JP5890686B2 - 敗血症の検出方法 - Google Patents
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Description
4.1.1.一般的な方法
マイクロRNA種のレベルを測定することにより敗血症を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、マイクロRNA種のレベル上昇は、敗血症を示すものである。いくつかの実施形態では、マイクロRNA種のレベル低下は、敗血症を示すものである。いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号1〜86から選択される配列に特異的にハイブリダイズすることが可能な少なくとも1種の標的RNAの正常を上回るレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号196〜399、950、565〜707、および863〜897から選択される配列の少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、または少なくとも24個の連続するヌクレオチドを含む少なくとも1種の標的RNAの正常を上回るレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号1〜86から選択される配列の少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、または少なくとも24個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む少なくとも1種の標的RNAの正常を上回るレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、標的RNAは、その成熟形態で、30個未満のヌクレオチドを含む。標的RNAは、いくつかの実施形態では、マイクロRNAである。
65、67または79から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な1種以上の標的RNAの発現の増加は、グラム陽性細菌の感染によって引き起こされた敗血症の存在を示すものである。いくつかの実施形態では、ヒト単球の試料中の表2の配列番号8、14、59、62、63、64、74または78から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な1種以上の標的RNAの発現の増加は、グラム陽性細菌またはマイコバクテリアの感染によって引き起こされた敗血症の存在を示すものである。
いくつかの実施形態では、各標的RNAの正常レベル(対照)は、正常ヒト単球または他の参照物質の特徴を示す平均のレベルまたは範囲として測定することができ、この平均のレベルまたは範囲に対して、試料中で測定されたレベルを比較することができる。正常対象中の標的RNAの測定された平均または範囲は、敗血症を示す正常を上回るまたは正常を下回るレベルの標的RNAを検出するための基準として用いることができる。いくつかの実施形態では、標的RNAの正常レベルは、1人以上の個人、例えば、健常人または疾患の臨床的重症度は敗血症症候群と診断された患者と類似している(例えば、ICU臨床(APACHE II)スコアが一致している)が、敗血症症候群とは診断されていない集中治療患者の個々のまたはプールされたRNA含有試料を用いて測定することができる。
標的RNAを任意の適切な方法により調製することができる。トータルRNAを、限定するものではないが、Wilkinson,M.(1988) Nucl.Acids Res.16(22):10,933;およびWilkinson,M.(1988) Nucl.Acids Res.16(22):10934に示されたプロトコルをはじめとする任意の方法によって、または市販のキットもしくは試薬、例えば、TRIzol(登録商標)試薬(Invitrogen(商標))、トータルRNA抽出キット(iNtRON Biotechnology)、トータルRNA精製キット(Norgen Biotek Corp.)、RNAqueous(商標)(Ambion)、MagMAX(商標)(Ambion)、RecoverAll(商標)(Ambion)、RNeasy(Qiagen)などを用いて、単離することができる。
上記のように、患者由来の試料中で敗血症を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、対照試料、例えば、敗血症症候群と診断されていない患者由来の試料、または正常ヒト単球の試料中の少なくとも1種の標的RNAの正常な発現レベルよりも大きい、表2に示す配列番号1〜86から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な試料中の少なくとも1種の標的RNAの発現レベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対照試料中の少なくとも1種の標的RNAの正常な発現レベルよりも大きい、配列番号1〜86から選択される配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む試料中の1種以上の標的RNAのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対照試料中の少なくとも1種の標的RNAの正常な発現レベルよりも大きい、配列番号196〜399、950、565〜707、および863〜897から選択される配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む試料中の1種以上の標的RNAのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、標的RNAは、その成熟形態で、30個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的RNAはマイクロRNAである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、合成ポリヌクレオチドを提供する。