WO1994027958A1 - 4-amidinophenylsulfonamide zur behandlung von thromboembolischen erkrankungen - Google Patents

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WO1994027958A1
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Wolfgang Von Der Saal
Herbert Leinert
Thomas Poll
Karlheinz Stegmeier
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention comprises new 4-amidinophenylsulfonamides of the general formula I
  • A represents an ⁇ -amino acid
  • R 1, R 2 are identical or different and are hydrogen, phenyl, carboxyl or C j -CG alkyloxycarbonyl mean
  • the invention also relates to the optically active forms, the racemates and the diastereomer mixtures of these compounds.
  • the invention also relates to processes for the preparation of the above compounds, medicaments containing such compounds and the use of these compounds in the production of medicaments.
  • the compounds of general formula I are inhibitors of serine proteases such as thrombin, trypsin, plasmin, factor Xa, kallikrein, tryptase and other serine proteases.
  • Thrombin the last enzyme in the coagulation cascade, cleaves fibrinogen to fibrin, which is cross-linked by factor XIII and becomes an insoluble gel that forms the matrix for a thrombus.
  • Thrombin activates platelet aggregation by proteolysis of its receptor on the platelets and in this way also contributes to thrombus formation.
  • thrombin concentrations in the blood plasma.
  • Increasing thrombin concentration can lead to the formation of thrombi and thus to thromboembolic diseases, which occur very frequently, especially in the industrialized countries.
  • Thrombin is kept in the form of prothrombin in the plasma, which is released by factor Xa. Thrombin activates factors V and VIII, which then convert factor X to Xa. Thrombin thereby catalyzes its own release, which is why thrombin concentrations can increase very rapidly. Thrombin inhibitors and factor Xa inhibitors can therefore inhibit the release of thrombin, platelet-induced and plasmatic blood coagulation.
  • Synthetic thrombin inhibitors have long been known. Starting from fibrinogen, the natural substrate of thrombin, substances of the (D) -Phe-Pro-Arg type were synthesized. Such tripeptides mimic the amino acid sequence before the cleavage site on the fibrinogen. In order to obtain good inhibitors, the carboxylate group of the arginine was changed so that the hydroxyl group of the serine-195 of the active site of the thrombin can react with it. This is possible, for example, by replacing the carboxylate group with the aldehyde function. Corresponding (D) -Phe-Pro-Arginale are described in the patent applications EP 185390.
  • a second type of thrombin inhibitor was based on the benzamidine known as the trypsin inhibitor.
  • the inhibitors obtained in this way differ from the (D) -Phe-Pro-Arg types not only in their chemical structure, but also in the type of inhibition: the serine-195 of thrombin does not bind to these inhibitors. This emerges clearly from X-ray structure studies (W. Bode, D. Turk, J. Sturzbecher, Eur. J. Biochem. 193, 175-182 (1990)).
  • NAPAP belongs to this second class of thrombin inhibitors (DD 235866, May 21, 1986).
  • Trypsin is a digestive enzyme that is released by the pancreas when needed. If the pancreas is injured or inflamed, the resulting increased release of trypsin can lead to tissue destruction. Trypsin inhibitors can reduce this risk and can be used to treat pancreatitis, for example.
  • Plasmin lyses fibrin and fibrinogen and thus dissolves grinnings. Under normal conditions, the fibrinolysis system is in equilibrium with the coagulation system. If the fibrinolytic activity is too high, this can lead to prolonged bleeding.
  • Kallikrein is released by factor XII from precallikrein on negatively charged surfaces. It cleaves factor XII into factor Xlla, the first enzyme in the intrinsic coagulation cascade. A large-scale activation of this system can be found in shock and in disseminating intravascular coagulation. Kallikrein cleaves kininogen to bradikinin, a vasodilator. Bradikinin causes increased vascular permeability and increases leukocyte mobility. Kinin release inhibitors can be used for inflammation, arthritis and pancreatitis, and possibly for the treatment of asthma. Aprotinin, a polypeptide, inhibits kallikrein and has been used clinically.
  • Tryptase occurs in large quantities in human mast cells in the lungs. Although its exact function in vivo is still unknown, a not insignificant involvement in asthmatic vision is discussed. Tryptase inhibitors could therefore be used to treat asthma.
  • a and B represent amino acids such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, norleucine, methionine, proline, phenylalanine, tryptophan, serine, threonine, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, tyrosine, cysteine, lysine, Arginine and histidine, which can be in the D or L form or as a mixture of both forms, but preferably are in the L form.
  • A is the amino acids with aliphatic side chains, such as alanine, valine, leucine, isoleucine, norleucine or methionine
  • B is the amino acid glycine and R- and R 2 are phenyls are particularly preferred.
  • A, B, R. and R 2 have the meanings given above. These are either added with H 2 S in pyridine in the presence of a base such as triethylamine, diisopropylmethylamine or N-methylmorpholine to the thioamides of the general formula III or in a lower alcohol such as ethanol in the presence of chlorine-hydrogen to the imidic acid ester halides general formula IV um.
  • a base such as triethylamine, diisopropylmethylamine or N-methylmorpholine
  • a lower alcohol such as ethanol
  • the thioimidic acid ester halides of the general formula V are obtained from the compounds of the general formula III by reaction with an alkyl halide, preferably methyl iodide.
  • the compounds of the general formula IV are reacted with alcoholic ammonia solution or the compounds of the general formula V with alcoholic ammonium acetate solution. In the latter case, the acetate salts of the compounds of the general formula I are isolated
  • the compounds of the general formula II are prepared by reacting 4-cyano-benzenesulfonyl chloride with the peptides of the general formula HAB-NH-CHR-, R 2 . These peptides are obtained by the methods customary in peptide synthesis. The reactions of the sulfonyl chloride with the amine are advantageously carried out with the addition of an acid-binding agent, such as. B.
  • organic bases such as pyridine, triethylamine, N-methylmorpholine or di-isopropylmethylamine
  • inert solvents such as ether, methylene chloride, dioxane, toluene or an excess of the tertiary amine serves.
  • the reaction medium used is, for example, water, aqueous ethanol or aqueous dioxane.
  • physiologically usable salts of the compounds of formula I are salts with physiologically compatible mineral acids, such as hydrochloric acid, sulfuric acid, sulfurous acid or phosphoric acid, or with organic acids, such as Methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid, tartaric acid, succinic acid or salicylic acid.
  • the compounds of formula I with a free carboxy group can also form salts with physiologically compatible bases. Examples of such salts are alkali metal, alkaline earth metal, ammonium and alkylammonium salts, such as the sodium, potassium, calcium or tetramethylammonium salt.
  • the compounds of the formula I can be solvated, in particular hydrated.
