DE2457470C2

DE2457470C2 - Verfahren zur Reinigung von synthetisch hergestellten Peptiden des Human-Calcitonin-Typs und nach diesem Verfahren gereinigte Calcitonine

Info

Publication number: DE2457470C2
Application number: DE2457470A
Authority: DE
Inventors: Max Dr. Birsfelden Brugger; Bernhard Dr. Frenkendorf Riniker; Werner Dr. Basel Rittel
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1973-12-14
Filing date: 1974-12-05
Publication date: 1983-12-08
Also published as: NL7416294A; ATA990674A; IL46238A; AT352916B; PH13237A; MY8100317A; PL94022B1; CA1046053A; JPS5089391A; JPS5928545B2; IL46238A0; BE823316A; AU7634974A; ES432845A1; SE417829B; IE40551L; US3948876A; FR2254555B1; CH594608A5; NZ176195A

Description

Bei der synthetischen Herstellung langkettiger Peptide aus Peptidfragmenten werden im allgemeinen mehr oder minder erhebliche Mengen an Nebenprodukten gebildet, die sich schwer abtrennen lassen. So können in der Aminosäurekette einzelne Aminosäurereste in Form von Diastereomeren vorliegen, beispielsweise bei der von Sieber et al. (HeIv. Chim. Acta 53, 2135—2150 [1970]) beschriebenen Synthese des Human Calcitonins die Aminosäurereste Leu⁴, Leu⁹, Thr⁶, Phe^lb und His²⁰. Weiter kann bei schwefelhaltigen Peptiden eine Alkylierung oder eine N ->· O-Acylwanderung eintreten, wie ebenfalls in der angegebenen Publikation beschrieben. Um solche Nebenprodukte abzutrennen, werden entweder auf der Stufe größerer geschlitzter Fragmente und/oder auf der Stufe des geschützten Gesamtpeptids und/oder im Endprodukt selbst aufwendige Reinigungsoperationen wie Gegenstromverteilung, Elektrophorese oder Chromatographie vorgenommen. Diese erschweren die Herstellung solcher langkettiger Peptide in technischem Maßstab, denn es werden große Mengen an Adsorbentien und/oder Lösungsmitteln benötigt, die schwer bzw. nur mit erheblichen Kosten zu regenerieren sind.

Es wurde nun ein sehr einfaches Reinigungsverfahren für Peptide des Human-Calcitonin-Typs mit einem isoelektrischen Punkt, der zwischen den pH-Werten von ca. 6,5 bis 8,5 liegt (d. h. pi = ca. 6,5—8,5) gefunden. Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Reinigung von synthetisch hergestellten Peptiden des Human-Calcitonin-Typs und nach diesem Verfahren gereinigte Calcitonine entsprechend den vorstehenden Patentan-Sprüchen. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man das jeweilige Calcitonin aus einer Lösung eines Salzes mit Säuren oder Basen in Wasser oder gegebenenfalls in Wasser und einem organischen Peptidlösungsmittel durch Einstellen des pH auf den isoelektrischen Bereich als inneres Salz ausfällt Der Ausdruck isoelektrischer »Bereich« wird verwendet, da bei den vorliegenden Verbindungen der isoelektrische Punkt nicht scharf definiert ist, sondern sich über einen größeren pH-Bereich erstreckt, vgl. Kortüm, Lehrbuch der Elektrochemie, Verlag Chemie, Weinheim, 1966, S. 336. Unter isoelektrischem Bereich verstehen wir den pH-Bereich von pl±ca. 1 pH-Einheit

Überraschenderweise wird bei dieser Ausfällung das Peptid in großer Reinheit erhalten, da die oben erwähnten Nebenprodukte nicht mit ausgefällt bzw. im Fall der O-Acylderivate in die N-Acylderivate zurückverwandelt werden. Der Reinheitsgrad der Produkte übertrifft denjenigen der durch zweimalige Gegenstromverteilung, nämlich in der geschützten Vorstufe und im Endprodukt (vgl. z. B. HeIv. Chim. Acta 53, 2135 [1970]) gereinigten Peptide. Man kann Calcitonine von hoher Reinheit auch dann erhalten, wenn die geschützte Vorstufe (geschütztes Dotriacontapeptidamid) nicht durch Gegenstromverteilung etc., sondern nur durch Umfallen gereinigt worden ist Die Verluste durch die Reinigungsoperation sind geringer als bei den üblichen Verfahren. Das erhaltene Produkt weist volle biologische Aktivität auf.

