KR20020077926A - 리조포스포리파제 디 활성 측정방법 - Google Patents
리조포스포리파제 디 활성 측정방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20020077926A KR20020077926A KR1020027011256A KR20027011256A KR20020077926A KR 20020077926 A KR20020077926 A KR 20020077926A KR 1020027011256 A KR1020027011256 A KR 1020027011256A KR 20027011256 A KR20027011256 A KR 20027011256A KR 20020077926 A KR20020077926 A KR 20020077926A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- activity
- lysophospholipase
- lpld
- protein
- sample
- Prior art date
Links
- 108010022198 alkylglycerophosphoethanolamine phosphodiesterase Proteins 0.000 title claims abstract description 185
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 133
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 65
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 27
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 69
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 41
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 36
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 33
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 31
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 31
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 102000011420 Phospholipase D Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000553 Phospholipase D Proteins 0.000 claims description 10
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 claims description 8
- -1 α-naphthyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 6
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 5
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N palmitic acid group Chemical group C(CCCCCCCCCCCCCCC)(=O)O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid group Chemical group C(CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)(=O)O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N linoleic acid group Chemical group C(CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC)(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 claims description 3
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical group CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000005314 unsaturated fatty acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 2
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 58
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 abstract description 10
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical group 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 14
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 14
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 14
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 11
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 11
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 11
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 11
- WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 1-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol group Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 244000309466 calf Species 0.000 description 7
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 7
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 6
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 6
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 6
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 6
- 238000003819 low-pressure liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 5
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000004549 pulsed laser deposition Methods 0.000 description 5
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 4
- 102100021977 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2 Human genes 0.000 description 4
- 108050004000 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2 Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 4
- 238000006193 diazotization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- JAPYIBBSTJFDAK-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tri(propan-2-yl)benzenesulfonyl chloride Chemical compound CC(C)C1=CC(C(C)C)=C(S(Cl)(=O)=O)C(C(C)C)=C1 JAPYIBBSTJFDAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 229960004956 glycerylphosphorylcholine Drugs 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2h-chromen-2-one Chemical group C1=CC=CC2=C1OC(=O)C=C2C PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000235546 Rhizopus stolonifer Species 0.000 description 2
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DGMOQCHIPOPXEK-UHFFFAOYSA-N Spermic acid 2 Chemical compound OC(=O)CCNCCCCNCCC(O)=O DGMOQCHIPOPXEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N docosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical group 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000016160 smooth muscle contraction Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- DUYSYHSSBDVJSM-KRWOKUGFSA-N sphingosine 1-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O DUYSYHSSBDVJSM-KRWOKUGFSA-N 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- FXALEAIVMIXJPW-UHFFFAOYSA-N (2-hydroxy-5-nitrophenyl)-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC=C1O FXALEAIVMIXJPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCHPYGAXOWFYHA-UHFFFAOYSA-N (5-hydroxy-2-nitrophenyl)-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C1=CC(O)=CC=C1[N+]([O-])=O MCHPYGAXOWFYHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUXYLFPMQMFGPL-UHFFFAOYSA-N (9Z,11E,13E)-9,11,13-Octadecatrienoic acid Natural products CCCCC=CC=CC=CCCCCCCCC(O)=O CUXYLFPMQMFGPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 1-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- HKJAWHYHRVVDHK-UHFFFAOYSA-N 15,16,17-trihydroxyhentriacontane-14,18-dione Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)C(O)C(O)C(O)C(=O)CCCCCCCCCCCCC HKJAWHYHRVVDHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRBGUGQWTMBDTR-UHFFFAOYSA-N 2,3,4-tri(propan-2-yl)benzenesulfonyl chloride Chemical compound CC(C)C1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C(C(C)C)=C1C(C)C HRBGUGQWTMBDTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLZVIIYRNMWPSN-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-4-nitrophenol Chemical compound NC1=CC([N+]([O-])=O)=CC=C1O VLZVIIYRNMWPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- MUCCHGOWMZTLHK-UHFFFAOYSA-N 2-nitronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C([N+]([O-])=O)C=CC2=C1 MUCCHGOWMZTLHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLQNJZKBJSMXCJ-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3-methoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC(OC)=C1 ZLQNJZKBJSMXCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGEZJWMZNGUEHR-UHFFFAOYSA-N 3-amino-4-nitrophenol Chemical compound NC1=CC(O)=CC=C1[N+]([O-])=O WGEZJWMZNGUEHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QMIJLOSXZVDDAT-UHFFFAOYSA-N 3-aminonaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=CC2=CC(N)=CC(O)=C21 QMIJLOSXZVDDAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXNVOWPRHWWCQR-UHFFFAOYSA-N 4-Chloro-ortho-toluidine Chemical compound CC1=CC(Cl)=CC=C1N CXNVOWPRHWWCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABJQKDJOYSQVFX-UHFFFAOYSA-N 4-aminonaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(N)=CC=C(O)C2=C1 ABJQKDJOYSQVFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEUIKXVPXLWUDU-UHFFFAOYSA-N 4-diazoniobenzenesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC=C([N+]#N)C=C1 UEUIKXVPXLWUDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSAGPCOTGOTBQB-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxynaphthalene-1-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)O)=CC=C(O)C2=C1 PSAGPCOTGOTBQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIOAVQYSSKOCQP-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxynaphthalene-2-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C(=O)O)=CC(O)=C21 NIOAVQYSSKOCQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBIBQNVRTVLOHQ-UHFFFAOYSA-N 5-aminonaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(N)=CC=CC2=C1O ZBIBQNVRTVLOHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZCRQTJLUGGTAG-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxy-2-nitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(S(O)(=O)=O)=C1 ZZCRQTJLUGGTAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUHKQTKKZAXSMH-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxy-2-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1[N+]([O-])=O BUHKQTKKZAXSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYYMNZLORMNCKK-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxynaphthalene-1-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)O)=CC=CC2=C1O NYYMNZLORMNCKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRFJWEHVFMYQSS-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxy-4-methylchromen-2-one;hydrate Chemical compound O.C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HRFJWEHVFMYQSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNPDEGBVWDHAR-UHFFFAOYSA-N 8-aminonaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC(O)=C2C(N)=CC=CC2=C1 HMNPDEGBVWDHAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHOOSJLGRQTMFC-UHFFFAOYSA-N 8-hydroxynaphthalene-1-carboxylic acid Chemical compound C1=CC(O)=C2C(C(=O)O)=CC=CC2=C1 SHOOSJLGRQTMFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000021357 Behenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100348617 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) NIK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 239000005632 Capric acid (CAS 334-48-5) Substances 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- 108010000659 Choline oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004137 Lysophosphatidic Acid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000642 Lysophosphatidic Acid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108020002496 Lysophospholipase Proteins 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100039306 Nucleotide pyrophosphatase Human genes 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100007329 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100007331 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 description 1
- CUXYLFPMQMFGPL-FWSDQLJQSA-N alpha-Eleostearic acid Natural products CCCCC=CC=C\C=C\CCCCCCCC(O)=O CUXYLFPMQMFGPL-FWSDQLJQSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013527 bean curd Nutrition 0.000 description 1
- 229940116226 behenic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXLCRBHDOFCYRY-UHFFFAOYSA-N dioxido(dioxo)chromium;mercury(2+) Chemical compound [Hg+2].[O-][Cr]([O-])(=O)=O IXLCRBHDOFCYRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003248 enzyme activator Substances 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N gamma-Linolensaeure Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N gamma-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N 0.000 description 1
- 235000020664 gamma-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002733 gamolenic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108010027581 nucleoside triphosphate pyrophosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010067588 nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 125000001095 phosphatidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical group C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
- C07F9/09—Esters of phosphoric acids
- C07F9/10—Phosphatides, e.g. lecithin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
- C07F9/09—Esters of phosphoric acids
- C07F9/12—Esters of phosphoric acids with hydroxyaryl compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
일반식(I)의 리조포스포리피드로서, 식중, R1및 R2는 서로 다르고 이들 중 하나는 8 내지 22 탄소원자를 갖는 포화 또는 불포화된 지방산 잔기이고, 다른 하나는 수소 원자 또는 아세틸기이고, X는 발색단임; 그러한 포스포리피드를 기질로서 사용하는 것을 특징으로 하는, 리조포스포리파제 D의 활성 측정방법; 리조포스포리파제 D를 저해하는 물질의 스크리닝 방법; 및 이들 방법에 유용한 시약 및 시약 키트. 신규한 리조포스포리피드를 기질로서 사용하면 고감도로 리조포스포리파제 D의 활성을 특이적으로 측정하는 것이 가능하다. 더욱이, 안전하고 쉽게 검출되는 발색단의 사용은 다수의 샘플을 신속하게 측정하는 것이 가능하게 한다.
Description
포스포리파제 D(이하 PLD로서도 언급됨)는 포스포리피드의 포스포디에스테르 결합 중 글리세롤 골격의 반대편의 결합을 분해하는 효소이다. PLD 중, 리조포스포리피드를 특히 기질로서 이용하는 PLD는 리조포스포리파제 D로서 언급되며 구별된다(이하에서는 LPLD로서도 언급됨). 현재까지, 동물 조직에서의 LPLD의 존재가 보고되었고(Wykle RL 등, Arch. Biochem. Biophys. 184, 149-155, 1977, Kawasaki T. 등, Biochem. Biophys. Acta 920, 85-93, 1987), 조직뿐만 아니라 래트의 혈장(Tokumura A. 등, Lipids 33, 1009-1015, 1998), 인간 혈장(Akira Tokumara 등, Proceeding of Japanese Conference on the Biochemistry of Lipids 42, 41-44, 2000)에서도 존재한다는 것이 보고되었다. 그렇지만, LPLD의 성공적인 정제또는 클로닝에 대한 보고는 없었다(Liscovitch M. 등, Biochem. J. 345, 401-415, 2000).
LPLD는 체내에서 기질로서 리조포스파티딜콜린(이하에서는 LPC로서도 언급됨) 등을 주로 이용하고 리조포스파티드산(이하에서는 LPA로서도 언급됨)의 생산에도 기여한다. 최근, LPA는 세포성장 촉진, 평활근 수축, 암세포 침입 촉진 등과 같은 다양한 생리학적 활성을 갖는 것으로 보여지고 있다(Koji Bando 등, Experimental Medicine 18, 184-191, 2000). 부가적으로, LPA는 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암(Xu Y. 등, JAMA 280, 719-723, 1998), 동맥경화증(Siess W. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6931-6936, 1999) 등의 진단 지표로서 주목을 끌고 있고, LPA를 생성하는 LPLD의 활성 측정은 이들 질병의 진단에 극히 중요한 것으로 생각된다. 더욱이, LPA 수용체의 저해는 동맥경화증 및 심혈관 질환의 예방 및 치료의 한가지 수단으로 제시되어 왔다(Siess W. 등,ibid., 1999). 이는 LPA를 생산하는 LPLD를 저해하는 물질(LPLD 활성 저해제)를 이들 질병에 대한 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 잠재성을 나타낸다.
LPLD 활성측정 방법으로서, 방사-표지된 LPC를 샘플과 혼합하고, 주어진 시간동안 반응시킨 후, 지방을 추출하고, 박막 크로마토그래피에 의해 분리시키고 밴드의 방사활성을 결정하는 것을 포함하는 방법이 공지되어 있다. 그렇지만, 이 방법은 실용적이지 못하다.
한편, 발색단을 기질 반응 부위에 첨가하고 효소분해에 의해 방출된 발색 화합물을 측정하는 것을 포함하는 효소 활성 측정방법으로서, D-니트로페닐인산을기질로서 사용하는 알칼린 포스파타제 활성 측정방법, 포스파티딜-p-니트로페놀을 기질로서 사용하는 포스포리파제 D 측정방법(Arrigo P. D' 등, Analytica Chimica Acta 304, 249-254, 1995, 미국 특허 제 5011964호) 등이 공지되어 있다. 그렇지만, 리조포스포리파제 D 활성 측정방법에 대한 보고는 없었다.
