CN105543337A - 一种5’-核苷酸酶检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种5’-核苷酸酶检测试剂盒及其制备方法，属于体外诊断试剂领域。解决现有的5’-核苷酸酶检测试剂盒精密度和稳定性低的问题。所述的试剂盒由试剂R1和试剂R2组成。本发明还提供一种5’-核苷酸酶检测试剂盒的制备方法。所述试剂R1中含有AES和TritonX-305组成的复合稳定剂，在提高试剂稳定性的同时能够提高试剂的分散度，减小两次空白定标之间的吸光度差异，提高试剂盒精密度；R1中含有A90可有效防止磷酸镁沉淀的产生，替换了价格昂贵的18-冠醚-6，既提高了试剂的稳定性、降低了试剂空白吸光度变化率，又极大地降低了成本；试剂R2中添加甘氨酸和EDTA·2K来提高试剂盒检测灵敏度和精密度，同时甘氨酸的加入可以降低试剂空白吸光度。

Description

一种5’-核苷酸酶检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种5’-核苷酸酶检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
5'-核苷酸酶(5'-Nucleotidase，5'-NT)测定主要用于肝胆系统疾病的诊断和骨骼疾病的鉴别诊断。血清5'-NT活性升高主要见于肝胆系统疾病，如阻塞性黄疸、肝癌、肝炎等，其活性增高可达2～6倍，且与病情严重程度呈正相关，且其活性变化与ALP一致。但骨骼系统疾病，如肿瘤转移、畸形性骨炎、佝偻病、甲状旁腺功能亢进等，通常ALP活性升高，而5'-NT正常。因此ALP和5'-NT同时测定有助于肝胆和骨骼系统疾病的鉴别诊断。
目前，临床上对5’-NT的测定方法多采用酶法，该方法简便快捷、结果相对可靠，对肝胆疾患的诊断具有较高应用价值。但该方法在测定过程中，精密度不高，尤其是低值血清样本，而且还存在热稳定性差以及冷藏过程中嘌呤核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶活性下降快的问题，导致酶用量大，成本提高，另外ALP对5’-IMP的水解不能完全消除，从而造成测定灵敏度低，重复性不佳，给临床进一步推广应用此方法带来困难，市场上多采用β-甘油磷酸钠来降低ALP对5’-IMP的水解(PNP-XTO-POD偶联单一试剂匀相速率法测定血清5’-NT；出处：中国卫生检验杂志2010年1月第20卷第1期；作者：潘利琴)，一方面效果不好，另一方面成本明显增加，限制了临床应用的推广；另外，市场上常用18-冠醚-6来避免游离磷酸根与镁离子发生沉淀导致的稳定性差，但此物料纯度低时稳定效果差，且会增加试剂的空白吸光度变化率，而纯度高效果好的价格昂贵，极大地增加了成本，限制了临床的广泛应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的5’-核苷酸酶检测试剂盒精密度和稳定性低的问题，而提供一种5’-核苷酸酶检测试剂盒及其制备方法。
本发明首先提供一种5’-核苷酸酶检测试剂盒，所述的试剂盒由试剂R1和试剂R2组成：
试剂R1:
试剂R2：
优选的是，所述的缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ相同，选自PIPES-KOH、KH2PO4-KOH或HEPES-KOH中的一种。
优选的是，所述的缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ的pH为7.0～7.7。
本发明还提供一种5’-核苷酸酶检测试剂盒的制备方法，包括：
步骤一：试剂R1的制备：
1、在反应容器中先加入缓冲液Ⅰ，搅拌溶解，然后依次加入磷酸二氢钾、EDTA·2K、4-氨基安替比林、Proclin300和AES搅拌，调节溶液pH值调至7.0-7.7，得到混合溶液；
