CN102225903A

CN102225903A - 脒基胍基取代芳杂环类化合物的合成方法及其用途

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Publication number: CN102225903A
Application number: CN2011101005174A
Authority: CN
Inventors: 田伏洲; 任建东; 何菱; 余蓉; 骆助林; 王瑞丰
Original assignee: Individual
Current assignee: Ren Jiandong; Tian Fuzhou
Priority date: 2011-04-21
Filing date: 2011-04-21
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2031-04-21
Also published as: CN102225903B

Abstract

一种脒基、胍基取代的芳杂环类化合物，其结构如通式(I)所示，其中R₁、R₂可表示相同或不同的基团，可以在芳杂环的任意位置发生取代，可以表示为：-O-R₃、-S-R₃、-COOR₃、-COR₃、-O-COR₃、-NH-COR₃、

其中m表示0、1、2等自然数；R3表示氢原子、直链或支链的烷基基团、取代和非取代的芳环、芳杂环；R₄、R₅表示氢原子、直链或支链的烷基基团、芳环、芳杂环。A环可表示脂肪环、芳环、芳杂环、稠杂环。X、Y表示：碳、氮、氧、硫等元素且可以在环上任意位置；B表不：-COO-、-CONH-、-COS-、-CSO-、-CSNH-、-CSS-、-OCO-、-NHCO-、-SCO-、-OCS-、-NHCS-、-SCS-等基团；n表示0、1、2等自然数。本发明化合物的性质稳定，通过酶活性实验考察证明能显著抑制胰蛋白酶活性，可用于制备治疗急性、慢性胰腺炎药物。

Description

脒基胍基取代芳杂环类化合物的合成方法及其用途

[技术领域]

本发明涉及医药技术领域，是一类具有抑制人类胰蛋白酶活性的脒基胍基取代芳杂环类化合物，及该类化合物的用途。

[背景技术]

急性胰腺炎(AP)为腹部外科常见病，近年来重型胰腺炎发病率逐渐增多。由于它对生理扰乱大，而且对各重要脏器损害明显，故死亡率很高。有时可引起骤然死亡。重型胰腺炎死亡率为20％，有并发症者可高达50％。AP的病因复杂，而发病机制至今仍未完全阐明，临床上尚缺乏特异性治疗药物。急性胰腺炎的治疗是现代胃肠病学面临的最大的挑战之一。急性胰腺炎治疗药物的设计与研发成为医药工作者的重中之重。

众多学者对AP进行了大量基础和临床研究，但因其病因复杂，发病机制至今仍未完全阐明。早在1901年，德国学者Opie提出急性胰腺炎是胰腺因胰蛋白酶的自身消化作用而引起的疾病，该理论至今仍然得到人们的普遍认可。胰蛋白酶原不适当的活化成胰蛋白酶分解蛋白质，会直接导致胰腺自身消化；此外，胰蛋白酶又能激活胰弹性蛋白酶，间接导致胰腺自身消化。治疗急性胰腺炎的关键在于控制胰蛋白酶的活性，因此，胰蛋白酶成为药物设计中最吸引人的一个靶标，研究其抑制剂也就具有相当重要的意义。

目前胰蛋白酶抑制剂主要分为肽类抑制剂与非肽类抑制剂两大类。肽类抑制剂价格昂贵，需要在低温避光条件下储存。非肽类化学合成抑制剂价格便宜，可在室温储存，能自由进入血管及胰腺组织，直接作用于胰腺细胞上，且不受肽类抑制剂不能口服的限制，更适合研发为胰腺炎治疗药物。研究表明，苯甲脒类化合物对胰蛋白酶有抑制活性，而四胍基苯甲酸酯类化合物对胰蛋白酶的抑制活性高，尤其受到人们的青睐，先后对其进行一系列的合成和构效关系研究，目前已开发出获准上市的药物——加贝酯、萘莫司他、卡莫司他及司匹司他用于急慢性胰腺炎的治疗。这些药物的成功上市和临床表现证明以胰蛋白酶为靶点进行急性胰腺炎药物的研发是最有可能获得突破性进展的新药研究领域，具有十分广阔的前景。

本专利通过合成一系列脒基胍基取代的芳杂环类新结构化合物，并对其进行了胰蛋白酶抑制活性筛选，证明该类脒基胍基取代的芳杂环类化合物具有胰蛋白酶抑制活性。

[发明内容]