  • the hydration can take place in the course of production or can occur gradually as a result of hygroscopic properties of an initially anhydrous compound of the formula.
  • Pure enantiomers of the compounds of the formula I are obtained either by resolving racemates (via salt formation with optically active acids or bases) or by using optically active starting materials in the synthesis.
  • the substances of the general formula I are mixed with suitable pharmaceutical carriers, flavoring, flavoring and coloring agents and shaped, for example, as tablets or dragées or with the addition of appropriate auxiliaries in water or oil, e.g. in olive oil, suspended or dissolved.
  • the substances of the general formula I and their salts can be administered enterally or parenterally in liquid or solid form.
  • Water is preferably used as the injection medium, which contains the additives customary for injection solutions, such as stabilizing agents, solubilizers or buffers.
  • additives are, for example, tartrate and citrate buffers, complexing agents (such as ethylenediaminetetraacetic acid and its non-toxic salts) and high molecular weight polymers such as liquid polyethylene oxide for viscosity regulation.
  • Solid carriers are, for example, starch, lactose, mannitol, methyl cellulose, talc, highly disperse silicas, high molecular fatty acids (such as stearic acid), animal and vegetable fats and solid high molecular polymers (such as polyethylene glycols).
  • Preparations suitable for oral administration can, if desired, contain flavorings and sweeteners.
  • the compounds are usually applied in amounts of 10-1500 mg per day based on 75 kg of body weight. It is preferred to administer 1-2 tablets with an active substance content of 5-500 mg 2-3 times a day.
  • the tablets can also be delayed, which means that only 1-2 tablets with 20-700 mg of active ingredient have to be given once a day.
  • the active substance can also be given by injection 1-8 times a day or by continuous infusion, with 50-2000 mg per day usually being sufficient.
  • step a) Boc-alanine is used instead of Boc-glycine.
  • Step c) 2- (4-cyano-benzenesulfonylamino) -propanoic acid- (benzhydrylcarbamoyl-methyl) -amide. Mp .: 195-197 ° C. MS: m / e 476.
  • MS: m / e 510.
  • step a The preparation is carried out analogously to Example 1, except that in step a), instead of glycine (N-benzhydryl) amide, phenylaianin (N-benzhydryl) amide is used.
  • MS: m / e 487.
  • MS: m / e 586.
  • Step b) 2- (4-aminothiocarbonyl-benzenesulfonylamino) acetic acid (benzhydryl) amide. Mp: 185-187 ° C. MS: m / e 439.
  • MS: m / e 339.
  • Step c) 2- (4-cyano-benzenesulfonylamino) -3-methyl-butanoic acid (benzhydryl-carbamoyl-methyl) -amide. Mp .: 197-198 ° C. MS: m / e 504.
  • step a) Boc-norleucine is used instead of Boc-glycine.
  • step a) Boc-isoleucine is used instead of Boc-glycine.
  • Step c) 2- (4-cyano-benzenesulfonylamino) -3-methyl-pentanoic acid (benzhydryl-carbamoyl-methyl) -amide. Mp: 229-230 ° C. MS: m / e 518.
  • step a) Boc-methionine is used instead of Boc-glycine.
  • MS: m / e 536.
  • step a) is used instead of boc-glycine (D) -boc-leucine.
  • step a The preparation is carried out analogously to Example 1, except that in step a), instead of Boc-glycine (L) -Boc-leucine and instead of glycine- (N-benhydryl) -amide, glycine-benzylamide is used.
  • Thrombin time is a test commonly used in clinical coagulation diagnostics. This parameter measures thrombin effects on fibrinogen and clot formation. Thrombin inhibitors cause an increase in thrombin time.
  • the following table shows the measured thrombin times in seconds as the difference to the control.
  • the concentrations of the active substances in the final volume were 250 ⁇ M (TT250) and 25 ⁇ M (TT25).
  • the substrate was used in the concentrations 100 ⁇ M, 50 ⁇ M, 30 ⁇ M, 20 ⁇ M and one measurement without inhibitor and three measurements in the presence of different concentrations of the inhibitors listed in the following table were carried out for each substrate concentration.
  • the reactions were started by adding thrombin. The increase in absorbance at 405 n followed by the resulting p-nitroaniline over a period of 12 minutes. Measuring points (time vs. extinction) were transferred to a PC at intervals of 20 seconds. The velocities V 0 (change in extinction per second; measurements without inhibitor) and Vj (measurements with inhibitor) were determined from the data by linear regression. Only the part of each measurement in which the substrate concentration is reduced by less than 15% was used would have. From a series of measurements (constant inhibitor concentration, variable substrate concentrations), K m ⁇ and V Q ⁇ X were determined by a nonlinear fit to the equation
  • the Michaelis constant K m was 3.8 ⁇ 2 ⁇ M in all measurements.
  • the inhibition constants Kj of the active substances are given in the following table in the unit ⁇ M.

Abstract

Verbindungen der Formel (I), in der A eine α-Aminosäure bedeutet, B eine Bindung oder eine α-Aminosäure bedeutet, R1, R2 gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatom, Phenyl-, Carboxyl oder C1-C8-Alkyloxycarbonyl bedeuten, sowie deren physiologisch verträgliche Salze, Hydrate, Solvate und optische Isomeren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneimittel, die diese Stoffe enthalten, zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen.

Description

-AMIDINOPHENYLSULFONAMIDE ZUR BEHANDLUNG VON THROMBOEMBOLISCHEN ERKRANKUNGEN
Die vorliegende Erfindung umfaßt neue 4-Amidinophenylsulfonamide der allgemeinen Formel I
Figure imgf000003_0001
in der
A eine α-Aminosäure bedeutet,
B eine Bindung oder eine α-Aminosäure bedeutet,
R1 , R2 gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatom, Phenyl-, Carboxyl oder C-j-Cg-Alkyloxycarbonyl bedeuten,
sowie Hydrate, Solvate und physiologisch verträgliche Salze davon. Gegenstand der Erfindung sind auch die optisch aktiven Formen, die Racemate und die Di- astereomerengemische dieser Verbindungen.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung der obigen Verbindungen, Arzneimittel, die solche Verbindungen enthalten, sowie die Verwendung dieser Verbindungen bei der Herstellung von Arzneimitteln. Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind Inhibitoren von Serin-Proteasen wie Thrombin, Trypsin, Plasmin, Faktor Xa, Kallikrein, Tryptase und anderen Serinproteasen.