本明細書で用いられる合成ポリヌクレオチドは、化学的にかまたは酵素的にかのいずれかでインビトロで合成されたポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの化学合成としては、限定するものではないが、OligoPilot(GE Healthcare)、ABI 3900 DNA合成装置(Applied Biosystems)などのようなポリヌクレオチド合成装置を用いた合成が挙げられる。酵素合成としては、限定するものではないが、酵素的増幅(例えば、PCR)によるポリヌクレオチドの産生が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも1種の標的RNAの検出方法は、修飾された1以上のポリヌクレオチド、例えば、1以上の親和性増強ヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドを利用する。本明細書に記載の方法において有用な修飾ポリヌクレオチドとしては、逆転写用のプライマー、PCR増幅プライマー、およびプローブが挙げられる。いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチドの組込みは、デオキシリボヌクレオチドのみを含むポリヌクレオチドと比較した場合、その標的核酸に対するポリヌクレオチドの結合親和性と特異性を増大させ、より短いポリヌクレオチドを使用することまたはポリヌクレオチドと標的核酸の間の相補的な領域をより短くすることを可能にする。
いくつかの実施形態では、プライマーを提供する。いくつかの実施形態では、プライマーは、標的RNAの少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、または少なくとも24個の連続するヌクレオチドと同一または相補的である。いくつかの実施形態では、プライマーは、標的RNAと同一または相補的でない部分または領域も含み得る。いくつかの実施形態では、標的RNAと同一または相補的でないプライマーの任意の領域によって同一または相補的な領域が分断されないように、標的RNAと同一または相補的なプライマーの領域は連続している。
様々な実施形態では、敗血症の存在を検出する方法は、ヒト試料の核酸をプローブとハイブリダイズさせることを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、標的RNAに相補的な部分を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、標的RNAに全く同じように存在する部分を含む。いくつかのそのような実施形態では、標的RNAに相補的なプローブは、使用される特定のアッセイの条件下で標的RNAに選択的にハイブリダイズするように標的RNAの十分な部分に相補的である。いくつかの実施形態では、標的RNAに相補的なプローブは、標的RNAの少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、または少なくとも24個の連続するヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、標的RNAに相補的なプローブは、標的RNAの少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、または少なくとも24個の連続するヌクレオチドに相補的な領域を含む。すなわち、標的RNAに相補的なプローブは、標的RNAに相補的でない部分または領域も含み得る。いくつかの実施形態では、標的RNAに相補的でないプローブの任意の領域によって相補的な領域が分断されないように、標的RNAに相補的なプローブの領域は連続している。
別の態様では、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法において用いられる組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、標的RNA発現レベルの定量では、細胞当たりのトータルRNAと試料調製時の試料損失の程度とについて推定を行なう必要がある。異なる試料間または異なる条件の下で調製された試料間の違いを補正するために、いくつかの実施形態における標的RNAの量は、少なくとも1種の内在性ハウスキーピング遺伝子の発現に対して標準化される。
いくつかの実施形態では、方法は、正常な標的RNAプロファイル(いくつかの例示的な実施形態では、対照試料の標的RNAプロファイル)と比較したときの、ヒト試料から作成された標的RNAプロファイルの量的変化を検出することを含む。発現プロファイルのいくつかの量的変化は、対象由来の試料における敗血症の存在を示すものである。「標的RNAプロファイル」という用語は、同じ試料中の複数の標的RNAの同時発現に関するデータセットを指す。