Die Methode war nicht voraussehbar, denn andere langkettige Peptide, wie z. B. ACTH, Insulin, Glucagon können nicht in dieser Weise gereinigt werden.

Als Peptide des Human-Calcitonin-Typs mit einem isoelektrischen Punkt von pl = ca. 6,5—8,5 sind in erster Linie zu nennen: Human-Calcitonin (Calcitonin M) und dessen Derivate und Analoge, z. B. diejenigen, die in den BE-PS 7 37 890, 7 40 256, 7 57 786 und in der CH-PS 58 26 653 beschrieben sind. Analoge sind vor allem diejenigen, die statt Methionin⁸ eine Λ-Niederalkyl-otaminoessigsäure, besonders eine solche, worin Niederalkyl 2—4 Kohlenstoffatome aufweist, insbesondere Valin, ferner Norvalin, Leucin, Isoleucin, Norleucin oder Λ-Aminobuttersäure enthalten. Weitere bevorzugte Austauschaminosäuren, die auch neben den genannten Austauschaminosäuren in 8-Stellung vorhanden sein können, sind L-Lysin", L-Leucin¹², L-Leucin¹⁶, L-Leucin¹⁹, L-Tyrosin²², L-Asparagin²⁶ und L-Threonin²⁷. Derivate sind vor allem entsprechende Desamino'-Peptide sowie N^a-Acylderivate.

Human-Calcitonin weist einen isoelektrischen Bereich von 7—8 auf. Die Veränderung des isoelektrischen Bereiches bei Ersatz einzelner Aminosäuren durch andere kann experimentell, z. B. elektrophoretisch, bestimmt werden oder berechnet werden. Der isoelektrische Punkt der Peptide kann beispielsweise nach J. Greenstein and M. Winitz »Chemistry of the Amino Acids«, Vol. 1, Ed. John Wiley & Sons, Inc., New York, London, 1961, S. 482 ff. berechnet werden.

Als Salze der Peptide, die bei dem neuen Verfahren als Ausgangsmaterial eingesetzt werden, kommen alle Salze in Betracht, die in Wasser oder gegebenenfalls einer Lösung von Wasser und einem organischen Peptidlösungsmittel, z. B. niederen Alkanolen, besonders Methanol, Äthanol, Isopropanol, tert-Butanol, oder Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, löslich sind. Solche Salze sind z. B. Salze von Mineralsäuren, besonders Halogenwasserstoffsäuren, oder von organischen Säuren, vor allem Essigsäure und halogenierten Essigsäuren wie Trifluoressigsäure, Dichloressigsäure, ferner Sulfonsäuren wie Niederalkansulfosäuren, z. B. Methansulfonsäure, oder Benzol- oder Toluolsulfonsäu-

Das Peptid kann auch als Salz mit Basen, z. B. mit Ammoniak oder mit primären, sekundären, tertiären Aminen oder quaternären Ammoniumbasen, z. B. entsprechenden Aminen, die als organische Reste einen oder mehr Niederalkyl-, Cycloalkyl (mit vorzugsweise 5—6 Ringatomen), oder Aralkyl-, besonders Phenylniederalkylreste enthalten, z.B. Triäthylamin, Cyclohexylamin, Dicyclohexylamin, Benzylamin, Trimethylbenzylammoniumhydroxyd, ferner mit durch die genannten organischen Reste substituiertem Guanidin, z. B. Tetramethylguanidin, eingesetzt werden. In erster Linie verwendet man das Peptid in Form desjenigen Salzes, in dem es bei der Synthese erhalten wird, z. B. in Form des Hydrochlorids, des Hydrobromids, des Hydrofkiorids, des Trifluoracetats oder Acetats.