Thrombin, das letzte Enzym der Gerinnungskaskade, spaltet Fibrinogen zu Fibrin, das durch den Faktor XIII quervernetzt und zu einem unlöslichen Gel wird, das die Matrix für einen Thrombus bildet. Thrombin aktiviert durch Proteolyse seines Rezeptors auf den Blutplättchen die Plättchenaggregation und trägt auf diesem Weg ebenfalls zur Thrombusbildung bei. Bei der Verletzung eines Blutgefäßes sind diese Prozesse notwendig, um eine Blutung zu stoppen. Unter normalen Umständen sind keine meßbaren Thrombin-Konzentrationen im Blutplasma vor¬ handen. Ansteigen der Thrombinkonzentration kann zur Ausbildung von Thromben und damit zu thromboembolischen Krankheiten führen, die vor allem in den Industriestaaten sehr häufig auftreten. Thrombin wird im Plasma in Form des Prothrombins bereitgehalten, durch den Faktor Xa aus diesem freigesetzt. Thrombin aktiviert die Faktoren V und VIII, die dann den Faktor X in Xa umwan- dein. Thrombin katalysiert dadurch seine eigene Freisetzung, weshalb es zu sehr rasch ansteigenden Thrombin-Konzentrationen kommen kann. Thrombin-Inhibi- toren und Faktor Xa-Inhibi- toren können deshalb die Freisetzung des Thrombins, die plättcheninduzierte und die plasmatische Blutgerinnung hemmen.
Synthetische Thrombin-Inhibitoren sind schon lange bekannt. Ausgehend vom Fibrinogen, dem natürlichen Substrat des Thrombins, wurden Substanzen des (D)-Phe-Pro-Arg-Typs synthetisiert. Solche Tripeptide ahmen die Aminosäure¬ sequenz vor der Spaltstelle am Fibrinogen nach. Um gute Inhibitoren zu erhalten, wurde die Carboxylatgruppe des Arginins dabei so verändert, daß die Hydroxy- gruppe des Serin-195 der active site des Thrombins mit ihr reagieren kann. Dies ist beispielsweise dadurch möglich, daß man die Carboxylatgruppe durch die Aldehydfunktion ersetzt. Entsprechende (D)-Phe-Pro-Arginale sind in der Patent¬ anmeldungen EP 185390 beschrieben. Zu einem zweiten Typ von Thrombin- Inhibitoren wurde das als Trypsin-inhibitor bekannte Benzamidin zur Grundlage genommen. Die so erhaltenen Inhibitoren unterscheiden sich von den (D)-Phe- Pro-Arg-Typen nicht nur im chemischen Aufbau, sondern auch in der Art der Inhibierung: das Serin-195 des Thrombins bindet nicht an diese inibitoren. Dies geht aus Röntgenstruktur-Unteruchungen eindeutig hervor (W. Bode, D. Turk, J. Stürzebecher, Eur. J. Biochem. 193, 175-182 (1990)). Zu dieser zweiten Klasse von Thrombin-Inhibitoren gehört das NAPAP (DD 235866, 21. 5. 1986).
Trypsin ist ein Verdauungsenzym, das vom Pancreas bei Bedarf ausgeschüttet wird. Bei Verletzungen oder Entzündungen des Pancreas kann die dadurch be- dingte erhöhte Freisetzung von Trypsin zur Gewebezerstörung führen. Trypsin- Inhibitoren können diese Gefahr eindämmen und zur Behandlung etwa der Pancreatitis eingesetzt werden.
Plasmin lysiert Fibrin und Fibrinogen und löst somit Grinnsel auf. Unter normalen Bedingungen steht das Fibrinolyse-System im Gleichgewicht mit dem Koagula¬ tions-System. Wird die fibrinolytische Aktivität zu groß, kann das zu verlängerten Blutungen führen.
Kallikrein wird durch den Faktor XII aus Präkallikrein auf negativ geladenen Oberflächen freigesetzt. Es spaltet den Faktor XII zu Faktor Xlla, dem ersten Enzym der intrinsischen Koagulations-Kaskade. Eine großflächige Aktivierung dieses Systems findet man im Schock und bei disseminierender intravasculärer Koagulation. Kallikrein spaltet Kininogen zu Bradikinin, einem Vasodilatator. Bradikinin verursacht erhöhte vaskuläre Permeabilität und erhöht die Mobilität von Leukozyten. Hemmer der Kinin-Freisetzung können bei Entzündungen, Arthritis und Pancreatitis und möglicherweise auch zur Behandlung von Asthma ange- wendet werden. Aprotinin, ein Polypeptid, inhibiert Kallikrein und wurde bereits klinisch eingesetzt.
Tryptase kommt in großen Mengen in humanen Mastzellen der Lunge vor. Obschon seine genaue Funktion in vivo noch unbekannt ist, wird eine nicht unerhebliche Beteiligung am asthmatischen Gesehen diskutiert. Tryptase- Inhibitoren könnten daher zur Behandlung von Asthma eingesetzt werden.
In der allgemeinen Formel I bedeuten A und B -Aminosäuren wie Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Methionin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Serin, Threonin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutamin, Glutaminsäure, Tyrosin, Cystein, Lysin, Arginin und Histidin, die in der D- oder L-Form oder als Mischung beider Formen vorliegen können, bevorzugt jedoch in der L-Form vorliegen. Unter C-j-Cg-Alkoxycarbonylgruppen für R1 oder R2 in der allgemeinen Formel I versteht man geradkettige oder verzweigte Ester wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, tert.Butyl-, Neopentyl-, Hexyl-, Heptyl- oder Octylester.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen, in denen A die Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten bedeutet, wie Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Norleucin oder Methionin, und B die Aminosäure Glycin bedeutet und R-, und R2 Phenyle bedeutet.
Die Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I geschieht nach an sich bekannten Verfahren.
Man geht aus von den Nitrilen der allgemeinen Formel II
NC -U ^ - S - A-B- NH-CHR ,.R£ -2 (ll).
in der A, B, R. und R2 die oben genannten Bedeutungen haben. Diese setzt man entweder mit H2S in Pyridin in Gegenwart einer Base wie Triethylamin, Diisopro- pyl-methylamin oder N-Methylmorpholin zu den Thioamiden der allgemeinen Formel III oder in einem niederen Alkohol wie Ethanol in Gegenwart von Chlor- Wasserstoff zu den Imidsäureesterhalogeniden der allgemeinen Formel IV um.
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Figure imgf000007_0001
Cl-
Aus den Verbindungen der allgemeinen Formel III werden durch Umsetzung mit einem Alkylhalogenid, vorzugsweise Methyliodid, die Thioimidsäureesterhalo- genide der allgemeinen Formel V erhalten.
