、LPLDを含有する試料を含めることが好ましい。該「LPLDを含有する試料」としては、好ましくは「既知量の高度に精製されたLPLDを含有する試料」であり、特に好ましくは「既知量の組換えLPLDを含有する試料」である。当該キットにLPLDを含有する試料をあらかじめ含めておくことで、同一試料を用いて、被検物質添加時および未添加時のLPLD活性の変化を測定することができる。
本発明のスクリーニング方法によって得られるLPLD活性を阻害する物質は、当該LPLD阻害作用によりLPAの産生を抑制することができ、LPAの過剰な、あるいは異常な産生に起因すると考えられる種々の疾患に好適に使用することができる。例えば、動脈硬化症の予防、治療に用いることができる。
実施例
以下、本発明を実施例にて具体的且つ詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。また、特に断りのない限り、以下の実施例で使用する試薬等の各材料は、商業的に入手可能であり、添付のマニュアルに基づいて使用することができる。
実施例1:1−アシルリゾホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成(1)大豆由来1−リノレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール:
(1)大豆由来1,2−ジリノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成
大豆由来のジリノレオイルグリセロール2.68g(4.3mmol)と4−ニトロフェニルホスホロジクロライド0.916g(3.6mmol)をP2O5上で約2時間乾燥させた後、無水ピリジン10mLを添加し十分に懸濁後、塩化2,4,6−トリイソプロピルベンゼンスルホニル2.71g(8.95mmol)を加えて室温下一晩反応させた。この反応液に水を入れて混合、攪拌し、さらにエタノール、トルエンを加えて、減圧濃縮乾固した。得られた乾固物にジエチルエーテルを加えて、不溶部分を除去し、可溶部分を得て、これを少量のクロロホルムに溶解し、同溶媒系で活性化したシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付してクロロホルム−メタノール系の溶出液を用いて精製を行い、黄色油状物1.45gを得た。
(2)大豆由来1−リノレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール
上記(1)で得られた黄色油状物564mgをジエチルエーテル20mLに溶解し、次いでホスホリパーゼA2(コブラ毒由来;和光純薬工業株式会社)100mgをpH6.5の0.1mol/Lホウ酸−リン酸緩衝液10mL及び1mol/L塩化カルシウム0.1mLに溶解した後、お互いを混合し、48時間反応させた。反応後ジエチルエーテル画分を減圧濃縮し、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、クロロホルム−メタノール系の溶出液を用いて精製を行い、黄色油状物として表題化合物252mgを得た。
ESI−MS(Negative)m/z 554[m−H]−
NMR(溶媒CDCl3)
1H−NMR:0.87−0.92(m,3H),1.27−1.48(m,20H),2.05−2.11(m,4H),2.76−2.79(m,2H),3.55−4.07(m,4H),4.53(s,1H),5.33−5.41(m,2H),7.32−7.35(d,2H),8.06−8.09(d,2H)
13C−NMR:13.52(methyl),22.04−33.42(methylenes,10signals),62.05(methylenes),74.96(methyne),119.58 and 124.89(aroma),127.36,127.65,129.37 and 129.74(vinyl C),142.98 and 156.94(aroma),173.54(C=0)
実施例2:1−アシルリゾホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成(2)
卵黄由来1−オレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール:
(1)卵黄由来ジアシルホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成
卵黄由来のジアシルグリセロール1.75g(2.95mmol)と4−ニトロフェニルホスホロジクロライド0.686g(2.68mmol)ならびに塩化2,4,6−トリイソプロピルベンゼンスルホニル2.02g(6.7mmol)を用いて実施例1(1)に準じて合成、精製を行うことにより黄色油状物1.41gを得た。
(2)卵黄由来1−オレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール
上記(1)で得られた黄色油状物573mgをホスホリパーゼA2(コブラ毒由来;和光純薬工業株式会社)123mgを用いて、実施例1(2)に準じて加水分解し、精製を行うことにより黄色油状物として表題化合物221mgを得た。