从以上所述内容可以看出，本发明目的在于合成包括脒基、胍基取代的芳环、芳杂环类化合物及其相应的一系列盐类，并通过逐步的实验筛选提供具有良好的人类胰蛋白酶抑制活性的药物，可将其应用于急慢性胰腺炎以及其他疾病的治疗。

本发明提供了一种脒基、胍基取代的芳杂环类化合物，其结构如通式(I)所示

其中R₁、R₂可表示相同或不同的基团，可以在芳杂环的任意位置发生取代，可以表示为：-O-R₃、-S-R₃、-COOR₃、-COR₃、-O-COR₃、-NH-COR₃、

其中m表示0、1、2等自然数；R₃表示氢原子、直链或支链的烷基基团、取代和非取代的芳环、芳杂环；R₄、R₅表示氢原子、直链或支链的烷基基团、芳环、芳杂环。A环可表示脂肪环、芳环、芳杂环、稠杂环。X、Y表示：碳、氮、氧、硫等元素且可以在环上任意位置；B表示：-COO-、-CONH-、-COS-、-CSO-、-CSNH-、-CSS-、-OCO-、-NHCO-、-SCO-、-OCS-、-NHCS-、-SCS-等基团；n表示0、1、2等自然数。

进一步的，当R₂为脒基或胍基时，R₁可以表示：-O-R₃、-S-R₃、-COOR₃、-COR₃、-O-COR₃、-NH-COR₃、

等一系列取代基，其中m表示0、1、2等自然数；R₃表示氢原子、直链或支链的烷基基团、取代和非取代的芳环、芳杂环；R₄、R₅表示氢原子、直链或支链的烷基基团、芳环、芳杂环。A环可表示脂肪环、芳环、芳杂环、稠杂环。X、Y表示：碳、氮、氧、硫等元素且可以在环上任意位置；B表示：-COO-、-CONH-、-COS-、-CSO-、-CSNH-、-CSS-、-OCO-、-NHCO-、-SCO-、-OCS-、-NHCS-、-SCS-等基团；n表示0、1、2等自然数。结构如(II)所示。

R₁＝-O-R₃、-S-R₃、-COOR₃、-COR₃、-O-COR₃、-NH-COR₃、

更进一步的，当R₁为脒基或胍基时，R₂也可以表示：-O-R₃、-S-R₃、-COOR₃、-COR₃、-O-COR₃、-NH-COR₃、等一系列取代基，其中m表示0、1、2等自然数；R₃表示氢原子、直链或支链的烷基基团、取代和非取代的芳环、芳杂环；R₄、R₅表示氢原子、直链或支链的烷基基团、芳环、芳杂环。A环可表示脂肪环、芳环、芳杂环、稠杂环。X、Y表示：碳、氮、氧、硫等元素且可以在环上任意位置；B表示：-COO-、-CONH-、-COS-、-CSO-、-CSNH-、-CSS-、-OCO-、-NHCO-、-SCO-、-OCS-、-NHCS-、-SCS-等基团；n表示0、1、2等自然数。结构如式(III)所示。

R₂＝-O-R₃、-S-R₃、-COOR₃、-COR₃、-O-COR₃、-NH-COR₃、

通过初步的胰蛋白酶抑制活性实验筛选，我们发现在上述通式(I)的化合物中，R₁为N-(4-硝基苄基)氨基，当R₂为脒基，A为苯环，B为-COO-，X、Y为碳原子，具有更好的胰蛋白酶抑制活性。如式(III)所示，本专利以其作为一个具体实例的化合物。

对于上述通式(I)的合成，可采用以二环己基脲(DCC)为缩合剂，4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂的方法，此外，以酰氯法进行缩合对部分化合物的合成也具有较好的效果。

对上述式(I)所示用于抑制胰蛋白酶活性的化合物的合成路线如下式：

具体操作过程如下：

1、将对硝基苯甲醛、对氨基苯甲酸与NAY沸石研磨均匀，在无溶剂条件下，微波照射10分钟，生成(E)-4-(4-硝基苄亚氨基)苯甲酸。

2、将(E)-4-(4-硝基苄亚氨基)苯甲酸溶于无水甲醇中，0℃条件下，小心加入硼氢化钠，室温反应2小时，生成(E)-4-(4-硝基苄氨基)苯甲酸。

3、a).冰浴条件下，向甲醇中通入干燥HCl气体，使之饱和后，加入6-氰基-2-萘酚，生成methyl 6-hydroxy-2-naphthimidate，减压蒸出甲醇。

b).补加甲醇，在50℃的条件下，向methyl 6-hydroxy-2-naphthimidate的甲醇溶液中通入干燥氨气，生成6-羟基-2-萘甲脒。

c).6-羟基-2-萘甲脒在甲醇溶液中与甲磺酸作用，生成6-羟基-2-萘甲脒甲磺酸盐。

4、将(E)-4-(4-硝基苄氨基)苯甲酸与6-羟基-2-萘甲脒甲磺酸盐溶于无水吡啶中，加入DCC、DMAP，室温搅拌过夜，即得到相应的式(III)结构产物。

以下通过具体实施方式的实例再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。

[附图说明]