- A-B-NH-CHRιR2 (V)
Figure imgf000007_0002
I-
Zur Herstellung der Zielverbindungen der allgemeinen Formel I setzt man die Ver¬ bindungen der allgemeinen Formel IV mit alkoholischer Ammoniaklösung oder die Verbindungen der allgemeinen Formel V mit alkoholischer Ammoniumacetat- Lösung um. In letzterem Falle isoliert man die Acetat-Salze der Verbindungen der allgemeinen Formel I.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel II stellt man her durch Umsetzung von 4-Cyano-benzolsulfonylchlorid mit den Peptiden der allgemeinen Formel H-A-B-NH-CHR-,R2. Diese Peptide werden durch die in der Peptidsynthese üblichen Verfahren gewonnen. Die Umsetzungen des Sulfonylchlorids mit dem Amin erfolgt zweckmäßig unter Zusatz eines säurebindenden Mittels, wie z. B. Alkaiiacetat, Alkalihydroxid, Calciumoxid, Calciumcarbonat oder Magnesium- carbonat oder mit organischen Basen wie Pyridin, Triethylamin, N-Methylmorpholin oder Di-isopropylmethylamin, wobei als inerte Lösungsmittel z.B. Ether, Methylen¬ chlorid, Dioxan, Toluol oder ein Überschuß des tertiären Amins dient. Beim Einsatz anorganischer Säurebinder verwendet man als Reaktionsmedium z.B. Wasser, wäßriges Ethanol oder wäßriges Dioxan.
Beispiele von physiologisch verwendbaren Salzen der Verbindungen der Formel I sind Salze mit physiologisch verträglichen Mineralsäuren, wie Salzsäure, Schwefel¬ säure, schweflige Säure oder Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Methansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Zitronen¬ säure, Fumarsäure, Maleinsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure oder Salicylsäure. Die Verbindungen der Formel I mit freier Carboxygruppe können auch Salze mit physiologisch verträglichen Basen bilden. Beispiele solcher Salze sind Alkali¬ metall-, Erdalkalimetall-, Ammonium- und Alkylammoniumsalze, wie das Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Tetramethylammoniumsalz.
Die Verbindungen der Formel I können solvatisiert, insbesondere hydratisiert sein. Die Hydratisierung kann im Zuge der Herstellung erfolgen oder allmählich als Folge hygroskopischer Eigenschaften einer zunächst wasserfreien Verbindung der Formell auftreten.
Zu reinen Enantiomeren der Verbindungen der Formel I kommt man entweder durch Racematspaltung (über Salzbildung mit optisch aktiven Säuren oder Basen), oder indem man in die Synthese optisch aktive Ausgangsstoffe einsetzt.
Zur Herstellung von Arzneimitteln werden die Substanzen der allgemeinen Formel I mit geeigneten pharmazeutischen Trägersubstanzen, Aroma-, Geschmacks- und Farbstoffen gemischt und beispielsweise als Tabletten oder Dragees ausgeformt oder unter Zugabe entsprechender Hilfsstoffe in Wasser oder Öl, z.B. in Olivenöl, suspendiert oder gelöst.
Die Substanzen der allgemeinen Formel I und ihre Salze können in flüssiger oder fester Form enteral oder parenteral appliziert werden. Als Injektionsmedium kommt vorzugsweise Wasser zur Anwendung, welches die bei Injektionslösungen üblichen Zusätze wie Stabilisierungsmittel, Lösungsvermittler oder Puffer enthält. Derartige Zusätze sind z.B. Tartrat- und Citratpuffer, Komplexbildner (wie Ethylendiamin- tetraessigsäure und deren untoxische Salze) und hochmolekulare Polymere wie flüssiges Polyethyloxid zur Viskositätsregulierung. Feste Trägerstoffe sind z.B. Stärke, Lactose, Mannit, Methyl- cellulose, Talcum, hochdisperse Kieselsäuren, hochmolekulare Fettsäuren (wie Stearinsäure), tierische und pflanzliche Fette und feste hochmolekulare Polymere (wie Polyethylenglykole). Für orale Applikation geeignete Zubereitungen können gewünschtenfalls Geschmacks- und Süßstoffe enthalten. Die Verbindungen werden üblicherweise in Mengen von 10-1500 mg pro Tag bezogen auf 75 kg Körpergewicht appliziert. Bevorzugt ist es, 2-3 mal pro Tag 1-2 Tabletten mit einem Wirkstoffgehalt von 5-500 mg zu verabreichen. Die Tabletten können auch retardiert sein, wodurch nur noch einmal pro Tag 1-2 Tabletten mit 20-700 mg Wirkstoff gegeben werden müssen. Der Wirkstoff kann auch durch Injektion 1-8 mal pro Tag oder durch Dauerinfusion gegeben werden, wobei 50-2000 mg pro Tag normalerweise ausreichen.
Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind außer den in den Beispielen genannten Verbindungen die folgenden:
(R)-2-[4-(Amino-imino-methyl benzolsulfonylaminoj-propansäure- (benzhydrylcarbamoyl-methyl -amid
(R)-2-[4-(Amino-imino-methyl -benzolsulfonylamino]-3-methyl-butansäure- (benzhydrylcarbamoyl-methyl -amid
(R)-2-[4-(Amino-imino-methyl •benzolsulfonylaminoj-hexansäure- (benzhydrylcarbamoyl-methyl -amid
(R)-2-[4-(Amino-imino-methyl -benzolsulfonylamino]-3-methyl-pentansäure- (benzhydrylcarbamoyl-methyl -amid
(R)-2-[4-(Amino-imino-methyl -benzolsulfonylamino]-4-methyl-thio-butansäure- (benzhydrylcarbamoyl-methyl -amid
Beispiel 1
2-r4-(Amino-imino-methyl)-benzolsutfonylamino.essigsäure- (benzhvdrylcarbamoyl-methyl)-amid Acetat
a) Zu 2.2 g (12.5 mmol) N-Boc-Glycin in 40 ml Methylenchlorid gibt man nach¬ einander bei -15 bis -20 °C 1.4ml (12.5 mmol) N-Methylmorpholin und 1.9 ml (14 mmol) Isobutylchlorformiat und rührt 30 min. nach. Dazu tropft man 3 g (12.5 mmol) Glycin-(N-benzydryl)-amid in 25 ml Methylenchlorid. Man rührt 1 h bei -10 °C, extrahiert mit Wasser, trocknet die organische Phase mit Natriumsulfat, filtriert und entfernt das Lösungsmittel i.Vak. Der Rückstand wird mit Ether verrieben und abgesaugt. Man erhält 3.9 g (80%) 2-(tert.-Butyl- oxycarbonylamino)-essigsäure-(benzhydrylcarbamoyl-methyl-)amid. Fp.: 168 - 170 °C. MS: m/e = 397.