ESI−MS(Negative)m/z 556[m−H]−
NMR(溶媒CDCl3)
1H−NMR:0.87−0.91(m,3H),1.28−1.48(m,22H),2.02−2.11(m,4H),2.78−2.79(m,2H),3.55−4.06(m,4H),4.52(s,1H),5.33−5.36(m,2H),7.32−7.35(d,2H),8.07−8.10(d,2H)
13C−NMR:13.56(methyl),22.15−33.43(methylenes,10signals),62.40(methylenes),75.02(methyne),119.59 and 124.91(aroma),127.64,129.07 and 129.57(vinyl C),143.00 and 157.03(aroma),173.55(C=0)
実施例3:2−アシルリゾホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成(1)
大豆由来1−ヒドロキシ−2−リノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール:
実施例1(1)で得られた化合物1.45gをジエチルエーテル50mLに溶解し、次いでリパーゼ(クモノスカビ由来:生化学工業株式会社)1gをpH6.5の0.1mol/Lホウ酸−リン酸緩衝液14mL及び1mol/L塩化カルシウム0.1mLに溶解した後、お互いを混合し、48時間反応させた。反応後ジエチルエーテル画分を減圧濃縮し、濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、クロロホルム−メタノール系の溶出液を用いて精製を行い、黄色油状物として表題化合物568mgを得た。
ESI−MS(Negative)m/z 554[m−H]−
NMR(溶媒CDCl3)
1H−NMR:0.87−0.92(m,3H),1.23−1.47(m,20H),2.04−2.17(m,4H),2.75−2.79(m,2H),3.62−4.12(m,4H),4.96−4.98(m,1H),5.32−5.41(m,2H),7.27−7.31(d,2H),8.01−8.04(d,2H)
13C−NMR:13.52(methyl),22.04−33.66(methylenes,10signals),59.74 and 64.31(methylenes),72.12(methylene),119.50 and 124.86(aroma),127.36,127.64,129.37 and 129.74(vinyl C),142.94 and 156.83(aroma),173.40(C=0)
実施例4:2−アシルリゾホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成(2)
卵黄由来1−ヒドロキシ−2−オレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール:
実施例2(1)で得られた化合物714mgをリパーゼ700mgを用いて、実施例3に準じて加水分解し、精製を行うことにより表題化合物374mgを得た。
ESI−MS(Negative)m/z 556[m−H]−
NMR(溶媒CDCl3)
1H−NMR:0.87−0.91(m,3H),1.24−1.47(m,22H),2.02−2.17(m,4H),2.77−2.83(m,2H),3.63−4.12(m,4H),4.97(s,1H),5.36(m,2H),7.32−7.31(d,2H),8.02−8.04(d,2H)
13C−NMR:13.55(methyl),22.14−33.66(methylenes,11signals),59.77 and 64.32(methylenes),72.05(methylene),119.57 and 124.88(aroma),127.35,127.65,129.04 and 129.57(vinyl C),143.02 and 156.79(aroma),173.43(C=0)
実施例5:活性測定1(反応pH)
(1)試薬の調製
試薬A:N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−3−プロパンスルホン酸(200mmol/L)、トリトンX−100(0.02%)
試薬B:試薬Aを分取し、それぞれpH7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6に調整した後、2倍に希釈して、pHの異なる試薬Bを調製した。
試薬C:pH4.5
クエン酸1水和物(10mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)、上記実施例で調製した1−ヒドロキシ−2−リノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例3;10mmol/L)
(2)試料
市販の管理血清2種類、それぞれ検体1(コンセーラ:日水製薬株式会社製)および検体2(リピッドセーラムII:栄研化学株式会社製)、さらに血清中のアルブミン画分における活性を調べるために、5%ヒト血清アルブミン(脂肪酸フリー:シグマ社製)溶液を用いた。