图1.存活小鼠数量累积曲线图

图2.小鼠血清淀粉酶水平(*p＜0.05，各组与模型组比较)

图3.光学显微镜下大鼠胰腺组织病理切片图(200倍，其中A：对照组；B：模型组；C：化合物III治疗组；D：萘莫司他治疗组)

[具体实施方式]

实施例1：脒基取代芳杂环类化合物的合成

(1)将对硝基苯甲醛、对氨基苯甲酸与NAY沸石研磨均匀，在无溶剂条件下，微波照射10分钟后冷却至室温，加入甲醇溶解，过滤除去NAY沸石，滤液减压浓缩，得到(E)-4-(4-硝基苄亚氨基)苯甲酸。

(2)将(E)-4-(4-硝基苄亚氨基)苯甲酸溶于无水甲醇中，0℃条件下，小心加入硼氢化钠，室温反应2小时，向反应液中加水，甲酸调PH＝6，用二氯甲烷/甲醇提取，聚酰胺或硅胶等方法进行分离纯化，得到4-(4-硝基苄氨基)苯甲酸。

(3)a.冰浴条件下，向甲醇中通入干燥HCl气体并使之饱和后，加入6-氰基-2-萘酚，室温反应过夜，生成methyl 6-hydroxy-2-naphthimidate，减压蒸出甲醇。

b.补加甲醇，在50℃的条件下，向methyl 6-hydroxy-2-naphthimidate的甲醇溶液中通入干燥氨气3小时，减压浓缩，剩余物中加入饱和碳酸氢钠溶液，析出固体，过滤后，水洗滤饼，干燥后得到6-羟基-2-萘甲脒。

c.将6-羟基-2-萘甲脒悬浮于甲醇溶液中，冰浴滴加甲磺酸，室温反应0.5小时，加入乙醚，析出固体，过滤后，用乙醚洗涤滤饼，无水乙醇重结晶，得到6-羟基-2-萘甲脒甲磺酸盐。

(4)将4-(4-硝基苄氨基)苯甲酸与6-羟基-2-萘甲脒甲磺酸盐溶于无水吡啶中，加入DCC、DMAP，室温搅拌过夜，减压蒸馏除去吡啶后，用硅胶柱层析进行分离纯化，即得到相应的式(III)结构产物。

实施例2：BApNA(N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐)法测定化合物(III)对胰蛋白酶的抑制活性

实验方法：

取96孔板，在每孔中依次加入50μl不同浓度的化合物(III)水溶液(0.061、0.122、0.245、0.489、0.977、1.953、3.906、7.813μg/ml)、50μl人胰蛋白酶溶液(0.1mg/ml)以及100μl BApNA溶液(用pH 7.4，0.05M的Tris-HCl缓冲液配制成0.5mg/ml的溶液)，在另外3个孔中用50μl去离子水代替化合物(III)，其余试剂的加入与上面相同，作为无抑制对照，将96孔板于37℃下孵育10min后加入冰乙酸20μl终止反应，立刻使用酶标仪测定405nm处的吸收度值。根据吸收度值计算化合物(III)在不同浓度下对胰蛋白酶的抑制率，计算公式如下：

其中：A_I值为加入了化合物(III)的孔中测得的吸收度值；

A₀值为无抑制对照孔测得的吸收度值

将测得的化合物(III)的浓度与其相对应的抑制率值代入计算软件，求得化合物(III)对胰蛋白酶的半数抑制浓度(IC₅₀)值。

实验结果：

不同浓度下的化合物(III)对胰蛋白酶的抑制率：

浓度(μg/ml)	抑制率(％)
		0.061	12.45
0.122	21.69
		0.245	38.15
0.489	69.08
		0.977	94.78
1.953	97.99
		3.906	98.8
7.813	99.6

经计算求得其胰蛋白酶IC₅₀值为0.309μg/ml

实施例3：化合物(III)对急性胰腺炎小鼠的保护作用

实验方法：

(1)生存率考察：

取KM小鼠40只，随机分为4组(n＝10)：对照组、急性胰腺炎模型组、急性胰腺炎模型+化合物(III)给药组、急性胰腺炎模型+萘莫司他给药组，其中模型组制备方法为：每小时1次，连续2次给小鼠腹腔注射L-精氨酸(每次剂量为4g/kg)诱导急性胰腺炎；对照组仅注射生理盐水；急性胰腺炎模型+化合物(III)给药组、急性胰腺炎模型+萘莫司他给药组中，化合物(III)和萘莫司他均在最后一次L-精氨酸注射后1h腹腔注射给药，剂量均为10mg/kg。各组给药后观察72h内的存活情况。

(2)酶活性检测和组织病理学观察

另取KM小鼠24只，随机分为4组(n＝6)：分组及处理同上，在造模后24h颈脱臼处死小鼠，从股动脉取血，分离血清后使用全自动生化仪测定血清中淀粉酶活性；开腹另取胰腺组织，用4％多聚甲醛固定，常规酒精脱水，石蜡包埋后切成6μm的薄片，HE染色。制备好的HE染色病理切片在光学显微镜下观察病理改变。

实验结果：

(1)生存率

造模后72h，对照组小鼠全部存活；模型组小鼠存活率为20％(2/10)；化合物(III)治疗组小鼠存活率为50％(5/10)；萘莫司他治疗组小鼠存活率为40％(4/10)，结果表明，化合物(III)腹腔给药对急性胰腺炎小鼠有明显的保护作用，其活性略优于对照药萘莫司他(见图1)。

(2)酶活性检测和组织病理学观察

A.酶活性：模型组小鼠血清淀粉酶水平显著高于对照组，但化合物(III)和萘莫司他腹腔给药后，小鼠血清淀粉酶水平显著降低(见图2)。

B.组织病理学观察：对照组胰腺组织结构完整致密，腺泡小叶完整，无间质水肿和炎性细胞浸润，无间质充血、出血和坏死(图3A)；模型组胰腺可见腺泡萎缩、闰管部分消失、间质水肿、红细胞渗出、炎性细胞浸润、腺泡细胞退变坏死等病理改变(图3B)；化合物(III)治疗组和萘莫司他治疗组可见胰腺以上病变程度明显减轻(图3C、3D)。

Claims

1.一种脒基、胍基取代的芳杂环类化合物，其结构如通式(I)所示。

2.当R₂为脒基或胍基时，R₁可以表示：-O-R₃、-S-R₃、-COOR₃、-COR₃、-O-COR₃、-NH-COR₃、等一系列取代基，其中m表示0、1、2等自然数；R₃表示氢原子、直链或支链的烷基基团、取代和非取代的芳环、芳杂环；R₄、R₅表示氢原子、直链或支链的烷基基团、芳环、芳杂环。A环可表示脂肪环、芳环、芳杂环、稠杂环。X、Y表示：碳、氮、氧、硫等元素且可以在环上任意位置；B表示：-COO-、-CONH-、-COS-、-CSO-、-CSNH-、-CSS-、-OCO-、-NHCO-、-SCO-、-OCS-、-NHCS-、-SCS-等基团；n表示0、1、2等自然数。结构如(II)所示。

R₁＝-O-R₃、-S-R₃、-COOR₃、-COR₃、-O-COR₃、-NH-COR₃、

3.当R₁为脒基或胍基时，R₂也可以表示：-O-R₃、-S-R₃、-COOR₃、-COR₃、-O-COR₃、-NH-COR₃、

等一系列取代基，其中m表示0、1、2等自然数；R₃表示氢原子、直链或支链的烷基基团、取代和非取代的芳环、芳杂环；R₄、R₅表示氢原子、直链或支链的烷基基团、芳环、芳杂环。A环可表示脂肪环、芳环、芳杂环、稠杂环。X、Y表示：碳、氮、氧、硫等元素且可以在环上任意位置；B表示：-COO-、-CONH-、-COS-、-CSO-、-CSNH-、-CSS-、-OCO-、-NHCO-、-SCO-、-OCS-、-NHCS-、-SCS-等基团；n表示0、1、2等自然数。结构如式(III)所示。

R₂＝-O-R₃、-S-R₃、-COOR₃、-COR₃、-O-COR₃、-NH-COR₃、

4.如权利要求1所述脒基、胍基取代的芳杂环类化合物均可制成盐酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐等一系列盐类用于改善其活性。

5.权利要求1所述脒基、胍基取代的芳杂环类化合物用于制备治疗急、慢性胰腺炎药物。