Das Salz wird in Wasser oder in einer Lösung von Wasser und einem organischen Peptialösungsmittel in Lösung gebracht Man mißt das pH und gibt, je nachdem, ob ein Salz mit einer Säure oder einer Base vorliegt, so lange vorsichtig Base oder Säure hinzu, bis der isoelektrische Bereich erreicht ist. Als Basen verwendet man beispielsweise Ammoniak, wässeriges Alkali, besonders Natronlauge oder Kalilauge, Alkalicarbonate oder -hydrogencarbonate, z. B. Natriumcarbonat oder -bicarbonat, organische Basen wie die oben genannten Amine oder bevorzugt basische Ionenaustauscher. Es eignen sich schwach basische, solcher mittlerer Basiszeit und stark basische Ionenaustauscher. Mit Vorteil verwendet man im Handel erhältliche Produkte, z. B. solche auf Cellulose-Basis wie DEAE-Cellulose oder DEAE-Sephadex®. Besonders geeignet sind Ionenaustauscher auf Polystyrol-Basis, z. B. der schwach basische Merck-Ionenaustauscher No. II oder der stark basische Merck-Ionenaustauscher No. III oder die verschiedenen Handelsformen der basischen Dowex®-Ionenaustauscher oder der basischen Amberlite®. Falls der isoelektrische Bereich mittels Säuren eingestellt werden muß, verwendet man beispielsweise Mineralsäuren, vor allem Halogenwasserstoftsäuren, besonders Salzsäure, oder organische Säuren, z. B. Essigsäure oder Citronensäure, oder saure Ionenaustauscher entsprechend den oben genannten basischen Ionenaustauschern, z. B. solche auf Polystyrol-Basis wie Amberlite® IR-120 oder Dowex® 50.

Wenn der isoelektrische Bereich erreicht ist, beginnt langsam die Ausfällung des Peptids. Man läßt die Ausfällung während mehrerer Stunden, z. B. während zwei Stunden, sich vervollständigen. Während dieser Zeit steigt der pH-Wert um etwa eine Einheit an. So beträgt beispielsweise das pH von Calcitonin M-Acetat ca. 4. Bei Zugabe von schwach basischem Ionenaustauscher erhöht es sich langsam auf 6,0 bis 6,2. Hier beginnt die Ausfällung. Im Verlauf von weiteren 2 Stunden steigt das pH auf ca. 7,5, bleibt dann aber konstant.

Nach der vollständigen Ausfällung des Peptids trennt man es ab, z. B. durch Abnutschen oder Zentrifugieren, und wäscht gründlich mit Wasser nach. Da das ausgefällte Peptid in Wasser sehr schwer löslich ist, treten dabei praktisch keine Verluste auf. Hat man durch Zugabe von Ionenaustauschern gefällt, so muß das freie Peptid vom Ionenaustauscher abgetrennt werden. Dies kann beispielsweise geschehen, indem man das Peptid mittels Säure in ein gewünschtes Salz überführt, z. B. in das Acetat oder Hydrochlorid, und die Lösung beispielsweise durch Abfiltrieren oder Abnutschen vom Ionenaustauscher abtrennt und lyophilisiert. Hat man ohne Ionenaustauscher gearbeitet, so kann

man, wenn erwünscht, das ausgefällte Produkt durch Lösen in Säure und Lyophilisieren in die gewünschte Salzform überführen.

Die verfahrensgemäß erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.

Die Erfindung wird in den Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet:

System 43C:

tert. Amylalkohol-Isopropanol- Wasser

(51 :21 :28)
System 45:

see. Butanol-3°/oiges wässeriges Ammoniak

(70:30)
System 52:

n-Butanol-Eisessig-Wasser

(75:7,5:21)
System 52 A:

n-Butanol-Eisessig-Wasser

(67:10:23)
System 70:

Äthylacetat-Pyridin-Wasser

(40:20:40), Oberphase
System 79:

n-Butanol-Pyridin- Wasser

(34 :33 :33)
System 96:

sek.-Butanol-Eisessig-Wasser

(67 :10:23)
System 100:

Äthylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser

(62:21 :6:11)
System 101A:

n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser

(42 : 24 :4 :30)
System 102A:

Äthylacetat-Methyläthylketon-Ameisensäure-

Wasser(50:30:l0:10)
System 107:

Äthylacetat-Pyridin-Wasser

(49 : 24 : 27)
System 114:

see. Butanol-Methyläthylketon-25%iges

wässeriges NH₃-Wasser (37 :37 :13 :13) System 121:

Isopropanol-25%iges wässeriges NH3-Wasser

(70:10:20)
System 121A:

Isopropanol-25%iges wässeriges NH3- Wasser

(85:5:10)
DS: Auf Silicagel-Fertigplatten SL 254 der Fa. Antec, Birsfelden.

