CN110951919A - 一种用于检测的寡核苷酸、试剂盒以及使用其的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，具体的，涉及一种用于实时荧光定量PCR的寡核苷酸，所述寡核苷酸自5’至3’包含：第一区域，具有1‑25个碱基；第二区域，具有0‑15个碱基；第三区域，在退火时与相应模板上的结合区反向互补；荧光基团；和淬灭基团。使用本发明的组合物，杂交效率高、探针锚定序列短以及对较不保守的靶序列或短片段序列的检测效果良好。

Description

一种用于检测的寡核苷酸、试剂盒以及使用其的检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体地，涉及一种寡核苷酸、试剂盒以及使用其的检测方法。

背景技术

实时荧光定量PCR(RealTime-PCR)技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用检测每个循环荧光信号积累实时监测整个PCR进程。由于荧光染料法特异性较差，目前广泛应用的检测系统为Taqman探针体系。

Taqman探针体系除PCR扩增所需的上游引物和下游引物外，还需要设计一条特异性的Taqman探针。Taqman探针是由报告基团、淬灭基团和模板特异性匹配的DNA序列组成。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR退火延伸时，Taqman探针将特异性结合到模板上，让具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光信号形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。因此，该体系中的检测信号是基于Taqman探针与模板杂交后被水解而产生，受到体系中分子间杂交效率的影响，进而影响信号产生的稳定性和特异性。

对此，已提出一些将探针和引物链接在一起的结构，以提高杂交效率。例如DavidWhitcombe等(“Detection of PCR products using self-probing amplicons andfluorescence”)公开了通过碳链将引物和探针连接的结构。通过这样的结构，将探针的杂交和信号释放转化为单分子事件，从而在热力学、动力学、试验设计、探针稳定性以及试验的便捷性等方面得到了改善。

但是这样的结构仍然存在一定的不足：1)该结构必须使用碳链连接探针部分与引物部分，使DNA合成不能延伸至探针部分，否则新合成的双链对探针部分等同于形成双链杂交，会产生非特异性的荧光信号，失去探针的杂交特异性；2)该结构需要通过碳链将探针与引物连接，且需要在探针两端设计额外的茎环结构，其相比普通探针有较高的合成难度与合成成本；3)该信号由5’末端探针与模板中部序列杂交产生，虽然从分子间杂交转变为分子内杂交，但杂交的探针部分与其互补序列部分间隔至少25个nt(茎环结构设计部分、Blocker碳链、原引物部分、原引物和互补序列区域的间隔部分)。在分子杂交的热力学和分子动力学上还有进一步优化空间，以进一步提高杂交效率。

另一方面，无论是常规Taqman探针或David Whitcombe的连接设计，仍需要根据模板序列分别设计三段核酸序列作为引物和探针。为了保证检出的效率和对不同检测个体之间检测的一致性，引物和探针需设计在特异性靶基因的保守序列区段上。保守序列区段指该段序列在所检测靶标(如特定的属、种或特定群体)中完全一致，且不存在于其他非检测靶标中。但是，由于生物多态性的存在，尤其是对于细菌和病毒等基因组较小且突变频率较高的物种，种属内保守序列区段较少。而为保证PCR扩增效率，引物和探针还需要符合一定的设计规范(如长度，Tm值，特异性，无发卡结构等)，同时引物和探针的保守序列区段相对集中(一般荧光定量PCR产物建议控制在150bp以内)。所以，Taqman探针法在检测许多高频突变的病毒等靶标上存在难以设计的瓶颈，在实际应用中，往往需要牺牲一定的保守性以实现检测。

因此，存在对更低成本，更高杂交效率和特异性的探针结构设计的需求。同时，Taqman探针法在检测许多高频突变靶标的局限性也亟待突破，以降低实验设计的难度。

发明内容

有鉴于此，本发明的第一方面提供一种用于实时荧光定量PCR的寡核苷酸，所述寡核苷酸自5’至3’包含：第一区域，具有1-25个碱基；第二区域，具有0-15个碱基；第三区域，在退火时与相应模板上的结合区反向互补；荧光基团；和淬灭基团；

其中，所述第一区域的碱基序列与所述结合区的上游碱基序列一致，所述第二区域的碱基序列与所述结合区的5’末端序列一致。

第三区域即为引物区，按照常规引物设计要求进行设计，与相应模板上的结合区反向互补。第一区域的碱基序列与所述结合区的上游碱基序列一致是指第一区域的碱基序列与所述模板上的结合区的5’末端向外延伸的序列一致，例如，结合区是模板上3’到5’末端方向的第1-8号碱基，则所述模板上的结合区的5’末端外的序列则从第9号碱基开始。

