JPH07503608A - Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

Ｆｌａｂｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐｅａｒｉｎｕｍ由来のヘパリバーゼ遺伝 子発明の背景 本発明は、一般的にヘパリンーゼの技術分野に関し、特に、Ｆ１ａｖｏｂａｅｔ ｅｒｔｕ＋ａ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ中で発現するヘパリナーゼＩをコードする遺 伝子に向けられる。 アメリカ合衆国政府が、国立衛生研究所の認可番号２５８１０により、本発明の 権利を有する。 ヘパリンは、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン（ｓｅｒｐｉｎｓ））を活性 化する抗凝血剤である。このヘパリンは、血液凝固カスケードにおいて、Ｄａｍ ｕｓら、Ｎａｔｕｒｅ　２４６：３５５−３５７（１９７３）により記載のよう に、鍵となる役割を演じる。Ｌｉｎｄａｈｌら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｔ 　Ｓｃｉ、　１１：２２１−２２５（１９８６）によれば、ヘパリンは、現在既 知である、最も酸性の天然ボッマーである。それは、叶ウロン酸１．４−β−叶 グルコサミンである１、４結合ジサッカライドの主要な繰り返し単位からなり、 モ／すｌカライド単位あたり４価の平均負電価（３つの硫酸基および１つのカル ボキシラド基（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ　ｚｒｏｕｐ））を有する。ヘパリンは 、Ｋｕｓｃｈｅら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　７７： ６５５１−６５５５（１９８０）およびＣｏｍｐｅｒ、Ｐｏ１ｙ＋＊ｅｒ　Ｍｏ ｎｏｇｒａｐｈ　７．１９８１による報告のように、３．０００〜４５，０００ ダルトンの平均分子量を有する多分散系であり、かつＤ−グルクロン酸のし一イ ズロン酸への部分的エピマー化、および不完全なＮおよび〇−硫酸化により不均 質である。 さ−らに、ヘパリンのようなプロテオグリカンは、広範囲の生物学的作用を有し 、これには、血液化学、成長因子相互作用および傷治癒、細胞外マトリ、クスお よび免疫応答を介した細胞における塩基性構造タンパク賃との相互作用を含む。 タンパク質／ペプチド／ヘパリン／複合体炭水化物相互作用の基本的性質が、重 要である。ヘパリンは、かなり不均質であると考えられるが、Ｃａｒｄｉｎ、　 Ａ、　Ｄ、および■、　Ｊ、　Ｒ，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、　Ａｒｔｅｒｉｏｓｃ ｌｅｒｏｓｉｓ　９．２１−２１−３２（１９により論評されるように、異なる ヘパリン画分が、その生物学的役割に対して、なんらかの組成上、そして、おそ らく構造上の特異性を示唆する明瞭で独特な特性を示すことは、現在、まったく 明らかである。 ヘパリンーゼは、ヘパリンリアーゼとも呼ばれ、詳細にわたって特徴づけられて いるヘパリンを分解し得る唯一の既知の酵素である。ヘパリナーゼは、酵素委員 会により、ＥＣ４，２゜２．７と命名されている。Ｇａ１ｌｉｈｅｒら、Ｅｕｒ 、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｆ、　１５：２Ｓ２（１９８２）によ れば、本酵素は、グラム陰性土壌単離間であるＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋ 　ｈｅｐａｒｉｎｕｗのペリプラズム空間に見出されるポリサッカライドリアー ゼである。Ｈｏｗ　ｉｎｚおよびＬｉｎｋｅｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 、　２４５：６１７０（１９７０）Ｉこ君己載のよう１こ、Ｆ。 ｈｅｐａｒｉｎｕｍは、ヘパリンを、炭素および窒素の唯一の供給源として利用 する。ヘパリンーゼは、ヘパリン異化の最初の酵素である。構成的には小量しか 分泌されないが、Ｇａ１ｌｉｈｅｒら、Ａｐｐ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　４１：３６０（１９８１）は、酵素発現が、へバリンにより誘導 され、培地中の硫化物により可逆的に抑制されることが発見された。Ｌｉｎｄｈ ａｒｄｔら、Ａｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９＋４ １（１９８４）は、ヘパリナーゼが他のポリアニオン性ポリサブカライドにより 阻害されることを示した。 ヘパリンーゼは、標準的クロマトグラフ技術により精製され、その酵素特性が詳 細にわたって明らかになった。これは、Ｙａｎｇら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｗ、　２６０：１８４９（１９８５）を含む科学者により記載されている。本酵 素は、４４．０００ダルトンの単量体タンパク質で約９の２１を有する。 ヘパリンーゼは、エリミナーゼとして作用し、不飽和二重結合を非還元末端基に 残す。この二重結合は、不飽和産物の２３２ｒ＋ｍでの吸光度によるヘパリンー ゼ活性のア・７セイにおいて使用される。本酵素は、塩類に対する耐性が低く、 ヘパリンに対し非常に特異的であり、３０ｎＭのＫｄを有する。ヘパリナーゼは 、４．５Ｋｃａｌ／ｍｏｌの活性化エネルギー、ａＸ　１０−’のｋｍ値および ４Ｘ　１０−’Ｍ／分の最大反応速度（Ｖ＋ｎａｘ）を宵する。 ヘパリンは、しばしば外科的に使用され、血液凝固を防止し、心肺および腎臓透 析機のような３０の体外装置の適合性を高める。ヘパリンーゼによるヘパリンの 酵素的な分解は、外科手術において、ヘパリンの抗凝血特性を除去するのに十分 であるｏ　Ｌａｎｇｅｒら、ｉｎ　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：　ｒ界面の現象 および適用」、　Ａｄｖ、ｉｎ　Ｃｈｅｗ、　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅ ｓ、　Ｃｈａｐ、　１３．　４９３頁−５０９頁（１９８２）に記載のように、 この特性により、ヘパリナーゼは、固定化バイオリアクターとして心肺および腎 臓透析機と組み合わせられ、血液を脱ヘパリン化するために使用されてきた。ヘ パリナーゼバイオリアクターの商業上の適用は、臨床試験中である。 ヘパリナーゼバイオリアクター使用における主要な問題は、表面上に固定化され る十分な量の純粋なヘパリナーゼの入手可能性にある。この理由は、主に、Ｆ、 　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ中で、構成的に発現されるヘパリナーゼの量が、非常に低 いからである。 Ｆ、　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ中での、ヘパリンによるヘパリンーゼ発現の誘導は、 必要とされるヘパリンの量と、どんな実際の用途に対しても合理的な量のヘパリ ナーゼを生産するための発酵の規模とのために非常に高価である。 ヘパリンーゼ遺伝子のクローニングおよび発現は、いくつかの方法において重要 である。第１に、現在までに、クローニングされ、特徴が明らかであり、プロテ オグリカンを脱型台する唯一の酵素は、ヘパリンーゼである。第２に、ヘパリン は、外科手術に一般的に使用される唯一の抗凝血剤である。 