いくつかの実施形態では、配列番号1〜86から選択される配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な1種以上の標的RNAの検出および/または配列番号196〜399、950、565〜707、および863〜897から選択される配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む1種以上の標的RNAの検出および/または配列番号1〜86から選択される配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む1種以上の標的RNAの検出と組み合わせて、本明細書中の方法は、敗血症と関連する少なくとも1種の他のマーカーの発現レベルを検出することをさらに含む。
5.1 実施例1:単球由来のマイクロRNA
個別のマイクロRNAが、病原体模倣物(アゴニスト)による刺激に応答して、単球で過剰発現することを示すために、マイクロアレイ解析を用いた。
ヒト末梢血起源の急性単球性白血病細胞株である単球細胞株THP−1(ATCC番号TIB−202)からトータルRNAを調製した。
Flash PAGE Fractionator(Ambion)を用いて、マイクロRNA精製を行なった。Ambionゲル精製プロトコルによって、マイクロRNAを含む40ヌクレオチド(nt)長未満の低分子RNAが濃縮される。簡潔に述べると、Flash PAGE Fractionatorを用いてトータルRNA試料をプレキャストゲルに充填した。ゲル移動後に、40ntより小さいトータルRNA画分(「マイクロRNA画分」)を回収し、ヌクレアーゼ不含水に再懸濁した。
プローブ設計およびスポッティング
マイクロアレイ調製に用いられたオリゴヌクレオチドプローブは、5’−NH2−(C)6−(スペーサー)−(オリゴマープローブ配列)−3’という構成であった。5’−アミノ基は、アレイ支持体への化学的化合を可能にした。各々は、オリゴヌクレオチドプローブとアレイ支持体との非特異的な相互作用を防ぐために、下に示すような、15ntの同一のスペーサー配列を含んでいた。
マイクロRNA画分の標識は、European Molecular Biology GroupによりEMBL(Heidelburg,Germany)で開発された公開プロトコル(Castoldi et al., “A sensitive array for microRNA expression profiling(miChip) based on locked nucleic acids(LNA)”, RNA 2006 May;12(5):913−20.Epub 2006 Mar 15、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)をもとにした。簡潔に述べると、マイクロRNA画分を、RNアーゼ不含水、8%ポリエチレングリコール(PEG)、2mMのアデノシン三リン酸(ATP)と、T4 RNAリガーゼ(0.7U/μl)とを含む1倍に希釈したAmbion緩衝液中で、10μMの色素標識テトラヌクレオチド(5’−rUrUrUrU−Cy5−3’)(またはあるいは、5’−rUrUrUrU−Cy3−3’)(Biospring,Germany)を含む混合物とともに4℃で6時間インキュベートした。65℃で15分間混合物を加熱して標識反応を行なった。この手順により、ポリ−U色素標識テールが全てのマイクロRNAの3’末端に連結された。標識された試料をハイブリダイゼーションするまで4℃で保存した。
ディスカバリーハイブリダイゼーションステーション(Ventana,Tucson,AZ)を用いて、標識マイクロRNA画分をスポッティングしたアレイにハイブリダイズさせた。簡潔に述べると、1%BSA、2×SSC、および0.2%SDSの2mLの混合物をチップとともに42℃で30分間インキュベートした。次に、チップをEZ Prep緩衝液(Ventana)を用いて1回洗浄した後、Ribowash(Ventana)でさらに3回洗浄した。次に、20μlの標識マイクロRNA混合物と180μlのChipHybe試薬(Ventana)をアレイに添加した。アレイを37℃で6分間加熱した後、42℃で8時間インキュベートし、その後、加熱を停止した。チップをRibowash(Ventana)で1回洗浄した後、37℃で2分間加熱した。チップをCheapClean(Ventana)を1滴添加したRibowash(Ventana)で再び洗浄し、37℃で2分間インキュベートした。チップをRibowash(Ventana)を用いてさらに2回洗浄した。チップを乾燥させて一晩保存した。翌日、ディスカバリーハイブリダイゼーションステーションについてのVentanaの取扱説明書に従って最後の洗浄を行なった。スライドを2×SSC+0.2×SDS緩衝液で2回洗浄した後、0.1×SSCでもう1回洗浄した。全てのスライドを室温でArrayit(TeleChem International,Sunnyvale,CA)製の高速遠心分離器を用いて乾燥させ、スキャンするまで暗所で保存した。
Axon(商標)スキャナー(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)とそのGenepix(商標)ソフトウェアを用いて、アレイをスキャンした。16ビット/ピクセル(1600*1600)の画像色深度で規定されるtifフォーマットで画像をフォーマット化した。このような設定では、ピクセルは、0〜65,535の強度値を取ることができる。最大強度値を示すピクセルは「飽和して」おり 、これには65,535の値が割り当てられた。アッセイスキャンの解像度は、10μm/ピクセルに設定された。異なる蛍光色素(例えば、Cy5とCy3)を用いるハイブリダイゼーション実験の場合、強度がより高いスポットに光電子倍増管(PMT)を合わせた(Cy3は、Cy5よりも低いPMT設定でスキャンされる)。