b) 3.8 g (10 mmol) dieser Verbindung löst man in 2.3 (30mmol) Trifluoressigsäure, rührt 2 h bei Raumtemperatur und entfernt die Trifluoressigsäure i.Vak.. Den Rückstand löst man in 2 N Natronlauge, extrahiert mit Essigester, trocknet die organische Phase über Natriumsulfat, filtriert und entfernt das Lösungsmittel i.Vak. Man erhält 2.9 g (97%) Glycin-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid als Öl. MS: m/e = 297.
c) Zu 2.5 g (8.4 mmol) dieser Verbindung und 1.3 ml (9.4mmol) Triethylamin in 40 ml Methylenchlorid tropft man unter Eiskühlung bei 10 °C 1.9 g (9.4 mmol) 4-Cyanobenzolsulfonylchlorid in 10 ml Methylenchlorid. Man rührt 1 h bei Raumtemperatur, extrahiert mit Wasser, trocknet die organische Phase mit Natriumsulfat, filtriert und entfernt das Lösungsmittel i.Vak. Den öligen Rück¬ stand verreibt man mit Isopropanoi, saugt die Kristalle ab und kristallisiert aus Essigester um. Man erhält 2 g (51%) 2-(4-Cyano-benzolsulfonylamino)-essig- säure-(benzyhdrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 192 - 193 °C. MS: m/e = 462.
d) In eine Lösung von 1 g dieser Substanz und 1 ml Triethylamin in 10 ml Pyridin leitet man 30 min. lang Schwefelwasserstoff ein. Man entfernt das Lösungs¬ mittel i.Vak, nimmt den Rückstand in Essigester auf, extrahiert mit 1 N Salzsäure und mit Wasser, trocknet die organische Phase mit Natriumsulfat, filtriert und entfernt das Lösungsmittel i.Vak.. Der Rückstand wird mit Ether verrieben. Man erhält 1 g (91%) 2-(4-Aminothiocarbonyl-benzolsulfonylamino)- essigsäure-(benzyhdryicarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 130 - 134 °C.
MS: m/e = 496.
e) Eine Lösung von 0.8 g (1.61 mmol) dieser Verbindung und 0.47 ml (7.16 mmol) lodmethan in 15 ml trockenem Aceton läßt man 20 h unter Lichtausschluß stehen. Man entfernt das Lösungsmittel i.Vak. und erhitzt den Rückstand mit 0.42 g (4.83 mmol) Ammoniumacetat in 15 ml trockenem Methanol 3 h auf
60 °C. Man entfernt das Lösungsmittel i.Vak., nimmt den öligen Rückstand in Aceton auf. Nach kurzer Zeit bilden sich Kristalle, die man absaugt und i.Vak. trocknet. Man erhält die Titelverbindung mit dem Fp. 187 - 190 °C in 46 % Ausbeute. FAB-MS: M+H = 481.
Beispiel 2
2-f4-(Amino-imino-methyl)-benzolsulfonylamino1- propansäure-(benzhvdrylcarbamoyl-methyl)-amid Acetat
Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1 , nur daß in Stufe a) an Stelle von Boc-Glycin Boc-Alanin eingesetzt wird.
Stufe a) 2-(tert.-Butyloxycarbonylamino)-propansäure-(benzhydrylcarbamoyl- methyl-)amid. Fp.: 135 - 137 °C. MS: m/e = 411.
Stufe b) Alanin-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid als Öl. MS: m/e = 311.
Stufe c) 2-(4-Cyano-benzolsulfonylamino)-propansäure-(benzhydrylcarbamoyl- methyl)-amid. Fp.: 195 - 197 °C. MS: m/e = 476.
Stufe d) 2-(4-Aminothiocarbonyl-benzolsulfonylamino)-propansäure-(benz- hydrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 110 - 115 °C. MS: m/e = 510.
Stufe e) Titelverbindung. Fp.: 174 - 177 °C. FAB-MS: M+H = 495.
Beispiel 3
2-fr4-(Amino-imino-methyl)-benzolsutfonylaminol-methyl- carbonylamino}-3-phenyl-propansäure-(benzhvdryl)-amid Acetat
Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1 , nur daß in Stufe a) an Stelle von Glycin-(N-benzhydryl)-amid Phenylaianin-(N-benzhydryl)-amid eingesetzt wird. Stufe a) 2-(tert.-Butyloxycarbonylamino-methylcarbonylamino)-3-ρhenyl- propansäure-(benzhydryl)amid. Fp.: 185 - 188 °C. MS: m/e = 487.
Stufe b) 2-(Aminomethyl-carbonylamino)-3-phenyl-propansäure-(benzhydryl)- amid als Öl. MS: m/e = 387.
Stufe c) 2-(4-Cyano-benzolsulfonylamino-methylcarbonylamino)-3-phenyl- propansäure-(benzhydryl)-amid. Fp.: 172 - 173 °C. MS: m/e = 552.
Stufe d) 2-(4-Aminothiocarbonyl-benzolsulfonylamino-methyl-carbonyl- amino)-propansäure-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 123 - 127 °C. MS: m/e = 586.
Stufe e) Titelverbindung. Fp.: 205 - 208 °C. FAB-MS: M+H = 571.
Beispiel 4
2-r4-(Amino-imino-methyl)-benzolsulfonylamino1- essigsäure-(benzhvdryl)-amid Acetat
Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1 , Stufen c - e.
Stufe a) Man bringt 4-Cyanobenzolsulfonylchlorid mit Glycin-(benzhydryl)-amid zur Reaktion, wie in Beispiel 1.
Stufe c) 2-(4-Cyano-benzolsulfonylamino)-essigsäure-(benzhydryl)-amid. Fp.: 165 - 166 °C. MS: m/e = 405.
Stufe b) 2-(4-Aminothiocarbonyl-benzolsulfonylamino)-essigsäure-(benz- hydryl)-amid. Fp.: 185 - 187 °C. MS: m/e = 439.
Stufe e) Titelverbindung. Fp.: 206 - 209 °C. FAB-MS: M+H = 424. Beispiel 5
2-r4-(Amino-imino-methyl)-benzolsulfonylamino1-3-methyl- butansäure-(benzhvdrylcarbamoyl-methyl)-amid Acetat
Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1 , nur daß in Stufe a) an Stelle von Boc-Glycin Boc-Valin eingesetzt wird.
Stufe a) 2-(tert.-Butyloxycarbonylamino)-3-methyl-butansäure-(benzhydryl- carbamoyl-methyl-)amid. Fp.: 164 - 168 °C. MS: m/e = 439.
Stufe b) Valin-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 121 - 122 °C. MS: m/e = 339.
Stufe c) 2-(4-Cyano-benzolsulfonylamino)-3-methyl-butansäure-(benzhydryl- carbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 197 - 198 °C. MS: m/e = 504.