2、在步骤1得到的混合溶液中依次加入A90、MgCl2·6H2O、TritonX-305、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶和过氧化物酶，搅拌均匀，得到试剂R1；
步骤二：试剂R2的制备：
1、在反应容器中先加入缓冲液Ⅱ，搅拌溶解，然后加入甘氨酸和EDTA·2K搅拌，调节溶液pH值至7.0-7.7，得到混合溶液；
2、在步骤1得到的混合溶液中依次加入TOOS、Proclin300和5’-IMP搅拌均匀，得到试剂R2。
优选的是，所述的试剂R1和R2的制备中，用KOH调节溶液pH值。
优选的是，所述的KOH的浓度为4M。
本发明的有益效果
本发明首先提供一种5’-核苷酸酶检测试剂盒，所述的试剂盒由试剂R1和试剂R2组成，与现有技术相对比，本发明所述试剂R1中含有AES和TritonX-305组成的复合稳定剂，在提高试剂稳定性的同时能够提高试剂的分散度，减小两次空白定标之间的吸光度差异，提高试剂盒精密度；R1中含有A90可有效防止磷酸镁沉淀的产生，替换了价格昂贵的18-冠醚-6，既提高了试剂的稳定性、降低了试剂空白吸光度变化率，又极大地降低了成本，增加了临床广泛应用的可能性；试剂R2中添加甘氨酸和EDTA·2K来提高试剂盒检测灵敏度和精密度，同时甘氨酸的加入可以降低试剂空白吸光度。
本发明还提供一种5’-核苷酸酶检测试剂盒的制备方法，该制备方法简单、操作简便、原料易得，制备得到的试剂盒具有较高的灵敏度、精密度和稳定性。
具体实施方式
本发明首先提供一种5’-核苷酸酶检测试剂盒，所述的试剂盒由试剂R1和试剂R2组成：
试剂R1:
试剂R2：
按照本发明，所述的缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ相同，保证了试剂反应的灵敏度，选自PIPES-KOH、KH2PO4-KOH或HEPES-KOH中的一种，所述的缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ的pH优选为7.0～7.7。所述的缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ主要作用是保证配制酶法试剂盒的过程中各组分的pH值保持在一定范围内，使各组分的酸碱度保持稳定，不会对其他物质的性能产生影响，同时又能为酶促反应的进行提供适宜的pH值及适宜的离子强度，从而保证试剂盒整体性能的稳定，使测试结果更准确。
按照本发明，所述试剂R1中含有AES和TritonX-305组成的复合稳定剂，在提高试剂稳定性的同时能够提高试剂的分散度，减小两次空白定标之间的吸光度差异，提高试剂盒精密度。
按照本发明，所述试剂R1中含有反应所必须的磷酸根离子和镁离子，但这两种离子能产生磷酸镁沉淀，使试剂盒在储存过程中出现沉淀而导致试剂盒失效，R1中添加A90可有效防止磷酸镁沉淀的产生，使试剂盒在储存过程中稳定，替换了价格昂贵的18-冠醚-6，既提高了试剂的稳定性、降低了试剂空白吸光度变化率，又极大地降低了成本，增加了临床广泛应用的可能性。
按照本发明，所述试剂R1中原料选用钾盐而非钠盐，一方面降低Na+对酶活性的抑制作用，另一方面，K+可与Mg+联合作用，对反应具有激活作用，缩短延迟时间，拓宽线性期，更利于临床应用。
按照本发明，所述试剂R2中添加甘氨酸和EDTA·2K来提高试剂盒检测灵敏度和精密度，同时甘氨酸的加入可以降低试剂空白吸光度。
本发明还提供一种5’-核苷酸酶检测试剂盒的制备方法，包括：
步骤一：试剂R1的制备：
1、在反应容器中先加入去离子水，然后加入缓冲液Ⅰ，搅拌溶解，再依次加入磷酸二氢钾、EDTA·2K、4-氨基安替比林、Proclin300和AES，搅拌完全溶解，优选在20℃下用碱溶液调节溶液pH值至7.0-7.7，所述的碱溶液优选为KOH，KOH的浓度优选为4M，得到混合溶液；
