CN111606997B - 抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列 - Google Patents

抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫学技术领域，具体公开了一种抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列，包括：一重链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的序列；以及一轻链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：2的序列，所述SEQ ID NO：1之序列与SEQ ID NO：2之序列具有至少一取代。本发明具有特异性高、亲和力强的特点。

Description

抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，特别涉及一种抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列。
背景技术
肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)(ATP:Creatine N-phosphotransferase EC2.7.3.2)又名磷酸肌酸激酶(Creatine Phosphokinase,CPK),通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，它能可逆性地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。肌酸激酶是由两个亚基组成的二聚体蛋白，根据组织分布的部位和亚基组成的不同可分为肌肉型(M)、脑型(B)、杂化型(MB)和线粒体型(Mt)四种同功酶形式。肌肉型肌酸激酶分子是由两个相同的亚基(MM型)组成的同源二聚体，主要存在于各种肌肉细胞中，BB型同源二聚体主要存在于脑细胞中，MB型异源二聚体主要存在于心肌细胞中，MM型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。不同的同工酶的增高意义并不完全一样。肌肉型(MM)的增高通常是肌病的表现,杂化型(MB)的增高与心肌损害有关，这对于诊断心肌梗塞有比较重要的意义。
肌酸激酶同工酶(CKMB)主要存在于心肌，在诊断急性心肌梗死上是一种很有效的指标。若患者具有CKMB活性升高和下降的序列性变化，且峰值超过参考值上限2倍，又无其他原因可解释时，应考虑急性心肌梗塞(AMI)。CKMB质量(CKMB mass)用于心梗的诊断时，所用诊断界值推荐为正常人参考数值上限的99％分位。CKMB胸痛发作3h后的诊断急性心肌梗塞(AMI)阳性率可达50％，6h的诊断阳性率可达到80％。急性心肌梗塞(AMI)发作后如未进行溶栓治疗，CKMB通常在3～8h出现升高，达峰时在发病后9～30h，于48～72h恢复至正常水平。与总CK测定比较，CKMB的峰时稍有提前，且消失也较快。由于诊断窗较窄，临床上可利用这一点对再梗死进行诊断。分析临床和实验性心肌梗死后血清CK及其同工酶CKMB和梗死区与非梗死区心肌内CKMM、CKMB含量变化表明：梗死后48h或72h内血清CK、CKMB呈升高、高峰、下降的动态规律，它们敏感地反映了损伤心肌内酶释放过程。血清CKMB不受横纹肌损伤因素影响，胸痛发作后72h内可诊断急性心肌梗塞(AMI)；对诊断急性心肌梗塞(AMI)入院后再次心梗具有很高的特异性(98％)。溶栓治疗时，CKMB早期升高及短时间内达峰是急性心肌梗塞(AMI)的征兆。下壁急性心肌梗塞(AMI)在治疗2h后CKMB增加2.2倍以上，前壁急性心肌梗塞(AMI)在治疗2h后增加2.5倍以上，均提示心肌出现再灌注。
因此如果能开发出一种特异性高、亲和力强的抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体，将其应用于临床诊断急性心肌梗塞，可以极大地提高急性心肌梗塞的救治成功率；然而目前并没有。
发明内容
本发明为了解决现有临床诊断急性心肌梗塞所存在的上述技术问题，提供了一种特异性高、亲和力强的抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列。
本发明的第一种技术方案：抗肌酸激酶同工酶抗体的氨基酸序列，包括
一重链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的序列；以及
一轻链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：2的序列，
所述SEQ ID NO：1之序列与SEQ ID NO：2之序列具有至少一取代。
作为优选，所述取代选自下组，
所述SEQ ID N0：1之第12个氨基酸由亮氨酸取代为精氨酸，所述SEQ ID NO：1之第20个氨基酸由亮氨酸取代为异亮氨酸，取代之后得到的重链为SEQ ID N0：3；
所述SEQ ID NO：2之第6个氨基酸由谷氨酰胺取代为天冬氨酸，所述SEQ ID NO：2之第12个氨基酸由丝氨酸取代为苏氨酸，所述SEQ ID NO：2之第22个氨基酸由苏氨酸取代为蛋氨酸，取代之后得到的轻链为SEQ ID N0：4；
且所述抗体与肌酸激酶同工酶结合。
作为优选，所述取代选自下组，
所述SEQ ID N0：1之第11个氨基酸由甲硫氨酸取代为色氨酸，所述SEQ ID NO：1之第24个氨基酸由苯丙胺酸取代为脯氨酸，取代之后得到的重链为SEQ ID N0：5；
所述SEQ ID NO：2之第13个氨基酸由丙氨酸取代为天冬氨酸，所述SEQ ID NO：2之第21个氨基酸由甲硫氨酸取代为精氨酸，所述SEQ ID NO：2之第42个氨基酸由丝氨酸取代为谷氨酸,取代之后得到的轻链为SEQ ID N0：6；
且所述抗体与肌酸激酶同工酶结合。
作为优选，所述取代选自下组，
所述SEQ ID N0：1之第22个氨基酸由半胱氨酸取代为丝氨酸，所述SEQ ID NO：1之第50个氨基酸由亮氨酸取代为谷氨酸，取代之后得到的重链为SEQ ID N0：7；
