Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania syntetycznych peptydów typu kalcitonin.Przy syntetyzowaniu peptydów o dlugich lancu¬ chach z czasteczek mniejszych, tworza sie mniej lub bardziej znaczne ilosci produktów ubocznych, które trudno oddzielaja sie. I tak w lancuchu ami¬ nokwasu poszczególne reszty aminokwasowe moga wystepowac w postaci diastereoizomerów, na przy¬ klad w opisanej przez Siebera i wspólpracowni¬ ków (Helv.Chim.Acta 53, 2135—2150 (1970) synte¬ zie kalcitoniny ludzkiej, reszty aminokwasowe Leu4, Leu9, Thr6, Phe16 i His20.W przypadku peptydów zawierajacych siarke mo¬ ze nastapic alkilowanie wzglednie przemieszczenie sie grupy acylowej w kierunku N O, co równiez opisano w przytoczonej publikacji. Celem oddzielenia tego rodzaju produktów ubocznych przeprowadza sie kosztowne procesy oczyszczania jak rozdzial za pomoca ekstrakcji przeciwpradowej, metoda elektroforezy albo chromatografii, badz to na etapie wiekszych chronionych fragmentów czasteczek, badz na etapie chronionego peptydu calkowitego, badz tez produktu koncowego. Wspom¬ niane procesy utrudniaja wytwarzanie czasteczek peptydów o dlugich lancuchach na skale technicz¬ na, poniewaz potrzebne sa wówczas wielkie ilosci absorbentów i/albo rozpuszczalników, których rege¬ neracja jest trudna, wzglednie kosztowna.Obecnie opracowano bardzo prosty proces oczysz¬ czania dajacy sie zastosowac do peptydów typu kalcitonin o zakresie izoelektrycznym zawartym w zakresie pH od 5 do 10 obejmujacym kalcitonine ludzka (kalcitonina M) jej pochodne i analogi.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze naj¬ pierw okresla sie punkt izoelektryczny oczyszcza¬ nej kalcitoniny na drodze eksperymentalnej lub przez wyliczenie teoretyczne, nastepnie w produk¬ cie wyjsciowym w postaci wodnego roztworu soli kalcitoniny, nastawia sie pH, za pomoca kwasu lub zasady, wzglednie za pomoca wymieniaczy jono¬ wych, na zakres izoelektryczny, przy czym jako za¬ kres izoelektryczny rozumie sie zakres pH równy pJ ± okolo 1 jednostka pH, a wytracona kalcito¬ nine w zwykly sposób oddziela sie od przesaczu i przemywa.W opisanych kalcitoninach przy wytracaniu ma znaczenie „zakres izoelektryczny" tzn. zakres pH równy pJ ± okolo 1 jednostka pH. („Kortiim, Lehr- buch der Elektrochemie" Verlag Chemie, Weinheim, 1966", str. 336), w którym pJ równa sie pH punktu izoelektrycznego.Podczas wspomnianego wytracania otrzymuje sie peptyd o bardzo wysokiej czystosci, poniewaz wy- zej wspomniane produkty uboczne nie ulegaja wspólstracaniu, wzglednie jak to ma miejsce w przypadku pochodnych O-acylowych, ulegaja po¬ nownej przemianie do pochodnych N-acylowych.Stopien czystosci wspomnianych produktów prze- wyzsza stopien czystosci peptydów oczyszczanych 94 02294 022 3 4 za pomoca dwukrotnej ekstrakcji przeciwpradowej, a mianowicie jako chroniony pólprodukt i produkt koncowy (per. np. Helv.Chim. Acta 53, 2135 (1970)).Mozna otrzymac wysokiej czystosci kalcitonine tak¬ ze wtedy, gdy chroniony pólprodukt (chroniony amid (dotriakontapeptydu) oczyszcza sie nie za pomoca ekstrakcji przeciwpradowej, lecz jedynie przez powtórne wytracanie. Straty spowodowane tym procesem oczyszczania sa mniejsze niz w przypad¬ ku procesów zazwyczaj stosowanych. Otrzymany produkt wykazuje pelna czynnosc biologiczna.Jest wprawdzie znane, ze mozna wytracac zwiaz¬ ki amfoteryczne jak aminokwasy i peptydy w pos¬ taci stajej z -wodnych roztworów soli w ten spo¬ sób, ze nastawia sie pH na punkt wzglednie zakres izoelektryczny. Takie wytracanie zwiazków amfote- rycznych nie pjrowadzi najczesciej do dalszego ooz^szcz^nia, poniewaz najczesciej obecnie sa sto¬ sowane substancje