したがって、血液の脱ヘパリン化は、重要な医学上の問題点である。さらに、Ｒ ｏｓｅｎｆｅｌｄおよびＤａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　 ２３７：６３９−６４６（１９８６）に記載のように、ヘパリナーゼに触媒され たヘパリンの、さらに低分子量のヘパリン分子への分解は、特異的抗凝血活性を 有する生産物を生成するために使用され得る。 改変された活性を有する組換えヘパリンーゼをデザインすることは、学術上およ び商業的に興味深い。例えば、ヘパリナーゼは、この酵素がＡＴ−Ｉｌｌ結合オ リゴマーを正確に開裂するため、血液を脱ヘパリン化するのに使用される。他方 、酵素結合の機構およびヘパリンの脱型台をさらに理解すれば、改変された特異 性を有する組換えヘパリナーゼがデザインされ得る。すなわち、ＡＴ−ＩＩ＋結 合ヘパリンは、組換え酵素により開裂されない。これは、ＡＴ−ＩＩ＋結合ヘパ リンオリゴサツカライドを生産する非常に有用な方法で有り得る。そして、現在 、このＡＴ−ＩＩＩ結合ヘパリンオリゴサツカライドは、抗凝血剤としての使用 のために、大量には入手し得ない。酵素の精製または固定化を、補助および／ま たは改善し得るヘバリナーゼの生産もまた、非常に重要である。例えば、標識（ 特定のペプチド配列）を、酵素の活性を変えないが、固定化の化学的作用を非常 に効果的にする領域に付加し得る。これは、酵素の固定化基質上への装着の改善 を助ける。 それゆえ、本発明の１つの目的は、ヘバリナーゼをコードする遺伝子および大量 のヘバリナーゼの生産を容易にする発現用システムの提供である。 本発明のもう１つの目的は、遺伝子を改変し、改変された特異性および他の所望 の特性を有する組換えヘパリナーゼの生産の方法と手段の提供である。 本発明のもう１つの目的は、サイトカインープロテオグリカン相互作用の領域で 、繊維芽細胞成長因子−ヘパリン相互作用により例証されるように、道具または 診断剤として使用する純粋なヘバリナーゼを提供することである。 発明の要旨 Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ遺伝子 の、ポリメラーゼ連鎖反応を用いるクローニングを記載する。精製されたヘバリ ナーゼのトリプシンペプチド起源のアミノ酸ｒｉｕＩｌｌゲノムＤＮＡをテンプ レートとしてＰＣＲ中で使用され、６００塩基対のプローブが生成された。この プローブは、ｐｌＪｃ１８　Ｐｌａｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのゲノムライブラリ をスクリーニングするのに使用された。このオープンリーディングフレーム（Ｏ ＲＦ）は、分子量が４３，８００ダルトンの前駆体タンパク質をコードする１１ ５２塩基対に対応する。１１の異なるトリプシンペプチド（全アミノ酸の約４８ ％）が、ＯＲＦ中にマツピングされた。このアミノ酸配列は、２０残基のリーダ ーペプチドを示す。 ヘバリナーゼは、上記遺伝子から発現され得る。さらに、上記遺伝子は、改変さ れた酵素活性、または、特には改変された結合特性を有するヘパリナーゼを生産 するように改変され得る。上記配列は、他の関連する酵素をコードする遺伝子の 単離において、プローブとしても゛また使用され得る。 図面の簡単な説明 図１は、それぞれ、６００および１６０塩基対である、ＰＣＲ生産物Ｙ１：Ｃお よびＤＥＣの模式図である。この６００塩基対ＰＣＲ生産物は、プライマーであ るＤおよびＣと共に、テンプレートとして使用され、１６０塩基対のＤＥＣ生産 物を生成した。 図２は、ヘパリナーゼ遺伝子を含有する挿入断片を有するゲ／　ムＤＮＡｌ７） 　ｐＵｃ１ｇプラスミドである、ｐＲＳ、　ＨＥＰ５１の制限７７ブである。こ のプラスミドは、５６３１塩基長であり、約２３００塩基対の挿入断片を宵する 。このヘバリナーゼ遺伝子は、Ｋｐｎｌ−Ｋｐｎｌフラグメント中にある。 図３は、オープンリーディングフレーム中での、異なるトリプ／ンペプチドマノ ビングと共にヘパリナーゼ遺伝子の構造を示すにｐｎｌ−Ｋｐｎｌフラグメント の地図である。６つの異なるペプチドをヘパリナーゼ遺伝子翻訳領域中にマツピ ングした。 発明の詳細な説明 Ｆ、　ｈｅｐａｒｉｎｕ＋ｏのヘバリナーゼをコードする遺伝子をクローニング した。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、以下に示す： 以下の配列（配列番号：　１、塩基対１から１７２を含む）は、リーダーペプチ ドをコードする： ＣＣＴｒＴ　ＴＧＧＧＡ　ＧＣλＣＡＡ　（、ＧＣＡＧ　ＡＡＣＣＡ　ＴＣＴＣ ＣＧＡＡＣＡ　ＡＡＧＧＣＡＧ入入ＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＡＡ　ＡＣＡＧＡ　Ｃ ＡＧＣＡ　ＡＴＴＣＡ　ＴＣＣＧＣＴＴＴＣＡ　ＡＣＣＡＡ　ＡＧＴＧＡ入ＡＧ ＣＡ　ＴＴＴ入入へ人ＡＣＡＡ　ＴＡＣＣＡ　ＧＡＡＴＧ　ＴＣＧＣＡ　ＴｒＴ ＣＣＣＴＴＴＣへＧＣＧＴ入ＣＴｒＴ　ＴｒＧＧＧ　Ｔへ人入Ｔ　へ人ＣＣ入　 ＡＴＡＡＡ　入ＡＣＴ入　ＡＡＧＡＣＧＧ以下の配列（配列番号：　Ｌ　１基対 １７３から１３７９を含む）は、ヘバリナーゼをコードする： 入ＴＧ　入ＡＡ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＡＴＴ　ＣＴＡ　ＴＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＴ　 ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＣＡＧ　ＣＡＡＣＴＧ　ＴＴＣＣＴＣＴＧＴ　ＴＣＧ　ＧＣＴ 　ＴＡＣＧＣＣＣＡＧ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＴＣＣＧＧＴ　ＡＡＣＡＴＣ ＣＣＴ　ＴＡＣＣＧＧ　ＧＴｋ　ＭＴ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＧＣＣＧＡＣＡＧＴＧ ＣＴ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＧＣＧ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　ＧＡＣＭＣＡＡＡ　 ＴＧＧ　ＧＴＧ　ＧＣＡＧＴＡ　ＧＧＣＡＴＣＡＡＴ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＴＡＴ 　ＧＣＡ　ＴＴＡ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＧＡＣＧＡＴＡＡＡ　ＣＴＧ　ＣＧＣＴＴ Ｔ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＡＭ　ＣＣＡ　ＴＣＣＴＡＴ　ＣＧＣＴＴＴ　ＧＡＧＣＴ ｒ　ＡＡＡ　ＧＣＣＧＡＡ　ＧＡＣＡＡＴ　ＴＣＧ　ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　 ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＧＣＡＧＧＡ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＡＡＧ　ＧＧＣＣＧＴ　ＡＣ Ａ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＴＣＧ　ＴＡＣＡＧＣＴＡＴＧＣＡ　ＡＣＣＡＣＣＡＡＴ 　ＧＡＴ　ＴｒＴ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＴＴ　ＣＣＣＣＣＡ　ＡＧＣＧＴＡＴＡ ＣＣＡＡ　ＭＴ　ＧＣＧ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　ＣＴＡ　入ＡＡ　ＡＣＣＧＴｒ　Ｔ ＡＴ　ＣＡＴ　ＴＡＣＧＧＣＡＡＡ　ＧＧＧ　ＡＴＴ　ＴＧＴ　ＧＡＡ　ＣＡＧ 　ＧＧＧ　ＡＧＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴ　ＴＣＡ　ＧＴＧ　Ｔ ＡＣＡＴＡ　ＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＩ’ＣＣＣＣＧＡＣＡＡＴＧＣＧ　ＡＣＴ　 ＡＣＴ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＧＣＣＣＡＡ　ＴＧＧ　ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　Ｃ ＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＣＧ　ＣＴｒ　ＧＴＡ　ＣＣＴ　入ＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡ Ｇ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＡＴｒ　ＡＡＡ　ＡＣＡＣＴＧ　ＡＧＣＡＴＡ　ＧＡＡ　 ＧＡＧ　ＴＴＩ’　ＴＴＧ　ＧＣＣＴＴＡ　ＴＡＣＧＡＣＣＧＣＡＴＧＡＴＣＴ ＴＣ八人Ａ　八人Ａ　ＡＡＴ　ＡＴＣＧＣＣ（ＡＴ　ＧＡＴ　八人Ａ　ＧＴｒ　 ＣＡＡ　大入入入ＡＡ　ＧＡＴ　ＡＡＧ　ＧＡＣＧＧＡ　ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＡＣ Ｔ　ＴＡＴ　ＧＴＡ　ＧＣＣＧＧＡ　ＡＡＧＣＣＡ　ＡＡＴ　ＧＧＣＴＧＧ　Ａ ＡＧ　ＧＴＡ　ＧＭ　ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＴＡＴ　ＣＣＣＡＣＧＣＴＧ　 ＧＣＣＴｒＴ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＡＡＡ　ＧＧＧ　ＴＡＴ　ＴＴｒ　Ｔ ＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣＡ　ＡＡＣＴＣＣＧＡＣＣＧＧ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＴ 　ＡＣＣＧＡＣＡＡＡ　ＧＣＣＧＡＣＣＧＴ　入ＡＣＡＡＴ　ＧＣＣ、Ｕ−Ｔ　 ＣＣＣＧＡＧ　ＭＴ　ＡＧＴ　ＧＡＡ　ＧＴＡ　ＡＴＧ　入ＡＧＣＣＣＴＡＴ　 ＴＣＣＴＣＧ　ＧＡＡ　ＴＡＣＡＡＡ　ＡＣＴ　ＴＣＡ　入ＣＣＡＴＴ　ＧＣＣ ＴＡＴＡＡＡ　ＡＴＧ　ＣＣＣＴＴＴ　ＧＣｅ　ＣＡＧ　ＴＴＣＣＣＴ　ＡＡＡ 　ＧＡＴ　ＴＧＣＴＧＧ　ＡＴＴＡＣＴ　ＴＴｒ　ＧＡＴ　ＧＴＣＧＣＣＡＴＡ 　ＧＡＣＴＧＧ　ＡＣＧ　入Ｍ　Ｔ入’Ｉ’　ＧＧＡ　ＡＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡ Ｔ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＴＴＧ　ＡＭ　ＣＣＣＧＧＴ　ＭＧ　ＣＴＧ　ＧＡＴ　Ｇ ＴＧＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＴＡＴ　ＡＣ（ＡＡＧ　ＡＡＴ　ＡＡＧ　ＡＡＡ 　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＧＣＧＣＡＴ　ＡＴＣＧＴＡ　ＡＡＣＣＡＧ　ＣＡ Ｇ　ＣＡＡ　ＡＴＣＣＴＧ　ＡＴＣＧＧＡ　ＣＧＴ　ＡＡＣＧＡＴ　ＧＡＣＧＡ Ｔ　ＧＧＣＴＡＴ　ＴＡＣＴｒＣＡＡＡ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＴｒ　ＴＡＣＡＧ ＧＧＴＣＧＧＴ　ＡＡＣＡＧＣＡｃＧ　ＧＴＣＣＣＧ　ＧＴｒ　ＡＣＴ　ＴＡＴ 　ＭＣＣＴＧ　ＡＧＣＧＧＧ　ＴＡＣＡＧＣＧＡＡ　ＡＣＴ　ＧＣＣＡＧＡ　Ｔ ＡＧ　（！４之コドン　）以下はヘバリナーセのアミノ酸配列（配列番号、２） である：Ｍａｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ工ｌａ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｉ ｌａ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　ＧｌｎＬｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｓａ ｒ　Ａｈａ　Ｔｙｒ　入１ａ　にｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　５ｅｒＧｌｙ 　Ａｓｎ　工１ａ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ 　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ入１ａ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｈａ　工Ｉｓ　 Ｘ１ｅ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　八１ａＶａｌ　にｌｙ　工 １ａ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　入１ａ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ａ ｓｐ　ＡｓｐＬｙｓ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒ ｏ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｐｈａ　ＧｌｕＬａｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ 　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ ｃｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　 Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＴｙｒＡｈａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐ ｈａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　ＶａｌＴｙｒ　Ｇｌ ｎ　Ａｓｎ　入１ａ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｙ ｒ　Ｈｉｓ　ＴｙｒＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ 　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　ＴｙｒＴｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓａｒ　 Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｐｈ＠　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　 Ａｓｎ入１ａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　工ｌｅ　