所述SEQ ID NO：2之第35个氨基酸由丙氨酸取代为天冬氨酸，所述SEQ ID NO：2之第35个氨基酸由酪氨酸取代为甘氨酸，所述SEQ ID NO：2之第68个氨基酸由苏氨酸取代为色氨酸,取代之后得到的轻链为SEQ ID N0：8；
且所述抗体与肌酸激酶同工酶结合。
本发明的第二种技术方案：抗肌酸激酶同工酶抗体，包括氨基酸序列。
本发明的第三种技术方案：抗肌酸激酶同工酶抗体的制备方法，包括以下步骤，
(A)获取可变区基因；
(B)使用全基因合成手段将测序合格的可变区基因序列插入到重轻链表达质粒中；
(C)将表达质粒转化到感受态细胞中；
(D)从复苏细菌中提取去内毒素的表达质粒；
(E)选用HEK293细胞，并对HEK293细胞进行传代培养；
(F)瞬时转染HEK293细胞；
(G)重组抗体纯化。
作为优选，所述步骤(A)中的获取包括以下步骤，
(A1)设计重链引物和轻链引物，并进行相应免疫球蛋白G基因序列的合成；
(A2)从杂交瘤细胞总RNA逆转录模版中钓取抗肌酸激酶同工酶抗体可变区基因；
(A3)将钓取出来的基因序列插入T载体后测序。
作为优选，所述步骤(A1)中，选取与肌酸激酶同工酶结合的单克隆抗体之轻链可变区氨基酸序列与重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列中包括SEQ ID NO：2之序列，所述重链氨基酸序列可包括SEQ ID NO：1之序列，根据SEQ ID NO：2之序列和SEQID NO：1之序列可变区的V基因和CH区、CL区的保守序列特征，分别设计重链引物和轻链引物，并利用杂交瘤细胞进行相应免疫球蛋白G基因序列的合成。
作为优选，所述步骤(A2)中的钓取包括以下步骤，
(A21)取一个0.2mL的离心管，在离心管中分别加入10μL的5хTaq Buffer试剂、4μL的dNTP Mixture(10mM each)试剂、1μL的杂交瘤细胞总RNA逆转录模版、5μL的重链引物、5μL的轻链引物、24.75μL的ddH20试剂和0.25μL的Taq DNA polymerase(5u/μL)试剂，然后将离心管中的混合物振荡混匀后，放置在离心机上离心；
(A22)将步骤(A21)中的离心管放置在基因扩增仪模块中进行扩增。
作为优选，所述步骤(A22)中的扩增按照以下顺序进行，
(a1)94℃的温度下扩增90min；
(a2)按照94℃的温度下30s、56℃的温度下30s和72℃的温度下10min的顺序，循环扩增30次；
(a3)72℃的温度下扩增1min；
(a4)4℃的温度下扩增直到完成。
作为优选，所述步骤(A3)中的插入和测序包括以下步骤，
(A31)在离心管中加入T载体、钓取出来的基因序列片段、10×DNA ligase buffer试剂1μL、连接酶0.5～1μL和水，将离心管中的混合液混匀并在离心机上离心，使得样品全部沉于管底；
(A32)离心之后，将离心管置于16℃的温度条件下孵育1～3h，或将离心管置于4℃的温度条件下孵育过夜；
(A33)将孵育完成之后的样品进行测序，并利用抗体数据库和/或NCBI对测序反馈回来的序列进行分析，确定是否属于需要的抗体序列，若是则继续进行后续步骤，若不是则重新进行钓取。
作为优选，所述T载体与钓取出来的基因序列片段的摩尔比为1：(3～5)。
作为优选，所述T载体与钓取出来的基因序列片段的摩尔比确定是采用电泳的方法。
作为优选，所述步骤(B)中，
将测序正确后的抗体重轻链及生物信息学分析优化后抗体重轻链的可变区基因序列，分别插入到带有重轻链恒定区的表达质粒pcDNA3.1中。
作为优选，所述步骤(C)中的转化包括以下步骤，
(C1)取出多管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；
(C2)取出三根管子，并在其中按照加入表达质粒DNA、加入标准超螺旋质粒DNA和不加入任何DNA的方式形成对照组，然后使用移液器吸打均匀，并在冰上放置30分钟；
(C3)将三根管子分别放置在42℃的水中，水浴热击90秒；然后再将三根管子快速转移至冰水中，冰浴1～2min；
(C4)冰浴之后在每根管子中加900μl无抗LB培养基，并在37℃的摇床上温和摇动，温育45分钟，使细菌复苏；
(C5)取适量体积的复苏细菌，均匀涂布于含有抗生素的LB平板上，倒置LB平板，并于37℃的温度中培养12～16小时完成转化。
作为优选，所述管子中是按照100μl感受态细胞对应20ng质粒DNA的比例加入相应的质粒DNA。
作为优选，所述步骤(D)中的提取包括以下步骤，
(D1)离心获得13ml复苏细菌中的菌体，在菌体中加入260ul Buffer N3试剂后放冰上预冷30～60min；
(D2)预冷后加入500ul solution I/RNAseA混和试剂，漩涡振荡使菌体完全悬浮后移到EP管中；
(D3)在EP管中加入500ul solution II试剂，颠倒混合后，放冰上冷却2min；
(D4)在EP管中加入250ul冰预冷的buffer N3试剂，颠倒混合，放冰上冷却1～5min后，在4℃的温度下15000×g离心30min；
(D5)将步骤(D4)中EP管内的上清液转移到新的EP管中，加入0.1倍上清液体积的ETR后混合，将混合液在冰上放置10min，在放置期间颠倒多次；
(D6)将步骤(D5)中的EP管在42℃的温度环境中放置5min后，在25℃的温度下12000×g离心3min；
(D7)在步骤(D6)中的EP管内加入200ul GPS试剂，在室温放置3～5min，12000×g离心3min后，弃废液；
(D8)将步骤(D7)中的上层清液转移到2个新的EP管内，在每个EP管内均添加0.5倍清液体积的乙醇，混合后，室温放置2min；
(D9)将步骤(D8)中2个EP管内的混合液体全部转移到吸附柱内，10000×g离心1min，循环多次；
(D10)在步骤(D9)中的吸附柱内加入500ul buffer HB试剂，10000×g离心1min；
(D11)在步骤(D10)中的吸附柱内加入700ul DNA wash buffer试剂，10000×g离心1min，重复两次；
(D12)步骤(D11)中的吸附柱13000×g离心5min；
(D13)将步骤(D12)中的吸附柱架在一个新EP管内，在所述吸附柱内加入125ulElution buffer试剂后，静置5min，然后将EP管10000×g离心洗脱2～3min；
(D14)不更换EP管，重复步骤(D13)；
(D15)在步骤(D14)中的EP管内加入1/10管内液体体积的3M NaAC 25ul试剂，颠倒混合；
(D16)在步骤(D15)中的EP管内添加0.7倍异丙醇193ul，颠倒混合，室温放置5min，然后在4℃的温度下15000×g离心30min，弃上清液；
(D17)在步骤(D16)中的EP管内添加70％乙醇，上下颠倒，在4℃的温度下15000×g离心10～30min，无菌环境下弃上清，然后干燥15～20min；
(D18)在步骤(D17)中的干燥物中加入50ul无菌水，在4℃的温度下过夜重溶，完成提取。
作为优选，所述步骤(E)中的传代培养包括以下步骤，
(E1)从液氮罐中取出HEK293细胞或取出用干冰运输的HEK293细胞，进行细胞复苏和培养；
(E2)先做细胞计数，将细胞悬液依照所需比例兑入培养液中，开始进行传代培养；
(E3)传代后的细胞密度控制在0.3×106个/毫升，每隔4天传代1次；或传代后的细胞密度控制在0.6×106个/毫升，每隔3天传代1次；细胞存活率控制在95％以上，直到完成整个传代培养过程。
作为优选，所述培养液可支撑的最高细胞密度为1.3×107个/毫升；若在震荡培养过程中出现死细胞数过多，则接种低细胞密度进行静置培养，待细胞恢复到正常活率后再进行震荡培养。
作为优选，所述步骤(F)中的瞬时转染包括以下步骤，
(F1)取备两支15ml的无菌离心管，在其中一支无菌离心管中加入5mlKPM和100μg无菌质粒DNA，轻轻吹打混匀；在另一支无菌离心管中加入5mlKPM和500μl TA-293转染试剂，轻轻吹打混匀；
(F2)将含有转染试剂的离心管中的所有液体转移至含无菌质粒DNA的离心管中，轻轻吹打混匀，在室温下静置10min后，制备出质粒-载体复合物；
(F3)从CO2恒温摇床中取出HEK293细胞，边摇边加入步骤(F2)中的质粒-载体复合物，然后放回CO2恒温摇床中震荡培养；3小时后加入适量抗生素。
作为优选，所述步骤(G)中的纯化包括以下步骤，
(G1)在层析柱中按照每100ml细胞培养液上清对应1mlprotein A试剂的比例加入填料后，在4℃的温度下慢速搅拌24小时；
(G2)将步骤(G1)中得到的层析填料，在100mM pH8.2的Tris-HCl缓冲液中漂洗4次后，再用含250mM氯化钠的同样缓冲液洗脱，然后使用硫酸铵对液体进行分步沉淀，在4℃的温度下处理12小时后高速离心，取沉淀；
(G3)将沉淀重新溶于步骤(G2)中不含氯化钠的缓冲液中，并于同样缓冲液中透析过夜后浓缩10倍，得到样品待用。
作为优选，所述步骤(G2)中的层析液在硫酸铵沉淀之前的起始浓度为35％饱和度，沉淀之后的终止浓度为63％饱和度；使用HPLC检定步骤(G3)中样品的纯度；采用Follin酚法定量检测步骤(G3)中样品的蛋白质含量。
作为优选，还包括步骤(H)抗体效价检测，所述抗体效价检测包括以下步骤，
(H1)包被，
用CB将肌酸激酶同工酶(CKMB)稀释到0.5μg/ml，以每孔100μl的量加入到酶标板孔中，在37℃的温度下孵育2h，或在4℃的温度下过夜；
(H2)封闭，
将步骤(H1)中的酶标板拍干，每孔加入200μl封闭液，在室温下封闭1～2h，拍干后在4℃的温度下保存备用；
(H3)加一抗，
将样品用PBS稀释5倍，在步骤(H2)中酶标板的每个孔内加入100μl稀释后的样品，并设置空白对照组和复孔，在37℃的温度下孵育30min，再用洗板机洗板3～4次后拍干；
(H4)加二抗，
用洗液将二抗稀释成5000倍的工作液，在步骤3中酶标板的每个孔内加入100μl，在37℃的温度下孵育30min，再用洗板机洗板3～4次后拍干；
(H5)显色，
将显色液A和显色液B恢复至室温，以1:1的比例混合成工作液，在步骤4中酶标板的每个孔内加入100μl，在37℃的温度下孵育10min；
(H6)终止，
在步骤(H5)中酶标板的每个孔内加入50μl终止液；
(H7)读数，
将步骤(H6)中的酶标板使用酶标仪在450nm处测定并读取OD值。
作为优选，所述封闭液为100ml的PBS试剂中加入1g BSA试剂溶解后制得；所述洗板所用的洗液为1LPBS中加入0.5ml Tween-20试剂后制得。
本发明的第四种技术方案：抗肌酸激酶同工酶抗体在制备急性心肌梗塞早期诊断试剂盒中的应用。
本发明具有如下有益效果：
本发明通过传统杂交瘤融合技术得到了一种高特异性、高亲和力的抗肌酸激酶M型(CKMB)初始抗体，并给出了相关序列，该抗体的重链序列包括SEQ ID NO:1，轻链序列包括SEQ IDNO:2；
本发明通过取代SEQ ID NO:1重链序列中的第12个氨基酸和第20个氨基酸，通过取代SEQ IDNO:2轻链序列中的第6个氨基酸、第12个氨基酸和第22个氨基酸得到一种高特异性、高亲和力的抗肌酸激酶M型(CKMB)1号抗体；1号抗体的重链序列包括SEQ ID NO:3，轻链序列包括SEQ IDNO:4；
本发明通过取代SEQ ID NO:1重链序列中的第11个氨基酸和第24个氨基酸，通过取代SEQ IDNO:2轻链序列中的第13个氨基酸、第21个氨基酸和第42个氨基酸得到一种高特异性、高亲和力的抗肌酸激酶M型(CKMB)2号抗体；2号抗体的重链序列包括SEQ ID NO:5，轻链序列包括SEQ IDNO:6；
本发明通过取代SEQ ID NO:1重链序列中的第22个氨基酸和第50个氨基酸，通过取代SEQ IDNO:2轻链序列中的第13个氨基酸、第35个氨基酸和第42个氨基酸得到一种高特异性、高亲和力的抗肌酸激酶M型(CKMB)3号抗体；3号抗体的重链序列包括SEQ ID NO:7，轻链序列包括SEQ IDNO:8；
将1号抗体、2号抗体、3号抗体和主流商品化抗体分别稀释不同的倍数之后，作用肌酸激酶同工酶，然后使用酶标仪在450nm处测定并读取OD值，测定结果如表1：
Figure BDA0002516208940000051
从表1中的抗体效价检测结果来看，可以看出三种新的抗体与主流商品化抗体试剂盒的检测数据持平或具有更优的结果。
因此，提供一组重轻链序列，将本发明中特异性高、亲和力强的抗肌酸激酶同工酶(CKMB)单克隆抗体应用于临床诊断，可以提高临床诊断特异性、准确性和实效性，最终提高急性心肌梗塞的救治成功率。
附图说明
图1是本发明中抗肌酸激酶同工酶抗体的制备方法流程图；
图2是中由左及右分别为本发明DNA marker、重链NO：1可变区扩增产物、轻链NO：2可变区扩增产物、重链NO：3可变区扩增产物、轻链NO：4可变区扩增产物、重链NO：5可变区扩增产物、轻链NO：6可变区扩增产物、重链NO：7可变区扩增产物、轻链NO：8可变区扩增产物电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1：
如图2所示的抗肌酸激酶同工酶抗体的氨基酸序列，包括
一重链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的序列；以及
一轻链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：2的序列，
SEQ ID NO：1之序列与SEQ ID NO：2之序列具有至少一取代。
取代选自下组，
SEQ ID N0：1之第12个氨基酸由亮氨酸取代为精氨酸，SEQ ID NO：1之第20个氨基酸由亮氨酸取代为异亮氨酸，取代之后得到的重链为SEQ ID N0：3；
SEQ ID NO：2之第6个氨基酸由谷氨酰胺取代为天冬氨酸，SEQ ID NO：2之第12个氨基酸由丝氨酸取代为苏氨酸，SEQ ID NO：2之第22个氨基酸由苏氨酸取代为蛋氨酸，取代之后得到的轻链为SEQ ID NO：4；
且抗体与肌酸激酶同工酶结合。
实施例2：
抗肌酸激酶同工酶抗体的氨基酸序列，包括
一重链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的序列；以及
一轻链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：2的序列，
SEQ ID NO：1之序列与SEQ ID NO：2之序列具有至少一取代。
取代选自下组，
SEQ ID N0：1之第11个氨基酸由甲硫氨酸取代为色氨酸，SEQ ID NO：1之第24个氨基酸由苯丙胺酸取代为脯氨酸，取代之后得到的重链为SEQ ID N0：5；
SEQ ID NO：2之第13个氨基酸由丙氨酸取代为天冬氨酸，SEQ ID NO：2之第21个氨基酸由甲硫氨酸取代为精氨酸，SEQ ID NO：2之第42个氨基酸由丝氨酸取代为谷氨酸,取代之后得到的轻链为SEQ ID N0：6；
且抗体与肌酸激酶同工酶结合。
实施例3：
抗肌酸激酶同工酶抗体的氨基酸序列，包括
一重链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的序列；以及
一轻链之可变区的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：2的序列，
SEQ ID NO：1之序列与SEQ ID NO：2之序列具有至少一取代。
取代选自下组，
SEQ ID N0：1之第22个氨基酸由半胱氨酸取代为丝氨酸，SEQ ID NO：1之第50个氨基酸由亮氨酸取代为谷氨酸，取代之后得到的重链为SEQ ID N0：7；
SEQ ID NO：2之第35个氨基酸由丙氨酸取代为天冬氨酸，所述SEQ ID NO：2之第35个氨基酸由酪氨酸取代为甘氨酸，所述SEQ ID NO：2之第68个氨基酸由苏氨酸取代为色氨酸,取代之后得到的轻链为SEQ ID N0：8；
且抗体与肌酸激酶同工酶结合。
具体的氨基酸序列取代结果如表3：
Figure BDA0002516208940000061
Figure BDA0002516208940000071
实施例4：
抗肌酸激酶同工酶抗体，包括氨基酸序列。
实施例5：
如图1所示首先,取得一与肌酸激酶M型(CKMB)结合的非人类单克隆抗体之轻链可变区氨基酸序列与重链可变区氨基酸序列；与肌酸激酶M型(CKMB)结合的非人类单克隆抗体可选择一鼠源单克隆抗体，此鼠源单克隆抗体之轻链氨基酸序列中包括SEQ ID NO：2之序列，重链氨基酸序列可包括SEQ ID NO：1之序列；分析鼠抗体IgG基因后，根据鼠抗体重轻链基因的可变区的V基因区和CH1区、CL1区的保守序列特征，分别设计重链引物和轻链引物，并送上海生工生物股份有限公司利用DNA合成技术进行合成，得到鼠抗体免疫球蛋白G基因序列；
抗体为免疫球蛋白G抗体，氨基酸序列为免疫球蛋白G抗体之氨基酸序列；
抗体为单克隆抗体。
抗肌酸激酶同工酶抗体的制备方法，包括以下步骤，
(A)获取可变区基因；
步骤(A)中的获取包括以下步骤，
(A1)设计重链引物和轻链引物，并进行相应免疫球蛋白G基因序列的合成；
步骤(A1)中，选取与肌酸激酶同工酶结合的单克隆抗体之轻链可变区氨基酸序列与重链可变区氨基酸序列，轻链可变区氨基酸序列中包括SEQ ID NO：2之序列，重链氨基酸序列可包括SEQ ID NO：1之序列，根据SEQ ID NO：2之序列和SEQ ID NO：1之序列可变区的V基因和CH区、CL区的保守序列特征，分别设计重链引物和轻链引物，重链引物为重链钓取引物，轻链引物为轻链钓取引物，如表2，并利用杂交瘤细胞进行相应免疫球蛋白G基因序列的合成。
表2：分析鼠抗体IgG基因后，根据鼠抗体重轻链基因的可变区的V基因区和CH1，CL1区的保守序列特征分别设计重轻链引物，
Figure BDA0002516208940000081
Figure BDA0002516208940000091
(A2)从杂交瘤细胞总RNA逆转录模版中钓取抗肌酸激酶同工酶抗体可变区基因；
步骤(A2)中的钓取包括以下步骤，
(A21)取一个0.2mL的离心管，在离心管中分别加入10μL的5хTaq Buffer试剂、4μL的dNTP Mixture(10mM each)试剂、1μL的杂交瘤细胞总RNA逆转录模版、5μL的重链引物、5μL的轻链引物、24.75μL的ddH20试剂和0.25μL的Taq DNA polymerase(5u/μL)试剂，然后将离心管中的混合物振荡混匀后，放置在离心机上离心；
(A22)将步骤(A21)中的离心管放置在基因扩增仪模块中进行扩增。
步骤(A22)中的扩增按照以下顺序进行，
(a1)94℃的温度下扩增90min；
(a2)按照94℃的温度下30s、56℃的温度下30s和72℃的温度下10min的顺序，循环扩增30次；
(a3)72℃的温度下扩增1min；
(a4)4℃的温度下扩增直到完成。
(A3)将钓取出来的基因序列插入T载体后测序。
步骤(A3)中的插入和测序包括以下步骤，
(A31)在离心管中加入T载体、钓取出来的基因序列片段、10×DNA ligase buffer试剂1μL、连接酶0.5～1μL和水，将离心管中的混合液混匀并在离心机上离心，使得样品全部沉于管底；
(A32)离心之后，将离心管置于16℃的温度条件下孵育1～3h，或将离心管置于4℃的温度条件下孵育过夜；
(A33)将孵育完成之后的样品进行测序，并利用抗体数据库和/或NCBI对测序反馈回来的序列进行分析，确定是否属于需要的抗体序列，若是则继续进行后续步骤，若不是则重新进行钓取。
T载体与钓取出来的基因序列片段的摩尔比为1：(3～5)。
T载体与钓取出来的基因序列片段的摩尔比确定是采用电泳的方法。
(B)使用全基因合成手段将测序合格的可变区基因序列插入到重轻链表达质粒中；
步骤(B)中，将测序正确后的抗体重轻链及生物信息学分析优化后抗体重轻链的可变区基因序列，分别插入到带有重轻链恒定区的表达质粒pcDNA3.1中。
(C)将表达质粒转化到感受态细胞中；
步骤(C)中的转化包括以下步骤，
(C1)取出多管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；
(C2)取出三根管子，并在其中按照加入表达质粒DNA、加入标准超螺旋质粒DNA和不加入任何DNA的方式形成对照组，然后使用移液器吸打均匀，并在冰上放置30分钟；
(C3)将三根管子分别放置在42℃的水中，水浴热击90秒；然后再将三根管子快速转移至冰水中，冰浴1～2min；
(C4)冰浴之后在每根管子中加900μL无抗LB培养基，并在37℃的摇床上温和摇动，温育45分钟，使细菌复苏；
(C5)取适量体积的复苏细菌，均匀涂布于含有抗生素的LB平板上，倒置LB平板，并于37℃的温度中培养12～16小时完成转化。
管子中是按照100μL感受态细胞对应20ng质粒DNA的比例加入相应的质粒DNA。
(D)从复苏细菌中提取去内毒素的表达质粒；
步骤(D)中的提取包括以下步骤，
(D1)离心获得13ml复苏细菌中的菌体，在菌体中加入260ul Buffer N3试剂后放冰上预冷30～60min；
(D2)预冷后加入500ul solution I/RNAseA混和试剂，漩涡振荡使菌体完全悬浮后移到EP管中；
(D3)在EP管中加入500ul solution II试剂，颠倒混合后，放冰上冷却2min；
(D4)在EP管中加入250ul冰预冷的buffer N3试剂，颠倒混合，放冰上冷却1～5min后，在4℃的温度下15000×g离心30min；
(D5)将步骤(D4)中EP管内的上清液转移到新的EP管中，加入0.1倍上清液体积的ETR后混合，将混合液在冰上放置10min，在放置期间颠倒多次；
(D6)将步骤(D5)中的EP管在42℃的温度环境中放置5min后，在25℃的温度下12000×g离心3min；
(D7)在步骤(D6)中的EP管内加入200ul GPS试剂，在室温放置3～5min，12000×g离心3min后，弃废液；
(D8)将步骤(D7)中的上层清液转移到2个新的EP管内，在每个EP管内均添加0.5倍清液体积的乙醇，混合后，室温放置2min；
(D9)将步骤(D8)中2个EP管内的混合液体全部转移到吸附柱内，10000×g离心1min，循环多次；
(D10)在步骤(D9)中的吸附柱内加入500ul buffer HB试剂，10000×g离心1min；
(D11)在步骤(D10)中的吸附柱内加入700ul DNA wash buffer试剂，10000×g离心1min，重复两次；
(D12)步骤(D11)中的吸附柱13000×g离心5min；
(D13)将步骤(D12)中的吸附柱架在一个新EP管内，在吸附柱内加入125ulElution buffer试剂后，静置5min，然后将EP管10000×g离心洗脱2～3min；
(D14)不更换EP管，重复步骤(D13)；
(D15)在步骤(D14)中的EP管内加入1/10管内液体体积的3M NaAC 25ul，颠倒混合；
(D16)在步骤(D15)中的EP管内添加0.7倍异丙醇193ul，颠倒混合，室温放置5min，然后在4℃的温度下15000×g离心30min，弃上清液；
(D17)在步骤(D16)中的EP管内添加70％乙醇，上下颠倒，在4℃的温度下15000×g离心10～30min，无菌环境下弃上清，然后干燥15～20min；
(D18)在步骤(D17)中的干燥物中加入50ul无菌水，在4℃的温度下过夜重溶，完成提取。
(E)选用HEK293细胞，并对HEK293细胞进行传代培养；
步骤(E)中的传代培养包括以下步骤，
(E1)从液氮罐中取出HEK293细胞或取出用干冰运输的HEK293细胞，进行细胞复苏和培养；
(E2)先做细胞计数，将细胞悬液依照所需比例兑入培养液中，开始进行传代培养；
(E3)传代后的细胞密度控制在0.3×106个/毫升，每隔4天传代1次；或传代后的细胞密度控制在0.6×106个/毫升，每隔3天传代1次；细胞存活率控制在95％以上，直到完成整个传代培养过程。
培养液可支撑的最高细胞密度为1.3×107个/毫升；若在震荡培养过程中出现死细胞数过多，则接种低细胞密度进行静置培养，待细胞恢复到正常活率后再进行震荡培养。
因为每次培养细胞生长速率还是有差异的，传代后的细胞密度控制在0.3×106个/毫升。E3就是对E2的补充说明。
(F)瞬时转染HEK293细胞；
步骤(F)中的瞬时转染包括以下步骤，
(F1)取备两支15ml的无菌离心管，在其中一支无菌离心管中加入5mlKPM和100μg无菌质粒DNA，轻轻吹打混匀；在另一支无菌离心管中加入5mlKPM和500μl TA-293转染试剂，轻轻吹打混匀；
(F2)将含有转染试剂的离心管中的所有液体转移至含无菌质粒DNA的离心管中，轻轻吹打混匀，在室温下静置10min后，制备出质粒-载体复合物；
(F3)从CO2恒温摇床中取出HEK293细胞，边摇边加入步骤(F2)中的质粒-载体复合物，然后放回CO2恒温摇床中震荡培养；3小时后加入适量抗生素。
(G)重组抗体纯化；
步骤(G)中的纯化包括以下步骤，
(G1)在层析柱中按照每100ml细胞培养液上清对应1mlprotein A试剂的比例加入填料后，在4℃的温度下慢速搅拌24小时；
(G2)将步骤(G1)中得到的层析填料，在100mM pH8.2的Tris-HCl缓冲液中漂洗4次后，再用含250mM氯化钠的同样缓冲液洗脱，然后使用硫酸铵对液体进行分步沉淀，在4℃的温度下处理12小时后高速离心，取沉淀；
步骤(G2)中的层析液在硫酸铵沉淀之前的起始浓度为35％饱和度，沉淀之后的终止浓度为63％饱和度；使用HPLC检定步骤(G3)中样品的纯度；采用Follin酚法定量检测步骤(G3)中样品的蛋白质含量。
(G3)将沉淀重新溶于步骤(G2)中不含氯化钠的缓冲液中，并于同样缓冲液中透析过夜后浓缩10倍，得到样品待用。
(H)抗体效价检测；
抗体效价检测包括以下步骤，
(H1)包被，用CB将肌酸激酶同工酶(CKMB)稀释到0.5μg/ml，以每孔100μl的量加入到酶标板孔中，在37℃的温度下孵育2h，或在4℃的温度下过夜；
(H2)封闭，将步骤(H1)中的酶标板拍干，每孔加入200μl封闭液，在室温下封闭1～2h，拍干后在4℃的温度下保存备用；
(H3)加一抗，将样品用PBS稀释5倍，在步骤(H2)中酶标板的每个孔内加入100μl稀释后的样品，并设置空白对照组和复孔，在37℃的温度下孵育30min，再用洗板机洗板3～4次后拍干；其中空白对照组指阴性对照；复孔是为了保证实验数据的准确性，每个孔要做一定数量的重复，测量的时候取这几个孔的平均值；
(H4)加二抗，用洗液将二抗稀释成5000倍的工作液，在步骤3中酶标板的每个孔内加入100μl，在37℃的温度下孵育30min，再用洗板机洗板3～4次后拍干；
(H5)显色，将显色液A和显色液B恢复至室温，以1:1的比例混合成工作液，在步骤4中酶标板的每个孔内加入100μl，在37℃的温度下孵育10min；显色液A的配方为取无水乙酸钠8.2g,β-糊精2.5g,过氧化氢脲428.6mg,加双蒸水至1000mL,调节pH至5.0制得；显色液B的配方为取100mgTMB溶于10mL DMSO中,棕色瓶保存制得；
(H6)终止，在步骤(H5)中酶标板的每个孔内加入50μl终止液；终止液的配方为1.25mol/L的H2SO4溶液；
(H7)读数，将步骤(H6)中的酶标板使用酶标仪在450nm处测定并读取OD值。
封闭液为100ml的PBS试剂中加入1g BSA试剂溶解后制得；洗板所用的洗液为1LPBS中加入0.5ml Tween-20试剂后制得。
实施例6：
抗肌酸激酶同工酶抗体在制备急性心肌梗塞早期诊断试剂盒中的应用。
序列表
<110> 杭州博岳生物技术有限公司
<120> 抗肌酸激酶同工酶抗体及其制备方法、应用、氨基酸序列
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 443
<212> PRT
<213> 小鼠(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Asn Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Leu Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ser Arg Leu Asp Tyr Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys
210 215 220
Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser
260 265 270
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
290 295 300
Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn
305 310 315 320
Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
325 330 335
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
340 345 350
Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
355 360 365
Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala
370 375 380
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr
385 390 395 400
Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
405 410 415
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
420 425 430
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 小鼠(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Thr Val Thr Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 3
<211> 443
<212> PRT
<213> 小鼠(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Asn Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Arg Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Leu Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ser Arg Leu Asp Tyr Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys
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Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
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Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
245 250 255
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Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
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Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
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Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
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<210> 4
<211> 213
<212> PRT
<213> 小鼠(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Phe Val Leu Thr Asp Ser Pro Ala Leu Met Thr Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Met Cys Ser Ala Ser Ser Thr Val Thr Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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<210> 5
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<212> PRT
<213> 小鼠(Artificial Sequence)
<400> 5
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Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Leu Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ser Arg Leu Asp Tyr Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys
210 215 220
Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser
260 265 270
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
290 295 300
Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn
305 310 315 320
Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
325 330 335
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
340 345 350
Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
355 360 365
Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala
370 375 380
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr
385 390 395 400
Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
405 410 415
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
420 425 430
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 6
<211> 213
<212> PRT
<213> 小鼠(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Asp Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Arg Thr Cys Ser Ala Ser Ser Thr Val Thr Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Glu Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 7
<211> 443
<212> PRT
<213> 小鼠(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Asn Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Ser Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Glu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Leu Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ser Arg Leu Asp Tyr Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys
210 215 220
Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser
260 265 270
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
290 295 300
Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn
305 310 315 320
Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
325 330 335
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
340 345 350
Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
355 360 365
Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala
370 375 380
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr
385 390 395 400
Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
405 410 415
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
420 425 430
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 8
<211> 213
<212> PRT
<213> 小鼠(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Thr Val Thr Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Gly Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Trp Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Trp Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
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Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210

Claims (6)

1.抗肌酸激酶同工酶抗体，其特征是：
所述抗体由重链和轻链组成；
所述重链和轻链为以下三种组合形式中的任意一种：
组合形式之一为：
所述重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的序列；
所述轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的序列；
组合形式之二为：
所述重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示的序列；
所述轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示的序列；
组合形式之三为：
所述重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示的序列；
所述轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示的序列；
且所述抗体与肌酸激酶同工酶结合。
2.如权利要求1所述的抗肌酸激酶同工酶抗体的制备方法，其特征是：包括以下步骤，
（A）获取重链和轻链的基因；
（B）使用全基因合成手段将测序合格的重链和轻链的基因序列插入到重轻链表达质粒中；
（C）将表达质粒转化到感受态细胞中；
（D）从复苏细菌中提取去内毒素的表达质粒；
（E）选用HEK293细胞，并对HEK293细胞进行传代培养；
（F）瞬时转染HEK293细胞；
（G）重组抗体纯化。
3.根据权利要求2所述的抗肌酸激酶同工酶抗体的制备方法，其特征是：
所述步骤（A）中的获取包括以下步骤，
（A1）设计重链引物和轻链引物，并进行相应免疫球蛋白G基因序列的合成；
（A2）从杂交瘤细胞总RNA逆转录模版中钓取抗肌酸激酶同工酶抗体重链和轻链基因；
（A3）将钓取出来的基因序列插入T载体后测序。
4.根据权利要求3所述的抗肌酸激酶同工酶抗体的制备方法，其特征是：所述步骤（A1）中，选取与肌酸激酶同工酶结合的单克隆抗体之轻链氨基酸序列与重链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，根据SEQID NO：2之序列和SEQ ID NO：1之序列可变区的V基因和CH区、CL区的保守序列特征，分别设计重链引物和轻链引物，并利用杂交瘤细胞进行相应免疫球蛋白G基因序列的合成。
5.根据权利要求3所述的抗肌酸激酶同工酶抗体的制备方法，其特征是：所述步骤（A2）中的钓取包括以下步骤，
（A21）取一个0.2mL的离心管，在离心管中分别加入10μL的5хTaq Buffer试剂、4μL10mM each的dNTPMixtur试剂、1μL的杂交瘤细胞总RNA逆转录模版、5μL的重链引物、5μL的轻链引物、24.75μL的ddH2O试剂和0.25μL 5u/μL的Taq DNA polymerase试剂，然后将离心管中的混合物振荡混匀后，放置在离心机上离心；
（A22）将步骤（A21）中的离心管放置在基因扩增仪模块中进行扩增。
6.如权利要求1所述抗肌酸激酶同工酶抗体在制备急性心肌梗塞早期诊断试剂盒中的应用。
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