towarzyszace, które równiez po¬ siadaja charakter amfoteryczny i z tego powodu lub z innych powodów jak np. w wyniku wlasci¬ wosci absorbcyjnych, wspólstracaja sie.Sposobu wedlug wynalazku nie dalo sie przewi¬ dziec, gdyz innych peptydów o czasteczkach dlugo- lancuchowych jak na przyklad ACTH, insuliny i glukagonu nie udalo sie oczyscic w opisany spo¬ sób. Jako peptydy typu kalcitoniny posiadajace za¬ kres izoelektryczny o pJ = ok. 5—10, nalezy wy¬ mienic przAde wszystkim kalcitonine ludzka (kalcito- nina M) oraz jej pochodne i analogi na przyklad opi¬ sane w belgijskich patentowych opisach nr 737890, nr 740256, nr 757786 i w zgloszeniu szwajcarskim nr 4454/73. Analogami sa przede wszystkim zwiazki zawierajace zamiast metioniny8 kwas a-aminoocto- wy, podstawiony w pozycji a nizsza grupa alkilo¬ wa, zwlaszcza taka, która posiada 2—4 atomów wegla, a w szczególnosci walina, norwalina, leu- cyna izoleucyna, norleucyna albo kwas a-aminoma- slowy.Korzystne jest, jesli oprócz wyzej wspomnianych w polozeniu 8 znajduja sie równiez nastepujace aminokwasy: L-lizyna11, L-leucyna12, L-leucyna16, L-leucyna19, L-tyrozyna22, L-asparagina26 i L-treo- nina. Pochodnymi sa przede wszystkim odpowied¬ nie dezamino-1-peptydy jak równiez pochodne Na- -acylowe.Grupami acylowymi do acylowania grupy Na- -aminowej sa reszty kwasów karboksylowych na przyklad karboksylowych kwasów alifatycznych, aromatycznych, aryloalifatycznych, heterocyklicz¬ nych i heterocykliczno-alifatycznych, zwlaszcza jedno- albo dwuwartosciowych nizszych kwasów alkano albo alkenokarboksylowych przede wszyst¬ kim nizszych kwasów alkanokarboksylowych o 1—4 atomach wegla jak na przyklad kwas mrówkowy, octowy, propionowy, maslowy, akrylowy, burszty¬ nowy, karboksylowych kwasów alicyklicznych jak na przyklad kwasy cykloalkilowe jak na przyklad niepodstawiony i podstawiony kwas benzoesowy albo ftalowy, kwasów karboksylowych niepodsta- wionych i podstawionych rodnikami arylowymi, nizszymi rodnikami aryloalkilowymi albo alkenylo- wymi jak na przyklad kwas fenylooctowy, niepod¬ stawionyeh albo podstawionych, jedno- albo dwu¬ wartosciowych piecio-szescioczlonowych kwasów heterocyklicznych zawierajacych jako heteroatomy azot, siarke i/albo tlen, jak na przyklad kwasy piridynokarboksylowe, tiofenokarboksylowe, albo nizszych kwasów alkanowych zawierajacych grupe heterocykliczna jak na przyklad kwas piridylo- octowy, imidazolilooctowy, w których podstawni¬ kami pierscieni sa na przyklad atomy chlorowców, grupy nitrowe, nizsze grupy alkilowe nizsze grupy alkoksylowe, albo nizsze grupy karboalkoksylowe.Resztami acylowymi moga byc równiez reszty acylowe aminokwasów, a zwlaszcza a-aminokwa- sów, jak na przyklad glicyl, L-leucyl, L-piroglute- mil, nastepnie reszty acylowe pochodzace z kwasu weglowego albo tioweglowego wzglednie od ich estrów albo amidów, na przyklad nizsze grupy alkiloksykarbonylowe jak na przyklad etoksykar- bonylowe trzeciorzedowe grupy butyloksykarbony- lowe, niepodstawiona i podstawiona grupa benzylo- ksykarbonylowa, grupa karbamylowa i tiokarbamy- lowa, na przyklad N-podstawiona grupa karbamy¬ lowa i tiokarbamylowa, na przyklad grupa karba¬ mylowa podstawiona przy azocie nizsza grupa alki¬ lowa albo fenyIowa, grupa tiokarbamylowa podsta¬ wiona przy azocie grupa fenylowa.Kalcitonina ludzka wykazuje zakres izoelektrycz¬ ny od 7 do 8. Zmiane tego zakresu przez zastepo¬ wanie poszczególnych aminokwasów innymi mozna okreslic eksperymentalnie na przyklad za pomoca elektroforezy albo mozna ja wyliczyc. Punkt izo¬ elektryczny peptydów mozna wyliczyc korzystajac na przyklad z pracy J. Greensteina i M. Winitza pt. „Chemistry of the