발명의 개시
그러므로 본발명의 목적은 샘플 내의 리조포스포리파제 D(LPLD) 활성을 특이적이고 편리하게 측정하는 방법 및 이 측정에 유용한 기질을 제공한다. 본발명의 또다른 목적은 이 측정방법을 이용하여 LPLD 활성을 저해하는 물질을 스크리닝하고 이 스크리닝에 유용한 키트 및 시약을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기한 목적을 이루기 위해 광범위한 연구를 수행하여, 발색단-첨가된 기질을 사용하고 방출된 발색 물질을 인덱스로서 사용하여 발색 정도를 측정하는 것을 포함하는 LPLD 활성 측정방법을 알아냈다. 더욱이, 본 발명자들은 이제까지 보고된 바 없는 LPLD 관련된 분자 생물학적 지식을 얻었고, 이 지식에 기초하여 본 활성 측정 방법 및 본 스크리닝 방법의 유용성을 확인하여 본발명을 완성하였다.
따라서 본발명은 다음을 제공한다.
(1) 일반식(I)의 리조포스포리피드
식중, R1및 R2는 서로 다르고 이들 중 하나는 8 내지 22 탄소원자를 갖는 포화 또는 불포화된 지방산 잔기이고, 다른 하나는 수소 원자 또는 아세틸기이고, X는 발색단이다.
(2) 상기(1)의 리조포스포리피드에서, 지방산 잔기가 리놀산 잔기, 올레인산 잔기, 팔미틴산 잔기 및 미리스틴산 잔기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 리조포스포리피드.
(3) 상기 (1) 또는 (2)의 리조포스포리피드에서, 발색단이 p-니트로페닐기 또는 α-나프틸기인 리조포스포리피드.
(4) 상기 (1)의 리조포스포리피드를 활성 성분으로서 포함하는, 리조포스포리파제 D 활성 측정용 시약.
(5) 상기 (1)의 리조포스포리피드를 샘플에 부가하여 리조포스포리피드와 리조포스포리파제 D가 샘플 내에서 반응하도록 하고, 반응에 의해 방출된 발색 화합물의 양을 비색정량하는 것을 포함하는, 샘플 내의 리조포스포리파제 D 활성 측정 방법.
(6) 상기 (5)에서 샘플이 전혈, 혈청, 혈장, 뇨 및 침으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 측정방법.
(7) 상기 (6)에서, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 유방암 및 동맥경화증으로 구성된 그룹으로부터 선택된 질병 중 하나를 진단하는데 사용되는 측정방법.
(8) 상기 (1)의 리조포스포리피드를 포함하는, 샘플의 리조포스포리파제 D 활성 측정용 키트.
(9) 상기 (8)에서, 샘플이 전혈, 혈청, 혈장, 뇨 및 침으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 키트.
(10) 상기 (8)에서, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 유방암 및 동맥경화증으로 구성된 그룹으로부터 선택된 질병 중 하나를 진단하는데 사용되는 키트.
(11) 다음 (a) 또는 (b)의 DNA를 포함하는 유전자:
(a) 서열식별번호: 1에서 도시된 염기 서열로 구성된, 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA,
(b) 스트린젠트 조건(stringent condition)에서 (a)의 염기 서열로 구성된 DNA와 혼성화하는, 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(12) 다음 (a) 또는 (b)의 단백질:
(a) 서열식별번호: 2에 도시된 아미노산 서열로 구성된, 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 단백질,
(b) 상기 (a)의 아미노산 서열로 구성되고, 하나 내지는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된, 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 단백질.
(13) 상기 (11)의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
(14) 상기 (11)의 유전자를 기능적으로 포함하는 발현 벡터.
(15) 숙주 세포를 상기 (13) 또는 (14)의 벡터로 형질전환시켜 얻어진 형질전환체.
(16) 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서, 상기 (14)의 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고 얻어진 배양물로부터 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 물질을 수확하는 것을 포함하는 리조포스포리파제 D의 생산방법.
(17) 상기 (16)의 생산방법에 의해 생산된 리조포스포리파제 D.
(18) 상기 (4)에서 리조포스포리파제 D가 상기 (11)의 유전자에 의해 암호화된 단백질인 리조포스포리파제 D 활성 측정용 시약.
(19) 상기 (4)에서 리조포스포리파제 D는 상기 (12)의 단백질인 리조포스포리파제 D 활성 측정용 시약.
(20) 상기 (11)의 유전자에 의해 암호화된 단백질을 혈청에 부가시켜 얻어지는, 리조포스포리파제 D 활성 측정용 관리 혈청.
(21) 상기 (12)의 단백질을 혈청에 부가하여 얻어지는, 리조포스포리파제 D 활성 측정용 관리 혈청.
(22) 최소한 다음의 단계를 포함하는, 리조포스포리파제 D 활성을 저해하는 물질의 스크리닝 방법:
(i) 테스트 물질을 리조포스포리파제 D를 함유한 샘플에 부가하는 단계,
(ii) 상기 (1)의 리조포스포리피드를 리조포스포리파제 D를 함유하는 샘플에 부가하는 단계,
(iii) 리조포스포리피드와 샘플 내 리조포스포리파제 D의 반응에 의해 방출된 발색 화합물의 양을 비색정량하는 단계, 및
(iv) 발색 정도로 보여진 리조포스포리파제 D 활성을 테스트 물질이 부가되지 않은 것과 비교하는 단계.
(23) 상기 (22)에서 리조포스포리파제 D가 상기 (11)의 유전자에 의해 암호화되는 스크리닝 방법.
(24) 상기 (22)에서 리조포스포리파제 D가 상기 (12)의 단백질인 스크리닝 방법.
(25) 상기 (1)의 리조포스포리피드 및 리조포스포리파제 D를 함유한 샘플을 포함하는, 리조포스포리파제 D 활성을 저해하는 물질의 스크리닝용 키트.
(26)상기 (25)에서 리조포스포리파제 D가 상기 (11)의 유전자에 의해 암호화되는 단백질인 키트.
(27) 상기 (25)에서 리조포스포리파제 D가 상기 (12)의 단백질인 키트.
본발명은 신규한 리조포스포리피드, 이 리조포스포리피드를 함유하는 리조포스포리파제 D 활성 측정용 시약, 및 이 리조포스포리피드의 사용을 특징으로 하는 리조포스포리파제 D 활성의 측정방법에 관한 것이다. 본발명은 상기 방법 및 그에 대한 키트를 이용하여 리조포스포리파제 D 활성을 저해하는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
도 1은 다양한 반응 pH에서 혈청 샘플 및 5% 혈청 알부민 용액에 적용된 본발명의 LPLD 활성 측정방법의 결과를 도시하는 그래프로서, 테스트 샘플 1은 콘세라(CONCERA)를 나타내고 테스트 샘플 2는 리피드 혈청 II를 나타낸다.
도 2는 다양한 기질을 사용하여 인간 혈청 샘플, 5% 혈청 알부민 용액 및 PLD 5U/ml 용액에 적용된 본발명의 LPLD 활성 측정 방법의 결과를 도시하는 그래프로서, 도 2-1은 인간 혈청 샘플의 결과를 도시하고, 도 2-2는 5% 혈청 알부민 용액의 결과를 도시하고, 도 2-3은 PLD 5U/ml 용액의 결과를 도시한다.
기질 A: 대두-유래의 1-히드록시-2-리놀fp오일-포스파티딜-p-니트로페놀
기질 B: 대두-유래의 1-리놀레오일-2-히드록시-포스파티딜-p-니트로페놀
기질 C: 난황-유래의 1-히드록시-2-올레오일-포스파티딜-p-니트로페놀
기질 D: 난황-유래의 1-올레오일-2-히드록시-포스파티딜-p-니트로페놀
도 3은 다양한 기질 농도에서 인간 혈청 샘플 및 5% 혈청 알부민 용액에 적용된 본발명의 LPLD 활성 측정방법의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 4은 샘플로서 일련의 희석된 인간 혈청에 적용된 본발명의 LPLD 활성 측정방법의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 5은 다양한 반응 pH에서 샘플로서 정제된 LPLD(LPLD 정제품)에 적용된 본발명의 LPLD 활성 측정방법의 결과를 도시하는 그래프로서, 사용된 기질은 1-미리스토일-포스파티딜-p-니트로페놀이었다.
본발명에서 사용된 LPLD는 포스포리피드의 포스포디에스테르 결합 중 글리세롤 골격의 반대편의 결합을 분해하는 효소이다. 특히, 다음 (a) 또는 (b)의 DNA를 포함하는 유전자에 의해 암호화되는 단백질, 또는 다음 (c) 또는 (d)의 단백질이다:
(a) 서열식별번호: 1에서 도시된 염기 서열로 구성된, 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA,
(b) 스트린젠트 조건(stringent condition)에서 (a)의 염기 서열로 구성된DNA와 혼성화하는, 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA,
(c) 서열식별번호: 2에 도시된 아미노산 서열로 구성된 단백질,
(b) 상기 (c)의 아미노산 서열로 구성되고, 하나 내지는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된, 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 단백질.
특히, 본발명의 LPLD는 바람직하게는 다음 3개의 아미노산 서열을 갖는 단백질이다:
(i) MHTARVRDIEHLTSLDFFRK (서열식별번호: 3)
(ii) YASERNGVNVISGPIFDYDYDGLHDTEDK (서열식별번호: 4)
(iii) FNHRWWGGQPLWITATK (서열식별번호: 5)
본발명에서, 리조포스포리파제 D는 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 한 유도체에 관해서는 어떤 특별한 제한이 없고, 생물학적 기원을 갖고 자연에 존재하는 것, 천연 또는 인공적 돌연변이, 외부적 리조포스포리파제 D 유전자를 도입하여 얻어진 형질전환체로부터 얻어진 것 등을 포함한다.
인공적으로 돌연변이를 제조하는 방법은 예를 들면 부위-특이적 돌연변이를 포함한다. 더욱 상세하게는, 돌연변이 리조포스포리파제 D는 서열식별번호: 1에 도시된 염기 서열 내에서 이 방법에 의해 임의적으로 돌연변이를 일으켜 얻어질 수 있다. 그리하여 얻어진 돌연변이 리조포스포리파제 D는 포스포리피드의 포스포디에스테르 결합 중 글리세롤 골격의 반대편의 결합을 분해하는 리조포스포리파제 D 활성을 갖는다.
본발명의 리조포스포리파제 D는 (1) 이 효소를 생성하는 세포 또는 조직의배양물을 출발 물질로 하여, 또는 전혈, 혈청, 혈장, 뇨, 침 등과 같은 생물학적 샘플을 분리 및 정제하는 방법, (2) 화학적 합성 방법 또는 (3)유전자 재조합 기술 등에 의해 리조포스포리파제 D를 발현하도록 설계된 세포로부터 정제 등의 공지된 적절한 방법에 의해 얻어질 수 있다.
본발명의 리조포스포리파제 D의 분리 및 정제는 다음과 같이 행해질 수 있다. 즉, 리조포스포리파제 D를 발현시키는 세포를 적절한 액체 배지에 배양시키고 얻어진 배양물을 공지된 방법에 의해 추출하고 정제한다. 추출 및 정제를 위해, 목적 생성물을 함유하는 분획에 따라 적절한 공지된 방법이 사용된다.
특이적 절차는 다음을 포함한다. 첫째, 배양물을 여과, 원심분리 등과 같은 공지의 방법을 적용시키고, 세포 또는 상청액을 회수한다. 이 효소가 세포 내에 축적될 때, 회수된 세포는 적절한 완충액 내에 현탁되고, 막을 용해시키기에 적절한 농도의 계면활성제가 부가된다. 얻어진 조추출물 용액은 필요한 경우 계면활성제의 존재 하에서 일반적으로 사용되는 방법을 적절히 조합하여 처리되고, 이에 의해 효소가 분리되고 정제된다.
효소가 배지에 존재할 때, 배양물은 우선 여과 또는 원심분리시키고 침강물(세포 등과 같은 고체)을 제거하여 용액 부분만 남기고, 이것은 일반적으로 사용되는 방법을 적절히 조합하여 목적 물질을 분리 및 정제한다. 염석, 용매 침전 방법 등과 같이 용해도를 이용하는 방법, 투석, 초여과, 겔여과, SDS-PAGE 등과 같은 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피 등과 같은 전하를 이용하는 방법, 친화 크로마토그래피 등과 같은 특이적 친화도를 이용하는 방법, 역상 고성능액체 크로마토그래피 등과 같은 소수성 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기영동과 같은 등전점 차이를 이용하는 방법 등의 방법이 언급되어 있다. 더욱 상세하게는, 예를 들면, 효소는 감압하에서의 농축, 동결화, 통상적 용매를 사용한 추출, pH 조절, 음이온 교환 수지, 양이온 교환 수지, 비이온 흡착 수지 등과 같은 통상적인 흡착제로 처리, 결정, 재결정 등과 같은 통상적인 방법에 의해 분리되고 정제될 수 있다.
화학적 합성에 의한 본발명의 리조포스포리파제 D의 생산은 예를 들면, 서열식별번호: 2에 도시된 아미노산 서열에 기초한 펩티드 합성기에 의한 아미노산의 합성 또는 반합성에 의해 수행될 수 있다.
본발명에서, 또한 LPLD는 전혈, 혈청, 혈장 등과 같은 자연 발생적 생물학적 샘플을 정제시켜 얻어질 수 있다. 예를 들면, LPLD는 LPLD를 함유한 샘플을 다음 단계를 거치도록 하여 얻어질 수 있다.
단계 1: 폴리에틸렌 글리콜 침전
단계 2: 블루 세파로스 6FF 칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피
단계 3: 콘카나발린 A 세파로스를 사용한 친화성 크로마토그래피
단계 4: BioAssistQ 칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피
단계 5: HiTrap Heparin 칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피
단계 6: RESOURCE PHE 칼럼을 사용한 소수성 크로마토그래피
단계 7: Econo-Pac CHT-II 카트리지를 사용한 히드록시아파타이트 크로마토그래피
각 단계의 정제 수준은 HPLC에 의해 검출가능한 피크의 수 및 강도, SDS-PAGE에 의해 검출가능한 밴드의 수 및 강도, 또는 인덱스로서 LPLD를 사용함으로써 도시된 단백질의 존재를 통해 확인될 수 있다.
LPLD 활성은 예를 들면 리조포스파티딜콜린을 기질로서 사용하는 리조포스파티드산 및 콜린을 생성하는 LPLD의 반응을 이용하고, 리조포스파티딜콜린을 각 단계에서 얻어진 각 분획으로 처리하고, 그에 의해 생성된 콜린의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다.
리조포스포리파제 D 유전자의 클로닝은 다음의 방법에 의해 일반적으로 수행된다. 우선, 당해 효소를 리조포스포리파제 D를 함유한 샘플로부터 일반적인 방법에 의해 완전히 또는 부분적으로 정제하고, N-말단 아미노산 서열이 에드만(Edman) 방법에 의해 결정된다. 결정된 부분 아미노산 서열에 상응하는 염기 서열을 갖는 올리고누클레오티드가 합성되고, 이를 프라이머 또는 프로브로서 사용하여, 해당 유전자가 리조포스포리파제 D를 생성하는 세포 또는 조직으로부터 제조되어 이미 존재하는 cDNA 또는 게놈 DNA로부터 클로닝된다.
택일적으로, 당해 효소 또는 그 서브유닛에 대한 항체는 완전 또는 부분 정제된 리조포스포리파제 D의 전체 또는 일부를 항원으로서 사용하여 통상적인 방법에 의해 제조되고, 당해 효소를 암호화하는 DNA는 리조포스포리파제 D를 생산하는 세포 또는 조직으로부터 제조된 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리로부터 항체 스크리닝에 의해 클로닝될 수 있다.
상기에서 언급된 방법과 달리, 본발명에서 리조포스포리파제 D를 암호화하는DNA는 PCR에 의해 직접적으로 클로닝될 수도 있다. 즉, PCR은 템플레이트로서 당해 효소 활성을 갖는 세포 또는 조직으로부터 유래한 게놈 DNA 또는 cDNA(또는 mRNA)를 사용하고, 증폭 단편이 리조포스포리파제 D의 코딩 영역을 포함하는 올리고누클레오티드의 적절한 쌍을 프라이머로서 사용하여, 종래 방법에 따라 수행되고, 이에 의해 당해 효소의 코딩 영역을 함유하는 DNA 단편은 증폭될 수 있다.
얻어진 DNA 삽입물의 염기 서열은 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 방법, 디데옥시 터미네이션(dideoxy termination) 방법과 같은 공지된 서열결정 기술에 의해 결정될 수 있다.
본발명에서 리조포스포리파제 D를 암호화하는 유전자는 서열식별번호: 1에 도시된 염기 서열로 실질적으로 구성된 DNA의 전체 또는 일부를 포함한다. 본명세서에서, "실질적으로 구성된 DNA"란 상기한 특정 염기 서열로 구성된 DNA에 부가하여, 스트린젠트 조건(본발명에서는, 약 60% 이상, 바람직하게 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성을 갖는 DNA가 당해 염기 서열과 혼성화할 수 있는 조건, 여기서 스트린젠시는 온도, 염농도 등을 혼성화 반응 및 세척 중 적절히 변화시켜 제어될 수 있다) 하에서 상기 특정 염기 서열로 구성된 DNA와 혼성화할 수 있는 염기 서열로 구성된 DNA를 의미한다.
본발명의 유전자는 어떠한 방법에 의해서 얻어질 수 있다. 예를 들면, mRNA로부터 제조된 상보적 DNA(cDNA), 게놈 라이브러리로부터 제조된 게놈 DNA, 화학적으로 합성된 DNA, RNA 또는 DNA를 템플레이트로서 사용하는 PCR에 의한 증폭에 의해 얻어진 DNA, 이들 방법을 적절히 조합하여 제조된 DNA가 언급될 수 있다.
본발명은 또한 상기한 유전자를 함유한 재조합 벡터에 관한 것이다. 본발명에서 재조합 벡터는 원핵 세포 및/또는 진핵 세포의 다양한 숙주에서 복제-유지 또는 자율증식할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 플라스미드 벡터, 파지 벡터 등을 포함한다. 재조합 벡터는 상기한 DNA 중 하나를 관련 분야에서 입수가능한 클로닝 벡터 또는 발현 벡터 내로, 적절한 제한효소 부위를 사용하여 삽입함으로써 제조될 수 있다.
특히, 본발명의 재조합 벡터는 리조포스포리파제 D를 암호화하는 유전자를 기능적으로 함유하는 발현유전자이다. 본 명세서에서, "기능적으로"는 당해 유전자(DNA)가 벡터에 적합한 숙주 세포 내에서 전사되고 당해 유전자가 그에 의해 암호화되는 단백질이 생성될 수 있는 위치에 존재하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 프로모터 영역, 개시 코돈, 리조포스포리파제 D를 암호화하는 유전자, 종결 코돈 및 종결자 영역을 순차적으로 배열시킨 발현 카세트를 갖는 벡터이다. 본발명의 재조합 벡터는 원핵 세포 및/또는 진핵 세포의 다양한 숙주에서 복제-유지 또는 자율증식할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 플라스미드 벡터, 파지 벡터 등을 포함한다.
재조합 벡터는 본발명에 따른 리조포스포리파제 D를 암호화하는 DNA를 관련분야에서 입수가능한 발현 벡터와 통상의 방법에 의해 기능적으로 결찰시켜 편리하게 제조될 수 있다. 사용된 발현 벡터는 원핵 세포 및/또는 진핵 세포의 다양한 숙주에서 리조포스포리파제 D를 발현하고 생성하는 한 특별한 종류에 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 혈질전환체의 선택을 위한 선택적 마커 유전자를 함유한다. 예를 들면, 포유동물 세포가 형질전환되는 경우, pSV2-neo, pSV2-dhfr 등으로부터 유래한 선택적인 마커 유전자(네오마이신 내성 유전자, 디하이드로폴레이트 리덕타제 등)를 SV40, RSV, MMLV 등과 같은 동물 바이러스의 프로모터 및 폴리아데닐화 신호가 제한 효소 부위, 바람직하게는 멀티클로닝 부위를 통해 결찰된 플라스미드 내로 삽입시켜 얻어진 플라스미드가 사용될 수 있다.
본발명에서 형질전환된 세포는 리조포스포리파제 D를 암호화하는 상기한 DNA를 함유하는 발현 벡터를 숙주 세포 내에 도입시켜 제조될 수 있다. 숙주 세포는 사용된 발현 벡터에 적합하고 형질전환될 수 있는 한 특별히 제한되는 것은 아니고, 천연 세포, 인공적으로 수립된 재조합 세포 등과 같이 본발명의 기술분야에서 일반적으로 사용되는 다양한 세포가 사용될 수 있다. 특이적으로는, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등과 같은 박테리아, 이스트 등과 같은 곰팡이, 동물 세포, 곤충 세포 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 포유동물 세포, 특히 래트-유래 세포, 햄스터-유래 세포(CHO, BHK 등), 마우스-유래 세포(COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH T3 등), 원숭이-유래 세포(COS1, COS3, COS7, CV1, Velo 등) 및 인간-유래 세포(Hela, 이배체 섬유아세포 유래 세포, 골수, Namalwa 등)가 사용된다.
발현 벡터의 숙주 세포 내로의 도입은 공지된 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 포유동물 세포 내로의 도입을 위해, 칼슘 포스페이트 공침 방법, 원형질 융합 방법, 마이크로주입 방법, 전기영동방법, 리소좀 방법 등이 사용될 수 있다.
본발명에서 리조포스포리파제 D는 상기한 바와 같이 제조된 발현 벡터를 함유한 형질전환체를 배양시켜 생성될 수도 있다. 배지는 바람직하게는 숙주 세포(형질전환체)의 성장에 필수적인 탄소 공급원 및 무기 또는 유기 질소 공급원을 함유한다. 탄소 공급원은 예를 들면, 글루코스, 덱스트린, 가용 전분, 수크로스 등이고, 질소공급원은 예를 들면, 암모늄 염, 니트레이트, 아미노산, 콘 스팁 리커(corn steep liquor), 펩톤, 카제인, 육류 추출물, 두부, 감자 추출물 등이다. 필요한 경우, 다른 영양 공급원[예를 들면, 무기염(염화칼슘, 이수소 인산나트륨, 염화 마그네슘 등), 비타민, 항생제(테트라사이클린, 네오마이신, 가나마이신, 암피실린 등)]이 포함될 수 있다.
배양은 관련 분야에서 공지된 방법에 따라서 수행된다. 배양 조건은 단백질의 발현을 허용하여야 하는데, 예를 들면 온도, 배지 pH 및 배양 시간은 효소의 대량 생산을 허용하도록 적절히 결정된다.
예를 들면, 숙주가 동물 세포인 경우, 최소 필수 배지(MEM), 둘베코의 변형 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)), RPMI-1640 배지, 199 배지 등 약 5-20%의 태아송아지 혈청(FCS)를 함유한 것이 배지로서 사용될 수 있다. 배지의 pH는 바람직하게는 약 6-8이고, 배양은 30-40℃에서 약 15-72 시간 동안, 필요한 경우 공기공급 및 교반과 함께 일반적으로 수행된다.
본발명에서 리조포스포리파제 D는 배양물로부터 리조포스포리파제 D를 발현시키는 세포를 분리 정제시키는 상기한 방법과 같은 방법으로, 상기한 배양에 의해 얻어진 배양물로부터 수확될 수 있다.