Stufe d) 2-(4-Aminothiocarbonyl-benzolsulfonyiamino)-3-methyl-butansäure-
(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 109 - 112 °C. MS: m/e = 538.
Stufe e) Titelverbindung. Fp.: 212 - 214 °C.
Beispiel 6
2-r4-(Amino-imino-methyl)-benzolsulfonylamino1- hexansäure-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid Acetat
Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1 , nur daß in Stufe a) an Stelle von Boc-Glycin Boc-Norleucin eingesetzt wird.
Stufe a) 2-(tert.-Butyloxycarbonylamino)-hexansäure-(benzhydrylcarbamoyl- methyl-)amid als Öl. MS: m/e = 453
Stufe b) Norleucin-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid als Öl. MS: m/e = 353. Stufe c) 2-(4-Cyano-benzolsulfonylamino)-hexansäure-(benzhydrylcarbamoyl- methyl)-amid. Fp.: 202 - 205 °C. MS: m/e = 518.
Stufe d) 2-(4-Aminothiocarbonyl-benzolsulfonylamino)-hexansäure-(benz- hydrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 107 - 110 °C. MS: m/e = 552.
Stufe e) Titelverbindung. Fp.: 222 - 224 °C.
Beispiel 7
2-r4-(Amino-imino-methyl)-benzolsulfonylamino1-3-methyl- pentansäure-(benzhvdrylcarbamoyl-methyl)-amid Acetat
Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1 , nur daß in Stufe a) an Stelle von Boc-Glycin Boc-Isoleucin eingesetzt wird.
Stufe a) 2-(tert.-Butyloxycarbonylamino)-3-methyl-pentansäure-(benzhydryl- carbamoyl-methyl-)amid. Fp.: 165 - 169 °C. MS: m/e = 453.
Stufe b) lsoleucin-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid als Öl. MS: m/e = 353.
Stufe c) 2-(4-Cyano-benzolsulfonylamino)-3-methyl-pentansäure-(benzhydryl- carbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 229 - 230 °C. MS: m/e = 518.
Stufe d) 2-(4-Aminothiocarbonyl-benzolsulfonylamino)-3-methylpentansäure- (benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 96 - 99 °C. MS: m/e = 552.
Stufe e) Titelverbindung. Fp.: 214 - 217 °C. Beispiel 8
2-f4-(Amino-imino-methyl)-benzolsulfonylamino1-4-methylthio- butansäure-(benzhvdrylcarbamoyl-methyl)-amid Acetat
Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1 , nur daß in Stufe a) an Stelle von Boc-Glycin Boc-Methionin eingesetzt wird.
Stufe a) 2-(tert.-Butyloxycarbonylamino)-4-methylthiobutansäure-(benz- hydrylcarbamoyl-methyl-)amid als Öl. MS: m/e = 471.
Stufe b) Methionin-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid als Öl. MS: m/e = 371.
Stufe c) 2-(4-Cyano-benzolsulfonylamino)-4-methylthio-butansäure-(benz- hydrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 193- 199 °C. MS: m/e = 536.
Stufe d) 2-(4-Aminothiocarbonyl-benzolsulfonylamino)-4-methylthio-butan- ssääuurree--((bbeennzzhhyydc rylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 175 - 178 °C. MS: m/e = 570.
Stufe e) Titelverbindung. Fp.: 241 - 243 °C. FAB-MS: M+H = 555.
Beispiel 9
(S)-2-f4-(Amino-imino-methyl)-benzolsulfonylamino1-4-methyl- pentansäure-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid Acetat
Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1 , nur daß in Stufe a) n Stelle von Boc-Glycin (L)-Boc-Leucin eingesetzt wird.
Stufe a) (S)-2-(tert.-Butyloxycarbonylamino)-4-methyl-pentansäure- (benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid als Öl. MS: m/e = 453.
Stufe b) (L)-Leucin-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 124 - 125 °C. MS: m/e = 353. Stufe c) (S)-2-(4-Cyano-benzolsulfonylamino)-4-methyl-pentansäure-
(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 190 -192. MS: m/e = 518.
Stufe d) (S)-2-(4-Aminothiocarbonyl-benzolsulfonylamino)-4-methylpentan- säure-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 222 - 224 C. MS: m/e = 552.
Stufe e) Titelverbindung. Fp.: 200 - 201 °C. MS: pos. LSIMS 536.
Beispiel 10
(R,-2-f4-(Amino-imino-methyl)-benzolsulfonylaminol-4-methyl- pentansäure-(benzhvdrylcarbamoyl-methyl)-amid Acetat
Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1 , nur daß in Stufe a) an Stelle von Boc-Glycin (D)-Boc-Leucin eingesetzt wird.
Stufe a) (R)-2-(tert.-Butyloxycarbonylamino)-4-methyl-pentansäure- (benzhydrylcarbamoyl-methyl-)amid als Öl. MS: m/e = 453.
Stufe b) (D)-Leucin-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 123 - 124 °C. MS: m/e = 353.
Stufe c) (R)-2-(4-Cyano-benzoisulfonylamino)-4-methyl-pentansäure-
(benzhydrylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 192 -193. MS: m/e = 518.
Stufe d) (R)-2-(4-Aminothiocarbonyl-benzolsulfonylamino)-4-methyl-pentan- säure-(benzhydrylcarbamoyl-methyl)- amid. Fp.: 227 °C. MS: m/e = 552.
Stufe e) Titelverbindung. Fp.: 193 - 194 °C. MS: pos. LSIMS 536. Beispiel 11
(S,-2-f4-(Amino-imino-methyl)-benzolsulfonylamino.-4- methyl-pentansäure-(benzylcarbamoyl-methyl)-amid Acetat
Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1 , nur daß in Stufe a) an Stelle von Boc-Glycin (L)-Boc-Leucin und an Stelle von Glycin-(N-benhydryl)-amid Glycin-benzylamid eingesetzt wird.
Stufe a) (S)-2-(tert.-Butyloxycarbonylamino)-4-methyl-pentansäure- (benzylcarbamoyl-methyl)-amid als Öl. MS: m/e = 378.
Stufe b) (L)-Leucin-(benzylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 86 - 87 °C. MS: m/e = 277.
Stufe c) (S)-2-(4-Cyano-benzoisulfonylamino)-4-methyl-pentansäure-
(benzylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 153 - 154 °C. MS: m/e = 442.
Stufe d) (S)-2-(4-Aminothiocarbonyl-benzolsulfonylamino)-4-methyl-pentan- säure-(benzylcarbamoyl-methyl)-amid. Fp.: 225 - 230 °C. MS: m/e = 476.