2、在步骤1得到的混合溶液中加入A90，待溶液中均无不溶性颗粒后，加入MgCl2·6H2O搅拌混匀，再用移液器吸取TritonX-305加入上述反应容器中，搅拌混匀，最后加入嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶和过氧化物酶，用去离子水定容，搅拌均匀，得到试剂R1；
步骤二：试剂R2的制备：
1、在反应容器中先加入去离子水，然后加入缓冲液Ⅱ，搅拌溶解，再加入甘氨酸和EDTA·2K，完全溶解，优选在20℃下用碱溶液调节溶液pH值调至7.0-7.7，所述的碱溶液优选为KOH，KOH的浓度优选为4M，得到混合溶液；
2、在步骤1得到的混合溶液中依次加入TOOS、Proclin300和5’-IMP，用去离子水定容，搅拌均匀，得到试剂R2。
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
试剂R1的制备：(1L)
1)用量筒量取1L的去离子水取0.9L加入烧杯中，剩余水留用；
2)称取40mmol的PIPES、80mmol的KOH加入上述烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解；
3)依次称取15mmol的磷酸二氢钾、1mmol的EDTA·2K、1mmol的4-氨基安替比林、0.02ml的Proclin300和0.5g的AES加入上述大烧杯中，搅拌至完全溶解；
4)在20℃条件下用4M的KOH将上述溶液pH值调至7.6；
5)量取0.1ml的A90加入上述烧杯中搅拌混匀；
6)待上述烧杯中的溶液均无不溶性颗粒后，称取3mmol的MgCl2·6H2O加入上述烧杯中，轻轻搅拌混匀；
7)用移液器吸取0.1ml的TritonX-305加入上述烧杯中，轻轻搅拌混匀；
8)最后加入0.2KU的嘌呤核苷磷酸化酶、0.6KU的黄嘌呤氧化酶和4KU的过氧化物酶，然后用剩余的去离子水将该溶液定容至1L，轻轻搅拌混匀；
试剂R2的制备：(1L)
1)用量筒量取1L的去离子水取0.9L加入烧杯中，剩余水留用；
2)称取40mmol的PIPES、80mmol的KOH加入上述烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解；
3)称取10mmol的甘氨酸和1mmol的EDTA·2K加入上述烧杯中搅拌至完全溶解；
4)在20℃条件下用4M的KOH将上述溶液pH值调至7.6；
5)称取1mmol的TOOS、0.01ml的Proclin300和5mmol的5’-IMP依次加入上述烧杯中搅拌至完全溶解；
6)用剩余的去离子水定容至1L，轻轻搅拌混匀。
实施例2
制备：
试剂R1的制备：(1L)
1)用量筒量取1L的去离子水取0.9L加入烧杯中，剩余水留用；
2)称取40mmol的KH2PO4、70mmol的KOH加入上述烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解；
3)依次称取2mmol的EDTA·2K、2mmol的4-氨基安替比林、0.02ml的Proclin300和1.0g的AES加入上述大烧杯中，搅拌至完全溶解；
4)在20℃条件下用4M的KOH将上述溶液pH值调至7.6；
5)量取0.2ml的A90加入上述烧杯中搅拌混匀；
6)待上述烧杯中的溶液均无不溶性颗粒后，称取6mmol的MgCl2·6H2O加入上述烧杯中，轻轻搅拌混匀；
7)用移液器吸取0.2ml的TritonX-305加入上述烧杯中，轻轻搅拌混匀；
8)最后加入0.2KU的嘌呤核苷磷酸化酶、0.6KU的黄嘌呤氧化酶和4KU的过氧化物酶，然后用剩余的去离子水将该溶液定容至1L，轻轻搅拌混匀；
试剂R2的制备：(1L)
1)用量筒量取1L的去离子水取0.9L加入烧杯中，剩余水留用；
2)称取40mmol的KH2PO4、70mmol的KOH加入上述烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解；
3)称取10mmol的甘氨酸和2mmol的EDTA·2K加入上述烧杯中搅拌至完全溶解；
4)在20℃条件下用4M的KOH将上述溶液pH值调至7.6；
5)称取1mmol的TOOS、0.01ml的Proclin300和5mmol的5’-IMP依次加入上述烧杯中搅拌至完全溶解；
6)用剩余的去离子水定容至1L，轻轻搅拌混匀。
实施例3
制备：
试剂R1的制备：(1L)
1)用量筒量取1L的去离子水取0.9L加入烧杯中，剩余水留用；
2)称取40mmol的HEPES、60mmol的KOH加入上述烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解；
3)依次称取30mmol的磷酸二氢钾、2mmol的EDTA·2K、2mmol的4-氨基安替比林、0.02ml的Proclin300和1.0g的AES加入上述大烧杯中，搅拌至完全溶解；
4)在20℃条件下用4M的KOH将上述溶液pH值调至7.6；
5)量取0.2ml的A90加入上述烧杯中搅拌混匀；
6)待上述烧杯中的溶液均无不溶性颗粒后，称取6mmol的MgCl2·6H2O加入上述烧杯中，轻轻搅拌混匀；
7)用移液器吸取0.2ml的TritonX-305加入上述烧杯中，轻轻搅拌混匀；
8)最后加入0.2KU的嘌呤核苷磷酸化酶、0.6KU的黄嘌呤氧化酶和4KU的过氧化物酶，然后用剩余的去离子水将该溶液定容至1L，轻轻搅拌混匀；
试剂R2的制备：(1L)
1)用量筒量取1L的去离子水取0.9L加入烧杯中，剩余水留用；
2)称取40mmol的HEPES、60mmol的KOH加入上述烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解；
3)称取10mmol的甘氨酸和2mmol的EDTA·2K加入上述烧杯中搅拌至完全溶解；
4)在20℃条件下用4M的KOH将上述溶液pH值调至7.6；
5)称取1mmol的TOOS、0.01ml的Proclin300和5mmol的5’-IMP依次加入上述烧杯中搅拌至完全溶解；
6)用剩余的去离子水定容至1L，轻轻搅拌混匀。
实施例4
制备：
试剂R1的制备：(1L)
1)用量筒量取1L的去离子水取0.9L加入烧杯中，剩余水留用；
2)称取100mmol的PIPES、200mmol的KOH加入上述烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解；
3)依次称取40mmol的磷酸二氢钾、6mmol的EDTA·2K、4mmol的4-氨基安替比林、0.3ml的Proclin300和10g的AES加入上述大烧杯中，搅拌至完全溶解；
4)在20℃条件下用4M的KOH将上述溶液pH值调至7.6；
5)量取10ml的A90加入上述烧杯中搅拌混匀；
6)待上述烧杯中的溶液均无不溶性颗粒后，称取40mmol的MgCl2·6H2O加入上述烧杯中，轻轻搅拌混匀；
7)用移液器吸取5ml的TritonX-305加入上述烧杯中，轻轻搅拌混匀；
8)最后加入1KU的嘌呤核苷磷酸化酶、3KU的黄嘌呤氧化酶和10KU的过氧化物酶，然后用剩余的去离子水将该溶液定容至1L，轻轻搅拌混匀；
试剂R2的制备：(1L)
1)用量筒量取1L的去离子水取0.9L加入烧杯中，剩余水留用；
2)称取100mmol的PIPES、200mmol的KOH加入上述烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解；
3)称取100mmol的甘氨酸和6mmol的EDTA·2K加入上述烧杯中搅拌至完全溶解；
4)在20℃条件下用4M的NaOH将上述溶液pH值调至7.6；
5)称取20mmol的TOOS、0.3ml的Proclin300和100mmol的5’-IMP依次加入上述烧杯中搅拌至完全溶解；
6)用剩余的去离子水定容至1L，轻轻搅拌混匀。
实施例5
制备：
试剂R1的制备：(1L)
1)用量筒量取1L的去离子水取0.9L加入烧杯中，剩余水留用；
2)称取60mmol的PIPES、120mmol的KOH加入上述烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解；
3)依次称取20mmol的磷酸二氢钾、3mmol的EDTA·2K、2mmol的4-氨基安替比林、0.03ml的Proclin300和1g的AES加入上述大烧杯中，搅拌至完全溶解；
4)在20℃条件下用4M的KOH将上述溶液pH值调至7.6；
5)量取0.5ml的A90加入上述烧杯中搅拌混匀；
6)待上述烧杯中的溶液均无不溶性颗粒后，称取14mmol的MgCl2·6H2O加入上述烧杯中，轻轻搅拌混匀；
7)用移液器吸取0.5ml的TritonX-305加入上述烧杯中，轻轻搅拌混匀；
8)最后加入0.2KU的嘌呤核苷磷酸化酶、0.6KU的黄嘌呤氧化酶和6KU的过氧化物酶，然后用剩余的去离子水将该溶液定容至1L，轻轻搅拌混匀；
试剂R2的制备：(1L)
1)用量筒量取1L的去离子水取0.9L加入烧杯中，剩余水留用；
2)称取60mmol的PIPES、120mmol的KOH加入上述烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解；
3)称取70mmol的甘氨酸和3mmol的EDTA·2K加入上述烧杯中搅拌至完全溶解；
4)在20℃条件下用4M的KOH将上述溶液pH值调至7.6；
5)称取10mmol的TOOS、0.1ml的Proclin300和30mmol的5’-IMP依次加入上述烧杯中搅拌至完全溶解；
6)用剩余的去离子水定容至1L，轻轻搅拌混匀。
实施例6
制备：
试剂R1的制备：(1L)
1)用量筒量取1L的去离子水取0.9L加入烧杯中，剩余水留用；
2)称取80mmol的PIPES、160mmol的KOH加入上述烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解；
3)依次称取30mmol的磷酸二氢钾、4mmol的EDTA·2K、3mmol的4-氨基安替比林、0.2ml的Proclin300和7g的AES加入上述大烧杯中，搅拌至完全溶解；
4)在20℃条件下用4M的KOH将上述溶液pH值调至7.6；
5)量取8ml的A90加入上述烧杯中搅拌混匀；
6)待上述烧杯中的溶液均无不溶性颗粒后，称取30mmol的MgCl2·6H2O加入上述烧杯中，轻轻搅拌混匀；
7)用移液器吸取3ml的TritonX-305加入上述烧杯中，轻轻搅拌混匀；
8)最后加入0.5KU的嘌呤核苷磷酸化酶、1.5KU的黄嘌呤氧化酶和8KU的过氧化物酶，然后用剩余的去离子水将该溶液定容至1L，轻轻搅拌混匀；
试剂R2的制备：(1L)
1)用量筒量取1L的去离子水取0.9L加入烧杯中，剩余水留用；
2)称取80mmol的PIPES、160mmol的KOH加入上述烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解；
3)称取80mmol的甘氨酸和4mmol的EDTA·2K加入上述烧杯中搅拌至完全溶解；
4)在20℃条件下用4M的KOH将上述溶液pH值调至7.6；
5)称取15mmol的TOOS、0.2ml的Proclin300和80mmol的5’-IMP依次加入上述烧杯中搅拌至完全溶解；
6)用剩余的去离子水定容至1L，轻轻搅拌混匀。
本发明实施例1的试剂盒效果检测试验：
(1)甘氨酸和EDTA·2K对试剂盒精密度及甘氨酸对试剂盒空白吸光度的影响：
将试剂R2没有加入甘氨酸和EDTA·2K试剂盒作为对比试剂盒，与实施例1得到的试剂盒进行对比测血清，同时以市售北京九强生物技术股份有限公司的试剂盒作为对照试剂。
测定方法：
步骤一：输入分析参数于日立7100全自动生化分析仪：温度37℃，主波长546nm，副波长700nm，试剂R1180μl，试剂R290μl，样本量5μl，测光点：27-34；
步骤二：将本发明的试剂盒和对比试剂盒放入试剂仓中；
步骤三：输入理论因数3400，进行空白定标，结果如表1所示：