Amino Acids", Vol. 1, Ed.John Wiley and Sons, Inc., New York,London, 1961, str. 482 ff. Solami peptydów, stanowiacymi material wyjsciowy w omawianym procesie moga byc wszystkie sole rozpuszczalne w wodzie lub w da¬ nym przypadku w roztworze zlozonym z wody i organicznego rozpuszczalnika peptydów na przy¬ klad nizszych alkanoli, a zwlaszcza metanolu, eta¬ nolu, izopropanolu, trzeciorzedowego butanolu albo dwumetyloformamidu albo dwumetyloacetamidu.Takimi solami sa na przyklad sole kwasów mine¬ ralnych, zwlaszcza kwasów chlorowcowodorowych, albo kwasów organicznych, przede wszystkim kwa¬ su octowego i kwasu chlorowco-octowego, jak na przyklad trójfluorooctowego, dwuchlorooctowego, kwasów sulfonowych jak na przyklad kwasów alkanosulfonowych z nizszymi grupami alkilowymi, na przyklad kwasu metanosulfonowego albo benzeno- albo toluenosulfonowego. Peptyd moze utworzyc sól z zasadami na przyklad z amonia¬ kiem albo z pierwszo-drugo-trzecio- albo czwarto¬ rzedowymi aminami, na przyklad z odpowiednimi aminami, które jako grupe organiczna posiadaja jedna albo wiecej nizszych grup alkilowych, cyklo- alkilowych (najkorzystniej o piecio-szescio-atomo- wym pierscieniu) albo grupy aryloalkilowe, zwlasz¬ cza grupe zlozona z rodnika fenylowego i z niz¬ szego rodnika alkilowego, na przyklad trójetylo- amina, cykloheksyloamina, dwucykloheksyloamina, benzyloamina, wodorotlenek trójmetylobenzyloami- nowy, ze zwiazkami, w których wyzej wymienione grupy organiczne zastapiono guanidyna, na przy- klad czterometyloguanidyna. 40 45 50 55 eo94 022 6 Przede wszystkim peptyd przeprowadza sie w postaci takiej soli, w jakiej otrzymuje sie go podczas syntezy, na przyklad w postaci chlorowo¬ dorku, bromowodorku, fluorowodorku, trójfluoro- octanu albo octanu. Jesli zachodzi potrzeba to ta¬ kie sole peptydu mozna przed procesem oczyszcza¬ nia przeprowadzic w sól octanowa, na przyklad za pomoca wymieniacza jonowego. Taka sól przenosi sie do wody albo do roztworu, w sklad którego wchodzi woda i organiczny rozpuszczalnik peptydu.Mierzy sie pH dodajac powoli zasady albo kwasu, zaleznie od tego czy sól powstala z kwasem czy zasada, az do osiagniecia zakresu izoelektrycznego.Jako zasady uzywa sie na przyklad amoniaku, wodnych roztworów zasad zwlaszcza sodowej albo potasowej, obojetnego albo kwasnego weglanu pier¬ wiastka alkalicznego, na przyklad weglanu albo kwasnego weglanu sodu, zasad organicznych jak na przyklad podanych wyzej amin albo najkorzystniej wymieniaczy jonowych. Do tego celu nadaja sie zwiazki majace slaby badz sredni charakter za¬ sadowy oraz wymieniacze jonowe o silnym charak¬ terze zasadowym. Takie wymieniacze jonowe wy¬ twarza sie przez polimeryzacje odpowiednich sub¬ stancji podstawowych, albo przez wprowadzenie zasadowych grup do polimerów. Najkorzystniej sto¬ sowac produkty znajdujace sie w handlu, na przy¬ klad oparte na celulozie jak na przyklad DEAF- celuloza albo DEAF-Sefadex.Do tego celu nadaja sie zwlaszcza wymieniacze jonowe oparte na polistyrenie, produkowane przez rozmaite firmy i znajdujace sie w handlu pod roz¬ maitymi nazwami firmowymi, jak na przyklad sla- bozasadowy wymieniacz jonowy Nr. II firmy „Merck", lub silnie zasadowy wymieniacz jonowy Nr. III firmy „Merck", albo rozmaite formy handlo¬ we zasadowego wymieniacza firmy „Dowex" albo zasadowe emberlity.Jesli zakres izoelektrycznyc ma byc nastawiany za pomoca kwasów, uzywa sie na przyklad kwasów mineralnych, przede wszystkim kwasów chlorowco- wodorowych, zwlaszcza kwasu solnego, albo kwa¬ sów organicznych, na przyklad kwasu octowego, albo cytrynowego, albo kwasnego wymieniacza jo¬ nowego, odpowiednio do wyzej wymienionych