DC: Auf Cellulose-Fertigplatten der Fa. Merck, Darmstadt.
DA: Auf Alox-Platten (45 g Al₂O₃ der Fa. Camag, Muttenz, +3,5 g Gips, Dicke 0,3 mm).

In den Beispielen weröen folgende Abkürzungen verwendet:

Boc tert.-Butyloxycarbonyl,

Z Carbobenzoxy

OtBu tert.-Butylester

ONp p-Nitrophenylester

OMe Methylester

OSu Hydroxysuccinimidester tBu tert-Butyläther
DMF Dimethylformamid.

Beispiel 1 Reines Calcitonii; M-Acetat

50 mg rohes trifluoressigsaures Salz von Calcitonin M (BE-PS 7 37 890) werden in 5 ml Wasser gelöst Der pH-Wert der Lösung beträgt 2,5. Unter Rühren gibt man innert 15 Minuten in mehreren Anteilen total 0,6 ml Merck-Ionenaustauscher Nr. II, schwach basisch, freie Basenform, zu. Dabei erhöht sich der pH-Wert der Lösung auf 6,2. Man rührt weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur, wobei sich der pH-Wert auf 7,5 erhöht und eine flockige Fällung auftritt Nach 3 Stunden Rühren nutscht man Fällung und Ionenaustauscher ab und wäscht mit Wasser nach. Das Waschwasser enthält 12 mg Nebenprodukte von Calcitonin M.

Das ausgefallene Calcitonin M trennt man von Ionenaustauscher durch 4maliges Waschen mit je 4 ml 9O°/oiger Essigsäure und jeweiliges Abnutschen. Man lyophilisiert die vereinigten Essigsäureextrakte und erhält 36 ml Calcitonin M als essigsaures Salz. Das Produkt weist folgende analytische Daten auf:

Wassergehalt nach Karl Fischer 8,1 %

Essigsäuregehalt

(gaschromatographisch) 1,1%

Peptidgehalt 89,0%

Fluorgehalt (mikroanalytisch) 0,02%;

Aminosäureanalyse (6-N. HCl, 24h, 110°):

alle Aminosäuren im richtigen molaren Verhältnis, außer Ser, Thr, Cys, die bei der Hydrolyse teilweise

zerstört werden);
UV-Spektrum (in 10%iger Essigsäure):

A_ra„=275nm,6=1540.

Beispiel 2

Reines Calcitonin M-Trihydrochlorid 1. Calcitonin M-trifluoracetat, roh

I I

58,0 g Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met - Leu - GIy - Thr(tBu) - Tyr(tBu) - Thr(tBu) - GIn Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(Boc)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ (14,3 mMol) werden unter Stickstoff in 700 ml Trifluoressigsäure 85%ig gelöst, diese Lösung wird 2 Stunden bei 30° belassen. Anschließend rührt man sie in 6 Liter peroxidfreien Äther bei guter Eiskühlung ein. Man filtriert den Niederschlag ab, wäscht ihn mit Äther und trocknet am Hochvakuum. Man erhält das rohe Trifluoracetat von Calcitonin M als farbloses Pulver.

2. Calcitonin M-innereb Salz

43,5 g des unter 1. erhaltenen rohen Trifluoracetats von Calcitonin M werden in 1 Liter 1-proz. Essigsäure gelöst, durch eine G-4 Glasfilternutsche filtriert. Dann wird mit Ammoniak wie folgt gefällt: Die Lösung wird unter Stickstoff bei Zimmertemperatur gerührt, wobei man den pH-Wert mit einer Glaselektrode kontinuierlich mißt. Man gibt langsam ca. 1N (D 0,97) Ammoniaklösung zu, so daß nach 1,25 Stunden ein pH von 5 erreicht ist. Innerhalb ca. einer weiteren Stunde erhöht man das pH auf 6 durch gleichmaßige Zugabe weiterer ca. 1N Ammoniaklösung. Dabei beginnt das innere Salz von Calcitonin M als unlösliches Pulver auszufallen. Man fährt mit der langsamen Zugabe von Ammoniaklösung fort bis innerhalb ca. einer weiteren Stunde der pH-Wert von 7,6 erreicht ist Anschließend wird noch 3 Stunden gerührt, wobei sich das pH kaum mehr verändert Man filtriert, wäscht mit verdünntem Ammoniak vom pH 7,6 und trocknet am Hochvakuum.

ίο Man erhält 18,9 g eines wasserunlöslichen Pulvers. Die gaschromatographische Essigsäurebestimmmig einer so erhaltenen Probe ergibt einen Wert von 0,3 Gewichtsprozent Essigsäure (entspricht ca. 0,17 Mol-%).

3. Calcitonin M-Trihydrochlorid

27,3 g (8,0 mMoi) Calcitonin M-inneres Salz werden in 700 ml t-Butanol aufgeschlämmt. Man gibt 250 ml Wasser und 360 ml 0,1 N Salzsäure (36 mMol) zu, rührt einige Minuten und filtriert die trübe Lösung durch eine G-4 Glasfilternutsche. Den Filtrationsrückstand löst man mit weiteren 250 ml Wasser und filtriert ihn zum ersten Filter. Dieses wird eingefroren und lyophilisiert. Nach Äquilibrieren mit Luftfeuchtigkeit erhält man 27,0 g Calcitonin M-trihydrochlorid. Das Produkt zeigt

folgende analytische Daten:

Dünr.schichtchromatogramm auf Cellulose (Merck):

Rf = 0,61 im System 101A 0,52 im System 45 0,51 im System 114 auf Aluminiumoxid mit 8% Gips:

0,72 im System 79

In der Dünnschichtelektrophorese erscheint ein Fleck mit einer Wanderungsstrecke von 4,8 cm in Richtung Kathode auf Celluloseplatten (Merck) und bei pH 1,9; 9 V/cm und 3,5 Std. Laufzeit.

Essigsäuregehalt
(gaschromatographisch)
Wassergehalt
nach Karl-Fischer
Chlorgehalt

UV (in 10% Essigsäure)

<0,05%;

8,5%;

2,80%

(ber. auf wasserfreies Trihydrochlorid:3,02%); ^msx= 275 nm, ε=1440.

so Das in den Beispielen 3, 4 und 5 verwendete Ausgangsmaterial kann wie in der DE-OS 24 13 106 (entspricht BE-PS 8 12 881) beschrieben hergestellt werden.

Beispiel 3

Reines Asn²⁶-Thr²⁷-Ca!citonin M-Trihydrochlorid 1. Asn²⁶-Thr²⁷-Calcitonin M-Trifluoracetat, roh

5,8 g (1,41 mMol) Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-

Thr(tBu)-Cys-Met - Leu - GIy - Thr(tBu) - Tyr(tBu) Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(Boc)-Phe-His_fc5 Thr(tBu) - Phe - Pro - GIn - Thr(tBu) - Asn -Thr(tBu) -GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂ werden unter Stickstoff in 70 ml 85-proz. Trifluoressigsäure von 0° gelöst und dann zwei Stunden bei 29-31° gerührt. Man gießt die Lösung in

600 ml eisgekühlten und peroxid-freien Äther unter starkem Rühren, filtriert die entstandene Fällung ab und trocknet sie am Hochvakuum.

2. Asn²⁶-Thr²⁷-Calcitonin M-inneres Salz

Das unter 1. erhaltene getrocknete Präcipitat wird in 130 ml Wasser gelöst, durch eine G4Glasfritte filtriert und mit verd. Ammoniak wie folgt gefällt: Die Lösung wird unter Stickstoff bei Zimmertemperatur gerührt, wobei man langsam ca. Ί-N. Ammoniaklösung zutropfen läßt (D 0,97). Das pH wird mit einer Glaselektrode kontinuierlich gemessen. Man reguliert den Zufluß in der Weise, daß innerhalb etwa 1,5 Stunden ein pH von 5 erreicht wird. In einer weiteren Stunde wird durch fortgesetzte Zugabe von Ammoniak ein pH von 6 erhalten. Während dieser Zeit beginnt das innere Salz auszufallen. Man fährt mit dem Zutropfen der verd. Ammoniaklösung fort in der Weise, daß innerhalb einer weiteren Stunde ein pH 7,6 entsteht. Anschließend wird noch drei Stunden weitergerührt, filtriert und mit Wasser von pH 7,5 (eingestellt durch Ammoniak) gut gewaschen. Der Rückstand wird am Hochvakuum getrocknet.

3. Asn²⁶-Thr²⁷-Calcitonin M-Trihydrochlorid

Das unter 2. erhaltene, wasserunlösliche innere Salz wird in 80 ml Wasser/t-Butanol 1 :1 aufgeschlämmt. Man gibt 39,0 ml 0,1-N Salzsäure zu, rührt einige Minuten unter Stickstoff und filtriert. Man wäscht mehrmals mit insgesamt 120 ml Wasser/t-Butanol 1 :1 nach und lyophilisiert. Es wird ein farbloses Lyophilisat erhalten, welches man mit Luftfeuchtigkeit äquilibriert. Ausbeute: 3,13 g.
Das Produkt zeigt folgende analytische Werte:

Dünnschichtchromatogramm auf Cellulose (Merck):

Rf = 0,41 im System 114

0.36 im System 45

0,55 im System 101A
auf Aluminiumoxid mit 8% Gips:

0,49 im System 52

Die Wanderungsstrecke in der Dünnschichtelektrophorese auf Celluloseplatten (Merck) bei pH 1,9 (Ameisensäure/Essigsäurepuffer), 9 V/cm und 3,5 Stunden Laufzeit beträgt 4,8 cm.

Beispiel 4
Reines Thr²⁷-Calcitonin M-Acetat

80 mg rohes Thr²⁷-Calcitonin M, essigsaures Salz, werden in 5 mi Wasser gelöst und unter Rühren portionsweise mit insgesamt 1,2 ml Merck-Ionenaustauscher Nr. II, schwach basisch, freie Aminform versetzt Dabei steigt der pH-Wert der Lösung vom ursprünglichen 4,6 auf 6,1. Man rührt weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur, wobei sich eine flockige Fällung bildet und der pH-Wert der Lösung auf 7,1 ansteigt Man rührt weitere 30 Minuten bei diesem pH-Wert nutscht Fällung und Ionenaustauscher zusammen ab und wäscht gut mit Wasser nach. Hierauf trennt man den Peptid vom Ionenaustauscher ab, indem man die noch feuchte Mischung mit 15 ml 90%iger Essigsäure unter Erwärmen auf 60° rührt und die Essigsäure-Lösung abnutseht Lyophilisation des Eluates gibt 74 mg Thr²⁷-Calcitonin M-Acetat von sehr hohem Reinheitsgrad. Rf-Wert bei Dünnschichtchromatographie auf Celluloseplatten im Svstem 52 =030, Rf = 0,49 auf Aluminiumoxidplatten im System 101A = 0,52.

Bei der Dünnschichtelektrophorese (pH = 1,9; 280 V, 2 Std.) wandert das Produkt 4,4 cm gegen die Kathode.

Essigsäuregehalt:
Wassergehalt:

Peptidgehalt:
UV-Spektrum:

4,22%

(gaschromatographisch);

7,78%

(Karl Fischer-Titration);

87,4% (titrimetrisch);

^max = 276 nm;

ε= 1560

(c = 2 in 5%iger Essigsäure, berechnet auf Peptidgehalt von 87,4%). Molares Aminosäureverhältnis nach Totalhydrolyse (6-N. HCI, 24 Std. 110°) (berechnete Werte in Klammern):

Ly s:	0,93(1);
His:	0,95(1);
NH₃:	3,40(4);
Asp:	3,00(3);
Thr:	5,23(6);
Ser:	1,17(1);
Gin:	2,02(2);
Pro:	2,06(2);
GIy:	3,87(4);
Ala:	2,03(2);
1/2(CyS)₂:	2,13(2);
VaI:	1 (Bezugswert);
Met:	1,07(1);
Leu:	1,82(2);
Tyr:	0,99(1);
Phe:	3,06 (3).
	Beispiel 5

Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Asn-

Thr-Gly-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂, Acetat
(Leu' ^Asn^-Thr⁵ '-Calcitonin M-Acetat).