表1
空白定标数据如表2所示：
表2
表1和表2的结果表明，加入甘氨酸后试剂的重复性显著提高，CV由9.25％降至2％以内，比市售北京九强生物技术股份有限公司的对照试剂CV明显要好；加入甘氨酸和EDTA·2K的试剂盒空白吸光度明显降低，性能提高，综上说明加入甘氨酸和EDTA·2K后能明显提高试剂盒检测的精密度并降低试剂盒空白吸光度。
(2)AES和TritonX-305作为复合稳定剂对试剂盒中酶活性的保护及试剂分散度的影响
将试剂R1中没有加入AES和TritonX-305的试剂盒作为对比试剂盒，与实施例1得到的试剂盒进行对比，数据如表3和表4所示：
表3
空白定标数据如表4所示：
表4
表3和表4的数据结果说明：加入AES和TritonX-305的试剂在储存过程中酶活性损失较小，而不加稳定剂的试剂酶活性很快损失；另外，该两种物质的加入使两次空白定标无明显差异，而不加这两种物质的试剂两次空白定标差异较大，对照试剂差异也非常明显，说明这两种物质的加入能明显提高试剂的分散度，减小两次空白定标之间的差异，对试剂的重复性有提高作用。
(3)本发明试剂与市售北京九强生物技术股份有限公司的试剂盒同时测血清进行对比：
测定方法：
步骤一：输入分析参数于日立7100全自动生化分析仪：温度37℃，主波长546nm，副波长700nm，试剂R1180μl，试剂R290μl，样本量5μl，测光点：27-34；
步骤二：将相应试剂放入试剂仓中；
步骤三：输入理论因数3400，进行空白定标。
结果如表5所示：
表5
表5的结果表明，本发明制备的试剂盒与对照试剂相关性较好，测值一致。

Claims (6)

1.一种5’-核苷酸酶检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒由试剂R1和试剂R2组成：
试剂R1:
试剂R2：
2.根据权利要求1所述的一种5’-核苷酸酶检测试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ相同，选自PIPES-KOH、KH2PO4-KOH或HEPES-KOH中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种5’-核苷酸酶检测试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ的pH为7.0～7.7。
4.根据权利要求1所述的一种5’-核苷酸酶检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一：试剂R1的制备：
1、在反应容器中先加入缓冲液Ⅰ，搅拌溶解，然后依次加入磷酸二氢钾、EDTA·2K、4-氨基安替比林、Proclin300和AES搅拌，调节溶液pH值至7.0-7.7，得到混合溶液；
2、在步骤1得到的混合溶液中依次加入A90、MgCl2·6H2O、TritonX-305、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶和过氧化物酶，搅拌均匀，得到试剂R1；
步骤二：试剂R2的制备：
1、在反应容器中先加入缓冲液Ⅱ，搅拌溶解，然后加入甘氨酸和EDTA·2K搅拌，调节溶液pH值至7.0-7.7，得到混合溶液；
2、在步骤1得到的混合溶液中依次加入TOOS、Proclin300和5’-IMP搅拌均匀，得到试剂R2。
5.根据权利要求4所述的一种5’-核苷酸酶检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的试剂R1和R2的制备中，用KOH调节溶液pH值。
6.根据权利要求5所述的一种5’-核苷酸酶检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的KOH的浓度为4M。
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