zasa¬ dowych wymieniaczy jonowych, na przyklad opar¬ tego na polistyrenie jak na przyklad „Amberlif IR-120 albo „Dowex" 50. Po osiagnieciu zakresu izoelektrycznego rozpoczyna sie powolne wytraca¬ nie sie peptydu.Wytracanie przebiega w ciagu kilku godzin, na przyklad dwu godzin, az do jego calkowitego zakon¬ czenia. W tym czasie wartosc pH podnosi sie prawie o jednostke. Dla przykladu pH roztworu octanu kalci- toninyM wynosi okolo 4. Po dodaniu slabozasado- wego wymieniacza jonowego podnosi sie powoli do wartosci 6,0—6,2. Wówczas rozpoczyna sie wytraca¬ nie. W przeciagu nastepnych dwu godzin pH wzras¬ ta do wartosci okolo 7,5 i wówczas pozostaje stale.Po zakonczeniu wytracania sie peptydu oddziela sie go od roztworu na przyklad przez odfiltrowanie na nuczy albo odwirowanie, a nastepnie przemywa dokladnie woda. Poniewaz wytracony peptyd bar¬ dzo slabo rozpuszcza sie w wodzie, praktycznie nie ma zadnych strat. Jesli wytracanie przeprowadza sie przez dotatek wymieniaczy jonowych, wówczas nalezy oddzielic wolny peptyd od wymieniacza jo¬ nowego. To moze miec miejsce jesli przeprowadza sie peptyd za pomoca kwasu w odpowiednia sól, na przyklad w octan albo chlorowodorek i otrzymany roztwór, po odfiltrowaniu od wymieniacza jono¬ wego poddaje sie liofilizacji, W przypadku pracy bez wymieniacza jonowego, mozna wytracony pro¬ dukt przez rozpuszczenie w kwasie i zliofilizowanie przeprowadzic w zadana forme soli.Kwasami nadajacymi sie do tworzenia soli, da¬ jacych sie zastosowac do celów terapeutycznych sa na przyklad kwasy nieorganiczne, jak na przyklad kwasy chlorowcowodorowe, na przyklad kwas solny albo bromowodorowy, nadchlorowy, azotowy lub tiocyjanowy, siarkowy, fosforowe albo kwasy orga¬ niczne jak na przyklad mrówkowy, octowy, propio- nowy, glikolowy, mlekowy, pirogronowy, szczawiowy, malonowy, bursztynowy, maleinowy, fumarowy, J0 jablkowy, winowy, cytrynowy, askorbinowy, hydro- ksymaleinowy, dwuhydroksymaleinowy, benzoeso¬ wy, fenylooctowy, 4-aminobenzoesowy, 4-hydro- ksybenzoesowy, antranilowy, cynamonowy, mig¬ dalowy, salicylowy, 4-aminosalicylowy, 2-fenoksy- benzoesowy, 2-acetoksybenzoesowy, metanosulfono- wy, benzenosulfonowy, p-toluenosulfonowy, nafta- lenosulfonowy albo sulfanilowy.Peptydy otrzymane sposobem wedlug wynalazku moga znalezc zastosowanie w formie preparatów M farmaceutycznych. Te ostatnie zawieraja peptydy w mieszaninie z odpowiednim nosnikiem farmaceu¬ tycznym, organicznym albo nieorganicznym, dosto¬ sowanym do zastosowania na przyklad dozylnego, domiesniowego, podskórnego albo do nosa.M Do tego celu nadaja sie substancje nie wchodzace w reakcje z polipeptydami jak na przyklad zela¬ tyna, agar-agar, guma tragantowa, celuloza jak na przyklad „Avicol" (mikrokrystaliczna celuloza) i pochodne celulozy jak na przyklad karboksy- 40 metyloceluloza, etery celulozy, jak na przyklad metylo- albo etyloceluloza, glikole polialkilenowe, jak na przyklad glikol polipropylenowy, woda, jedno- albo wielowartosciowe alkohole, jak na przyklad etanol, izopropanol, gliceryna, heksyt, oleje roslinne 45 oraz inne estry kwasów tluszczowych, jak na przy¬ klad olej arachidowy, olej z nasion bawelny, olej migdalowy, olej z oliwek, rycynusowy, oleinian ety¬ lowy, mirystynian izopropylowy, palmitymian izo¬ propylowy, „Octiol V" (ester kwasu olejowego 50 i cieklych alkoholi tluszczowych) „Miglyol" albo „Labrafac" (mieszanina trójglicerydów kwasów tluszczowych o 8—12 atomach wegla) „Labrafil M 2735" albo „Labrafac WL 1219" (mieszanki glice¬ ryny i estrów kwasów tluszczowych i polihydro- 55 ksyetylenu („Arlacel") ester kwasu tluszczowego i sorbitanu, „Tween" (monooleinian polihydroksy- etylenosorbitanu) oleje silikonowe jak na przyklad olej dwumetylosilikonowy albo inne znane nosniki leków. 