Stufe e) Titelverbindung. Fp.: 205 - 206 °C. MS: pos. LSIMS 536.
Beispiel 12
(2-f2-r4-(Amino-imino-methyl)-benzolsulfonylamino1-4-methyl- pentanoylamino)-acetylamino)-phenylessigsäure-ethylester
a) Zu 20 g Cbz-(L)-Leucin in 200 ml trockenem Dichlormethan gibt man bei
-20 °C 8.3 ml N-Methylmorpholin und 10.3 ml Chlorameisensäure-isobutyiester und rührt 30 min bei dieser Temperatur. Dazu tropft man bei dieser Temperatur eine Suspension von 10.5 g Glycin-Ethylester-Hydrochlorid in 100 ml trocke¬ nem Dichlormethan. Dann tropfte man 10.5ml Triethylamin dazu, läßt auf Raumtemperatur kommen, extrahiert mit 2 N Salzsäure, 5% Sodalösung und Wasser, trocknet die organische Lösung über Natriumsulfat, filtriert und ent¬ fernt das Lösungsmittel i.Vak.. Man erhält 30.4 g 2-(Benzyioxycarbonylamino)- 4-methylpentanoyl-(ethoxycarbonylmethyl)-amid als Öl. MS: m/e = 350.
b) 1 g dieser Verbindung in 3.1 ml 1 N Natronlauge rührt man 20 h bei Raum¬ temperatur, gibt Wasser dazu, extrahiert mit Essigester, säuert die wässrige Phase mit konz. Salzsäure an, extrahiert mit Essigester, trocknet die organi¬ schen Lösungen über Natriumsulfat, filtriert und entfernt das Lösungsmittel i.Vak.. Man erhält 0.6 g 2-(Benzyloxycarbonylamino)-4-methylpentanoyl- (carboxymethyl)-amid als Öl. MS: m/e = 322.
c) 1.1 g dieser Verbindung suspendiert man in 10 ml trockenem Dichlormethan und tropft nacheinander bei -20 °C 0.37 ml N-Methylmorpholin und 0.47 ml Chlorameisensäureisobutylester zu. Man rührt 30 min bei dieser Temperatur und gibt dann eine Suspension von 0.7 g Phenylglycin-ethylester-Hydrochlorid in 10 ml trockenem Dichlormethan und anschließend 0.47 ml Triethylamin zu. Man läßt 20 h bei Raumtemperatur stehen, extrhiert mit 2 N Salzsäure, 5% Sodalösung und Wasser. Man trocknet die organische Lösung über Natrium¬ sulfat, filtriert und entfernt das Lösungsmittel i.Vak.. Man erhält 1.3 g 2-(Benzyloxycarbonyiamino)-4-methylpentanoyl-(1-ethoxy-carbonyl-phenyl- methyl)-amid als Öl. MS: m/e = 484.
d) 1.3 g dieser Verbindung in 15 ml Ethanol hydriert man bei Raumtemperatur und Normaldruck in Gegenwart von 0.3 g 10% Pd auf Kohle. Man filtriert, und reinigt säulenchromatographisch (50 g Kieselgel, Essigester/Methanol = 90 : 10). Man entfernt das Lösungsmittel aus den entsprechenden Fraktionen und erhält 0.3 g 2-[2-(2-Amino-4-methyl-pentanoylamino)acetylamino]-phenyl- essigsäure-ethylester als Öl. MS: m/e = 349.
e) Diese Verbindung setzt man mit 4-Cyanobenzolsulfonylchlorid um, wie in Beispiel 1 , Stufe c) beschrieben. Man erhält (2-{2-[4-Cyano-benzolsulfonyl- amino]-4-methyl-pentanoylamino}-acetylamino)-phenylessigsäure-ethylester. Fp.: 111 - 115 °C. MS: m/e = 514. f) Daraus erhielt man analog Beispiel 1 , Stufe d) (2-{2-[4-(Aminothiocarbonyl)- benzolsulfonylamino]-4-methyl-pentanoylamino}-acetylamino)-phenylessig- säure-ethylester. Fp.: 158 - 161 °C. MS: m/e = 548.
g) Daraus erhält man analog Beispiel 1 , Stufe e) die Titelverbindung als amorphe Masse. MS: M+H+= 532.
Beispiel 13
(2-(2-f4-(Amino-imino-methyl)-benzolsulfonylamino1-4- methyl-pentanoylamino)-acetylamino)-phenylessiqsäure
0.2 g der Verbindung aus Beispiel 12 und 0.4 g Kaliumhydroxid rührt man in 10 ml Ethanol 2 h bei 60 °C. Man säuert mitverdünnter Salzsäure an, filtriert und engt das Filtrat zur Trockene ein. Den Rückstand digeriert man mit Aceton, filtriert und erhält 42 mg (22%) der Titelverbindung als amorphe Masse. MS: M + H+ = 504.
Beispiel 14
Pharmakoloqischer Versuchsbericht
Thrombinzeit
Ein in der klinischen Gerinnungsdiagnostik gebräuchlicher Test ist die Thrombinzeit. Dieser Parameter erfaßt die Thrombinwirkung auf Fibrinogen und die Gerinnselbildung. Inhibitoren von Thrombin bewirken eine Verlängerung der Thrombinzeit.
Zur Plasmagewiiuiung wurden 9 Teile frisches Blut gesunder Spender mit einem Teil Natrium- citratlösung (0.11 Mol/1) gemischt und bei ca. 3000 U/min 10 Min. bei Raumtemperatur zen- trifugiert. Das Plasma wurde abpipettiert und kann bei Raumtemperatur ca. 8 h aufbewahrt werden.
200 μl Citratplasma wurden in einem Kugelkoagulometer (KC10 der Firma Amelung) 2 Min. bei 37 °C inkubiert. Zu 190 μl vortemperiertem Thrombin-Reagenz (Boehringer Mannheim GmbH; enthält ca. 3 U/ml Pferdethrombin und 0.0125 M Ca"^) gab man 10 μl Dimethylsul- foxid (DMSO) oder eine Lösung der Wirksubstanz in DMSO. Mit Zugabe dieser 200 μl Lö¬ sung zum Plasma wurde eine Stoppuhr gestartet und der Zeitpunkt bis zum Eintritt der Gerin¬ nung bestimmt. Die Thrombinzeit betrug bei den Kontrollmessungen ca. 24 Sek. und wurde durch die Wirksubstanzen deutlich verlängert.
In der folgenden Tabelle sind die gemessenen Thrombinzeiten in Sekunden als Differenz zur Kontrolle angegeben. Die Konzentrationen der Wirksubstanzen betrugen im Endvolumen 250 μM (TT250) und 25 μM (TT25).