그리하여 얻어진 정제된 LPLD 또는 재조합 LPLD는 예를 들면, 표 1에서 도시된 기질 특이성을 갖는다.
| 기질 | 반응 생성물 |
| 리조포스파티딜콜린 | 리조포스파티드산, 콜린 |
| 리조포스파티딜세린 | 리조포스파티드산, 세린 |
| 리조포스파티딜에탄올아민 | 리조포스파티드산, 에탄올아민 |
| 리조포스파티딜이노시톨 | 리조포스파티드산, 이노시콜 |
| 리조스핑고미엘린 | 스핑고신-1-포스페이트, 콜린 |
| 1-알킬-2-히드록시-글리세로포스포콜린(리조PAF) | 1-알킬-2히드록시-글리세로-3-포스페이트, 콜린 |
| 1-알킬-2-아세틸-글리세로포스포콜린(PAF) | 1-알킬-2-아세틸-글리세로-3-포스페이트, 콜린 |
| 1-알케닐-2-히드록시-글리세로포스포콜린(리조플라스말로겐) | 1-알케닐-2-히드록시-글리세로-3-포스페이트, 콜린 |
반응 생성물 중, 특히 리조포스파티드산(LPA) 및 스핑고신-1-포스페이트는 생물학적으로 중요한 물질인데 왜냐하면 LPA는 세포 성장 촉진, 평활근 수축, 종양 세포 침입 촉진 등과 같은 생리학적 활성을 갖고, 스핑고신-1-포스페이트는 종양 세포의 주화성 운동조절, 성장 등과 같은 생리학적 활성을 갖기 때문이다.
부가적으로, 당업계의 숙련자가 통상의 방법에 따라서 정제된 LPLD 또는 재조합 LPLD를 면역 항원으로 사용하여 항체를 제조하는 것이 가능하다. 택일적으로, 부분 아미노산서열에 상응하는 펩티드 항체가 서열식별번호: 2에 도시된 아미노산 서열에 기초하여 제조될 수 있다.
면역 항원은 바람직하게는 보조제와 혼합하여 제조된다. 항원이 낮은 면역성을 갖는 경우, 항원은 바람직하게는 담체 단백질(예를 들면, 소혈청 알부민(BSA) 등)과 결합시켜 사용된다. 표적의 면역화용으로 사용되는 동물은 예를 들면, 말, 양, 염소, 토끼, 기니아 피그, 마우스 등이다. 면역화를 위해, 이들 동물은 한번 내지 여러번 피하내, 근육내, 정맥내, 풋 패드(food pad) 내 또는 복강내 주사를한다. 일반적으로, 첫 번째 면역화로부터 약 1-2주마다 1 내지 4번의 면역화가 행해지고, 이후 약 1-4주후, 최종 면역화가 수행된다. 최종 면역화 며칠 후, 특이적 항체가 항-혈청으로서 면역화된 동물로부터 얻어진다. 공지된 통상의 방법에 의해 마우스, 기니아 피그 등을 면역화시켜 모노클론 항체를 제조하는 것이 또한 가능하다. 당해 항체는 필요에 따라 사용 전에 바람직하게는 정제된다. 특이적으로, 정제 방법은 암모늄 설페이트 침전법, 단백질 A를 사용하는 방법, 항원 폴리펩티드 및/또는 펩티드와 결합하는 친화성 칼럼을 사용하는 방법 등에 의해 예시된다.
얻어진 특이적 항체는 LPLD의 추가적 정제 및 LPLD 및 LPLD과 관련된 것으로 생각되는 각종 질병 및 현상 연구에 대한 도구로서 유용하다.
본발명의 LPLD 활성 측정방법 및 본발명의 LPLD 활성 저해 물질의 스크리닝 방법에 대한 기질로서 사용되는 리조포스포리피드는 다음 일반식(I)에 의해 표시된다.
식중, R1및 R2는 서로 다르고 이들 중 하나는 8 내지 22 탄소원자를 갖는 포화 또는 불포화된 지방산 잔기이고, 다른 하나는 수소 원자 또는 아세틸기이고, X는 발색단이다.
본발명에서, "8 내지 22 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화된 지방산"은카프릴산, 카프린산, 라우린산, 미리스틴산, 팔미틴산, 스테아린산, 아라키딘산, 베헨산 등과 같은 포화된 지방산의 잔기, 스펌산(spermic acid), 팔미트올레인산, 올레인산, 박센산, 리놀산, α-리놀렌산, γ-리놀렌산, α-엘레오스테아린산, 아라키돈산, 아이코사펜타엔산 등과 같은 불포화 지방산, 등에 의해 예시되는데, 바람직하게는 리놀산 잔기, 올레인산 잔기, 팔미틴산 잔기 및 미리스틴산 잔기이다.
일반식(I)에서, X에 대한 "발색단"은 리조포스포리피드 또는 전구 물질로부터의 방출에 의해, 가시광선 또는 UV선을 흡수할 수 있는 기질 또는 형광을 방출하는 기질(이하에서는 이들 기질이 발색 화합물로서도 언급된다)일 수 있다. 본 명세서에서, 전구체는 서로 다른 발색 시약과의 반응에 의해, 가시광선 또는 UV선을 흡수하거나 형광을 방출하는 물질일 수 있다.
특이적 발색단은 예를 들면, 치환된 페놀 부분[예를 들면, p-니트로페놀, 5-히드록시-2-니트로벤조산, 2-히드록시-5-벤조산, N,N,N-트리메틸-N-(5-히드록시-2-니트로페닐)암모늄 클로라이드, N,N,N-트리메틸-N-(2-히드록시-5-니트로페닐)암모늄 클로라이드, 3-아미노-4-니트로페놀, 2-아미노-4-니트로페놀, 5-히드록시-2-니트로벤젠설폰산, o-니트로페놀 등], 나프톨 또는 나프톨 부분을 함유하는 잔기[예를 들면, α-나프톨, 4-아미노-1-나프톨, 4-히드록시-1-트리메틸암모늄- 나프탈렌 클로라이드, 4-히드록시-1-나프트산, 3-아미노-1-나프톨, 4-히드록시-2-트리메틸암모늄나프탈렌 클로라이드, 4-히드록시-2-나프트산, 8-아미노-1-나프톨, 8-히드록시-1-트리메틸암모늄나프탈렌 클로라이드, 8-히드록시-1-나프트산, 5-아미노-1-나프톨, 5-히드록시-1-트리메틸암모늄나프탈렌 클로라이드, 5-히드록시-1-나프트산 및 2-니트로-1-나프톨 등], 치환된 움벨리페론 부분을 함유한 잔기[예를 들면, 4-메틸움벨리페론, 3-아미노-4-메틸움벨리페론, 3-트리메틸암모늄-4-메틸움벨리페론 클로라이드, 4-메틸-5-아미노움벨리페론, 4-메틸-6-아미노움벨리페론, 5-트리메틸암모늄-4-메틸움벨리페론 클로라이드, 6-트리메틸암모늄-4-메틸움벨리페론 클로라이드, 4-메틸움벨리페론-5-설폰산, 4-메틸움벨리페론-6-설폰산, 3-트리메틸암모늄-4-메틸움벨리페론-5-설폰산 에스테르, 3-트리메틸암모늄-4-메틸움벨리페론-5-카복시산 클로라이드 및 3-트리메틸암모늄-4-메틸움벨리페론 클로라이드 등] 등이다.
치환된 페놀 부분을 함유한 잔기는 바람직하게는 p-니트로페닐기이고, p-니트로페닐기가 결합되어 있는 본발명의 리조포스포리피드의 효소분해에 의해, 발색 화합물인 p-니트로페놀이 방출된다. p-니트로페놀은 대략 400 nm(바람직하게는 405 nm)에서 최대 흡수율을 나타낸다.
나프톨 또는 나프톨 부분을 함유한 잔기는 바람직하게는 α-나프틸기이고, α-나프톨기가 결합되어 있는 본발명의 리조포스포리피드의 효소분해에 의해, 발색 화합물의 전구물질인 α-나프톨이 방출된다. α-나프톨은 디아조화에 의해 발색 화합물이 될 수 있다.
치환된 움벨리페론을 함유한 잔기는 바람직하게는 4-메틸움벨리페릴기이고, 4-메틸움벨리페릴기가 결합된, 본발명의 리조포스포리피드의 효소분해에 의해, 발색 화합물인 4-메틸움벨리페론이 방출된다. 4-메틸움벨리페론은 형광 화합물이고 형광도는 스펙트로플루오로-포토미터 등에 의해 정량될 수 있다.
측정의 간편성의 관점에서, p-니트로페닐기 및 α-나프틸기가 발색단으로서 바람직하다.
일반식(I)로 나타낸 본발명의 리조포스포리피드는 공지된 방법을 적절히 조합시켜 바람직하게는 제조될 수 있다. 상세한 것은 아래의 합성 예에서 설명되고, 예를 들면, 상업적으로 입수가능한 포스포리피드가 출발 물질로서 사용되고, 이는 포스포리파제 C에 의해 효소분해되고, 얻어진 디글리세라이드 및 발색단을 갖는 상업적으로 입수가능한 화합물을 용매 내에서 축합제의 존재하에서 반응시켜 발색단이 결합된 포스포리피드를 얻는다(포스포리피드의 합성법으로서, Analytica, Chimica Acta. 304, 249-254, 1995에 기술된 방법과 유사한 방법이 또한 사용될 수 있다). 포스포리피드는 포스포리파제 A 또는 리피제에 의해 효소분해시켜 본발명의 리조포스포리피드를 얻는다. 특이적으로는, 다음의 방법이 예시된다.
상업적으로 입수가능한 대두-유래의 포스파티딜콜린 또는 난황-유래의 포스파티딜콜린이 출발물질로서 사용되고, 이것은 포스포리파제 C(예를 들면 웰치 바실러스(Welch bacillus)-유래된)로 효소분해시키고, 얻어진 대두-유래 또는 난황-유래 디글리세라이드 및 상업적으로 입수가능한 4-니트로페닐 포스포로 디클로라이드를 트리이소프로필벤젠설포닐 클로라이드 등과 같은 축합제와, 무수 피리딘 등과 같은 용매 내에서 반응시켜 대두-유래 또는 난황-유도 포스파티딜 p-니트로페놀을 얻는다. 그리하여-얻어진 화합물을, 포스포리파제 A2(예를 들면 코브라 독-유래)에 의해 효소분해시켜 신규의 대두-유래 또는 난황 유래의 본발명의 1-아실포스파티딜-p-니트로페놀이 얻어질 수 있고, 리파제(예를 들면 리조푸스스톨로니퍼(Rhizopus stolonifer)유래)에 의한 효소분해에 의해 신규의 대두-유래 또는 난황-유래의 본발명의 아실포스파티딜-p-니트로페놀이 얻어질 수 있다.
다른 방법으로서, 상업적으로 입수가능한 대두-유래 포스파티딜콜린이 출발물질로서 사용되고, 이것은 포스포리파제 A2 또는 리파제에 의해 효소분해되고, 얻어진 대두-유래 1-아실포스파티딜콜린 또는 대두-유래 2-아실포스파티딜콜린을 클로로포름 등과 같은 용매 내에서 4-디메틸아미노피리딘, N,N-디이소프로필아민 등과 같은 촉매 존재 하에서 무수 초산과 반응시켜 대두-유래의 1-아실-2-아세틸 디글리세라이드 또는 대두-유래의 1-아세틸-아실-디글리세라이드를 얻는다. p-니트로페닐기는 상기한 방법과 유사한 방법에 의해 이들 화합물 내로 도입되고, 이에 의해 본발명에 따른 신규의 대두-유래 1-아실-2-아세틸-포스파티딜-p-니트로페놀 또는 대두-유래 1-아세틸-2-아실-포스파티딜-p-니트로페놀이 얻어진다.