在设计荧光定量PCR引物和探针序列时，除考虑引物探针通常的规范外，还需要考虑设计片段的特异性和保守性。特异性是指，设计片段序列和其他存在的DNA序列的不相似程度。保守性是指，设计片段序列在待检测靶标中的一致性。在有限的靶标序列中，符合上述各要求的序列往往很少。尤其是对于DNA序列变异度较大的病毒和微生物，找到连续的三段种内保守性高，种间特异性强的序列往往极为困难。通常在设计规范上让步后实现的设计，容易存在扩增失败或非特异性扩增的可能。

采用本申请的寡核苷酸，产物杂交后形成的未杂交的核苷酸链环更小，分子动力学优势更高，杂交效率更好，从而使得探针锚定序列很短，因此，在考虑上述提及的特异性和保守性时，由于探针锚定序列较短，使得探针设计的难度降低，因此，使得符合要求的序列增多，对较不保守的靶序列或短片段靶序列的检测有显著优势。并且由于本申请获得信号的方式是通过水解释放荧光信号而并非是特异性扩增的双链带来信号，因此。也无需避免扩增顺延至探针部分产生非特异性信号。

在一些具体的实施方案中，所述第一区域序列的长度为4-8个碱基。

在一些具体的实施方案中，所述第二区域序列的长度为0-8个碱基。

当第一区域与第二区域的碱基长度在此区间中时，杂交的特异性和杂交的效率均更高。

在一些具体的实施方案中，所述荧光基团和淬灭基团可分别标记在序列5’端和序列中部任意区域。更优选地，荧光基团和淬灭基团至少间距5个碱基。

在一些具体的实施方案中，所述寡核苷酸的长度为19-36个碱基。

在一些具体的实施方案中，在合适的退火温度下，所述寡核苷酸与相应模板匹配后扩增合成的DNA后，通过所述第一区域和第二区域与扩增合成的DNA杂交而形成稳定的发卡结构。

所使用荧光基团的类型不限，包括但不限于FAM、HEX、VIC、ROX、CY3、CY5等。

所使用淬灭基团的类型不限，包括但不限于BHQ系列、TAMRA、MGB等。

三个区段可以直接通过常规3’，5’-磷酸二酯键直接相连，也可以通过间隔区(spacer)进行连接。

进一步地，第一区域和第二区域，以及第二区域和第三区域之间可以通过间隔区进行连接。

间隔区可选择C3、C6、C12、C18中的任意一种。

间隔区可选择I碱基或与模板无配对的任意其他碱基。

所述I碱基为次黄嘌呤碱基。

在一些具体的实施方案中，除常规寡核苷酸外，上述任意寡核苷酸的任何位置均可以使用非常规或非自然核苷酸，诸如LNA、PNA等。

在一些具体的实施方案中，提供一种用于实时荧光定量PCR的寡核苷酸对，其包括如上所述的寡核苷酸。更具体地，上述寡核苷酸对包括如上所述的寡核苷酸作为上游引物和常规下游引物、如上所述的寡核苷酸作为下游引物和常规上游引物，或者如上所述的寡核苷酸作为下游引物和上游引物。

常规引物是指按照本领域技术人员知晓的常规方法设计的引物。

在一个具体的实施方案中，采用本发明的寡核苷酸同时设计上游引物和下游引物时，可在每一轮扩增循环中释放两倍的荧光量，大幅提高荧光检测效率。

在一个具体的实施方案中，所述第一区域序列为TTAGCC；所述第二区域序列为CAT；所述第三区域为TCCTCCGGCCCCTGAATG。

又在一个具体的实施方案中，所述寡核苷酸的序列为：

其中，[FAM]为荧光基团；[BHQ1]为淬灭基团；下划线部分为第一区域序列；斜体加粗部分为第二区域序列；大写碱基为起连接作用的间隔区；方框部分为第三区域序列。

进一步地，本发明提供了一种用于实时荧光定量PCR的寡核苷酸对，包括如上所述的寡核苷酸的任意一种。

第二方面，本发明提供了一种检测试剂盒，其包含如上所述的寡核苷酸对。

进一步地，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、dNTP、Mg²⁺、DNA聚合酶、逆转录酶、PCR缓冲液中的至少一种。

进一步地，所述dNTP、Mg²⁺、DNA聚合酶、逆转录酶的终浓度分别为：1～3mM、1～5mM、0.05～0.2U/μL、1～4U/μL。

第三方面，本发明提供了一种检测方法，其包括使用上述寡核苷酸对或者试剂盒进行检测的步骤。

进一步地，本发明的检测方法，包括

1)使用如上述的寡核苷酸对或者如上所述的试剂盒进行扩增；

2)获得并分析结果。

在一个具体实施方案中，如果检测模板为RNA，则采用常规的RT-PCR步骤，其退火温度根据设计的寡核苷酸的Tm值进行确定。

例如，在一个具体实施方案中，在获得了如上所述的寡核苷酸的序列后，通过寡核苷酸的序列以及设计的下游引物的碱基序列，确定Tm值从而确定如下所述PCR条件：

附图说明

图1为本发明一个具体实施方案的寡核苷酸的结构图；

图2a-2e为本发明的寡核苷酸参与PCR扩增的过程图；

图3为本发明的寡核苷酸检测人肠道病毒结果图；

图4为常规设计的引物和探针检测人肠道病毒结果图；

图5为本发明的寡核苷酸用于PCR的精密度验证结果图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。本发明所涉及的寡核苷酸是一个通用结构，对于任何靶标的检测均适用，以下仅用人肠道病毒作为示例。

本发明所涉及的寡核苷酸的具体结构如图1所示。在合适的退火温度下，本发明的寡核苷酸与模板匹配后扩增合成DNA，如图2a-2b所示；形成的DNA双链在第二轮扩增启动时，会解旋为单链，而由于本发明的寡核苷酸第二区域与第三区域对应模板的下游碱基序列一致，因此该单链会形成稳定的发卡结构，如图2c所示；而在第二轮由下游引物启动的扩增合成时，发卡会被DNA聚合酶水解，从而释放荧光信号，如图2d-2e所示。

实施例1、寡核苷酸检测人肠道病毒

根据寡核苷酸的结构设计用于肠道病毒检测的寡核苷酸，其具体序列如下所示：

EV-HPP：

EV-R：5’-gaaacacggacacccaaagtagt-3’

其中，[FAM]为荧光基团；[BHQ1]为淬灭基团；下划线部分为第一区域序列；斜体加粗部分为第二区域序列；大写碱基为起连接作用的间隔区；方框部分为第三区域序列。

按照如下表1和表2配置使用本发明的寡核苷酸的PCR反应液以及混合酶。

表1、PCR反应液配方：

表2、混合酶配方：

按每管试剂43μL反应液和2μL混合酶的比例，取相应量的反应液和混合酶混匀，以每反应45μL的体积分装至各反应管。分别向各反应管中加入待检测的样本核酸5μL，然后盖上PCR管盖，瞬时离心后放置于实时荧光PCR仪器中。按如表3所示的循环条件进行反应和检测：

表3、PCR循环条件

取手足口咽拭子样本，经磁珠法提取核酸并纯化，使用TE溶解并进行梯度稀释。结果如图3所示，使用本发明的寡核苷酸可以对样本核酸进行扩增。

对比例1、常规引物和探针检测人肠道病毒

采用常规引物和探针设计方法设计常规肠道病毒的引物和探针，具体序列如下所示：

常规上游引物：5’-GGTGYGAAGAGYCTATTGAGCTA-3’

常规上游引物：5’-CCAAAGTAGTCGGTTCCGC-3’

常规探针：5’-[FAM]CTCCGGCCCCTGAATGCGG[BHQ1]-3’

其他反应液配比和反应程序设置，样本核酸提取和检测等条件和操作，均如上述实施例1所述。其检测结果如图4所示，可见使用本发明的扩增效率略高于常规引物和探针的技术，尤其是在低浓度扩增曲线上。

实施例2、精密度验证

使用本发明的寡核苷酸进行PCR的精密度验证。使用1例低浓度核酸样本，按照如实施例1所述的方法,重复检测16次，结果如图5所示，计算各结果Ct值的变异系数CV为1.5％，证明本发明的寡核苷酸符合常规对PCR的精密度要求。

Claims (11)

1.一种用于实时荧光定量PCR的寡核苷酸，所述寡核苷酸自5’至3’包含：第一区域，具有1-25个碱基；第二区域，具有0-15个碱基；第三区域，在退火时与相应模板上的结合区反向互补；荧光基团；和淬灭基团；其中，所述第一区域的碱基序列与所述结合区的下游碱基序列一致，所述第二区域的碱基序列与所述结合区的5’末端序列一致。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述第一区域序列的长度为4-8个碱基，和/或所述第二区域序列的长度为0-8个碱基。

3.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸的长度为19到36。

4.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述荧光基团与淬灭基团相距至少5个碱基。

5.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，在合适的退火温度下，所述寡核苷酸与相应模板匹配后扩增合成的DNA后，通过所述第一区域和第二区域与扩增合成的DNA杂交而形成稳定的发卡结构。

6.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述第一区域与所述第二区域之间通过第一间隔子相连，和/或所述第二区域与所述第三区域之间通过第二间隔子相连。

7.根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中，所述间隔子选自C3、C6、C12、C18、I碱基，或与模板无配对的任意其他碱基。

8.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、ROX、CY3和CY5，和/或所述淬灭基团选自BHQ系列、TAMRA和MGB。

9.一种用于实时荧光定量PCR的寡核苷酸对，包括如权利要求1～8中任一项所述的寡核苷酸。

10.一种用于实时荧光定量PCR的试剂盒，包括如权利要求9所述的寡核苷酸对。

11.一种检测方法，包括：

1)使用如权利要求9所述的寡核苷酸对或者权利要求10所述的试剂盒进行扩增；

2)获得并分析结果。

Images