60 Preparaty farmaceutyczne moga byc na przyklad jako liofilizat albo w formie cieklej jako roztwory, zawiesiny, emulsje, albo spray'e, jak na przyklad opi¬ sane w niemieckim opisie patentowym nr 2212315 W danym przypadku sa one wysterylizowane 65 wzglednie zawieraja substancje pomocnicze jak na94 022 8 przyklad srodki konserwujace stabilizujace, sieciu¬ jace albo emulgujace. Moga one zawierac równiez jeszcze inne terapeutycznie wartosciowe substancje.Wynalazek objasniaja opisane w dalszej czesci tekstu przyklady. Temperatury podane sa w stop¬ niach Celsjusza. Dla celów chromatografii cienko¬ warstwowej uzywa' sie nastepujacych ukladów: uklad 43 C: trzeciorzedowy alkohol amylowy — izopropanol- woda7 (51:21:28), uklad 45: drugorzedowy butanol — 3% roztwór amoniaku w wodzie (70:30), uklad 52: n-butanol — lodowaty kwas octowy — woda (75:7,5:21), uklad 52 A: n-butanol — lodowaty kwas octo¬ wy — woda (67:10:23), uklad 70: octan etylu-pirydyna-woda (40:20:40) (faza górna), uklad 79: n-butanol-pirydyna-woda (34:33:33) uklad 96: drugorzedowy butanol-lodowaty kwas octowy — woda (67:10:23), uklad 100: octan etylu-pirydyna-lodowaty kwas octowy — woda (63:21:6:11), uklad 101 A: n-butanol-pirydyna-lodowaty kwas octowy — woda (42:24:4:30), uklad 102 A: octan etylu-metyloetyloketon — kwas mrówkowy — woda (50:30:10:10), uklad 107: octan etylu — pirydyna — woda (49:24:27), uklad 114: drugorzedowy butanol — metyloetylo- keton — 25% roztwór amoniaku w wodzie — woda (37:37:13:13), uklad 121: izopropanol — 25% roztwór amoniaku w wodzie — wóda (70:10:20), uklad 121 A: izopropanol — 25% roztwór amo¬ niaku" w wódzie ^^ woda (85:5:10).DS: na pokrytych zelem krzemionkowym go¬ towych do uzycia plytkach SL-254 Fa. Antec. Bris- felden,v DG: na pokrytych celuloza gotowych do uzycia plytkach firmy „Merck", Darmstadt, DA; na plytkach Alox (45g Al2Oa firmy „Camag, Muttens", +3,5 g gipsu, grubosc 0,3 mm).W przytoczonych w nastepnej czesci opisu przy¬ kladach uzyto nastepujacych skrótów: Boc — trzeciorzedowy butyloksykarbonyl Z — grupa karbobenzoksylowa Ot Bu — trzeciorzedowy ester butylowy ONp — ester p-nitrofenylowy ONe — ester metylowy OSu — imidoester kwasu bursztynowego tBu — trzeciorzedowy eter butylowy DMF — dwumetyloformamid Przyklad I. Otrzymywanie czystego octanu kalcitoniny M. 50 mg surowej soli kalcitoniny M z kwasem trójfluorooctowym (belgijski opis paten¬ towy nr 737890) rozpuszcza sie w 5 ml wody. War¬ tosc pH roztworu wynosi 2,5. Mieszajac dodaje sie kilku porcjami w ciagu 15 minut, w sumie 0,6 ml wymieniacza jonowego Nr. II firmy „Merck", slabo zasadowego, w postaci wolnej zasady. Wartosc pH roztworu rosnie dó 6,2. Calosc miesza sie w ciagu dalszych 30 minut w temperaturze pokojowej, przy czym wartosc pH wzrasta do 7,5 i wystepuje klacz- kowaty osad. Po trzygodzinnym mieszaniu osad i wymieniacz jonowy odfiltrowuje sie na nuczy a nastepnie przemywa woda. Przesacz zawiera 12 mg ubocznego produktu kalcitoniny M.Wytracona kalcitonine M oddziela sie od wymie¬ niacza jonowego przemywajac czterokrotnie porcja- mi po 4 ml 90%-owego kwasu octowego i odfiltro¬ wuje za kazdym razem na nuczy. Polaczone ekstrakty kwasu octowego liofilizuje sie otrzymujac 36 g kalcitoniny M w postaci soli kwasu octowego.Produkt wykazuje nastepujace dane analityczne: Zawartosc wody wg Karla Fischera: 8,1 % Zawartosc kwasu octowego (metoda chroma¬ tografii gazowej): 1,1% Zawartosc peptydu: 89,0% Zawartosc fluoru (metoda mikroanalizy): 0,02 % analiza aminokwasu (6-n HC1, 24 godz, 110°); wszystkie aminokwasy w odpowiednim