TTirombin-hihibierung
Die kinetischen Messungen wurden in 0.1 M Phosphatpuffer, der 0.2 M Kochsalz und 0.5 % Polyethylenglycol 6000 enthielt, bei einem pH = 7.5 und 25 C mit dem Substrat H-(D)-Phe- Pro-Arg-pNA (S-2238 Kabi) und humanem α- Thrombin (Sigma, spezifische Aktivität = 2150 NIH-units/mg) in Polyst-yrol-Halbmikroküvetten in einem Gesamtvolumen von 1 ml durchgeführt.
In einem Vorversuch wurde mit jeder Wirksubstanz bestimmt, ob sie Thrombin schnell oder langsam inhibiert. Dazu wurde die Reaktion einmal durch Zugabe von 0.03 NIH-units Throm¬ bin zu einer 100 μM-Lösung des Substrats und des Wirkstoffe gestartet. In einem zweiten Versuch wurde Substrat zu einer 5 Min. inkubierten Lösung des Thrombins und des Wirk¬ stoffs gegeben. Die Zunahme der Konzentration von p-Nitroanilin mit der Zeit wurde spektro¬ skopisch (UV-VIS-Spektrophotometer Lambda-2 der Firma Perkin-Elmer) bei 405 um 12 Min. verfolgt. Da die bei beiden Versuchen erhaltenen Messkurven linear und parallel waren, handelt es sich bei den Wirkstoffen der folgenden Tabelle um schnelle Thrombin- Inhibitoren. Die Inhibitionskonstanten K[ wurden dann wie folgt bestimmt. Das Substrat wurde in den Konzentrationen 100 μM, 50 μM, 30 μM, 20 μM eingesetzt und bei jeder Substratkonzen- tration eine Messung ohne Inhibitor und drei Messungen in Gegenwart unterschiedlicher Kon¬ zentrationen der in der folgenden Tabelle aufgeführten Inhibitoren durchgeführt. Die Reaktio¬ nen wurden durch Zugabe von Thrombin gestartet. Die Zunahme der Extinktion bei 405 n durch das entstehende p-Nitroanilin über einen Zeitraum von 12 Min. verfolgt. Im Abstand von 20 Sek. wurden Meßpunkte (Zeit vs. Extinktion) auf einen PC übertragen. Aus den Daten wurden die Geschwindigkeiten V0 (Extinktionsänderung pro Sek.; Messungen ohne Inhibitor) und Vj (Messungen mit Inhibitor) durch lineare Regression bestimmt. Benutzt wurde nur der Teil jeder Messung, bei dem sich die Substratkonzentration um weniger als 15 % vermindert hatte. Aus einer Meßreihe (konstante Inhibitorkonzentration, variable Substratkonzentratio¬ nen) bestimmte man Km Λ und VQ^X durch nichtlinearen Fit auf die Gleichung
Vmax * [S]
V =
[S] + κm
Aus den gesamten Meßreihen berechnete man schließlich Kj durch nichtlinearen Fit auf die Gleichung
Vmax * [S]
V =
Km * (l + [S]/Kj) + [S]
Die Michaeliskonstante Km betrug in allen Messungen 3.8 ± 2 μM. Die Inhibitionskonstanten Kj der Wirksubstanzen sind in der folgenden Tabelle in der Einheit μM angegeben.
Inhibierung von Trypsin und Plasmin
10 mg Bovines pancreatisches Trypsin (Sigma) wurden in 100 ml 1 mM Salzsäure gelöst und im Kühlschrank aufbewahrt. 20 μl davon wurden mit 980 μl 1 mM Salzsäure versetzt. 25 μl davon wurde für jede Messung verwendet. Die Messung wurde wie für Thrombin beschrieben durchgeführt. Km = 45 μM.
Die Messungen mit humanem Plasmin (Sigma, 10 Units) wurden mit dem Substrat S-2251 (H- (D)-Val-Leu-Lys-pNA, Kabi) wie für Thrombin beschrieben durchgeführt. Pro Messung wur¬ den 0.01 Units Plasmin verwendet. Km = 250 μM.
Bsp. Nr. Ki Trypsin Ki Thrombin Ki Plasmin TT 250 TT 25
3 2.00 7.00 31.00 45.00 8.00
5 2.00 23.00 220.00 64.00 15.00
6 3.00 11.00 180.00 75.00 18.00
7 2.00 7.00 120.00 123.00 31.00
8 9.00 12.00 280.00 40.00
9 3.10 7.90 115.00 155.0 32.00
11 12.60 21.00 26.00
12 8.70 25.70 51.00 11.00

Claims

Patentansprüche
1. 4-Amidinophenylsulfonamide der Formel I
- A-B-NH-CHR1R2 ( ,
Figure imgf000023_0001
in der
A eine α-Aminosäure bedeutet,
B eine Bindung oder eine α-Aminosäure bedeutet,
R--I , R2 gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatom, Phenyl-, Carboxyl oder C^Cg-Alkyloxycarbonyl bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze, Hydrate, Solvate und optische Isomeren.
Verfahren zur Herstellung von 4-Amidinophenylsulfonamiden der Formel I
Figure imgf000023_0002
in der A eine α-Aminosäure bedeutet,
B eine Bindung oder eine α-Aminosäure bedeutet,
R.-, , R2 gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatom, Phenyl-, Carboxyl oder C-,-Cg-Alkyloxycarbonyl bedeuten,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze, Hydrate, Solvate und optische Isomeren, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise eine Verbindung der Formelll
NC -Q-ϊ. A-B-NH-CHR.R (II),
1 ^2
in der A, B, R-, und R2 die oben angegebenen Bedeutungen haben, entweder
a) mit H2S in einem basischen Lösungsmittel in Gegenwart einer Base zu den Thioamiden der Formel III
Figure imgf000024_0001
umsetzt, die erhaltene Verbindung mit einem Alkylhalogenid zu einer Verbindung der Formel V
Figure imgf000025_0001
I-
umsetzt und diese Verbindung mit alkoholischer Ammoniumacetat-Lösung reagieren läßt oder
b) mit Ethanol in Gegenwart von HCI zu den
Imidsäureesterhalogeniden der Formel IV
Figure imgf000025_0002
Cl-
umsetzt, und die erhaltene Verbindung mit alkoholischer Ammoniaklösung reagieren läßt
und anschließend die erhaltenen Verbindungen gewünschtenfalls in ihre physiologisch verträglichen Salze, Hydrate, Solvate oder optische Isomeren überführt.
3. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß Anspruch 1 neben üblichen Träger- und Hilfsstoffen.
4. Verwendung von Verbindungen gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behanldung von thromboembolischen Erkrankungen.
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