Ｐｈａ　入１ａ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｈ ｉｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ＳａｒＡｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａｌ ａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌａ　Ｌｙｓ　ＴｈｒＬａｕ 　Ｓａｒ　工１ａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　入１ａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ 　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ工ｌａ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　入５ｎ　工ｌｅ　 Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＬｙｓ　Ａｓｐ　Ｌ ｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｔ’ｙｒ　Ｖａｌ　入１ａ　 Ｇｌｙ　ＬｙｓＰｒｏ　入ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｎ　Ｇｌｙ　（、ｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＬａｕ　Ａｌａ　Ｐｈａ　ｃ ｌｙ　Ｐｈｅ　ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ工１ｅ　Ｌｙ ｓ入１ａ　Ａｓｎ　Ｓｉｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ 　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　入１ａ　Ａｓｐ入ｒ９　人ｓｎ　Ａｓｎ　入１と　入ｓｎ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｍａｔ　ＬｙｓＰｒｏ　Ｔ ｙｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｕ　Ｔｙｒ　ＬＹＥ　Ｔｈｒ　Ｓｅ’：　Ｔｈｒ工 ｌｅ　Ａｌａ　ＴｙｒＬｙｓ　Ｍａｔ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｈ ａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　工ＩｇＴｈｒ　Ｐｈａ　Ａｓｐ 　Ｖａｌ　入Ｌａ　工１ｅ　へｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ 　Ｌｙｓにｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　 ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　ＶａｎＭｅｔ　Ｍａ：　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔ ｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓλ１ａＨｉｓ 　工１ｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　工’、ｅ　Ｌａｕ　工１ ｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　入５ｎＡｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ 　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　工１ｅ　Ｔｙｒ　ｋｒｑＶａｌ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　 Ｌｅｕ　５ａｒＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈ−Ａｌａ　Ａｒｇ。 実施−例１　：　Ｆ、　ｈｅｐａｒｉｎｕｍのヘバリナーゼをコードするｅＤＮ Ａの単離および分析 他者による、以下を用いた予備的なりローニングの試みが不成功だったため、ポ リメラーゼ連鎖反応を、ヘパ’Ｊ　ｔ−ゼ遺伝子のクローニングに使用した＝１ ）抗体のスクリーニング、２）Ｅ、　ｅｏｌｉ中の機能的に活性なヘバリナーゼ のスクリーニング、および３）臭化シアン（ＣＮＢｒ）化学消化により再生され たタンパク質配列起源のプローブを用いたヘパリナーゼ遺伝子のスクリーニング 。逆層精製ヘパリナーゼを、還元し、アルキル化し、そしてトリプリンで消化し 、以下に記載のように、２１０ｎｌおよび２７？ｎｍで（チロシンおよびトリプ トファンについて）モニターして、約６０ペプチドのピークを、逆層ＨＰＬＣに より分Ｍ採取した。 トリプシン゛および　ンパク　１ ヘパリナーゼを、Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｕ＋、　２４ ８：６４０８（１９７３）、０ｔａｔａｎｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ、　Ｒｅｓ、 　８８：２９１（１９８１）、およびＹａｎｇら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 、　２６０：１８４９（１９１１５）に記載のように、精製した。これらの文献 は、本門細書中に参考として援用した。 最終精製段階は、タンパク質の疎水性残基を利用する逆層カラムを使用して高性 能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により実施シた。１ナノモル（約４５μ ｇ）の精製酵素を、５０μ＋ノｇＭ尿素、ｏ、４ＭＫ酸アンモニウム溶液中で変 性し、５ｏｏｃ５５Ｉ＠Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元し、室温に冷却 し、そして、１ｈ＋Ｍヨードアセトアミドを用いて１５分間暗黒中でアルキル化 した。総反応容積は、２ｏｏμｌだうた。この反応混合液に、１／２５（ｖ／ｗ ）のトリプシンを添加し、３７℃で２４時間消化を行った。反応は、サンプルを 、６５°Ｃで２分間加熱することで停止した。消化物を、逆層ＨＰＬＣで、０か ら８０％のアセトニトリルのグラジェントを用いて分離した。トリプシンペプチ ドを、２１０ｎＩ１１および２７？ｎｍでモニターした。 トリプシン消化に関するピークを、エッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ ｆｆ　ｔｕｂｅ）に採取した。ペプチドピークの均質性に基づき、８つの異なる ピークを、ＭＩＴの癌研究センターのバイオポリマー実験室にあるＡｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製シークエンサー、モデル４７７を、モデル１２０Ｐ ＴＨアミノ酸分析装置とオンラインで共に用いて配列決定した。この配列を、以 下の表■に示す。（Ｋ、Ｒ）の記号は、表■中に使用され、トリプシンがリンノ またはアルギニン残基の一方を切断することを示す。表Ｉ中のアスタリスクは、 決定し得なかったアミノ酸配列を表す。 