stosunku molowym, oprócz Ser, Thr, Cys, które ulegaja czes¬ ciowemu rozkladowi podczas hydrolizy); widmo UV (w 10% kwasie octowym): y™x = 275 n £ = 154°- Przyklad II. Otrzymywanie czystego trój- chlorowodorku kalcitoniny M.Surowy trójfluorooctan kalcitoniny M 58,0 g Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser (tBu) — Thr (tBu) — Cys — Met — Leu — Gly-Thr (tBu) — Thr (tBu) — Thr(tBu) Gln-Asp (Ot Bu) — Phe-Asn-Lys (Boc) — Phe-His-Thr (tBu) — Phe-Pro-Gln-Thr (tBu) — Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (14,3 milimola) rozpuszcza sie w 700 ml 85% kwasu trójfluoro- octowego w atmosferze azotu. Otrzymany roztwór pozostawia" sie na 2 godziny w temperaturze 30°.Nastepnie mieszajac roztwór ten rozpuszcza sie w 6 "1' eteru wolnego od nadtlenków przy dobrym chlodzeniu lodem. Osad odfiltrowuje sie, przemywa eterem i suszy w wysokiej prózni. Otrzymuje sie surowy trójfluorooctan kalicitoniny M w posiaui bezbarwnego proszku.Sól wewnetrzna kalcitoniny M. 43,5 g surowego trójfluorooctanu kalcitoniny M, otrzymanego w wy- 40 zej opisany sposób, rozpuszcza sie w 1 litrze 1% kwasu octowego, filtruje sie przez szklana nucze filtracyjna C-4, a potem wytrzasa sie amoniakiem w sposób nastepujacy: roztwór miesza sie w at¬ mosferze azotu w temperaturze pokojowej, mierzac 45 pH w sposób ciagly za pomoca elektrody szkla¬ nej. Dodaje sie powoli In (t=0,97) roztwór amonia¬ ku tak, aby po uplywie 1,25 godz., osiagnac pH==5.W ciagu nastepnej godziny podwyzsza sie pH do wartosci 6 przez równomierne dodawanie dalszycn 50 porcji In roztworu amoniaku. W tym czasie za¬ czyna wytracac sie wewnetrzna sól kalcitoniny M w postaci nierozpuszczalnego proszku.W dalszym ciagu kontynuuje sie powolne doda¬ wanie roztworu amoniaku przez okres okolo go- 55 dziny az do osiagniecia wartosci pH=7,6. Nastep¬ nie miesza sie calosc jeszcze 3 godziny, przy czym pH praktycznie ulega zmianie, odfiltrowuje sie, przemywa rozcienczonym amoniakiem o pH=7,6 i suszy w wysokiej prózni. Otrzymuje sie 18,9 g 60 nierozpuszczalnego w wodzie proszku. Próbka tak otrzymanej substancji poddana analizie metoda chromatografii gazowej wykazuje zawartosc 0,3% wagowych kwasu octowego (co odpowiada ok. 0,17% molowych). 65 Trójchlorowodorek kalcitoniny M.9 94 022 27,3g {8,0 milimola) soli wewnetrznej kalcitoniny M rozrabia sie do postaci szlamu w 700 ml trze¬ ciorzedowego butanolu. Dodaje sie 250 ml wody i 360 ml 0,1-n kwasu solnego (36 milimoli) miesza przez kilka minut i otrzymany metny roztwór fil¬ truje przez szklana nucze filtracyjna C-4. Pozosta¬ losc po filtracji rozpuszcza sie w swiezej porcji 250 ml wody i filtruje do poprzednio otrzymanego filtratu. Polaczone filtraty zamraza sie i liofilizuje.Po osiagnieciu stanu równowagi pod wzgledem za¬ wartosci wilgoci z otaczajacym powietrzem otrzy¬ muje sie 27,0 g trójchlorowodorku kalcitoniny M.Produkt wykazuje nastepujace dane analityczne: chromatogram cienkowarstwowy na celulozie (Merck) Rf = 0,61 w ukladzie 101 A = 0,52 w ukladzie 45 = 0,51 w ukladzie 114 na tlenku glinu z 8% gipsu 0,72 w ukladzie 79.Podczas elektroforezy cienkowarstwowej pojawia sie plamka o drodze migracji dlugosci 4,8 cm w kierunku katody na plytkach celulozowych (Merck) i przy pH=l,9, 9 V/cm i czasie 3,5 godziny.Zawartosc kwasu octowego (metoda chromato¬ grafii gazowej: <0,05% Zawartosc wody wedlug Karla Fischera: 8,5% Zawartosc chloru: 2,8% (liczac na bezwodny trójchlorowodorek: 3,02%) Widmo UV (w 10% kwasie octowym): 7max = 275 mm t = 1440 Substraty uzyte w przykladach III, IV i V moz¬ na wytwarzac sposobem podanym w niemieckim opisie patentowym nr 2413106 (odpowiada on bel¬ gijskiemu patentowi nr 812881).Przyklad III. Otrzymywanie czystego trój- chlorowodorku Asn^-Thr27 kalcitoniny M.Surowy trójfluorooctan Asn^-Thr^-kalcitoniny M. 5,8 g (1.41 milimola) Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser (tBu) Thr (tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr (tBu) — Tyr (tBu) Thr (tBu)-Gln-Asp (Ot Bu)-Phe-Asn-Lys (Boc)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe- Procglin-Thr (tBu)- -Asn-Thr cza sie w 70 ml 85% kwasu trójfluorooctowego w O0 w atmosferze azotu i miesza sie przez 2 go¬ dziny w 29—31°. Otrzymany roztwór wlewa sie sil¬ nie mieszajac, do 600 ml chlodzonego lodem i wol¬ nego od nadtlenków eteru, odfiltrowuje wytracony osad i suszy w wysokiej prózni.Sól wewnetrzna Asn2<-Thr27-kalcitoniny M.Opisany powyzej wysuszony osad rozpuszcza sie w 130 ml wody, filtruje przez filtr szklany G-4 i wytraca rozcienczonym roztworem amoniaku w sposób nastepujacy: roztwór miesza sie w tempe¬ raturze pokojowej w atmosferze azotu, wkrapla- jac przy tym powoli In roztwór amoniaku (T = = 0,97). pH mierzy sie w sposób ciagly za pomoca elektrody szklanej. Doplyw reguluje sie tak, aby w ciagu 1,5 godziny osiagnac pH = 5. Po uplywie nastepnej godziny, podczas której nadal dodaje sie amoniak uzyskuje sie pH = 6. W tym czasie roz¬ poczyna wytracac sie sól wewnetrzna. W dalszym ciagu wkrapla sie rozcienczony roztwór amoniaku w taki sposób, aby podczas nastepnej godziny pH osiagnelo wartosc 7,6. Nastepnie miesza sie jeszcze przez 3 godziny, odfiltrowuje i dobrze przemywa woda o pH = 7,5 (nastawionym roztworem amonia¬ ku). Pozostalosc suszy sie w wysokiej prózni.Trójchlorowodorek Asn^-Thr^-kalcitoniriy M.Otrzymana sposobem opisanym powyzej nie roz¬ puszczalna w wodzie sól wewnetrzna rozrabia sie do postaci szlamu w 80 ml mieszaniny Woda (trze¬ ciorzedowy butanol 1:1).Dodaje sie 39,0 ml 0,1-n kwasu solnego, miesza przez kilka minut w atmosferze azotu i filtruje.Pozostalosc przemywa sie kilkakrotnie laczna ilos¬ cia 120 ml mieszaniny woda/trzeciorzedowy butanol 1:1 i liofilizuje. Otrzymuje sie bezbarwny liofilizat, który nawilza sie na powietrzu do osiagniecia sta¬ nu równowagi pod wzgledem zawartosci wilgoci z otaczajacym powietrzem. Wydajnosc: 3,13 g Otrzymany produkt wykazuje nastepujace war¬ tosci analityczne: chromatogram cienkowarstwowy na celulozie (Merck) Rf = 0,41 w ukladzie 114 0,36 w ukladzie 45 0,53 w ukladzie 101 A na tlenku glinu z dodatkiem 8% gipsu: 0,49 w ukladzie 52 Odleglosc migracji przy elektroforezie cienko¬ warstwowej na plytkach celulozowych (Merck) przy pH = 1,9 (bufor): kwas mrówkowy {kwas octowy), 9 V/cm i w czasie 3,5 godziny wynosi 4,8 cm.Przyklad IV. Otrzymywanie czystego octanu Thr27-kalcitoniny M. 80 mg surowej Thr *7 -kalcitoniny M w postaci soli octanowej rozpuszcza sie w 5 ml wody i mieszajac poddaje sie reakcji z laczna iloscia 1,2 ml wymie¬ niacza jonowego Nr II firmy Merck, slabo zasado¬ wego w postaci wolnej aminy. Wspomniany wymie¬ niacz jonowy dodaje sie porcjami. Przy tym war¬ tosc pH roztworu wzrasta od pierwotnej 4,6 do 6,1- Miesza sie przez dalsze dwie godziny w tempera¬ turze pokojowej, przy czym tworzy sie klaczkowa- ty osad i wartosc pH roztworu wzrasta do 7,1. Mie¬ sza sie przez dalsze 30 minut przy tej wartosci pH, odsacza na nuczy osad razem z wymieniaczem jo¬ nowym i dobrze przemywa woda. Nastepnie od¬ dziela sie peptyd od wymieniacza jonowego, mie¬ szajac wilgotna jeszcze mieszanine z 15 ml 00% kwasu octowego i równoczesnie ogrzewajac w tem¬ peraturze 60° miesza sie po czym otrzymany roz¬ twór kwasu octowego odsacza sie na nuczy.Liofilizacja eluatu daje 74 mg octanu Thr27-kal- cinoniny M, o bardzo wysokim stopniu czystosci.Wartosc Rf przy chromatografii cienkowarstwowej na plytkach z tlenkiem glinu w ukladzie 101 A wynosi 0,52. Przy elektroforezie cienkowarstwowej (pH=l,9; 280 V, 2 godz) wspomniany produkt wed¬ ruje 4,4 cm wzgledem katody.Zawartosc kwasu octowego: 4,22% (metoda chro¬ matografii gazowej); Zawartosc wody: 7,78% (metoda analizy miarecz¬ kowej Karla Fischera) Zawartosc peptydu: 87,4% (metoda analizy mia¬ reczkowej); Widmo UV: A.max = 276mm; e = 1560 (c = w 5% kwasie octowym, liczac na zawartosc peptydu 87,4%). 90 40 45 50 55 6011 94 022 12 Molowy stosunek aminokwasu po calkowitej hydrolizie (6-n HC1, 24 godz., 110° (wyliczone war¬ tosci w nawiasach): Lys: 0,93 (1); His: 0,95 (1); NH3: 3,40 (4); Asp: 3,00 (3)-Thr: 5,23 (6); Ser:l,17 (1); Gin: 2.02 (2) Pro: 2,06 (2); Gly: 3,87 (4); Ala:2,03 (2); 1/2 (Cys)2: 2,13 (2); Val: 1 (jednostka odniesienia) Met: 1,07 (1); Leu: 1,82 (2); Tyr: 0,99 (1); Phe: 3,06 (3).Przyklad V. Otrzymywanie octanu Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr- Leu -Thr-Gln -Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe- Pro-Gln-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (Octan Leu12-Asn26-Thr27-kalcitoniny M) Rozpuszcza sie 170 mg Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser (tBu) Thr (tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr (tBu)-Leu- Thr (tBu)- Gln-Asp (OtBu)-Phe-Asn-Lys (Boc)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe-Pro-Glin-Thr (t Bu)-Asn-Thr (t Bu) Cly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 w 5 ml 90% kwasu trój- fluorooctowego pozostawia do odstania przez 90 min w 25°, wytraca sie trójfluorooctan peptydu za pomoca nie zawierajacego nadtlenków eteru, od- filtrowuje na nuczy, przemywa eterem, suszy i rozpuszcza w 1% kwasie octowym. Nastepnie fil¬ truje przez kolumne wypelniona wymieniaczem jonowym firmy „Merck" (slabo zasadowym w po¬ staci octanu), eluuje za pomoca 1% kwasu octo¬ wego a nastepnie liofilizuje otrzymany eluat (116 mg).Celem oczyszczania rozpuszcza sie otrzymany octan w 5 ml wody (pH roztworu wynosi 4,2) i mieszajac dodaje porcjami lacznie 2,8 ml wy¬ mieniacza Nr II firmy „Merck" (slabo zasadowego w postaci zasady). Przy tym podwyzsza sie powoli pH roztworu i po osiagnieciu wartosci okolo 6,7 rozpoczyna sie wytracanie wolnego peptydu. Mie¬ sza sie przez dwievgodziny osiagajac wartosc pH = = 7,1. Nastepnie odsacza, sie osad razem z wymie¬ niaczem jonowym na nuczy, przemywa woda, a na¬ stepnie rozpuszcza peptyd z wymieniacza jonowego mieszajac calosc z 90% kwasem octowym w 60°.Nastepnie odsacza sie na nuczy, przemywa 90% kwasem octowym i liofilizuje. Otrzymuje sie 98 mg Leu12-Asn26-Thr27-kalcitoniny M w postaci oc¬ tanu o wysokiej czystosci.DC:Rf (101 A) = 0,33 DA:Rf (52) = 0,47 Przyklad VI. Otrzymywanie czystej kalcito- niny M (octan).Rozpuszcza sie 110 mg surowego octanu kalci- toniny M w 5 ml wody i dodaje w przeciagu 1 godziny, mieszajac porcjami 1,0 ml silnie zasado¬ wego wymieniacza jonowego Nr III firmy „Merck".Przy tym podwyzsza sie pH roztworu do wartosci 6,6 i rozpoczyna wytracanie kalcitoniny. Po dal¬ szym mieszaniu w temperaturze pokojowej pod¬ wyzsza sie w dalszym ciagu pH mieszaniny do war¬ tosci 7,3, która sie utrzymuje.Nastepnie odsacza sie na nuczy wymieniacz jo¬ nowy razem z wytraconym peptydem, przemywa woda i rozpuszcza peptyd z wymieniacza jonowego dodatkiem cieplego 90% kwasu octowego. Nastep¬ nie wymieniacz jonowy odsacza sie na nuczy, prze¬ mywa 90% kwasem octowym i liofilizuje. Otrzy¬ muje sie octan kalcitoniny M o wysokiej czystosci; jego dane analityczne odpowiadaja danym anali¬ tycznym produktu otrzymanego w przykladzie I. PL