レーザースキャナーのPMTによって、スライドの各々の所与の「ポイント」について、捕捉された蛍光強度をデジタル化し、数値をそのポイントに対応するピクセルとして保存した。その後、このようなピクセルから構成される写真を解析した。
アレイデータは全て、Rバイオコンダクターパッケージ(“Bioconductor:open software development for computational biology and bioinformatics”, Genome Biol.2004;5(10):R80.Epub 2004 Sep 15、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を用いて解析した。
1.ハイブリダイゼーション対照の特異性は、許容基準の範囲内でなければならなかった(例えば、CTL26とその対応する1塩基突然変異体のCTL26_MUT、またはCTL13とその対応する1塩基突然変異体のCTL13_MUT)。
2.陽性対照の複製物のシグナル強度の近似等価性
3.各ブロックの陽性対照に基づくブロックシグナル強度中央値間の近似等価性
4.検出された全ての配列に基づくアレイシグナル中央値間の近似等価性
5.精製および標識対照(CTL30)のシグナル強度
Luminex技術(Luminex Corp.,Austin,TX)は、プローブ標識ビーズの液相ハイブリダイゼーションと、それに続く様々な比の蛍光色素を含むビーズのフローサイトメトリー検出に基づくものである。最大100の異なる色素比を含むビーズが利用可能であり、これにより、単一の試料を最大100個の分析物について同時に調べることができる。
CD14陽性磁気マイクロビーズ陽性選択(製造元のプロトコルによる、Miltenyi Biotec)を用いて、ヒト単球を健康ドナーの全血から単離した。次に、単離した単球をRPMI 1640培地を用いて、5%CO2を含む37℃の加湿インキュベーターにて6ウェルプレート中で2.5×106/mLの濃度まで培養した。
miRNA発現を解析するために、細胞を上記の表5(実施例1)に示す刺激で8時間または24時間処理した。
単球の刺激に使用された各々のアゴニストについて、2つのコンフルエントな75cm2フラスコからの細胞を回収した(=約107細胞)。製造元のプロトコルに従ってTRIzol(登録商標)試薬、Invitrogen(Carlsbad,CA)を用いて、トータルRNAを調製した。RNA試料は全て、RNアーゼ不含水に希釈し、−80℃(−112°F)で保存した。
各々の5’−アミノ−修飾プローブ(5’アミノC6−プローブ配列、すなわち、実施例1の構造に似ているが、リンカー配列を含まない構造を有する)のアリコートを、分子生物学的等級の水に0.1nmol/μLの濃度で調製する。製造元のプロトコル(Luminexビーズ結合プロトコル)に従ってカルボジイミド化学反応を用いて、プローブをビーズに結合させる。プローブ結合ビーズを4℃で保存する。
8fmoleの各々7種の内部対照(アレイ対照に用いられるのと同じ合成RNA)を患者試料から単離されたトータルRNA画分に添加する。各試料について、3つの複製物を並行してアッセイする。各複製物について、250ngのトータルRNAを用いる。単一のRNA分子の環状化をもたらすデンドリマーの形成、または別のRNA分子への連結を防ぐために、Luminexビーズとのハイブリダイゼーションの前に、トータルRNA調製物をウシ腸ホスファターゼ(CIP;Invitrogen)で処理する。CIPによる前処理は製造元のプロトコルに従い、これによって、5’−リン酸基が除去される。
CIP処理の後、VantageマイクロRNA標識キット(Marligen)を用いて、トータルRNA画分をビオチンで標識する。Marligenプロトコルを用いて、標識画分をLuminexビーズにハイブリダイズさせる。簡潔に述べると、ポリヌクレオチドビーズをMarligen ハイブリダイゼーション溶液(1.5×TMAC)および標識トータルRNAと混合する。ハイブリダイゼーションは、暗所にて60℃で1時間行なわれる。ハイブリダイゼーション後、Luminex標準6×SSPET洗浄緩衝液(リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、EDTA、Triton X−100、pH7.4)を用いて、ビーズを洗浄する。
Luminexビーズの検出は、ストレプトアビジンフィコエリスリン(SAPE)(Europa Bioproducts,Cambridge,UK)を用いて行なわれる。Luminexプロトコルに従って、SAPEを洗浄したビーズに添加する。良好な解像度を得るためにゲインの高い設定でLuminex IS−200機器を用いて、ビーズを読み取る。
Luminex IS−200によって、反応混合物中の各色素比の少なくとも25種のビーズが読み取られる。各色素比のビーズは、特定のプローブ配列に対応し、強度値は、読み取られた全てのビーズの平均値として戻される。合成RNA対照を用いてまたはあるいは発現オリゴヌクレオチドの平均を用いて平均蛍光強度(MFI)データを標準化し、Bioplexソフトウェア(Bio−Rad,Hercules,CA)およびRバイオコンダクターパッケージ(Bioconductor:open software development for computational biology and bioinformatics,Genome Biol.2004;5(10):R80.Epub 2004 Sep 15)を用いて、正常試料と刺激された試料または罹患試料の間の変化倍数を計算する。
結合したビーズの強度が50MFIよりも高い全ての配列を発現マイクロRNAと分類する。結合したビーズの強度をさらなる解析に妥当であるとみなすためには、以下の基準を満たす必要がある。
1.陽性対照の複製物のシグナル強度の近似等価性
2.各ウェルの陽性対照に基づくウェルシグナル強度中央値間の近似等価性
3.検出された全配列に基づくウェルシグナル中央値間の近似等価性
例えば、表2に示したプローブを用いて検出されるマイクロRNAを同定するために、プローブ配列を用いて低分子RNAシークエンシング(smRNASeq)データセットを解析し、これらの配列により検出される発現マイクロRNAを同定した。この解析により、11個の群に対応する正確な末端を有する11個の配列が同定された。これら11個の候補マイクロRNA配列を表11に示す。
敗血症患者由来のトータルRNAをsmRNASeqデータセットの調製に用いた。簡潔に述べると、5μgのトータルRNAを、製造元により提供された標準的なライブラリー/シークエンシングプロトコルを用いたSolexa GA II(Illumina)での低分子RNAシークエンシングに用いた。
表18は、敗血症smRNASeqデータセットにおけるカウント数と各々の新規マイクロRNAについての全ての他のsmRNASeqデータセットの平均カウント数の比であって、その比が2以上のものを示す。
Claims (17)
- 対象における敗血症の検出を補助する方法であって、前記対象由来の試料中の少なくとも1種の標的RNAのレベルを検出することを含み、ここで、前記少なくとも1種の標的RNAはマイクロRNAであり、前記少なくとも1種の標的RNAは、配列番号235、253、302から選択される配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、ここで、前記少なくとも1種の標的RNAの正常レベルよりも大きい前記試料中の少なくとも1種の標的RNAのレベルは前記対象における敗血症の存在を示す、方法。
- 前記方法が、前記試料中の前記少なくとも1種の標的RNAのレベルを前記少なくとも1種の標的RNAの正常レベルと比較することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 対象における敗血症の検出を補助する方法であって、
(a)前記対象由来の試料中の少なくとも1種の標的RNAのレベルを検出することであって、ここで、前記少なくとも1種の標的RNAはマイクロRNAであり、前記少なくとも1種の標的RNAは、配列番号235、253、302から選択される配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含むことと、
(b)前記対象が敗血症を有するかどうかを決定する目的で検出結果を医療実施者に報告することと、を含む方法。 - 試料中の少なくとも1種の標的RNAのレベルを検出することがRT−PCRを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 対象における敗血症の検出を補助する方法であって、
(a)前記対象由来の試料を前記試料中の少なくとも1種の標的RNAのレベルを検出するために実験室に提供することであって、ここで、前記少なくとも1種の標的RNAはマイクロRNAであり、前記少なくとも1種の標的RNAは、配列番号235、253、302から選択される配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含むことと、
(b)前記試料中の少なくとも1種の標的RNAのレベルを示す報告を前記実験室から受け取ることと、を含み、
ここで、前記少なくとも1種の標的RNAの正常レベルよりも大きい前記少なくとも1種の標的RNAのレベルは敗血症の存在を示す、方法。 - 前記方法が前記試料から核酸を単離することをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸がDNAから分離されたRNAを含む、請求項6に記載の方法。
- 少なくとも1種の成熟形態の標的RNAが30個未満のヌクレオチドを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも2種の標的RNAのレベルが検出され、ここで、前記少なくとも2種の標的RNAは、配列番号235、253、302、631、および662から選択される配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1種の標的RNAのレベルがその正常レベルよりも大きいことを検出することが敗血症の存在を示す、請求項9に記載の方法。
- 少なくとも2種の標的RNAのレベルがその正常レベルよりも大きいことを検出することが敗血症の存在を示す、請求項9に記載の方法。
- 少なくとも3種の標的RNAのレベルが検出され、ここで、前記少なくとも3種の標的RNAは、配列番号235、302、253、631、および662から選択される配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、請求項9に記載の方法。
- 少なくとも1種の標的RNAのレベルがその正常レベルよりも大きいことを検出することが敗血症の存在を示す、請求項12に記載の方法。
- 少なくとも2種の標的RNAのレベルがその正常レベルよりも大きいことを検出することが敗血症の存在を示す、請求項12に記載の方法。
- 少なくとも3種の標的RNAのレベルがその正常レベルよりも大きいことを検出することが敗血症の存在を示す、請求項12に記載の方法。
- 前記対象由来の試料が血液試料である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が単球である、請求項16に記載の方法。
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