Man löst 170 mg Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-

Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-AspiOtBuJ-Phe-Asn-LystBocJ-Phe-His-ThrCtBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBu)-Gly-Val-GIy-Ala-Pro - NH₂ in 5 ml 90%iger Trifluoressigsäure, läßt 90 Minuten bei 25° stehen, fallt das Peptid-Trifluoracetat mit peroxidfreiem Äther aus, nutscht es ab, wäscht es mit Äther nach, trocknet es und löst es in l%iger Essigsäure. Dann filtriert man über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher (schwach basisch, Acetatform), eluiert mit 1 %iger Essigsäure und lyophilisiert das Eluat (116 mg). Zur Reinigung löst man das erhaltene Acetat in 5 ml Wasser (pH der Lösung = 4,2) und gibt portionenweise unter Rühren insgesamt 2,8 ml Merck-Ionenaustauscher Nr. II (schwach basisch, Basenform) zu. Dabei erhöht sich das pH der Lösung langsam und bei Erreichen eines Wertes von ca. 6,7 beginnt die Ausfäl lung des freien Peptids. Man rührt insgesamt 2 Std. wobei ein pH-Wert von 7,1 erreicht wird. Dann nutscht man Fällung und Ionenaustauscher zusammen ab, wäscht mit Wasser nach und löst hierauf das Peptid aus dem Ionenaustauscher durch Verrühren mit auf 60° erwärmter SOVoiger Essigsäure. Man nutscht ab, wäscht mit 90%igeir Essigsäure nach und lyophilisiert. Man

erhält 98 mg Leu¹²-Asn²⁶-Thr²⁷-Calcitonin M als Acetat von hoher Reinheit.

DC: Rf(IOlA) = 0,33;
DA: Rf (52) =0,47.

Beispiel 6
Reines Calcitonin M (Acetat)

Man löst 110 mg rohes Calcitonin M-Acetat in 5 ml Wasser und gibt zu der Lösung portionenweise unter Rühren innert 1 Stunde 1,0 ml Merck-Ionenaustauscher Nr. III, stark basisch. Dabei erhöht sich der pH-Wert der

Lösung auf 6,6, und es beginnt die Ausfällung des Calcitonins. Nach weiterem Rühren bei Raumtemperatur erhöht sich der pH-Wert der Mischung weiter auf 7,3 und bleibt dabei stehen.

Jetzt nutscht man Ionenaustauscher und ausgefälltes Peptid zusammen ab, wäscht mit Wasser nach und löst dann das Peptid vom Ionenaustauscher durch Zugabe von warmer 9O°/oiger Essigsäure. Man nutscht wieder ab, wäscht mit 90%iger Essigsäure nach und lyophilisiert. Man erhält dabei Calcitonin M-Acetat von hoher Reinheit; seine analytischen Daten entsprechen denen des im Beispiel 1 erhaltenen Produkts.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung von synthetisch hergestellten Peptiden des Human-Calcitonin-Typs mit einem isoelektrischen Punkt, der zwischen den pH-Werten von ca. 6,5 bis 8,5 liegt, dadurch gekennzeichnet; daß man das jeweilige Calcitonin aus einer Lösung eines Salzes mit Säuren oder Basen in Wasser oder gegebenenfalls in Wasser und einem organischen Peptidlösungsmittel durch Einstellen des pH auf den isoelektrischen Bereich ausfällt *

Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das rohe Peptid in Form des Trifluoracetates als Ausgangsmaterial einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das rohe Peptid in Form des Acetates als Ausgangsmaterial einsetzt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—3, dadurch gekennzeichnet, daß man, ausgehend von Calcitonin-Salzen mit Säuren, das pH des isoelektrischen Bereichs mit wässerigem Ammoniak einstellt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—3, dadurch gekennzeichnet, daß man, ausgehend von Calcitonin-Salzen mit Säuren, das pH des isoelektrischen Bereichs mittels eines basischen Ionenaustauschers einstellt

6. Nach dem Verfahren der vorhergehenden Ansprüche gereinigte Calcitonine.