ｔｄ　Ｌｘと記号化されるペプチドは、配列決定された最長のペプチドであり、 ３８残基を有する。未変性のヘパリナーゼもまた、配列決定され、Ｎ末端アミ／ ＠を決定した。 （以下余白） 表！＝ヘパリナーゼのトリプシンペプチドの配列ペプチド　−二△１ＬＡ ｔｄ　０４　（Ｋ、　Ｒ）　Ｇ工ＣＥＱＧＳＳＲｔｄ　０９　（Ｋ、　Ｒ）　Ｔ 　Ｖ　Ｙ　ＨＹ　Ｇ　Ｋｔｄ　０９／　（Ｋ、　Ｒ）　Ｔ　Ｓ　Ｔ　Ｉ　Ａ　Ｙ 　Ｋｔｄ　２１　（Ｋ、　Ｒ）　Ｆ　Ｇ　Ｉ　Ｙ　Ｒｔｄ　３３　（Ｋ、　Ｒ） 　Ａ　Ｄ　工Ｖ　Ｎ　Ｑ　Ｑ　Ｅ　工Ｌ　工Ｇ　ＲＤ　Ｄ　＊ＹＹＦＫ ｔｄ１９　（Ｋ、Ｒ）　工　ＴＹＶＡＧＫＰＮＧＮＫＶＥＱＧＧＹＰＴＬＡＦ嚢 ｔｄ　４３　（Ｋ、　Ｒ）　Ｍ　Ｐ　Ｆ　Ａ　Ｑ　７　Ｐ　Ｋ　Ｄ　ＣＷ　工Ｔ 　Ｆ　Ｄ　ＶＡＩＤ＊ＴＫ ｔｄ　４０　（Ｋ、　Ｒ）　Ｎ　Ｌ　５　Ｇ　Ｙ　Ｓ　Ｅ　Ｔ　Ａ　Ｒｔｄｍ４ 　Ｋ　Ｎ工ＡＨＤＫＶＥＫＫ ｔｄ　７２　Ｋ　Ｔ　Ｌ　Ｓ　工Ｅ　Ｅ　Ｆ　Ｌ　Ａ　Ｌ　Ｙ　Ｄ　Ｒｔｄ　Ｌ ｘ　ＲＳ　Ｙ　Ｔ　Ｆ　Ｓ　Ｖ　Ｙ　Ｉ　Ｐ　Ｓ　Ｓ　Ｆ　Ｐ　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｔ 　Ｔ　工Ｆ　Ａ　Ｗ　ＨＧ　Ａ　Ｐ　Ｓ　ＲＴ　Ｌ　Ｖ　Ｔ　Ｐ　Ｅ　工　Ｋ３ セットのプライマーを、表１１に示すようにデザインし、合成した。プライマー を、ＭＩＴの癌研究センターのバイオポリマー実験室にあるＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製シークエンサーモデシ−クエンサーモデル４フフＴＨアミ ノ酸分析装置とオンラインで共に用いて合成した。これらのプライマーセットを 、ヘパリナーゼ遺伝子をクローニングするために、ＰＣＲ増幅系で使用した。シ ンボル°ドは、イノンンヌクレオチドを表わす。各ペプチドのアミノ酸は、太字 で書いているが、プライマーデザインのために選択された残基を表す。２つの異 なるプライマーセ、トを、トリプシンペプチド３３用に構築し、プライマーの３ ゛末端でのインロイシン置換の程度を減少した。 （以下余白） Ａ　Ｃ／−ＡＴＴ　ＡＡｒＴ／ＣＩ　ＣＡＣＡ／Ｇ’ｌ　ＧＡＣＡ／Ｇ）ＡＴＴ 　ｒｃ／Ｔ）Ｔ１表１−Ｉ　：ヘパリナーゼプライマーのデザインペプチド：　 ｔｄ０４ アミノ酸配列： ＫＧ工ＣＥＱＧＳＳＲ プライマｍ： Ｙｌ　５’　−ＡＡＡ　ＧＧＧＡＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ）　ＴＧ（Ｔ／Ｃ）　ＧＡ（Ａ ／Ｇ）ＣＡ（Ａ／Ｇ）　ＣＧ　−３！ アミノ酸配列： （Ｋ、Ｒ）ＭＰＦＡＱＦＰＫＤＥＷＩＴＦＣＶＡより＊ＴＫ アミノ酸配列： （Ｋ、　Ｒ）　Ａ　Ｄ　Ｘ　Ｖ　Ｎ　Ｑ　Ｑ　Ｅ　Ｉ　Ｌ　Ｘ　Ｇ　Ｆ２　Ｄ　 Ｄ　＊　Ｇ　Ｙ　Ｙ　Ｆ　Ｋ　Ａプライマーニ ゲするために選択した。３回のコロニー精製で残った２つの陽性クローンを同定 した。 ゲノムＤＮＡ　ＲＮ　およびブラスミドライブラ唾Ｆ、　ｈｅｐａｒｉｎｕｍゲ ／ムＤＮＡを、ゲノの改変をしたＡ、Ｓ、Ａ、Ｐ、Ｔ″キツトＢｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）で単離した◎ 単離したＤＮＡを、セファデックス１″Ｇ−５０カラム（Ｎｉｃｋ　ｃｏｌｕ＋ ＊ｎ。 Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、　ＮＪ）で脱塩し、セントリコ ンＴ″Ｐ−３０（ＡＩＩｌｉｃｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　 ＭＡ）を用いて最終容積１００１に濃縮した。典型的には、ｌＸ１０’の細胞か ら、１０５ｇから１１５ｇのＤＮＡを得た。全細胞ｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ 技術情報出版ＴＢ　０Ｂ７１２／８９、　Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃａｒｐ、、　Ｍａ ｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ　５３７１１に説明されるグアニジンチオシアネート手法を 用いて単離した。ｐＵｃ１ｇプラスミドは、マサチューセッツ工科大学の生物学 部のＡ、Ｊ、５ｉｎｓｋｅｙ博士から得た。上記ライブラリは、Ｆ、　ｈｅｐａ ｒｉｎｕｍゲノムＤＮＡを用いて構築した。ゲノムＤＮＡを、超音波処理し、Ｅ ｃｏＲ１リンカ−を添加して改変し、次いでｐＵｃ１Ｂベクターに連結した。　 ＤＨ５ａを、１）ＵＣＩＩＩゲノムライブラリで形質転換した。 とｔ１１１Δ皇皿 ヘパリナーゼのトリプシン消化プライマーの増幅を、５Ｇ＋ａＭのＭＣＩ、　１ ０ｍＭのトリスＨＣＩ　（ｐＦ［８，３）、１．５ａＭのＭｇＣｈおよび０．０ １％のゼラチンに、４種のデオキシリボースヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ ）を２００Ｍで加え、０．５Ｍのプライマーおよび３１のゲノムＤＮＡをテンプ レートとして用い、そして、２．５ユニ、２トのＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕ ｓ　Ｃａｒｐ、、　Ｅ＋ｏｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ）を含有する２５１の反応 容積および２５１の鉱物油で実行した。サンプルを、９２°Ｃ（２分）、５０℃ （１分）および７２℃（３分）のステップサイクルにプログラムした自動加熱ブ ロック（ＤＮＡサーマルサイクラ−１Ｐｅｒｋｉｎ　ＥＩＩＩｌｅｒ　Ｃｏｒｐ 、、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ）上に置いた。このサイクルを１．３５回繰り返 した。最終サイクルは、７２°Ｃで１０分間の延長を加えた。ＰＣＲ生産物を、 ０．６ｄｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する０、８％のアガロースゲル上で分 析した。コントロール反応は、ＣｅＬｕ５キツトで行ったＯ Ｐ　ａｖｏｂａｃｔｅｒ’ｕｍ　ｈｅ　ａｒ’ｎｕｍのυＣ１８ゲノムライブラ リのスフ１−ニング ｐＵｃ１８ライブラリを、約１５００コロニーを得るように、タイタープレート で培養し、ＰＣＨにより生成したプローブによりテストした。各プレートは、直 接にニトロセルロース上で適切な小さなサイズに成長した約１００のコロニーを 有した。次いで、このコロニーを１晩さらに成長するように復製した。 上８己ＰＣＲプローブを、Ｒａｎｄｏｍ　Ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ”キッ ト（Ｒ１（Ｎ）（ＩＢＩ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ、）を用いて標識 した。以下簡単に記載する。低温融解アガロースゲルから泳動したＰＣＲ生産物 由来の１ｄｇのＤＮＡを単離し、９５°Ｃで１０分間煮沸し変性し、次いで水冷 した。反応緩衝液中の変性ＤＮＡに、１０ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、　ｄＧＴ Ｐ。 ｄＣＴＰＳｄＴＴＰ）、ランダムへキサヌクレオチド類、および５０μＣ１の３ ２ＰｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を添加した。この反応を、３０分間３ ７°Ｃで、クラ／つと共に実施し、０．２ＭのＥＤＴＡを用いて停止した。標識 反応後、標識プローブを、遊離ヌクレオチドから、セフーアデノクスＧ−５ｏカ ラム（Ｎｉｃｋ　Ｃｏｌｕｍｎ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、 　ＮＪ）を使用して精製した。上記コロニーを、上記標識プローブで、本明細書 中に参考として援用するＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ、　ＮＹに記載のような標準コロニーハイブリダイゼー７ｇン手法を用いて 、スクリーニングした。 ２つの陽性クローンを単離し、そのプラスミドを６００塩基ＰｃＲ生産物を生成 する能力についてテストした。両クローンとも、テストの結果は陽性であり、そ して制限マツピングでさらに特徴を明らかにした。クローンｐＲＳ　）ｌｅｐ５ １は、約１．６ｋｂのＫｐｎ−Ｋｐｎフラグメントを伴うｐｔｌＣ１８中の２． ３ｋｂの挿入断片（図２に示す）である。このフラグメントは６００塩基対のＰ ＣＲ生産物を生成するための陽性テンプレートだった。ｐＲｓｓｉのＫｐｎ　Ｉ −Ｋｐｎ　Ｉフラグメントを、Ｍ１３中にサブクローニングし、配列決定した。 吐Ｍ

【肚犬定 ＤＮＡ配列決定は、Ｍ１３ファージを用い、ジデオキシアデノシン５′−アルフ ァー３５３−三リン酸およびシーケ不一ス（Ｓ６ｑｕｅｎａｓｅ）（ＵＳ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　Ｃ１ｅａｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）を、製造者 により記載されるように使用して実施した。配列データを、サイクロン■バイオ システムズ＜Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　 Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、　ＣＴ）によりＴ４のＤＮＡポリメラーゼを 使用して、Ｍ１３の継続的に入れ千秋に重なった欠失を使用して得、あるいは、 合成オリゴヌクレオチドブライマーを用いて配列決定しこの配列は、３８４のア ミノ酸および約２１アミノ酸のリーダー配列に対応する１１５２塩基対の単一の 連続するオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を明らかにした。このＰＣＲ 生産物は、開始部位から５６６塩基から１２１６塩基にわたり、全遺伝子の約５ ７％に相当する。 まず、６つの異なるトリプシンペプチドをＯＲＦ中にマツピングした。次いで、 ５つの池のペプチドを、構造研究のために配列決定し、それらの全てをＯＲＦ中 にマツピングし、全部で全３６７アミノ酸の約４８％であった。全部で３つのン ステインが存在する。その１つは、シグナルペプチドに結合していた。このシグ ナルペプチドは、原核生物の配列に典型的であり、電荷を持つＮ末端領域、中心 の疎水性領域、および開裂する標準的なＡｌａ、　ＸＸＸ、　Ａｌａ部位を含む 開裂領域を有する。 実施例２　：　Ｅ、ｃｏｌｉでのヘパリナーゼ遺伝子の発現Ｅ、ｃｏｌｉでのヘ パリナーゼ発現について２つの異なる発現系を選択した：　Ｏｍｐ　Ａ発現系お よび９ＫＫ高発現系である。両方の発現系のためにデザインしたプラスミドを表 ＩＩ＋に示す。 扱ユ肚」会１上 Ｏｍｐ　Ａ発現系は、参照として、本明細書中に援用される、Ｇｈｒａｙｅｂら 、εＭＢＯＪ、３：２４３７　（１９８４）ｉこｚ己載されるよう（こ、Ｏｍｐ Ａシグナル配列に支配されて、ペリプラズム空間に目的のタンパク質を分泌する 。ヘバリナーゼは通常、Ｆ、　ｈｅｐａｒｉｎｕｍのペリプラズム空間へ発現さ れるので、この系を選択した。上記プラスミドは、ｌａｃレプレッサーの制御下 にあり、そして培地へのＩＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄチオガラクトンド） の付加によって誘導される。上記プラスミドをｐｌＮ−１１１Ｏｍｐ　Ａ−３ベ クターに挿入した。 上記ヘバリナーゼ挿入断片は、ＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ旧部位へのクローン化に適合 する、２つの適切な制限部位を伴うようにヘパリナーゼのＮ末端およびＣ末端を 利用するＰＣＨにより、作成した。 ２つのプライマーを表ＩＩで示すように構築した。上記挿入断片はＰＣＲの５サ イクルで増幅し、そしてＥ、ｃｏｌｉのペリブラズミノクリーダー配列と共に、 Ｏｍｐ　Ａ　ｐｌＮベクターに連結した。ＤＨ５αを形質転換し、そして発現を ３〜５時間、ｌｏ＋ＭのＩ　ＰＴＧで、誘導した。 表ＩＩ＋に示すように、Ｏｍｐ　Ａ発現系の構築物はヘパリナーゼ遺伝子のアミ ノ末端に、Ｇｌｙおよびｌｉｅである、２つの余分なアミノ酸を生じる。ヘバリ ナーゼ配列はＧｉｎで始まる。 ■ムｌ臣系 ｐＫＫ発現系は、参照として本明細書中に援用する、ＢｒｏｓｉｕｓおよびＨｏ １ｙ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８１：　６９２９ 　（１９８４）ならびにＪａｆｆｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２７：１８６９　（ １９８８）の方法に従い、タンパク質の過剰発現に用いられる。この系は、０＋ ｏｐ　Ａ系のように、適当な宿主中で、ｌａｃレプレッサーによって調節され、 そしてＩ　ＰＴＧの付加によって誘導される、強いｔａｃプロモーターを含有す る。プラスミドｐＫＫ２２３−３は、ｐｔ＋ｃ　８マルチクローニングサイトお よび隣接してｔａｃプロモーターにつづく、強いｒｒｎＢリポソームターミネー タ−を有する。上記プラスミドのリポソーム結合部位（開始コドンＡＴＧから約 １２塩基）は、５Ｉｌａ　１部位へのへバリナーゼ遺伝子のクローニングにより 利用される。ＯｍｐＡの構築物のように、ヘパリナーゼ挿入断片は、該タン）＜ り質のＮおよびＣ末端に、Ｓ＋ａａｌおよび旧ｎｄｌｌｌを有するように、ＰＣ Ｈによって得られる。表ＩＩ＋に示すように、未変性へ／ずリナーゼのリーダー 配列をペリプラズムに過剰生産するように用いた。 （以下余白） Ｅ、　ｃｏｌ　ｉのペリプラズムタンパク質を、浸透圧ショックで単離した。簡 単に言えば、１．５ｍｌの細胞を誘導後に遠心分離し、モして１ｈＭのトリス（ ｐＨ７，５）で、洗浄した。そして細胞を２０％スクロース、１０ｄのトリス（ ｐＨ７，５）および０．５ＭのＥＤＴＡ、　５μｌ中で懸濁した。水上で５分間 インキュベートした後、細胞を遠心分離し、そして約１５０μｌの水を加えて浸 透圧シヨ、りを行った。ペリプラズム抽出物を酵素活性の測定のために用いた。 ヘバリナーゼ活性は、波長２３２ｎｍでモニタリングして測定し、そして参照と して、本明細書中に援用した、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１３７：５１５　（１９８１１））のアズールＡ法によ って測定した。 ペリプラズム抽出物は、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６９０（１９ ７４）の方法を用いて、ドデンル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気 泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、そしてクーマシーブルーを用いて染色 した。さらに、ウェスタンプロット法でヘバリナーゼモノクローナル抗体を用い て、ヘバリナーゼの存在の確認を行った。