본발명은 상기한 리조포스포리피드를 활성 성분으로서 포함하는 LPLD 활성 측정용 시약을 제공한다. 당해 측정용 당해 시약은 활성의 측정을 위한 하기에 언급된 LPLD 활성 저해용 물질의 스크리닝 방법으로서 사용될 수 있다. 측정용 당해 시약은, 기질로서 리조포스포리피드에 부가적으로 부형제, 완충제, 안정제, 보존제 등을 함유할 수 있고, 필요한 경우, 효소 활성화제 및 오염 물질의 영향을 감소시키는 시약이 부가될 수 있다. 본발명의 측정용 시약의 형태는 특별히 제한되지는 않고 건조 분말, 액체 등일 수 있다. 건조 분말이 형성된 경우, 용해, 희석 등의 처리가 사용시 필요하고, 처리에 필요한 요소(예를 들면, 완충액 등)는 본발명의 LPLD 활성 측정용 키트 또는 본발명의 LPLD 활성을 저해하는 물질의 스크리닝 키트에 포함될 수 있다. 용해, 희석 등의 처리에 필요한 용액은 기질의 용해도에 따라 결정되고 완충액 등과 같은 수성 형태일 수 있거나 또는 유기 용매 형태일 수있다. 제 1 반응 시약과 제 2 반응시약의 조합, 또한 반응 혼합물에 대한 다양한 부가 시간을 허용하는 두개 이상의 종류의 시약이 적절히 조합될 수 있거나 또는 하나의 시약 시스템이 사용될 수 있다.
본발명은 발색단을 기질로서 갖는 상기한 리조포스포리피드의 사용이 특징인, LPLD 활성 측정방법, 및 LPLD 활성을 저해하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 당해 측정 방법 및 스크리닝 방법은 다음 단계를 보통 포함한다.
(1) 일반식(I)(상기에서 언급됨)의 리조포스포리피드가 샘플에 부가되어 리조포스포리피드를 샘플 내의 LPLD와 반응시킨다.
(2) 상기한 단계(1)에 의해 방출된 발색 화합물의 양이 비색 정량되고, 발색 화합물이 전구체로서 방출되면, 발색 화합물을 적절한 발색 시약을 사용하여 전환시켜 화합물의 양이 비색 정량된다.
본발명의 LPLD 활성 저해 물질의 스크리닝방법에서, 상기한 단계에 부가적으로 테스트 물질을 LPLD를 함유한 샘플에 부가하는 단계 및 테스트 물질이 부가되었을 때 방출되는 발색 화합물의 양을 부가가 없었을 때의 양과 비교하는 단계가 포함된다. 이 비교 단계는 각 건별로 발색 수준의 비색정량(후술됨)에 의해 수행된다.
"테스트 물질"은 LPLD 활성에 대한 영향을 검사할 어떠한 물질을 의미하고, 공지이거나 신규일 수 있다. 합성 제품이거나 자연 발생적 생성물일 수 있다. 그형태는 LPLD와 리조포스포리피드의 반응을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않고, 화합물로서 정제되거나, 비정제된 조성물일 수 있고, 고체이거나 액체일 수 있다. 액체의 경우, 용매는 특별히 제한되지 않는다.
"샘플"은 활성 수준을 측정할, LPLD를 포함하거나 포함하지 않는 물건으로서, LPLD를 포함할 가능성이 있는 다양한 생물학적 샘플, 측정용 표준 샘플, 측정용 대조 샘플 및 LPLD 없는 다양한 완충액을 포함한다. 더욱 상세하게는, 예를 들면, 전혈, 혈청, 혈장, 뇨, 침, 복수, 척수액 등과 같은 임상적 테스트에 사용되는 체액 성분 및 동물 및 식물 세포 추출 용액 등과 같은 기초연구용 물질 등이 언급된다.
본발명의 스크리닝 방법에서 사용되는"LPLD 함유 샘플"은 상기한 "샘플"와 유사한 것이 사용된다. 공지된 양의 LPLD를 함유한 샘플이 본발명의 스크리닝 방법을 적용할 수 있다. 부가적으로, LPLD를 함유한 동일 샘플은 본발명의 스크리닝 방법에서도 사용될 수 있는데, 왜냐하면, 본발명에서, 스크리닝은 테스트 물질이 부가된 것 및 부가되지 않은 것 사이의 활성 수준을 비교함으로써 수행되고, 이것은 함유된 LPLD의 절대량을 특별히 결정할 필요를 없애주기 때문이다.
바람직하게는, "LPLD를 함유한 샘플"로서, 공지된 양의 고정제된 LPLD를 함유한 샘플, 더욱 바람직하게는 공지된 양의 재조합 LPLD를 함유한 샘플이 사용된다. 특히, 샘플이 혈청인 경우, 공지된 양의 고정제된 LPLD를 함유한 혈청, 또는 공지된 양의 재조합 LPLD를 함유한 혈청이 본발명의 활성 측정 방법 및 스크리닝 방법용 대조 혈청, 대조 샘플 또는 표준 샘플 으로서 유용하게 사용될 수 있다.
공지된 양의 고정제된 LPLD를 함유한 샘플은 LPLD를 함유한 샘플을 상기한 바와 같이 정제시켜 얻어질 수 있다. 상세한 단계는 실시예에서 후술된다. 택일적으로, 공저된 양의 고정제된 LPLD를 LPLD-없는 샘플 또는 LPLD 함량이 공지된 샘플에 부가시킴으로써 제조될 수 있다.
공지된 양의 재조합 LPLD 함유 샘플은 공지된 양의 재조합 LPLD(상기에서 언급됨)를 샘플에 부가시켜 얻어질 수 있다.
기질인 리조포스포리피드 및 샘플의 반응 조건은 사용되는 기질 및 샘플의 종류 및 조건에 따라 적절히 결정되고, 일반적으로 다음과 같다.
반응 온도
온도는 기질이 안정하고 LPLD 활성을 유지할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 측정의 간편성, 자동화 등을 고려하여, 측정은 일반적으로 25-40℃, 바람직하게는 약 35-40℃에서 수행된다.
반응 시간
본발명은 방출된 발색 화합물 양의 비색정량을 포함하는데, 이는 흡광도의 시간에 따른 변화 측정을 포함한다. 따라서, 리조포스포리피드와 샘플의 반응시작 직후부터 모니터링이 시작된다. 기질로부터의 발색 화합물의 방출을 위해, 반응은 기질 종류 및 기타 반응 조건에 따라 변경될 수는 있을지라도 일반적으로 5분 내지 수 시간 수행된다. 따라서, 흡광도의 변화는 본발명에서 바람직하게는 5분 내지 1시간 동안 모니티링된다.
반응 pH
pH는 LPLD가 기질과 반응하고 그의 효소반응이 측정가능한 한 특별히 제한되지 않는다. 사용된 발색단에 따라서, LPLD 활성용 pH 및 발색 반응용 pH는 서로 다르다. 예를 들면, p-니트로페닐 그룹이 발색단으로서 사용된 경우, LPLD 반응에 의해 방출된 p-니트로페놀은 알칼리 조건 하에서만 발색한다(Saiji Kanashima 등, Jorunal of Medical Technology 41, 1025-1028, 1997). 그러므로, LPLD 활성의 최적 pH는 산성 범위 또는 중성 범위에 가깝고, LPLD를 함유한 샘플 및 기질은 주어진 시간 동안 반응시키고, 발색 반응은 알칼리 조건 하에서 수행될 수 있다. 그렇지만 LPLD 활성의 최적 pH가 알칼리 범위일 때, LPLD 반응 및 발색 반응이 동일 pH에서 동시에 수행될 수 있다.
기질 농도
기질 농도는 기질의 종류 및 기타 반응 조건에 따라서 변화하지만, 오염 성분의 영향에 민감하지 않고 그 양이 샘플 내의 LPLD와의 충분한 반응을 허용하고 바람직한 양이 결정되는 한 특별히 제한되지 않다. 특이적으로, 최종 농도는 1 mmol/L 이상, 바람직하게는 2 mmol/L - 10 mmol/L, 특히 바람직하게는 약 2 mmol/L - 5 mmol/L이다. 1mmol/L이하인 경우, 블랭크와의 차이가 적게 되고 유의성 있는 값이 얻어지기 어렵다.
방출된 발색 화합물의 양은 비색정량에 의해 결정된다. 비색 정량법은 발색 화합물에 따라서 적절히 결정되고, 그 측정은 이 분야에서 공지된 방법에 따라서 수행된다. 예를 들면, 발색 화합물이 p-니트로페놀인 경우, 얻어진 노란색 발색은 40nm 근처에서 스펙트로포토미터 등에 의해 흡광도의 변화로서 측정된다. 발색 화합물이 4-메틸움벨리페론인 경우, 그 형광도는 스펙트로플루오로-포토미터 등에 의해 결정된다. α-나프톨의 경우, 디아조화 시약이 사용되어 커플링 반응을 수행하여 발색 화합물, 즉 아조 화합물이 얻어지고, 그 발색은 스펙트로포토미터 등에 의해 측정된다. 디아조화 시약으로서, 예를 들면 Fast Red TR, p-디아조벤젠설폰산 등이 언급된다. 디아조화 시약 등과 같은 부가적 발색 시약이 필요한 경우, 당해 시약은 이후에 언급될 본발명의 LPLD 활성 측정 키트 및 LPLD 활성 저해용 물질의 스크리닝 키트에 포함될 수 있다.
본발명의 스크리닝 방법에서, 테스트 물질 및 본발명의 기질인 리조포스포리피드의 샘플에의 부가는 LPLD 활성에 대한 테스트 물질의 영향이 충분히 반영될 때 수행하도록 적절히 결정된다. 예를 들면, 효과가 빨리 나타나면, 테스트 물질 및 기질인 리조포스포리피드는 거의 동시에 부가될 수 있다. 그렇지만, 일반적으로 테스트 물질 및 샘플 내의 LPLD는 미리 충분히 반응시키고, 기질인 본발명의 포스포리피드가 부가되어 본발명의 LPLD 활성 측정을 수행한다.
본발명에서, 본발명의 LPLD 활성 측정 또는 본발명의 LPLD 활성 저해 물질 스크리닝에 필요한 각 성분은 키트 내에 모아서 포장시킬 수 있다.
필요한 경우, 그러한 키트는 기질인 리조포스포리피드에 부가적으로, 용해용 용액, 발색 시약 등과 같은 반응에 필요한 성분이 포함될 수 있다. 더욱이, 측정에 필요한 성분에 부가적으로, 반응 용기, 설명 메뉴얼 등이 바람직하게는 편리성을 위해 함께 포장된다. LPLD 활성 저해용 물질의 스크리닝 키트는 바람직하게는 LPLD를 함유한 샘플을 함유한다. "LPLD 함유 샘플"은 바람직하게는 "공지된 양의고정제된 LPLD를 함유한 샘플"이고, 더욱 바람직하게는 "공지된 양의 재조합 LPLD를 함유한 샘플을 함유한 샘플"이다. LPLD를 함유한 샘플을 키트 내에 미리 함유시킴으로써, 테스트 물질의 부가 또는 부가가 없는 LPLD 활성의 변화가 동일 샘플을 사용하여 측정될 수 있다.
본발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 LPLD 활성을 저해하는 물질은 LPLD 저해 활성에 의해 LPA 생성을 억제할 수 있고 LPA의 과다하거나 비정상적인 생성에 의해 야기되는 것으로 생각되는 다양한 질병에 바람직하게는 사용될 수 있다. 예를 들면, 동맥경화증의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
실시예를 참고로 하여 본 발명을 하기에 상세히 설명하지만, 어느 방식으로든 본 발명을 이 실시예로 제한하는 것은 아니다. 구체적으로 언급하지 않는 한, 시약 등과 같이 실시예에서 사용되는 각각의 재료는 상업적으로 이용할 수 있고 첨부된 지시 책자에 따라 사용될 수 있다.
실시예 1: 1-아실-리소포스파티딜-p-니트로페놀-(1)의 합성
대두-유래 1-리놀레오일-2-하이드록시-포스파티딜-p-니트로페놀:
(1) 대두-유래 1,2-디리놀레오일--포스파티딜-p-니트로페놀의 합성:
대두-유래 디리놀레오일글리세롤(2.68g, 4.3mmol) 및 4-니트로페닐포스포로 디클로라이드(0.916g, 3.6mmol)를 약 2시간동안 P2O5상에서 건조시키고 무수 피리딘(10㎖)을 가하였다. 충분히 현탁시킨후, 2,4,6-트리이소프로필벤젠설포닐 클로라이드(2.71g, 8.95mmol)를 가하고 혼합물을 밤새도록 실온에서 반응시켰다. 물을 반응 혼합물에 붓고, 혼합물을 혼합하고 교반하고, 에탄올 및 톨루엔을 가한 후, 감압건조하에 농축시켰다. 디에틸 에테르를 수득한 건조물에 가하고 불용성인 부분을 제거하여 가용성인 부분을 수득하고, 이를 소량의 클로로포름에 용해시키고 동일한 용매 타입으로 활성화된 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 적용하여 클로로포름-에탄올 수성 타입의 용리제를 사용함으로써 1.45g의 황색 오일을 수득하였다.
(2) 대두-유래 1-리놀레오일-2-하이드록시-포스파티딜-p-니트로페놀
상기 언급된 (1)에서 수득한 황색 오일(564mg)을 디에틸 에테르(20㎖)에 용해시키고 포스포리파아제 A2(100mg, 코브라 독 유래; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 0.1mol/ℓ 보레이트-포스페이트 완충액(10㎖, pH 6.5) 및 1mol/ℓ 염화칼슘(0.1㎖)에 용해시켰다. 이를 48시간동안 혼합하고 반응시켰다. 반응 후, 디에틸 에테르 분획을 감압하에 농축시키고 농축물을 동일한 용매 타입으로 활성화된 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 적용하여 클로로포름-에탄올 수성 타입의 용리제를 사용함으로써 황색 오일로서 252mg의 표제 화합물을 수득하였다.
실시예 2: 1-아실-리소포스파티딜-p-니트로페놀-(2)의 합성
난황-유래 1-올레오일-2-하이드록시-포스파티딜-p-니트로페놀:
(1) 난황-유래 디아실포스파티딜-p-니트로페놀의 합성:
난황-유래 디아실글리세롤(1.75g, 2.95mmol), 4-니트로페닐포스포로 디클로라이드(0.686g, 2.68mmol) 및 2,4,6-트리이소프로필벤젠설포닐 클로라이드(2.02g, 6.7mmol)를 사용하여 실시예 (1)에 따른 합성 및 정제하여 황색 오일(1.41g)을 수득하였다.
(2) 난황-유래 1-올레오일-2-하이드록시-포스파티딜-p-니트로페놀:
상기 언급된 (1)에서 수득한 황색 오일(573mg) 및 포스포리파아제 A2(123mg, 코브라 독 유래; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 사용하여 실시예 1(2)에 따른 가수분해 및 정제에 의해 황색 오일로서 표제 화합물(221mg)을 수득하였다.
실시예 3: 2-아실-리소포스파티딜-p-니트로페놀-(1)의 합성
대두-유래 1-하이드록시-2-리놀레오일-포스파티딜-p-니트로페놀:
상기 언급된 실시예 1(1)에서 수득한 화합물(1.45g)을 디에틸 에테르(50㎖)에 용해시키고, 리파아제(1g, Rhizopus Stolonifer-유래: SEIKAGAKU CORPORATION)을 0.1mol/ℓ 보레이트-포스페이트 완충액(14㎖, pH 6.5) 및 1mol/ℓ 염화칼슘(0.1㎖)에 용해시켰다. 이를 48시간동안 혼합하고 반응시켰다. 반응 후, 디에틸 에테르분획을 감압하에 농축시키고 농축물을 동일한 용매 타입으로 활성화된 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 적용하여 클로로포름-에탄올 수성 타입의 용리제를 사용함으로써 황색 오일로서 568mg의 표제 화합물을 수득하였다.
실시예 4: 2-아실-리소포스파티딜-p-니트로페놀-(2)의 합성
난황-유래 1-하이드록시-2-올레오일-포스파티딜-p-니트로페놀:
상기 언급된 실시예 2(1)에서 수득한 화합물(714mg) 및 리파아제(700mg)를 사용하여 실시예 3에 따른 가수분해 및 정제에 의해 표제 화합물(374mg)를 수득하였다.
실시예 5: 활성 측정 1(반응 pH)
(1) 시약 제조
시약 A: N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-3-프로판설폰산(200mmol/ℓ), 트리톤 X-100(0.02%)
시약 B: 시약 A를 분취하고 pH 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4 및 8.6으로 조정하고 2배로 희석하여 다양한 pH를 갖는 시약 B를 수득하였다.
시약 C: pH 4.5
시트르산 모노하이드레이트(10mmol/ℓ), 트리톤 X-100(0.01%), 상기 언급된 실시예에서 제조된 1-하이드록시-2-리놀레오일-포스파티딜-p-니트로페놀(실시예 3; 10mmol/ℓ).
(2) 시료
혈청내 알부민 분획의 활성을 측정하기 위하여 두 종류의 상업적으로 이용가능한 대조군 혈청, 각각 시험 시료 1(CONSERA: Nissui Pharmaceutical Co.) 및 시험 시료 2(Lipid Serum II: Eiken Chemical Co., Ltd.) 및 5% 인간 혈청 알부민(지방산 없음: Sigma) 용액을 사용하였다.
(3) 측정
각 시료(10㎕) 및 시약 B(150㎕)를 마이크로플레이트에 분배하고 플레이트를 약 5분간 37℃에서 인큐베이션시켰다. 시약 C(50㎕)를 가하고 시간에 따라 405nm의 주파장 및 540nm의 부파장에서의 흡수도를 측정하였다. LPLD 작용에 의해 유리된 p-니트로페놀에 의존한 분당 흡수도 변화에 기초하여 LPLC 활성을 측정하였다. 활성을 1㎖의 반응 혼합물내 분당 유리된 p-니트로페놀의 양으로 나타내었다. 결과를 도 1에 나타낸다. pH가 알칼리성 상에 있는 경우 활성은 강력하고, 인간 혈청 알부민 분획의 활성 또한 상승하였다. 따라서, pH 8 이하에서는 알부민의 영향이 거의 없어 활성 측정이 가능하다.
실시예 6: 활성 측정 2(기질)
(1) 시약 제조
시약 A: pH 8.0
2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄설폰산(100mmol/ℓ), 트리톤 X-100(0.01%)
시약 B:pH 4.5
시트르산 모노하이드레이트(10mmol/ℓ), 트리톤 X-100(0.01%)
시약 C: 상기 언급된 실시예에서 제조된 100mmol/ℓ의 대두-유래 1-하이드록시-2-리놀레오일-포스파티딜-p-니트로페놀(실시예 3; 기질 A), 대두-유래 1-리놀레오일-2-하이드록시-포스파티딜-p-니트로페놀(실시예 1: 기질 B), 난황-유래 1-하이드록시-2-올레오일-포스파티딜-p-니트로페놀 (실시예 4: 기질 C), 및 난황-유래 1-올레오일-2-하이드록시-포스파티딜-p-니트로페놀 (실시예 2; 기질 D)에 상응하는 용액을 시약 B로 10배 희석하고 시약 C로서 사용하였다.
(2) 시료
시료로서 인간 혈청을 사용하여, 5% 인간 혈청 알부민(지방산 없음:Sigma) 용액을 사용하여 혈청내 알부민 분획의 활성을 측정하고, 5U/㎖의 스트렙토마이세프-유래 PLD(제품 약칭: Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) 용액을 사용하여 포스포리파아제 D(PLD)와의 반응성을 측정하였다.
(3) 측정
각 시료(10㎕) 및 시약 A(150㎕)를 마이크로플레이트에 분배하고 플레이트를 약 5분간 37℃에서 인큐베이션시켰다. 시약 C(50㎕)를 가하고 시간에 따라 405nm의 주파장 및 540nm의 부파장에서의 흡수도를 측정하였다. LPLD 작용에 의해 유리된 p-니트로페놀에 의존한 분당 흡수도 변화에 기초하여 LPLC 활성을 측정하였다. 활성을 1㎖의 반응 혼합물내 분당 유리된 p-니트로페놀의 양으로 나타내었다. 결과를 도 2에 나타낸다. 인간 혈청 알부민에 대한 반응은 기질 A 및 C와 같은 1-하이드록시-2-아실-포스파티딜-p-니트로페놀보다 기질 B 및 D와 같은 1-아실-2-하이드록시-포스파티딜-p-니트로페놀에 대하여 더욱 높았지만, 인간 혈청에 대한 반응은 1-아실-2-하이드록시-포스파티딜-p-니트로페놀보다 1-하이드록시-2-아실-포스파티딜-p-니트로펜놀에 대하여 더욱 높았다. 이는 특히 기질로서 1-하이드록시-2-아실-포스파티딜-p-니트로페놀을 사용하는 경우, 더욱 작은 알부민의 영향으로 LPLC 활성을 측정할 수 있다는 것을 제안한다.
이들 기질은 다양한 수준의 반응을 나타냈고, 모두 스트렙토마이세스-유래 PLD에 대한 기질이 될 수 있다는 것으로 밝혀졌다. 정상 인간 혈청중에 PLD가 존재한다고 보고된 바 없지만 PLD가 시료중에 공존하는 경우 상기 언급된 기질중 기질 A 또는 기질 B의 사용이 바람직할 수 있다.
실시예 7: 활성 측정 3(기질 농도)
(1) 시약 제조
시약 A: pH 8.0
2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄설폰산(100mmol/ℓ), 트리톤 X-100(0.01%), 트리톤 X-100(0.01%)
시약 B:pH 4.5
시트르산 모노하이드레이트(10mmol/ℓ), 트리톤 X-100(0.01%)
시약 C: 기질로서 상기 언급된 실시예에서 제조된 대두-유래 1-하이드록시-2-리놀레오일-포스파티딜-p-니트로페놀(실시예 3)을 시약 B를 사용하여 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 10, 20, 30 및 50mmoo/ℓ로 희석시키고 시약 C로서 사용하였다.
(2) 시료
시료로서 인간 혈청을 사용하여, 5% 인간 혈청 알부민(지방산 없음:Sigma) 용액을 사용하여 혈청내 알부민의 활성을 측정하였다.
(3) 측정
각 시료(10㎕) 및 시약 A(150㎕)를 마이크로플레이트에 분배하고 플레이트를 약 5분간 37℃에서 인큐베이션시켰다. 시약 C(50㎕)를 가하고 시간에 따라 405nm의 주파장 및 540nm의 부파장에서의 흡수도를 측정하였다. LPLD 작용에 의해 유리된 p-니트로페놀에 의존한 분당 흡수도 변화에 기초하여 LPLC 활성을 측정하였다. 활성을 1㎖의 반응 혼합물내 분당 유리된 p-니트로페놀의 양으로 나타내었다. 결과를 도 3에 나타낸다. 기질의 최종 농도로서, 5mmol/ℓ 이상의 첨가는 바람직하지 못하다.
실시예 8: 활성 측정 4(시료의 희석 직선성)
(1) 시약 제조
시약 A: pH 8.0
2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄설폰산(100mmol/ℓ), 트리톤 X-100(0.01%), 트리톤 X-100(0.01%)
시약 B: pH 4.5
시트르산 모노하이드레이트(10mmol/ℓ), 트리톤 X-100(0.01%),
대두-유래 1-하이드록시-2-리놀레오일-포스파티딜-p-니트로페놀(실시예 3; 20mmol/ℓ)
(2) 시료
시료로서, 생리학적 염수를 사용한 5개의 연속된 인간 혈청 희석액을 사용하였다.
(3) 측정
각 시료(10㎕) 및 시약 A(150㎕)를 마이크로플레이트에 분배하고 플레이트를 약 5분간 37℃에서 인큐베이션시켰다. 시약 C(50㎕)를 가하고 시간에 따라 405nm의 주파장 및 540nm의 부파장에서의 흡수도를 측정하였다. LPLD 작용에 의해 유리된 p-니트로페놀에 의존한 분당 흡수도 변화에 기초하여 LPLC 활성을 측정하였다. 활성을 1㎖의 반응 혼합물내 분당 유리된 p-니트로페놀의 양으로 나타내었다. 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 원점을 통과하는 우수한 직선을 얻었다. 이는 본 발명의 활성 측정 방법에 의해 인간 혈청내 LPLD 활성의 양 측정할 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 9: 리소포스포리파아제 D(송아지 리소포스포리파아제 D)의 정제
(3)의 용출을 제외하고 4℃에서 하기 모든 단계를 수행하였다.