(3)測定
マイクロプレートに、各試料10μLおよび試薬B150μLを分注し、37℃で約5分間加温した。これに試薬Cを50μL添加した後、経時的に主波長405nm、副波長540nmの吸光度を測定し、LPLDの作用によって遊離したp−ニトロフェノールに依存する、1分間あたりの吸光度変化量からLPLD活性を求めた。活性は、反応液1mLあたり、1分間に遊離したp−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図1に示す。pHがアルカリ側の方が活性は強いが、ヒト血清アルブミン画分中の活性も上昇する。よってpH8以下ではよりアルブミンの影響を少なくした活性測定が可能となる。
実施例6:活性測定2(基質)
(1)試薬の調製
試薬A:pH8.0
2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(100mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬B:pH4.5
クエン酸1水和物(10mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬C:上記実施例で調製した、大豆由来1−ヒドロキシ−2−リノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例3;基質A)、大豆由来1−リノレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例1;基質B)、卵黄由来1−ヒドロキシ−2−オレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例4;基質C)、卵黄由来1−オレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例2;基質D)の100mmol/L相当の溶液を、それぞれ試薬Bで10倍希釈し、試薬Cとして使用した。
(2)試料
試料として、ヒト血清を用い、血清中のアルブミン画分における活性を調べるために、5%ヒト血清アルブミン(脂肪酸フリー:シグマ社製)溶液を、さらにホスホリパーゼD(PLD)との反応性を調べるため、ストレプトマイセス属由来のPLD(商品略号PLDP:旭化成工業株式会社)の5U/mL溶液を使用した。
(3)測定
マイクロプレートに、各試料10μLおよび試薬A150μLを分注し、37℃で約5分間加温した。これに試薬Cを50μL添加した後、経時的に主波長405nm、副波長540nmの吸光度を測定し、LPLDの作用によって遊離したp−ニトロフェノールに依存する、1分間あたりの吸光度変化量からLPLD活性を求めた。活性は、反応液1mLあたり、1分間に遊離したp−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図2に示す。ヒト血清アルブミンに対する応答性は基質BやDといった、1−アシル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノールの方が、基質AやCといった1−ヒドロキシ−2−アシル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールよりも高いのに対し、ヒト血清に対する応答性は1−ヒドロキシ−2−アシル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールの方が1−アシル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノールよりも高い。このことから、特に1−ヒドロキシ−2−アシル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールを基質として用いた場合に、アルブミンの影響をより少なくしてLPLD活性を測定することができる。
またこれらの基質は、反応の強弱はあるものの、すべてストレプトマイセス属由来のPLDの基質となり得ることがわかった。PLDが正常ヒト血清中に存在するという報告はないが、PLDが試料中に混在している場合には、上記基質のうち、基質Aまたは基質Bを使用することが好ましい。
実施例7:活性測定3(基質濃度)
(1)試薬の調製
試薬A:pH8.0
2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(100mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬B:pH4.5
クエン酸1水和物(10mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬C:基質として上記実施例で調製した大豆由来1−ヒドロキシ−2−リノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例3)を用い、それぞれ0,0.5,1.0,2.0,3.0,5.0,10,20,30,50mmol/Lとなるように試薬Bで希釈し、試薬Cとした。
(2)試料
試料として、ヒト血清を用い、血清中のアルブミンの反応を調べるために、5%ヒト血清アルブミン(脂肪酸フリー:シグマ社製)溶液を使用した。
(3)測定
マイクロプレートに、各試料10μLおよび試薬A150μLを分注し、37℃で約5分間加温した。これに試薬Cを50μL添加した後、経時的に主波長405nm、副波長540nmの吸光度を測定し、LPLDの作用によって遊離したp−ニトロフェノールに依存する、1分間あたりの吸光度変化量からLPLD活性を求めた。活性は、反応液1mLあたり、1分間に遊離したp−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図3に示す。基質の終濃度として、5mmol/L以上の添加が望ましい。
実施例8:活性測定4(試料の希釈直線性)
(1)試薬の調製
試薬A:pH8.0
2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(100mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬B:pH4.5
クエン酸1水和物(10mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)、
大豆由来1−ヒドロキシ−2−リノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール(実施例3;20mmol/L)
(2)試料
試料として、ヒト血清を生理食塩水にて5段階希釈したものを使用した。
(3)測定
マイクロプレートに、各試料10μLおよび試薬A150μLを分注し、37℃で約5分間加温した。これに試薬Bを50μL添加した後、経時的に主波長405nm、副波長540nmの吸光度を測定し、LPLDの作用によって遊離したp−ニトロフェノールに依存する、1分間あたりの吸光度変化量からLPLD活性を求めた。活性は、反応液1mLあたり、1分間に遊離したp−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図4に示す。図4に示すように原点を通過する良好な直線が得られた。このことは、本発明の活性測定法が、ヒト血清中のLPLD活性を、定量的に測定し得ることを示している。
実施例9:リゾホスホリパーゼDの精製(ウシリゾホスホリパーゼD)
以下の工程は、(3)の溶出時以外、全て4℃で行った。
(1)ポリエチレングリコール(PEG)沈殿
原料となるウシ胎児血清(FCS)2Lに対して50%PEGをゆっくりと添加し、PEG終濃度5%とした。10分間攪拌した後、20,400gで60分間遠心し、その上清を回収した。さらに終濃度が10%になるまで50%PEGをゆっくりと添加した後、20,400gで60分間遠心し、得られた沈殿物を緩衝液A(20mMTris−HCl(pH7.4))400mLに懸濁させた。
(2)ブルーセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー
前記懸濁液を、緩衝液Aで平衡化したブルーセファロース6FF(ファルマシア社、カラムサイズ、50mL)に添加し、緩衝液Aで洗浄した。緩衝液A中でのNaClの直線濃度勾配(0−2M)により、LPLDを自然落下にて溶出させ、LPLD活性を示す画分を集めた。
(3)コンカナバリンA(ConA)セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー
前記活性画分を、緩衝液B(500mMのNaClを含む緩衝液A)で平衡化したConAセファロース(ファルマシア社、カラムサイズ、3mL)に添加し、緩衝液Bで洗浄した。これを室温にて緩衝液C(5mMのα−メチルマンノシドを含む緩衝液B)により、LPLDを自然落下にて溶出させ、LPLD活性を示す画分を集め、緩衝液Aにて透析した。
(4)BioAssistQカラムを用いる陰イオン交換クロマトグラフィー
前記透析物を緩衝液D(20mMTris−HCl(pH8.0))で平衡化したBioAssistQ(東ソー社、カラムサイズ0.8mL)に添加し、緩衝液Dで洗浄した。緩衝液D中でのNaClの直線濃度勾配(0−2M)により、LPLDを1.0mL/分にて溶出させ、LPLD活性を示す画分を集めた。
(5)ヘパリンカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
前記活性画分を緩衝液E(10%グリセロールを含む緩衝液A)にて10倍希釈したものを、緩衝液Eで平衡化したHiTrap Heparinカラム(ファルマシア社、カラムサイズ、1mL)に添加し、緩衝液Eで洗浄した。緩衝液E中でのNaClの直線濃度勾配(0−2M)により、LPLDを0.5mL/分にて溶出させ、LPLD活性を示す画分を集めた。
(6)RESOURCE PHEカラムを用いる疎水性クロマトグラフィー
前記活性画分に5M NaClを添加し、NaCl終濃度が2Mになるようにした。これを緩衝液F(2M NaClを含む緩衝液A)で平衡化したRESOURCE PHE(ファルマシア社、カラムサイズ、1mL)に添加し、緩衝液Fで洗浄した。これを1mM EDTAによりLPLDを1.0mL/分にて溶出させ、LPLD活性を示す素通り画分を集めた。
(7)ハイドロキシアパタイト(HAT)を用いる非特異的吸着
前記活性画分を緩衝液G(10%グリセロールを含む1mM NaH2PO4−NaOH(pH7.4))により10倍希釈したものを、緩衝液Gで平衡化したHAT(Bio−Rad社製、カラムサイズ1ml)に添加し、緩衝液Gで洗浄した。緩衝液G中でのNaH2PO4−NaOHの直線濃度勾配(1−150mM)により、LPLDを0.8mL/分にて溶出させた後、LPLD活性を示す画分を集め、ウシホスホリパーゼDの部分精製品を得た。
(8)各画分のリゾホスホリパーゼD活性の測定
原料であるFCS、ならびに上記(1)〜(7)で得られた各画分のそれぞれについてリゾホスホリパーゼD活性を測定することにより精製の程度を確認した。
各画分のリゾホスホリパーゼDの活性の測定は、反応混合液(100mMトリス塩酸(pH9.0)、500mM塩化ナトリウム、5mM塩化マグネシウム、0.05%トリトンX−100、1mMリゾホスファチジルコリン)中で行った。前記反応混合液に試料(FCS、(1)〜(7)で得られた各画分のいずれか)を加え100μLとし、37℃で60分間加温した。その内、15μLを測定試液(100mMトリス塩酸(pH8.0)、0.375mM N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、0.25mM 4−アミノアンチピリン、0.01% トリトンX−100、7.5U/mLパーオキシダーゼ、2.5U/mL コリンオキシダーゼ)200μLと10分間反応させた後、550nmにおける吸光度を測定した。測定値は前記反応混合液の代わりに、50μMの塩化コリンを用いた際の吸光度を基準に換算した。
結果を精製表として表2に示す。
実施例10:ウシリゾホスホリパーゼDの部分アミノ酸配列の決定
実施例9で得られたウシリゾホスホリパーゼDの部分精製品中の蛋白質を、10%トリクロロ酢酸を用いて沈殿させることによりウシリゾホスホリパーゼDを濃縮し、10%アクリルアミドSDS−PAGEによって蛋白質を分画した。CBB染色後、リゾホスホリパーゼD活性とよい相関性を示した分子量約100KDaの蛋白質のバンドをアクリルアミドゲルから切り出し、リジルエンドペプチダーゼ酵素処理を行った。さらに、得られたペプチド断片をC4逆相カラムクロマトグラフィーにより分画した。これらのペプチドのうち、3本について、エドマン法によりアミノ酸配列を決定した。
得られた部分アミノ酸配列について、BLAST−Tプログラムを用い、ホモロジー検索を行ったところ、得られた全ての配列がヒト、マウス、ラットのautotaxin(配列表配列番号2)と極めて高い相同性を示した。autotaxinは、癌細胞の運動性促進因子として知られ、ヌクレオチドピロホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ活性を有し、様々なヌクレオチド化合物に作用することが報告されている蛋白質であるが、当該蛋白質ならびにそれに類似する蛋白質がLPLD活性を有し、リン脂質に作用するという報告はない。
実施例11:組換え宿主細胞におけるLPLD活性の発現
実施例10の結果より、autotaxinにLPLD活性があることが予測されたため、ラットのautotaxinのcDNAを用いて形質転換体を作成し、該形質転換体のLPLD活性の発現について調べた。
報告されているラットautotaxinの配列(配列表配列番号1)から、逆転写酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法により、ラットautotaxinをコードするcDNAを単離した。鋳型としては、ラット肝臓由来のRNAから逆転写酵素で合成したcDNAを使用した。
得られたcDNAを発現ベクターpcDNA3のBamH I/Xho I部位に挿入し、cDNAのC末にはmycタグを導入した。得られたcDNAをリポフェクトアミンを用いてCHO−K1細胞へ一過的に導入した。
48時間後、培養上清を回収し、抗mycタグ抗体を用いたウエスタンブロットにより発現を確認し、また上述のLPLD活性測定法を用いて、当該組換え宿主細胞がLPLDを発現していることを確認した。
実施例12:精製LPLDおよび本願発明の基質を用いたLPLD活性の測定
(1)1−ミリストイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成
(i)1,2−ジミリストイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成
ジミリストイルグリセロール2.02gと4−ニトロフェニルホスホロジクロライド1.00gをP2O5上、約2時間室温で乾燥させた後、無水ピリジン12mLを加えて十分に懸濁させた。そこに塩化2,4,6−トリイソプロピルベンゼンスルホニル1.13gを加えて室温にて一晩反応させた。この反応液に水を加えて混合攪拌し、さらにエタノールおよびトルエンを加えて減圧濃縮乾固した。得られた乾固物にクロロホルム−メタノール(2:1)100mLを加えて溶解後、水を20mL加えて分液し、下層を採取した。無水硫酸ナトリウムで水分を乾燥後ろ過し、ろ液を減圧濃縮乾固した。得られた乾固物を少量のクロロホルムに溶解し、同溶媒系で活性化したシリカゲルクロマトグラフィーに付して、クロロホルム−メタノール−水系の溶出液を用いて精製し、白色粉末1.4gを得た。
(ii)1−ミリストイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールの合成
上記(i)で得られた白色粉末600mgクロロホルム40mLに溶解し、ついでホスホリパーゼA2(シグマ社、コブラ毒由来)90mgをpH6.5の0.1Mホウ酸−リン酸緩衝液20mL、および1Mの塩化カルシウム溶液0.1mLに溶解した後、お互いを混合し、35℃で24時間反応させた。反応液をクロロホルム−メタノール(2:1)100mLを加えて分液し、その下層を採取した。無水硫酸ナトリウムで水分を乾燥後ろ過し、ろ液を減圧濃縮乾固した。得られた乾固物をシリカゲルクロマトグラフィーに付して、クロロホルム−メタノール−水系の溶出液を用いて精製し、白色粉末として表題化合物223mgを得た。
ESI−MS(Negative)m/z 503[m−H]−
(2)試薬の調製
試薬A:pH8.0
2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(100mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬B:pH4.5
クエン酸一水和物(10mmol/L)、トリトンX−100(0.01%)
試薬C:1−ミリストイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールを試薬Bにて10mmol/L相当になるように溶解し、試薬Cとした。
(3)測定
測定には生化学用自動分析装置(東芝製:TBA−80FR NEO)を用いた。実施例9で得られた精製LPLD(8μL)と試薬A(240μL)とを37℃で約15分間予備加温し、試薬C(80μL)を添加後、経時的に約15分間、主波長405nm、副波長505nmの吸光度を測定し、LPLDの作用によって遊離したp−ニトロフェノールに依存する、1分間あたりの吸光度変化量からLPLD活性を求めた。活性は反応液1mLあたり、1分間に遊離したp−ニトロフェノールの量として表した。その結果を図5に示す。図1同様pHがアルカリ側の方が強い活性が見られた。
精製LPLDの代わりに組換えLPLDを用いた場合についても同様にして測定することができる。
産業上の利用分野
本発明の新規リゾリン脂質を基質として使用することにより、特異的、且つ高感度のLPLD活性測定が可能となる。また、安全で簡易に検出可能な発色基を使用することにより、多数の試料を迅速に測定することが可能となる。さらに、本発明の新規リゾリン脂質を基質として使用することにより、LPLD活性を阻害する物質をスクリーニングすることが可能となる。
本出願は、日本で出願された特願2000−403530および特願2001−023784を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、反応pHを種々に変化させ、血清試料および5%血清アルブミン溶液について本発明のLPLD活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。検体1はコンセーラを、検体2はリピッドセーラムIIをそれぞれ示す。
図2は、基質を種々に変化させ、ヒト血清試料、5%血清アルブミン溶液およびPLDの5U/mL溶液について本発明のLPLD活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。
図2−1はヒト血清試料に対して、図2−2は5%血清アルブミン溶液に対して、図2−3はPLD5U/mL溶液についての結果を示す。
基質A:大豆由来1−ヒドロキシ−2−リノレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール
基質B:大豆由来1−リノレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール
基質C:卵黄由来1−ヒドロキシ−2−オレオイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノール
基質D:卵黄由来1−オレオイル−2−ヒドロキシ−ホスファチジル−p−ニトロフェノール
図3は、基質濃度を種々に変化させ、ヒト血清試料および5%血清アルブミン溶液について本発明のLPLD活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。
図4は、試料としてヒト血清を段階的に希釈したものを用い、本発明のLPLD活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。
図5は、反応pHを種々に変化させ、試料として精製LPLD(LPLD精製品)を用い、本発明のLPLD活性測定方法を実施した場合の結果を示すグラフである。基質は、1−ミリストイル−ホスファチジル−p−ニトロフェノールを用いた。
Claims (27)
- 当該脂肪酸残基がリノール酸残基、オレイン酸残基、パルミチン酸残基およびミリスチン酸残基からなる群より選択されるものである、請求の範囲1記載のリゾリン脂質。
- 発色基がp−ニトロフェニル基またはα−ナフチル基である、請求の範囲1または2に記載のリゾリン脂質。
- 請求の範囲1に記載のリゾリン脂質を有効成分として含有する、リゾホスホリパーゼD活性測定用試薬。
- 試料中のリゾホスホリパーゼDの活性を測定する方法であって、試料に請求の範囲1記載のリゾリン脂質を添加し、当該リゾリン脂質と試料中のリゾホスホリパーゼDとを反応させることにより遊離する発色性化合物の量を比色定量することを特徴とする測定方法。
- 試料が、全血、血清、血漿、尿および唾液からなる群より選択されるものである、請求の範囲5記載の測定方法。
- 卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、乳癌および動脈硬化性疾患からなる群より選択される、少なくとも1種の疾患の診断に利用することを特徴とする、請求の範囲6記載の測定方法。
- 請求の範囲1記載のリゾリン脂質を含む、試料中のリゾホスホリパーゼD活性測定用キット。
- 試料が、全血、血清、血漿、尿および唾液からなる群より選択されるものである、請求の範囲8記載の測定用キット。
- 卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、乳癌および動脈硬化性疾患からなる群より選択される、少なくとも1種の疾患の診断用である、請求の範囲8記載の測定用キット。
- 以下の(a)または(b)のDNAからなる遺伝子。
(a)配列表配列番号1に記載の塩基配列からなる、リゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質をコードするDNA
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つリゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質をコードするDNA - 以下の(a)または(b)の蛋白質。
(a)配列表配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる、リゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質
(b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つリゾホスホリパーゼD活性を有する蛋白質 - 請求の範囲11記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求の範囲11記載の遺伝子を機能的に含む発現ベクター。
- 請求の範囲13または14記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
- 請求の範囲14記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を蛋白質の発現が可能な条件下で培養し、得られる培養物からリゾホスホリパーゼD活性を有する物質を採取することを含むリゾホスホリパーゼDの製造方法。
- 請求の範囲16記載の製造方法によって製造されるリゾホスホリパーゼD。
- リゾホスホリパーゼDが請求の範囲11記載の遺伝子によりコードされる蛋白質である、請求の範囲4記載のリゾホスホリパーゼD活性測定用試薬。
- リゾホスホリパーゼDが請求の範囲12記載の蛋白質である、請求の範囲4記載のリゾホスホリパーゼD活性測定用試薬。
- 請求の範囲11記載の遺伝子によってコードされる蛋白質を血清に添加してなる、リゾホスホリパーゼD活性測定用の管理血清。
- 請求の範囲12記載の蛋白質を血清に添加してなる、リゾホスホリパーゼD活性測定用の管理血清。
- リゾホスホリパーゼDの活性を阻害する物質をスクリーニングするための方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法;
(1)リゾホスホリパーゼDを含有する試料に被検物質を添加する工程、
(2)リゾホスホリパーゼDを含有する試料に請求の範囲1記載のリゾリン脂質を添加する工程、
(3)当該リゾリン脂質と試料中のリゾホスホリパーゼDとを反応させることにより遊離する発色性化合物の量を比色定量する工程、および
(4)発色の程度によって示されるリゾホスホリパーゼD活性を被検物質未添加の場合と比較する工程。 - リゾホスホリパーゼDが請求の範囲11記載の遺伝子によってコードされている蛋白質である、請求の範囲22記載のスクリーニング方法。
- リゾホスホリパーゼDが請求の範囲12記載の蛋白質である、請求の範囲22記載のスクリーニング方法。
- 請求の範囲1に記載のリゾリン脂質とリゾホスホリパーゼDを含有する試料とを含む、リゾホスホリパーゼDの活性を阻害する物質のスクリーニング用キット。
- リゾホスホリパーゼDが請求の範囲11記載の遺伝子によってコードされている蛋白質である、請求の範囲25記載のキット。
- リゾホスホリパーゼDが請求の範囲12記載の蛋白質である、請求の範囲25記載のキット。
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