ヘパリナーゼは、Ｇｅｒｓｈｏ旧およ びＰａ１ａｄｅ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３１：１　（１ ９８３）の方法を用いて、電気泳動的に５ＤＳ−ＰＡＧＥケルからニトロセルロ ースに移動させ、そしてモノクローナル抗体と共にインキュベートした。この抗 体は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした２次抗体を用いて染色 した。 ＲＮＡドツトプロ、ドア、セイ すべての細胞質ＲＮＡをＺｅｔａプローブ１１メンブレン（Ｂｉｏｒａｄ。 Ｒ４ｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）上でアルカリＲＮＡ変性および固定によって固定化 し、そして６００塩基のＰＣＲ生産物を用いてプローブし、ヘパリナーゼ遺伝子 をスクリーニングした。ハイブリダイゼーションはＴｈｏｍａｓＳＰｒｏｃ、　 Ｎａ１１．　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ、　７７：５２０１　（１９８０）の方法に従っ て、ドツトプロット装置で行った。異なる成長条件下のＲＮＡシグナルの研究は 、Ｇａ１ｌｉｈｅｒら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ。 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　（１９ｇ２）によって継続している。その研究によって 確立したものに、タンパク質レベルでヘパリナーゼが、低硫黄条件下で最適な発 現を示し、そして誘導のためのヘパリン要求性を取り払う。従って、低硫黄成長 条件下でヘパリナーゼｍＲＮＡシグナルをヘパリン誘導がある、および、ない状 態で検討した。 Ｏｍｐ　ＡおよびｐＫＫ系のいづれも、ヘパリナーゼを発現した。 Ｏｍｐ　Ａ系は効率的にヘパリナーゼをペリプラズムに輸送しなかった。理由は 明らかでないが、組換えヘパリナーゼの大きな断片は、そのＯｍｐ　Ａシグナル 配列と一緒に細胞質の領域に保持された。そして増殖に、より低い温度（２５〜 ３０℃）では、ペリプラズム空間への分泌が認められた。 ｐＫＫ過剰生産系はべりブラズム空間でのみ、ヘバリナーゼを生産した。上記ｐ ＫＫ系は、天然のＦ、　ｈｅｐａｒ　ｉｎｕｍヘパリナーゼリーダー配列を用い た。それは外来のリーダー配列を伴う組換えタンパク質の輸送において問題がな かった。発現がより低い温度でさらに至適であるにもかかわらず、ｐＫＫ系は異 常なプロセ／ングなしに、ヘバリナーゼを発現した。ペリプラズム中のヘパリナ ーゼの存在は、ウェスタンプロット法、および組換エヘパリナーゼのｉｎ　５ｉ ｔｕ）リブシン消化を天然のヘパリナーゼのそれと比較することにより、ピーク 外形、および、単離および配列決定したいくつかのピークから確認した。 陽性シグナルを、ヘバリナーゼ遺伝子を単離するために用いられてきたＰＣＲ由 来の６００塩基対プローブを用いて、単離したＦ、ｈｅｐａｒｉｕｍ　ｍＲＮＡ より得た。そして単離した遺伝子が、Ｅ、ｃｏｌｉにクローン化したＦ、　ｈｅ ｐａｒｉｕｍ遺伝子であることを確認した。 発現したヘバリナーゼは、少な（とも若干のヘパリナーゼ活性を有した。 上記配列は、ヘバリナーゼをコードする配列中に部位特異的突然変異誘発または オリゴマー置換を用いて、特異的な酵素活性または結合特異性、あるいは１つま たはそれ以上のアミノ酸の置換による親和力を改めるために改変され得る。これ を行う方法および材料は、当業者に周知である。改変した遺伝子を発現し、そし てその生産物は改変された活性について機械的に選抜される。 ２つの特異的な発現系を文献と共に記載したが、その他の発現系は充分周知であ り、そして市販的に入手し得る。同様のベクターおよびンクナルペプチド、また はリーダー配列を用いることにより、これらの系でも、ヘパリナーゼ遺伝子を発 現し得る。 本発明の修飾および改変は、当業者には自明である。そのよう−な修飾および改 変は、以下の請求の範囲に包含されるように意図される。 （以下余白） 配列表 （１）一般的情報： （ｉｖ）連絡住所： （＾）住所人：キルパトリ・１り　アンド　コープイー（Ｂ）番地ニスイード　 ２８０Ｇ、ビー＋７リー　スト’Ｊ−ト１１００（Ｃ）市：アトランタ （Ｄ）州二ノ１−シア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号＋　３０３０９−４５３０（Ｖ）コンビニ−ター読み出し形態 （＾）媒体型＝７０・ノビ−ディスク （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＮ　ＰＣ互換用（Ｃ）操作システＡ　：　ＰＣ− ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース１１１．０． バージョン１１１．２５（ｖｉ）現在の出願データ： （＾）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｗｉｌ＋＞代理人／事務所情報： （Ａ）氏名：ハフスト、バトレア　エル。 （Ｂ）登録番号：　３１．２８４ （Ｃ）照会／記録番号：　ＭＩＴＳＳ４６（ｉＸ）電話回線情報： （＾）電話：　４０４−８１５−６５０８（Ｂ）テレファックス：　４０４−８ １５−６５５５（２）配列番号：１の情報： （１）配列の特色： （＾）長さ：Ｈ７９塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮ＾ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖｉ）起源： （＾）生物名：　Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ（ｘｉ） 配列：配列番号、ｌ： ｃｃｒｒｒｒｃｃｃＡ　ＧＣ八へＡＧＧＣＡＧ　＾ｈｃｃＡｒｃｒｃｃ　ＧへＡ ＣＡＡＡＧにＣ八ＧＡＡＣＣＡＧＣＣＴＧＴ八ＡへＣＡＧＡ@６Ｇ （２）配列番号２の情報。 （１）配列の特色； （＾）長さ：３８４アミノ酸 ＣＢ）梨：アミノ酸 （Ｃ）填の数　−Ｘ鍮 （Ｄ）トボロノー：直珀状 ｆｉｉ）配列のｆｉ類　ペプチド （■１）ハイヂセティカル配ツ１１　：　Ｎ。 ＜ｉｖｌアノチ七／ス：一〇 （ｖ）フラグメント型二Ｎ末端 Ｃｙｓ　５ｅｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ＾ｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓ ｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｉｌ＠Ｐｒｏ　Ｔｙｒ＾ｒｑ２０　２５　）Ｏ Ｖａｌ　Ａｇｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ＾ｌａ　ｋｓｐ　Ｓａｒ＾ｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｉ ｎ　Ｌｙｓ＾ｌａ　Ｉｌ＠ＩＩｓ　Ａｓｐ＾ａｎコ５　４０　４５ Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ＶａＩＧｕｙ　ＩＩ＠＾ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒ ｏ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　ＡｓｐＳｏ　５５　６Ｇ ＾ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｈ＠＾ｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓ ａｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｓ６５　フＯ７５８０ ＾１ａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　八ｓｎ　５ｅｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　 Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ＧｌｙＡｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇ ｌｕ　Ｌａｕ　５ａｒ　Ｔｙｒ　５ａｒ　Ｔｙｒ＾Ｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ＾ｉｎ 　Ｍｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＺｏｏ　１０５　１１０ Ｐｈ＠Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ＾ｌａ　にｉ ｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ＋Ｉｉｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌ ｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓａ ｒ　八ｒｇ　Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈ■ ｌ】０　１コ５　１４０ Ｐｈ＊　５＠ｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｉｌ＠　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｓ＠ｒ　Ｐｈｅ　 Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　＾Ｌａ’ｌ°ｂｒ　Ｔｈｒ　ｌ１■ １４５　１５０　１５５　ｋ（ＩＱ Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　 Ａｒｑ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒ。 １６５　ｌ）Ｏ１７５ Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｕ　Ｉｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　ＩＬｅ　 Ｃ１ｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｌ、ｅｕ＾ｌａ　Ｌａｕ　ＴｙｒＡｓｐ＾ｒｇ　Ｍｅ ！　１１＠　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｉｌａ　Ａｌａ　１ｌｉｓ＾ｓ ｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｃ１ｕ　ＬｙｓＬｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｅ　Ａｓｐ　ＧＬｙ 　Ｌｙｓ　ＩＩｓ　’ｌ’ｌｔｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ＾ｌａ　Ｃ１ｙ　Ｌｙｓ　Ｐ ｒｏ　Ａｓｎ　Ｇ撃■ １’ｒｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ 　Ｔｌ＋ｒ　Ｌｅｕ＾Ｉａ　Ｉ”ｈｅ　Ｇａｙ　ｒ’ｌ＋ａ@５ａｒ ２２５　２コ０　２コ５　２４０ Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｈ＠↑ｙｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ＾ｌａ　Ａｓｎ　Ｓｅ ｒ　Ａｓｐ＾ｒｇ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｔｌ＋ｒ＾ｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｌａ 　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｇｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　Ａｓｎ 　Ｓｔｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　ＨａｔＬｙｓ　Ｐｒｏ↑ｙｒ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｇ ｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　ｒｌａ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌ ｙｓ　ＭｅｔＰｒｏ　ＰＭ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｇ　Ａｓｐ 　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠　八ｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ２９０　 ２９ｓ　）Ｇ。 ｈｎ正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）工、、、、６１４□ ２．８国

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍから単離されたへパリ ナーヤＩをコードする、単離された核酸分子。
2. ２．本質的に以下の配列： 【配列があります】 から成るヌクレオチド配列（配列番号：１、塩基対１７３から１３２４を含む） を有する、請求項１に記載の核酸分子。
3. ３．本質的に以下の配列： 【配列があります】 から成るアミノ酸配列（配列番号：２）をコードする、請求項１に記載の核酸分 子。
4. ４．発現ベクターをさらに包含する、請求項１に記載の核酸分子。
5. ５．シグナルペプチドをコードする核酸フラグメントをさらに包含する、請求項 １に記載の核酸分子。
6. ６．前記シグナルペプチドが、本質的に以下の配列：【配列があります】 から成る核酸（配列番号：１、塩基対１から１７２を含む）にコードされる、請 求項６に記載の核酸分子。
7. ７．前記シングルペプチドが、細胞質からペリプラズムヘのタンパク質の輸送を 支配する、請求項６に記載の核酸分子。
8. ８．配列番号：１にコードされるへパリナーゼと異なる親和力のヘパリン結合能 を有する、へパリナーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
9. ９．配列番号：１にコードされるヘパリナーゼの特異活性と異なる特異活性を有 する、へパリナーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
10. １０．請求項１に記載の核酸分子であって、該分子を発現し得る、Ｆ．ｈｅｐａ ｒｉｎｕｍ以外の原核細胞中での核酸分子。
11. １１．請求項１１に記載の核酸分子であって、該分子を発現し得る低硫酸塩条件 下での培養原核細胞中での核酸分子。