(1) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 침전
50% PEG를 원료인 소태아 혈청(FCS, 2ℓ)에 서서히 가하여 PEG의 최종 농도를 5%로 하였다. 10분동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 60분동안 20,400g에서 원심분리하고 상층액을 회수하였다. 50% PEG를 가하여 최종 농도 10%로 하고 반응 혼합물을 20,400g에서 60분동안 원심분리하였다. 수득한 침전물을 완충액 A(20mM Tris-HCl, 400㎖, pH 7.4)중에 현탁시켰다.
(2) 블루 세파로스를 사용한 친화 크로마토그래피
상기 언급된 현탁액을 완충액 A로 평형화된 블루 세파로스 6FF(Pharmacia Biotech, 칼럼 크기 50㎖)에 가하고, 완충액 A로 세척하였다. 완충액 A중 NaCl의 직선 농도 구배(0-2M)에 의해 LPLD를 자연낙하(gravity-drop)하여 용출시키고 LPLD 활성을 보이는 분획을 수집하였다.
(3) 콘카나발린 A(ConA) 세파로스를 사용한 친화 크로마토그래피
상기 언급된 활성 분획을 완충액 B(500mM NaCl을 함유하는 완충액 A)로 평형화된 ConA 세파로스(Pharmacia Biotech, 칼럼 크기 3㎖)에 가하고, 완충액 B로 세척하였다. 실온에서 완충액 C(5mM α-메틸만노시드를 함유하는 완충액 B)를 사용하여 자연낙하에 의해 LPLD를 용출시키고 LPLD 활성을 보이는 분획을 수집하고 완충액 A에 대하여 투석시켰다.
(4) BioAssistQ 칼럼을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피
상기 언급된 투석물을 완충액 D(20mM Tris-HCl, pH 8.0))로 평형화된 BioAssistQ(Tosoh Corporation, 칼럼 크기 0.8㎖)에 가하고, 완충액 D로 세척하였다. 완충액 D중 NaCl의 직선 농도 구배(0-2M)에 의해 LPLD를 자연낙하하여 용출시키고 LPLD 활성을 보이는 분획을 수집하였다.
(5) 헤파린 칼럼을 사용한 친화 크로마토그래피
상기 언급된 활성 분획을 완충액 E(10% 글리세롤을 함유하는 완충액 A)으로 10배 희석시키고 완충액 E로 평형화된 HiTrap Heparin 칼럼(Pharmacia Biotech, 칼럼 크기 1㎖)에 가하고 완충액 E로 세척하였다. 완충액 E중 NaCl의 직선 농도 구배(0-2M)에 의해 0.5㎖/분으로 LPLD를 자연낙하하여 용출시키고 LPLD 활성을 보이는 분획을 수집하였다.
(6) RESOURCE PHE 칼럼을 사용한 소수성 크로마토그래피
5M NaCl를 상기 언급된 활성 분획에 가하여 NaCl의 최종 농도를 2M으로 하였다. 완충액 F(1mM NaCl을 함유하는 완충액 A)로 평형화된 RESOURCE PHE(Pharmacia Biotech, 칼럼 크기 1㎖)에 가하고, 완충액 F로 세척하였다. LPLD를 1.0㎖/분으로 1mM EDTA을 사용하여 용출시키고 LPLD 활성을 보이는 패스(pass) 분획을 수집하였다.
(7) 하이드록시아파타이트(HAT)를 사용하여 비특이적 흡착
상기 언급된 활성 분획을 완충액 G(10% 글리세롤을 함유하는 1mM NaH2PO4-NaOH)로 10배 희석시키고 완충액 G로 평형화된 HAT(Bio-Rad, 칼럼 크기 1㎖)에 가하고 완충액 G로 세척하였다. 완충액 G중 NaH2PO4-NaOH의 직선 농도 구배(1-150mM)에 의해 0.8㎖/분으로 용출시키고 LPLD 활성을 보이는 분획을 수집하여 송아지 포스포리파아제 D의 부분 정제물을 수득하였다.
(8) 각 분획의 리소포스포리파아제 D 활성 측정
원료, FCS, 및 상기 언급된 (1)-(7)에서 수득한 각 분획을 리소포스포리파아제 D 활성에 대하여 측정하여 정제 정도를 확인하였다.
각 분획의 리소포스포리파아제 D 활성을 반응 혼합물(100mM Tris 염산(pH 9.0), 500mM 염화나트륨, 5mM 염화마그네슘, 0.05% Triton X-100, 1mM 리소포스파티딜콜린)에서 측정하였다. 시료(FCS, (1)-(7)에서 수득한 분획중 어느 하나)를 상기 언급된 반응 혼합물에 100㎕으로 가하고 혼합물을 60분동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 10분동안 그로부터 15㎕을 200㎕의 측정 시약(100mM Tris-염산(pH 8.0), 0.375mM N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3-메톡시아닐린, 0.25mM 4-아미노안티피린, 0.01% 트리톤 X-100, 7.5U/㎖ 퍼옥시다제, 2.5U/㎖ 콜린 옥시다제)과 반응시키고 550nm에서 흡수도를 측정하였다. 상기 언급된 반응 혼합물 대신 50μM 콜린 클로라이드를 사용한 경우 수득한 흡수도에 기초하여 측정치를 전환하였다.
결과를 정제표로서 표 2에 나타낸다.
표2
실시예 10: 송아지 리소포스포리파아제 D의 부분 아미노산 서열의 결정
실시예 9에서 수득한 송아지 리소포스포리파아제 D의 부분 정제물중 단백질을 10% 트리클로로아세트산으로 침전시켜 송아지 리소포스포리파아제 D를 농축시키고, 단백질을 10% 아크릴아미드 SDS-PAGE로 분별하였다. CBB로 염색한 후, 약 100Kda의 분자량을 갖는, 송아지 리소포스포리파아제 D와 우수한 상관성을 나타내는 단백질 밴드를 아크릴아미드로부터 적출하고 리실 엔도펩티다제 효소 처리하였다. 수득한 펩티드 단편을 C4 역칼럼 크로마토그래피에 의해 분별하였다. 이 펩티드중 3개의 아미노산 서열을 Edman 방법에 의해 결정하였다.
BLAST-T 프로그램을 사용하여 수득한 부분 아미노산 서열의 상동성 조사를 시행하였다. 결과 수득한 서열 모두 인간, 마우스 및 래트의 오토탁신(서열번호 2)과 매우 높은 상동성을 보였다. 오토탁신은 종양세포의 운동성 촉진인자로서 공지되어 있고, 뉴클레오티드 피로포스파타아제 활성, 포스포디에스테라제 활성을 갖고다양한 뉴클레오티드 화합물에 작용하는 것으로 보고된 단백질이지만, 상기 단백질 및 단백질 유사체가 LPLD 활성을 갖고 포스포리피드에 대하여 작용한다고 보고된 바는 없다.
실시예 11: 재조합 숙주 세포에서 LPLD 활성의 발현
오토탁신의 LPLD 활성이 실시예 10의 결과로부터 예측되기 때문에, 래트의 오토탁신의 cDNA를 사용하여 형질전환체를 작성하고 상기 언급된 형질전환체에 의해 LPLD 활성의 발현을 조사하였다.
보고된 래트 오토탁신의 서열(서열번호 1)로부터, 래트 오토탁신을 코딩하는 cDNA를 역전사효소를 사용하여 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)에 의해 분리하였다. 주형으로서 역전사효소에 의해 래트 간-유래 RNA로부터 합성된 cDNA를 사용하였다.
수득한 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3의 BamH I/Xho I 부위내로 삽입하고 myc 태그를 cDNA의 C 말단내로 도입하였다. 수득한 cDNA를 리포펙트아민을 사용하여 임시로 CHO-K1내로 도입하였다.
48시간 후, 배양 상층액을 회수하고 항-myc 태그 항체를 사용하여 웨스턴 블랏에 의해 발현을 확인하였다. 또한, 상기 언급된 LPLD 활성 측정법에 의해 재조합 숙주 세포에 의한 LPLD 발현을 확인하였다.
실시예 12: 정제 LPLD 및 본 발명의 기질을 사용한 LPLD 활성 측정
(1) 1-미리스토일-포스파티딜-p-니트로페놀의 합성
(i) 1,2-디미리스토일-포스파티딜-p-니트로페놀의 합성
디미리스토일그리세롤(2.02g) 및 4-니트로페닐포스포로디클로라이드(1.00g)를 약 2시간동안 실온에서 P2O5상에서 건조시키고 무수 피리딘(12㎖)을 가하였다. 충분히 현탁시킨 후, 2,4,6-트리이소프로필벤젠설포닐 클로라이드(1.13g)를 가하고 혼합물을 밤새도록 실온에서 반응시켰다. 물을 반응 혼합물에 붓고, 혼합물을 혼합하고 교반하고, 에탄올 및 톨루엔을 가한 후, 감압 건조하에 농축시켰다. 클로로포름-메탄올(2:1, 100㎖)을 수득한 건조물에 가하고, 물을 가하여 분리하였다. 하층을 회수하였다. 무수 황산나트륨으로 물을 제거하고 잔류물을 여과하였다. 여액을 감압 건조하에 농축시켰다. 수득한 건조물을 소량의 클로로포름에 용해시키고, 동일한 용액 타입으로 활성화된 실리카겔 칼럼 크로마토그래피하여 클로로포름 -메탄올-수성 타입의 용리제를 사용하여 정제함으로써 1.4g의 백색 분말을 수득하였다.
(ii) 1-미리스토일-포스파티딜-p-니트로페놀의 합성
상기 언급된 (i) 에서 수득한 백색 분말(600mg)을 클로로포름(40㎖)에 용해시킨 후, 포스포리파아제 A2(Sigma, 코브라 독-유래; 90mg)을 0.1M 보레이트-포스페이트 완충액(20㎖, pH 6.5) 및 1M 염화칼슘 용액(0.1㎖)에 용해시켰다. 이를 혼합하고 24시간동안 35℃에서 반응시켰다. 클로로포름-메탄올(2:1, 100㎖)을 반응 혼합물에 가하여 분리하고, 하층을 회수하였다. 무수 황산나트륨으로 물을 제거하고 잔류물을 여과하였다. 여액을 감압건조하에 농축시켰다. 수득한 건조물을 동일한 용액 타입으로 활성화된 실리카겔 칼럼 크로마토그래피하여 클로로포름-메탄올-수성 타입의 용리제를 사용하여 정제함으로써 백색 분말의 표제 화합물(223mg)을수득하였다.
ESI-MS(음성) m/z 503[m/H]-
(2) 시약 제조
2-[4-(2-하이드록시에틸-1-피페라지닐]에탄설폰산(100mmol/ℓ), 트리톤 X-100(0.01%)
시약 B: pH 4.5
시트르산 모노하이드레이트(10mmol/ℓ), 트리톤 X-100(0.01%)
시약 C: 1-미리스토일-포스파티닐-p-니트로페놀을 시약 B에 용해시켜 100mmol/ℓ로 일치시키고 시약 C로서 사용하였다.
(3) 측정
측정하기 위하여, 생화학용 자동 분석기(Toshiba Corporation: TBA-80FR NEO)를 사용하였다. 실시예 9에서 수득한 정제된 LPLD(8㎕) 및 시약 A(240㎕)을 약 15분동안 37℃에서 미리 가온시키고, 시약 C(80㎕)을 가한 후, 405nm의 주파장 및 540nm의 부파장에서의 흡수도를 약 15분동안 시간에 따라 측정하였다. LPLD 작용에 의해 유리된 p-니트로페놀에 의존한 분당 흡수도 변화에 기초하여 LPLC 활성을 측정하였다. 활성을 1㎖의 반응 혼합물내 분당 유리된 p-니트로페놀의 양으로 나타내었다. 결과를 도 5에 나타낸다. 도 1과 유사하게, 알칼리성 pH에서 강한 활성이 발견되었다.
정제 LPLD 대신 재조합 LPLD를 사용할 경우 유사한 측정을 사용할 수 있다.
기질로서 본 발명의 신규한 리소포스포리피드를 사용함으로써 특이적이고 고감도의 LPLD 활성을 측정할 수 있다. 또한, 안전하고 용이하게 검출할 수 있는 클로모포르를 사용함으로써 다수의 시료를 신속하게 측정할 수 있다. 또한, 기질로서 본 발명의 신규한 리소포스포리피드를 사용함으로써 LPLD 활성을 저해하는 물질을 선별할 수 있다.
본 출원은 일본 특허 제 403530/2000 및 023784/2001 호에 기초하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로서 인용된다.
Claims (27)
- 일반식(I)의 리조포스포리피드식중, R1및 R2는 서로 다르고 이들 중 하나는 8 내지 22 탄소원자를 갖는 포화 또는 불포화된 지방산 잔기이고, 다른 하나는 수소 원자 또는 아세틸기이고, X는 발색단이다.
- 제 1항에 있어서, 지방산 잔기가 리놀산 잔기, 올레인산 잔기, 팔미틴산 잔기 및 미리스틴산 잔기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 리조포스포리피드.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 발색단이 p-니트로페닐기 또는 α-나프틸기인 리조포스포리피드.
- 제 1항의 리조포스포리피드를 활성 성분으로서 포함하는, 리조포스포리파제 D 활성 측정용 시약.
- 제 1항의 리조포스포리피드를 샘플에 부가하여 리조포스포리피드와 리조포스포리파제 D가 샘플 내에서 반응하도록 하고, 반응에 의해 방출된 발색 화합물의 양을 비색정량하는 것을 포함하는, 샘플 내의 리조포스포리파제 D 활성 측정 방법.
- 제 5항에 있어서, 샘플이 전혈, 혈청, 혈장, 뇨 및 침으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 측정방법.
- 제 6항에 있어서, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 유방암 및 동맥경화증으로 구성된 그룹으로부터 선택된 질병 중 하나를 진단하는데 사용되는 측정방법.
- 제 1항의 리조포스포리피드를 포함하는, 샘플의 리조포스포리파제 D 활성 측정용 키트.
- 제 8항에 있어서, 샘플이 전혈, 혈청, 혈장, 뇨 및 침으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 키트.
- 제 8항에 있어서, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 유방암 및 동맥경화증으로 구성된 그룹으로부터 선택된 질병 중 하나를 진단하는데 사용되는 키트.
- 다음 (a) 또는 (b)의 DNA를 포함하는 유전자:(a) 서열식별번호: 1에서 도시된 염기 서열로 구성된, 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA,(b) 스트린젠트 조건(stringent condition)에서 (a)의 염기 서열로 구성된 DNA와 혼성화하는, 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
- 다음 (a) 또는 (b)의 단백질:(a) 서열식별번호: 2에 도시된 아미노산 서열로 구성된, 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 단백질,(b) 상기 (a)의 아미노산 서열로 구성되고, 하나 내지는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된, 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 단백질.
- 제 11항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 11항의 유전자를 기능적으로 포함하는 발현 벡터.
- 숙주 세포를 제 13항 또는 제 14항의 벡터로 형질전환시켜 얻어진 형질전환체.
- 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서, 제 14항의 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고 얻어진 배양물로부터 리조포스포리파제 D 활성을 갖는 물질을수확하는 것을 포함하는 리조포스포리파제 D의 생산방법.
- 제 16항의 생산방법에 의해 생산된 리조포스포리파제 D.
- 제 4항에 있어서, 리조포스포리파제 D가 제 11항의 유전자에 의해 암호화된 단백질인 리조포스포리파제 D 활성 측정용 시약.
- 제 4항에 있어서, 리조포스포리파제 D가 제 12항의 단백질인 리조포스포리파제 D 활성 측정용 시약.
- 제 11항의 유전자에 의해 암호화된 단백질을 혈청에 부가시켜 얻어지는, 리조포스포리파제 D 활성 측정용 관리 혈청.
- 제 12항의 단백질을 혈청에 부가하여 얻어지는, 리조포스포리파제 D 활성 측정용 관리 혈청.
- 최소한 다음의 단계를 포함하는, 리조포스포리파제 D 활성을 저해하는 물질의 스크리닝 방법:(i) 테스트 물질을 리조포스포리파제 D를 함유한 샘플에 부가하는 단계,(ii) 제 1항의 리조포스포리피드를 리조포스포리파제 D를 함유하는 샘플에부가하는 단계,(iii) 리조포스포리피드와 샘플 내 리조포스포리파제 D의 반응에 의해 방출된 발색 화합물의 양을 비색정량하는 단계, 및(iv) 발색 정도로 보여진 리조포스포리파제 D 활성을 테스트 물질이 부가되지 않은 것과 비교하는 단계.
- 제 22항에 있어서, 리조포스포리파제 D가 제 11항의 유전자에 의해 암호화되는 스크리닝 방법.
- 제 22항에 있어서, 리조포스포리파제 D가 제 12항의 단백질인 스크리닝 방법.
- 제 1항의 리조포스포리피드 및 리조포스포리파제 D를 함유한 샘플을 포함하는, 리조포스포리파제 D 활성을 저해하는 물질의 스크리닝용 키트.
- 제 25항에 있어서, 리조포스포리파제 D가 제 11항의 유전자에 의해 암호화되는 단백질인 키트.
- 제 25항에 있어서, 리조포스포리파제 D가 제 12항의 단백질인 키트.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JPJP-P-2000-00403530 | 2000-12-28 | ||
| JP2000403530 | 2000-12-28 | ||
| JPJP-P-2001-00023784 | 2001-01-31 | ||
| JP2001023784 | 2001-01-31 | ||
| PCT/JP2001/011612 WO2002053569A1 (fr) | 2000-12-28 | 2001-12-28 | Procede pour doser une activite de lysophospholipase d |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20020077926A true KR20020077926A (ko) | 2002-10-14 |
Family
ID=26607261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020027011256A KR20020077926A (ko) | 2000-12-28 | 2001-12-28 | 리조포스포리파제 디 활성 측정방법 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040053893A1 (ko) |
| EP (1) | EP1357126A4 (ko) |
| JP (1) | JPWO2002053569A1 (ko) |
| KR (1) | KR20020077926A (ko) |
| WO (1) | WO2002053569A1 (ko) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003031615A1 (fr) * | 2001-10-04 | 2003-04-17 | Apro Life Science Institute, Inc. | Inhibiteur de l'acide lysophosphatidique synthase |
| US7459285B2 (en) * | 2002-12-10 | 2008-12-02 | Echelon Biosciences Incorporated | Compounds and methods of use thereof for assaying lysophospholipase D activity |
| WO2011151461A2 (en) * | 2010-06-04 | 2011-12-08 | B.S.R.C. "Alexander Fleming" | Autotaxin pathway modulation and uses thereof |
| US9000025B2 (en) | 2010-08-20 | 2015-04-07 | Amira Pharmaceuticals, Inc. | Autotaxin inhibitors and uses thereof |
| EP2714680B1 (en) | 2011-05-27 | 2015-11-25 | Amira Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic autotaxin inhibitors and uses thereof |
| CN113030471B (zh) * | 2021-03-09 | 2024-01-26 | 河南省商业科学研究所有限责任公司 | 一种酶联比色法测定磷脂酶d酶活性的优化方法 |
| CN114295567B (zh) * | 2021-12-30 | 2024-01-16 | 青岛汉唐生物科技有限公司 | 一种磷脂酶a2检测试剂盒及其制备方法 |
| CN114774339B (zh) * | 2022-04-12 | 2023-10-20 | 深圳大学 | 用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器及检测方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5011964A (en) * | 1985-03-07 | 1991-04-30 | Cornell Research Foundation, Inc. | Novel diacylglycerophosphoric acid esters and use thereof as substrates in enzyme assays |
| US5731167A (en) * | 1992-01-17 | 1998-03-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Autotaxin: motility stimulating protein useful in cancer diagnosis and therapy |
| WO2000068386A1 (en) * | 1999-05-07 | 2000-11-16 | Zymogenetics, Inc. | Autotaxin variants and uses to treat diseases of metabolism |
| JP4621927B2 (ja) * | 2000-07-07 | 2011-02-02 | アルフレッサファーマ株式会社 | リゾリン脂質の測定方法 |
-
2001
- 2001-12-28 JP JP2002555092A patent/JPWO2002053569A1/ja active Pending
- 2001-12-28 KR KR1020027011256A patent/KR20020077926A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-12-28 EP EP01272916A patent/EP1357126A4/en not_active Withdrawn
- 2001-12-28 US US10/250,342 patent/US20040053893A1/en not_active Abandoned
- 2001-12-28 WO PCT/JP2001/011612 patent/WO2002053569A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040053893A1 (en) | 2004-03-18 |
| WO2002053569A1 (fr) | 2002-07-11 |
| EP1357126A1 (en) | 2003-10-29 |
| JPWO2002053569A1 (ja) | 2004-05-13 |
| EP1357126A4 (en) | 2006-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wu et al. | Choline acetyltransferase: celebrating its fiftieth year | |
| Calvert et al. | Tomato annexins p34 and p35 bind to F-actin and display nucleotide phosphodiesterase activity inhibited by phospholipid binding. | |
| Lin et al. | An Escherichia coli mutant with an amino acid alteration within the signal sequence of outer membrane prolipoprotein. | |
| EP0614489B1 (en) | NOVEL HUMAN cdc25 GENES, ENCODED PRODUCTS AND USES THEREFOR | |
| Kim et al. | Enzymatic characterization of O-GlcNAcase isoforms using a fluorogenic GlcNAc substrate | |
| DK175518B1 (da) | Molekyler med antistofkombinerende steder, som udviser katalytiske egenskaber | |
| JPH08507686A (ja) | 遺伝子操作酵素及びそれらの診断アッセイ用結合体 | |
| WO1994020636A9 (en) | Genetically engineered enzymes and their conjugates for diagnostic assays | |
| EP0584343A1 (en) | Recombinant calf intestinal alkaline phosphatase | |
| KR20020077926A (ko) | 리조포스포리파제 디 활성 측정방법 | |
| US7109012B2 (en) | Recombinant lysophosphatidic acid phosphatase | |
| JPH0466864B2 (ko) | ||
| JP2002509428A (ja) | Ａｆｃ１およびｒｃｅ１：イソプレニル化されたｃａａｘプロセシング酵素 | |
| US5770423A (en) | Nucleic acids encoding cdc25 A and cdc25 B proteins and method of making cdc25 A and cdc25 B proteins | |
| AU2003242820A1 (en) | Variants of human kallikrein-2 and kallikrein-3 and uses thereof | |
| JP3995420B2 (ja) | セラミダーゼ遺伝子 | |
| US20240287106A1 (en) | Method for Producing Fluorescent Probe Library Using Solid-Phase Extraction and Method of Measuring Enzyme Activity Using Same | |
| EA005853B1 (ru) | N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза человека, взаимодействующая с каспазой-8, и способы ее применения | |
| CA2416800A1 (en) | Isolation of drosophila and human polynucleotides encoding par-1 kinase, polypeptides encoded by the polynucleotides and methods utilizing the polynucleotides and polypeptides | |
| Communi et al. | Identification of an active site cysteine residue in human type I Ins (1, 4, 5) P 3 5-phosphatase by chemical modification and site-directed mutagenesis | |
| Lee et al. | Analysis of human lecithin–cholesterol acyltransferase activity by carboxyl-terminal truncation | |
| Visvanathan et al. | A novel fluorogenic reporter substrate for 1-phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-2 (PLCγ2): Application to high-throughput screening for activators to treat Alzheimer's disease | |
| US7148018B2 (en) | Protease-activated receptor (par) modulator assays | |
| JPWO2003031615A1 (ja) | リゾホスファチジン酸合成酵素阻害物質 | |
| JP2002504686A (ja) | プロテインキナーゼｃ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |