CN105506150B - 一种emsa方法及其探针和该探针的制备方法 - Google Patents

一种emsa方法及其探针和该探针的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105506150B
CN105506150B CN201610059545.9A CN201610059545A CN105506150B CN 105506150 B CN105506150 B CN 105506150B CN 201610059545 A CN201610059545 A CN 201610059545A CN 105506150 B CN105506150 B CN 105506150B
Authority
CN
China
Prior art keywords
emsa
sequence
probe
probes
chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610059545.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105506150A (zh
Inventor
董先辉
王晓香
曾健
张娟
杨嘉杰
周剑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUANGZHOU BIOSENSE BIOSCIENCE Co Ltd
Original Assignee
GUANGZHOU BIOSENSE BIOSCIENCE Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUANGZHOU BIOSENSE BIOSCIENCE Co Ltd filed Critical GUANGZHOU BIOSENSE BIOSCIENCE Co Ltd
Priority to CN201610059545.9A priority Critical patent/CN105506150B/zh
Publication of CN105506150A publication Critical patent/CN105506150A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105506150B publication Critical patent/CN105506150B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G01N33/561—Immunoelectrophoresis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种EMSA方法及其探针和该探针的制备方法。EMSA探针所述包含第一条链，所述第一条链包含转录因子结合序列和位于其5’及3’端的接头序列。所述EMSA探针的制备方法，包含以下步骤：合成模板链和生物素标记且LNA修饰的引物，所述模板链包含转录因子结合序列和位于其5’及3’端的接头序列，所述接头序列为回文序列，所述引物的核苷酸序列与接头序列的核苷酸序列相同；采用该引物以模板链为模板进行PCR扩增合成双链EMSA探针。使用所述的EMSA探针可进行EMSA。本发明由单链探针经PCR制得双链探针，不会出现由于复性不彻底造成的假阴性，还克服了单链自由探针带来的显影误差。

Description

一种EMSA方法及其探针和该探针的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种EMSA方法及其探针和该探针的制备方法。
背景技术
凝胶迁移或电泳迁移率检测(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是研究启动子结合蛋白的经典方法，是一种用于定性和定量分析核酸蛋白相互作用的技术。EMSA基本过程是将32P或33P标记或非放射性标记的包含特异的DNA位点的DNA片段与DNA结合蛋白共同孵育后进行电泳分析，蛋白-DNA复合物通过EMSA与游离DNA分离开来，蛋白质阻碍与其所结合的DNA片段的移动性。因此，游离DNA比DNA-蛋白质复合物移动的更快，凝胶的图像可以揭示游离和结合的标记的DNA的位置。EMSA不仅简单、迅速、灵敏度高；且可以用竞争性试验来评价蛋白和核酸结合的特性。目前，EMSA可以用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性抗体来检测特定的蛋白质，EMSA还可以结合蛋白双向电泳及质谱技术进行未知蛋白的鉴定分析。
随着EMSA技术的不断完善，其在生命科学研究及医学领域中扮演的角色愈加重要。Jiang X等用EMSA方法证明了AP1能够结合在启动子的功能区域，并且调控LoVo细胞的PPARdelta的表达(Jiang,X.,et al.,Transcription factor AP1 binds the functionalregion of the promoter and regulates gene expression of human PPARdelta inLoVo cell.Tumour Biol,2013.6(34):p.3619-3625)。Katanin是参与微管切断ATP酶家族成员的蛋白质，它的两种异源二聚体结构由KATNA1和KATB1编码，而Elk1能够与微管相互作用，Selcuk E等用EMSA方法证明Elk1能够结合KATB1启动子，调控其表达(Selcuk,E.,D.Canbaz and A.Et,Katanin-p80gene promoter characterization and regulationvia Elk1.PLoS One,2013.7(8):p.e69423)。凝胶阻滞电泳分析显示青蒿素激活PXR与CYP3A4 DNA 结合的能力，表明CYP3A4的诱导是由青蒿素通过PXR的活化所介导(Hu,D.,etal.,Artemisinin protects against dextran sulfate-sodium-induced inflammatorybowel disease,which is associated with activation of the pregnane Xreceptor.Eur J Pharmacol,2014(738C):p.273-284)。
现如今的研究中，EMSA探针主要是合成生物素标记的单链探针，再通过变性、复性实验得到的双链探针。如Kim JR等运用生物公司合成的3’末端被生物素标记的正、反单链EMSA探针，并在室温下复性得到双链探针(Kim,J.,S.Mathew and P.Mathew,Blimp-1/PRDM1regulates the transcription of human CS1(SLAMF7)gene in NK and Bcells.Immunobiology,2015.221(1):p.31-39)。又如GrycováA等、Hsu FT等亦分别通过设计合成包含转录因子结合位点的单链EMSA探针，之后通过低温复性得到双链探针，进而开展凝胶迁移率实验(Aneta,G.,D.Aneta and D.Zdenek,Impurities contained inantifungal drug ketoconazole are potent activators of human aryl hydrocarbonreceptor.TOXICOLOGY LETTERS,2015.239(2):p.67-72；Hsu,F.,B.Chang and C.John,Synergistic Effect of Sorafenib and Radiation on Human Oral Carcinoma invivo.SCIENTIFIC REPORTS,2015.5)。
上述EMSA探针的合成方法具有3点较明显的缺点：(1)通过复性得到的双链探针的比例难以保证，容易造成实验结果的假阴性；(2)复性不彻底的单链探针的显影亮度远高于蛋白-DNA复合物结合条带的显影亮度，造成假阴性，且双链探针比例较低影响阳性结果的显影；(3)需要合成大量的单链探针，成本较高。
发明内容
有鉴于此，本发明的第一个目的是提供一种EMSA探针，本发明的第二个目的是提供该探针的制备方法，本发明的第三个目的是提供使用该探针的EMSA方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种EMSA探针，包含第一条链，所述第一条链包含转录因子结合序列和位于其5’及3’端的接头序列。
优选地，所述接头序列为回文序列。
优选地，所述接头序列的长度为8-15nt。
优选地，所述接头序列的长度为12nt。
优选地，所述接头序列经生物素标记和LNA修饰。
优选地，所述转录因子结合序列含有简并序列。
更优选地，所述接头序列为GGGTCTAGACCC。
更优选地，所述接头序列为GCATCATGATGC。
更优选地，所述接头序列为GGGCTAGCCC。
更优选地，所述第一条链的序列为GGGTCTAGACCCGTGTCHGKCTRGGGTCTAGACCC，其中H＝A/C/T，K＝G/T，R＝A/G。
更优选地，所述第一条链的序列为GCATCATGATGCAGTTGGAAATYCCTCCCAGGCGCATCATGATGC。
更优选地，所述第一条链的序列为GGGCTAGCCCTCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTCGGGCTAGCCC。
优选地，所述EMSA探针包含与第一条链探针互补的第二条链。
一种EMSA探针的制备方法，包含以下步骤：
合成模板链和生物素标记且LNA修饰的引物，所述模板链包含转录因子结合序列和位于其5’及3’端的接头序列，所述接头序列为回文序列，所述引物的核苷酸序列与接头序列的核苷酸序列相同；采用该引物以模板链为模板进行PCR扩增合成双链EMSA探针。
优选地，所述PCR反应体系为：1μM模板链1μL，10μM Biotin-LNA-Oligo2μL，dNTPMix 4μL，DNA Polymerase 0.25μL，10×PCR reaction buffer 5μL，ddH2Oto 50μL；所述PCR反应条件为：94℃5min；95℃10sec，55℃20sec，72℃8sec，35循环；72℃10min。
一种EMSA方法，使用上述EMSA探针进行EMSA。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)不采用传统的两条单链探针复性得到双链探针的方法，而是由单链探针PCR制得双链探针，不会出现由于复性不彻底造成的假阴性，也克服了单链自由探针带来的显影误差；
(2)转录因子结合位点一般具有核苷酸序列多态性，传统方法制备EMSA探针时需要分开合成互补探针并分开退火，成本高，操作繁琐；而本发明探针制备方法在保证碱基互补配对的基础上，通过设计合成简并碱基模板可以制备多类型探针组，大大降低了探针的制备成本，简化了制备过程；
(3)与需要合成大量单链探针、每个单链探针都需要进行生物素标记的现有技术相比，本发明仅需合成少量单链探针和生物素标记的引物，大大降低了成本，缩短了标记时间，对于EMSA在生产、研发中的应用及临床疾病检测上的运用具有非常重要的意义。
附图说明
图1为EMSA探针中第一条链的结构示意图。
图2为实施例1的EMSA探针电泳图。
图3为实施例1的EMSA结果图。
图4为对比例1的EMSA结果图。
图5为实施例2的EMSA探针电泳图。
图6为实施例2的EMSA结果图。
图7为对比例2的EMSA结果图。
图8为实施例3的EMSA探针电泳图。
图9为实施例3的EMSA结果图。
图10为对比例3的EMSA结果图。
其中，P1为蛋白-探针-抗体超迁移条带，P2为蛋白-探针迁移条带，P3为自由探针(未结合蛋白的探针)条带；Probe表示标记探针，NE表示目的转绿因子的核蛋白，WT Probe表示未标记探针，Mut Probe表示未标记的突变探针，Anti-TF表示目的转录因子的特异抗体。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
本发明中模板链中的转录因子结合序列是参考转录因子结合序列数据库(transcription factor binding site，TFBS)，包括TRANSFAC、JASPAR、TFDB、TRRD、TRED、PAZAR、MAPPER等，区分物种特异性获得目的转录因子结合序列。具体可通过以下三种方式获得转录因子结合序列：根据TFBS序列直接确定转录因子结合序列；或根据TFBS序列与转录因子目标基因调控序列开展序列比对确定靶基因结合调控位点，以该靶基因结合调控位点作为转录因子结合序列；或直接使用转录调控数据库(如：PROMO、JASPAR、EpiTect ChIP、MatInspector等)针对靶基因调控序列分析结合调控转录因子，进而确定靶基因结合位点，以该靶基因结合位点作为转录因子结合序列。
实施例1、SMAD2
S1、制备模板链
根据HOCOMOCO或JASPAR数据库的SMAD2序列直接确定转录因子结合序列，获得的转录因子结合序列为GTGTCHGKCTR(H＝A/C/T；K＝G/T；R＝A/G)。在该转录因子结合序列的5’及3’端分别添加接头序列(GGGTCTAGACCC，SEQ ID NO：1)，获得模板链(接头序列+转录因子结合序列+接头序列，GGGTCTAGACCC+GTGTCHGKCTR+GGGTCTAGACCC,SEQ ID NO：4)，其结构如图1所示，该序列送交基因合成公司合成。同时合成突变单链，序列为GGGTCTAGACCC+TCGRTTHGKCG+GGGTCTAGACCC(SEQ ID NO：7)。
S2、合成引物
化学合成生物素标记且LNA修饰的引物，所述引物的核苷酸序列与接头序列的核苷酸序列相同，即为GgGTcTAgACcC(小写字母为LNA修饰锁核苷酸，下同)，记为Biotin-LNA-Oligo，该序列送交基因合成公司完成。同时合成未生物素标记的LNA修饰的寡核苷酸回文序列GgGTcTAgACcC，记为LNA-Oligo。
S3、PCR扩增合成双链探针
将合成的Biotin-LNA-Oligo和LNA-Oligo分别用双蒸水稀释，终浓度为10μM；将合成的模板链用双蒸水稀释，终浓度为1μM。以模板链为模板，以步骤S2中合成的引物为引物进行PCR。以Biotin-LNA-Oligo为引物，以本发明中模板链为模板PCR得到的探针为野生型标记探针。以LNA-Oligo为引物，以本发明中模板链为模板PCR得到的探针为野生型未标记探针；以LNA-Oligo为引物，以本发明中突变单链为模板PCR得到的探针为未标记突变探针。使用经LNA修饰的引物进行PCR反应，可以增加退火温度，使得短链引物获得长链引物的扩增效率，同时增加EMSA实验探针的特异性。
按照如下所示分别配置标记探针组PCR反应体系：模板(1μM)1μL，Biotin-LNA-Oligo(10μM)2μL，dNTP Mix 4μL，DNA Polymerase 0.25μL，10×PCR reaction buffer 5μL，ddH2O to 50μL。
同时设置野生型竞争冷探针组，其PCR反应体系如下：模板链(1μM)1μL，LNA-Oligo(10μM)2μL，dNTP Mix 4μL，DNA Polymerase 0.25μL，10×PCR reaction buffer 5μL，ddH2O to 50μL。
按照以下程序开展PCR扩增：①预变性：94℃5min；②35循环(变性：95℃10sec；退火：55℃20sec；延伸：72℃8sec)；③延伸：72℃10min；④保存：12℃。
PCR结果经3％琼脂糖凝胶电泳，100v恒压电泳15min，凝胶成像系统检测扩增效果，如图2所示。图中Maker为DNA标准品，a为野生型标记探针，b为野生型未标记型探针，c为未标记突变探针，探针大小约为40～50bp。
对上述PCR获得的EMSA探针进行纯化，具体方法如下：
在PCR反应终止后，向标记探针及冷竞争探针(包括野生型未标记探针和未标记突变探针)中加入1/10体积3M NaAO、2倍体积无水乙醇、3μL核酸助沉剂，混匀；-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜；4℃，12,000g-16,000g离心30分钟，小心去除上清；室温微晾干沉淀(约5min)；加入50μL TE，完全溶解沉淀；标记好的探针及冷竞争探针，-20℃保存备用。
S4、EMSA
S41、核蛋白提取
实验操作参考伯信生物EMSA试剂盒说明书，简要步骤为：取107个细胞用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀；加入400μL预冷含PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟)的蛋白抽提试剂A。最高速剧烈振荡(Vortex)5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长时间)。4℃12,000-16,000g离心5分钟。完全吸尽上清，向剩余沉淀中加入2.5倍体积(50μL)添加了PMSF的蛋白抽提试剂C。最高速剧烈振荡15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈振荡15-30秒，共30分钟。4℃12,000-16,000g离心10分钟。立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存备用。
S42、结合反应
结合反应组别设置如下：
①实验组(激活的目的转录因子的核蛋白+野生型标记探针)；
②阴性对照组(野生型标记探针)；
③野生型竞争组(含激活的目的转录因子的核蛋白+野生型标记探针+野生型标记探针100倍量的野生型未标记探针)；
④突变型竞争组(含激活的目的转录因子的核蛋白+野生型标记探针+野生型标记探针100倍量的未标记突变探针)；
⑤超迁移对照组(含激活的目的转录因子的核蛋白+野生型标记探针+目的转录因子的特异抗体)。
结合反应的简要步骤如下：
在加入野生型标记探针前，先将其他成分混匀，消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷竞争探针优先反应，然后加入野生型标记探针混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。
S43、电泳分析
向结合反应后的混合物中加入1μl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10×)，混匀后立即上样；用0.5×TBE作为电泳液，按照10V/厘米的电压预电泳10分钟；按照10V/厘米的电压电泳，电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。本实施例中电泳使用的是6.5％非变性PAGE胶，按照以下成分及用量配制：10×TBE1.0ml，40％Acrylamide 3.3ml，50％Glycerol 1.0ml，dH2O 14.8ml，TEMED 20μl，10％AP120μl。
S44、电转运及紫外交联
取和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜及两片滤纸，用0.5×TBE浸泡至少10～15分钟；采用湿法电转膜装置，以0.5×TBE为转膜液，4℃，380mA(约100V)转膜50分钟。用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联1-5分钟。
S45、信号检测
实验操作参考伯信生物EMSA试剂盒说明书，简要步骤如下：37-50℃水浴溶解封闭液和洗涤液，交联过的尼龙膜加入15ml封闭液，缓慢摇动15分钟。封闭液封闭的尼龙膜，转入15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液，缓慢摇动15分钟。尼龙膜转移至15-20ml洗涤液，缓慢摇动漂洗1分钟，重复漂洗3次(共漂洗4次)。尼龙膜转移至20-25ml检测平衡液的容器内，缓慢摇动5分钟；取出尼龙膜在表面小心加上BeyoECL Plus Reagent工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜，室温静置2-3分钟。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒内。用X光片压片1～5分钟，显影定影。结果如图3所示。
由图3可知，阴性对照反应组仅有自由探针条带，实验组、野生型竞争对照组和突变型竞争对照组均有自由探针条带和蛋白-探针迁移条带，超迁移对照组含有自由探针条带、蛋白-探针迁移条带和蛋白-探针-抗体超迁移条带。使用本发明方法进行EMSA，条带清晰、单一、特异性高，无拖尾现象，无假阴性出现。
对比例1
本对比例针对SMAD2序列采用传统的化学合成结合退火方式制备EMSA探针。化学合成的单链探针的序列为GTGTCHGKCTR(SEQ ID NO：8)、YAGMCDGACAC(SEQ ID NO：9)，竞争突变探针序列为TCGRTTHGKCG(SEQ ID NO：10)、CGMCDAAYCGA(SEQ ID NO：11)(H＝A/C/T；K＝G/T；M＝A/C；Y＝C/T；R＝A/G；D＝A/G/T)。末端分别进行生物素标记，然后95℃水浴5min，自然冷却形成双链EMSA探针。
用本对比例获得的EMSA探针按照实施例1所述的方法进行EMSA、电泳分析、电转运及紫外交联和信号检测。结果如图4所示。由图4可知，EMSA结果拖尾严重，显影模糊不清。
对比传统探针制备方法(对比例1)与本发明探针制备法(实施例1)EMSA实验结果可知，传统探针制备方法制得的探针进行EMSA，自由探针比例过高，这是由于复性效率低所引起；本发明探针制备方法制得的探针进行EMSA，自由探针条带与迁移阻止条带及超迁移阻止条带相比，比例比较均衡，显影效果比较美观。同时由于本发明方法基本不存在非复性单链探针，所以在探针加入量相较于传统方法更加易于计算及添加。同时，本实施例是针对NFKB结合位点设计的，根据转录因子结合位点核苷酸碱基多态性，设计含兼并碱基的模板序列，其对转录因子整体活性检测结果将更加准确。
以制备转录因子SMAD2的EMSA探针并用于检测100个位点为例，对本发明方法和传统方法的成本进行了比较。采用传统方法合成单链并制备双链探针的成本为100000元(100位点单链探针：100×1000)(参考上海生工生物合成价格)，而采用本发明方法制备探针的成本为7000元(模板50×100+标记的引物1000+PCR10×100)(参考上海生工生物合成价格)。若检测位点数越大，本发明探针成本越低。
实施例2、NFKB3
根据HOCOMOCO或JASPAR数据库的NFKB3序列直接确定转录因子结合序列，获得的转录因子结合序列为AGTTGGAAATYCCTCCCAGGC。在该转录因子结合序列的5’及3’端分别添加接头序列(GCATCATGATGC，SEQ ID NO：2)，获得模板链(接头序列+转录因子结合序列+接头序列，GCATCATGATGC+AGTTGGAAATYCCTCCCAGGC+GCATCATGATGC，SEQ ID NO：5)。该序列送交基因合成公司合成。同时合成突变单链，其序列为GCATCATGATGC+AGCTAGYCTGACATCACGCTG+GCATCATGATGC(SEQ ID NO：12)。
本实施例中的合成引物、PCR扩增合成双链探针和EMSA的方法与实施例1相同。引物经LNA修饰后的序列为GcATcATgATgC(小写字母为LNA修饰锁核苷酸)。探针电泳图如图5，EMSA结果如图6所示。
对比例2
本对比例针对NFKB3序列采用传统的化学合成结合退火方式制备EMSA探针。化学合成的单链探针的序列为AGTTGGAAATYCCTCCCAGGC(SEQ ID NO：13)、GCCTGGGAGGRATTTCCAACT(SEQ ID NO：14)，竞争突变探针序列为AGCTAGYCTGACATCACGCTG(SEQ ID NO：15)、CAGCGTGATGTCAGRCTAGCT(SEQ ID NO：16)，末端分别进行生物素标记，然后95℃水浴5min，自然冷却形成双链EMSA探针，复性率不高于80％。
用本对比例获得的EMSA探针按照实施例2所述的方法进行EMSA、电泳分析、电转运及紫外交联和信号检测。结果如图7所示。
对比传统探针制备方法(对比例2)与本发明探针制备法(实施例2)EMSA实验结果可知，传统探针制备方法制得的探针进行EMSA，自由探针存在双带现象，这是由于复性效率低所引起，对结果的判定上容易引起假阳性误判；本发明探针制备方法制备的探针进行EMSA，自由探针由于标记引物分子量相对于双链标记探针分子量差距明显且自身较小，一般会电泳出凝胶或通过探针纯化的方式去除，所以一般不会引发双带现象，而且条带间比较均衡显影效果比较美观。
实施例3、C-JUN
根据HOCOMOCO或JASPAR数据库的C-JUN序列直接确定转录因子结合序列，获得的转录因子结合序列为TCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTC。在该转录因子结合序列的5’及3’端分别添加接头序列(GGGCTAGCCC，SEQ ID NO：3)，获得模板链(接头序列+转录因子结合序列+接头序列，GGGCTAGCCC+TCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTC+GGGCTAGCCC，SEQ ID NO：6)。该序列送交基因合成公司合成。同时合成突变单链，所述突变单链的具体序列为GGGCTAGCCC+TCCTCGTCGTGTCAGTGGTCTTATGTC+GGGCTAGCCC(SEQ ID NO：17)。
本实施例中的合成引物、PCR扩增合成双链探针方法和EMSA实施例1相同，但是序列不同。引物经LNA修饰后的序列为GgGctAgCcC。探针电泳图如图8，EMSA结果如图9所示。
对比例3
本对比例针对C-JUN序列采用传统的化学合成结合退火方式制备EMSA探针。化学合成的单链探针的序列为TCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTC(SEQ ID NO：18)、GAAGACCCTCAAGAGTCAGAACACGGA(SEQ ID NO：19)，竞争突变探针序列为TCCTCGTCGTGTCAGTGGTCTTATGTC(SEQ ID NO：20)、GACATAAGACCACTGACACGACGAGGA(SEQ IDNO：21)，末端分别进行生物素标记，然后95℃水浴5min，自然冷却形成双链EMSA探针，复性率不高于80％。
用本对比例获得的EMSA探针按照实施例3所述的方法进行EMSA、电泳分析、电转运及紫外交联和信号检测。结果如图10所示。
对比传统探针制备方法(对比例3)与本发明探针制备方法(实施例3)EMSA实验结果可知，使用传统探针制备方法获得的探针进行EMSA，条带不清，拖尾严重；使用本发明探针制备方法的探针进行EMSA，带型清晰明确，更利于结果判断，结果更加严谨准确。
由上述各实施例和对比例可知，本发明EMSA探针明显优于传统EMSA探针。在制备方法方面，传统EMSA探针采用化学合成修饰的单链探针、低温退火、纯化检测等获得，具有探针标记效率低、纯度不高、降解程度大及结合效率不稳定等缺点，进而导致拖尾、模糊、出现多条结果条带等现象。相较于传统EMSA探针，本发明EMSA探针制备时采用生物素标记了接头序列，针对多样品多物种均能使用，探针利用率高，成本低。同时，由于探针纯度高，显影条带特异性强，结果条带清晰、单一，且无拖尾现象，无假阴性出现。
分析转录因子结合位点矩阵时，发现存在多个单核苷酸多态性，因此，传统EMSA探针需要有针对性的设计多条探针。在低温复性时，需要根据序列逐个复性或者混合复性，但是，探针逐个复性会使成本大大增加，而混合复性又会造成碱基错配现象，导致探针特异性低。本发明直接根据矩阵序列合成简并序列模板，添加生物素标记的接头序列，并通过PCR扩增得到特异性的EMSA探针，成功的避免了传统探针带来的碱基错配现象，特异性远超传统EMSA探针。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种EMSA探针的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
合成模板链和生物素标记且LNA修饰的引物，所述模板链包含转录因子结合序列和位于其5’及3’端的接头序列，所述接头序列为回文序列，所述引物的核苷酸序列与接头序列的核苷酸序列相同；采用该引物以模板链为模板进行PCR扩增合成双链EMSA探针。
2.根据权利要求1所述的EMSA探针的制备方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：1μM模板链1μL，10μM Biotin-LNA-Oligo2μL，dNTP Mix 4μL，DNA Polymerase 0.25μL，10×PCRreaction buffer 5μL，ddH2Oto 50μL；所述PCR反应条件为：94℃5min；95℃10sec，55℃20sec，72℃8sec，35循环；72℃10min。
3.一种根据权利要求1所述的EMSA探针的制备方法制得的EMSA探针，其特征在于，包含第一条链，所述第一条链包含转录因子结合序列和位于其5’及3’端的接头序列，所述接头序列为回文序列；
所述EMSA探针还包含与第一条链探针互补的第二条链，所述接头序列经生物素标记和LNA修饰。
4.根据权利要求3所述的EMSA探针，其特征在于，所述接头序列的长度为8-15nt。
5.根据权利要求4所述的EMSA探针，其特征在于，所述接头序列为GGGTCTAGACCC、GCATCATGATGC或GGGCTAGCCC。
6.根据权利要求5所述的EMSA探针，其特征在于，所述第一条链的序列为GGGTCTAGACCCGTGTCHGKCTRGGGTCTAGACCC、GCATCATGATGCAGTTGGAAATYCCTCCCAGGCGCATCATGATGC或GGGCTAGCCCTCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTCGGGCTAGCCC，其中H＝A/C/T，K＝G/T，R＝A/G，Y＝C/T。
7.根据权利要求3所述的EMSA探针，其特征在于，所述转录因子结合序列含有简并序列。
8.一种非诊断目的的EMSA方法，使用权利要求3所述的EMSA探针进行EMSA。
CN201610059545.9A 2016-01-27 2016-01-27 一种emsa方法及其探针和该探针的制备方法 Active CN105506150B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610059545.9A CN105506150B (zh) 2016-01-27 2016-01-27 一种emsa方法及其探针和该探针的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610059545.9A CN105506150B (zh) 2016-01-27 2016-01-27 一种emsa方法及其探针和该探针的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105506150A CN105506150A (zh) 2016-04-20
CN105506150B true CN105506150B (zh) 2018-09-25

Family

ID=55714440

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610059545.9A Active CN105506150B (zh) 2016-01-27 2016-01-27 一种emsa方法及其探针和该探针的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105506150B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723342B (zh) * 2017-10-19 2021-05-11 东南大学 一种端粒探针及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1690947A2 (en) * 2005-02-14 2006-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Base sequence for control probe and method of designing the same
CN102643910A (zh) * 2012-04-10 2012-08-22 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 非对称多色荧光发夹探针链反应在病原菌检测中的应用
CN104404142A (zh) * 2014-11-11 2015-03-11 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种用于荧光定量pcr反应的荧光探针

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1690947A2 (en) * 2005-02-14 2006-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Base sequence for control probe and method of designing the same
CN102643910A (zh) * 2012-04-10 2012-08-22 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 非对称多色荧光发夹探针链反应在病原菌检测中的应用
CN104404142A (zh) * 2014-11-11 2015-03-11 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种用于荧光定量pcr反应的荧光探针

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
膀胱癌中DNA聚合酶Polι转录调控机制及其作用初步研究;袁方;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20140515(第5期);实施例1、说明书[0008]、[0018]段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105506150A (zh) 2016-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108034658B (zh) 一种检测人葡萄膜黑色素瘤细胞的核酸适体
CN102876805B (zh) 鹿猪牛羊马驴兔鸡的pcr鉴定用引物体系
CN101538570B (zh) 用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法
CN105505939B (zh) 与漆沟藻毒素1和4特异性结合的高亲和力适配体及其应用
CN101717816B (zh) Oatp1b1重要基因突变检测基因芯片
CN101955939A (zh) 用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法
CN104561361A (zh) Her2基因扩增检测探针、试剂盒以及方法
CN104017899A (zh) 海马的鉴定方法
EP3292217B1 (en) Formation of hairpins in situ using force-induced strand invasion
CN105525010A (zh) 一种茎环结构组合探针及其应用
CN110241119B (zh) 心肌肌钙蛋白i特异性核酸适配体及其筛选方法和应用
CN109628645A (zh) 用于检测病毒的dna四面体探针及试剂盒
CN107190052B (zh) Loc101928926基因的用途
CN104232802A (zh) 检测鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒
CN105506150B (zh) 一种emsa方法及其探针和该探针的制备方法
CN111606997B (zh) 抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列
CN106032534A (zh) 一种与人非小细胞肺癌细胞特异结合的核糖核酸适配体及其筛选方法
CN107446949A (zh) Pls3重组蛋白真核表达质粒及其构建方法和应用
CN101434990B (zh) 貂心dna检测试剂盒及鉴定方法
CN110172514A (zh) 用于开发胃腺癌诊疗产品的分子标志物
CN104630379A (zh) 非小细胞型肺癌标志物fam107a及其应用
CN105506126B (zh) 具有较大张力的小环形核苷酸探针及其制备方法和应用
CN104651522A (zh) I型胶原α1链的新应用
CN101914543A (zh) 一种用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法
CN101666805A (zh) 特异性蛋白检测芯片的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant