CN113388674A - miRNA作为检测或治疗良性前列腺增生的药物靶点的应用 - Google Patents

miRNA作为检测或治疗良性前列腺增生的药物靶点的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miRNA作为检测或治疗良性前列腺增生的药物靶点的应用，其中所述miRNA选自miR‑483‑3p和/或miR‑483‑5p。本发明通过对良性前列腺增生模型高通量测序发现miR‑483‑3p和miR‑483‑5p在良性前列腺增生中表达下调，进一步验证发现上调miR‑483‑3p和miR‑483‑5p的表达可抑制人前列腺肌成纤维基质细胞和前列腺上皮细胞的增殖，达到防治良性前列腺增生的作用。即本发明首次发现了来源于人的miR‑483‑3p和miR‑483‑5p可作为检测或治疗良性前列腺增生的新的分子药物靶点，可利用该靶点达到良性前列腺增生的检测或药物筛选的目的。这为良性前列腺增生的的防治提供了新的思路以及基因资源。

Description

miRNA作为检测或治疗良性前列腺增生的药物靶点的应用
技术领域
本发明属于生物技术与良性前列腺增生技术领域，具体涉及miRNA作为检测或治疗良性前列腺增生的药物靶点的应用。
背景技术
良性前列腺增生(Benign prostate hyperplasia，BPH)是中老年男性的常见疾病，发病率呈上升趋势，且随年龄递增。目前BPH在50、60和80岁以上男性中的发病率分别约在25％、50％和83％。此外，BPH也是男性出现排尿困难和储尿障碍等下尿路症状的最常见原因。BPH虽然不是短期内可威胁生命的疾病，但给患者的日常生活造成极度的尴尬和烦恼，而且带来巨大的经济压力。随着我国人均寿命的延长和逐步进入老龄化社会，BPH对患者生存质量的严重制约已引起越来越多的关注。然而，BPH的病因学复杂，虽然既往研究揭示了年龄、激素水平改变、代谢综合征和炎症等因素参与BPH的诱发，但确切的发病分子机制至今仍未阐明，使得现阶段的临床干预手段并不能真正阻断或逆转BPH。BPH的首选治疗药物包括α受体阻滞剂和5α-还原酶抑制剂。但α受体阻滞剂并不能减少前列腺体积，而大约有25-30％的患者在使用5α-还原酶抑制剂后下尿路症状没有改善，甚至有5-7％的患者出现进一步恶化。因此迫切需要寻找新的分子靶点，以期为针对性的治疗提供新的指导。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一种内源性短链非编码RNA，通过5'端与靶基因mRNA的3'端中非翻译区(3'-UTR)特异性结合而发挥转录后调节效应。miRNA与良性前列腺增生的关联，目前研究相对较少。
发明内容
本发明的目的在于提供了miRNA作为检测或治疗良性前列腺增生的药物靶点的应用，本发明通过对良性前列腺增生模型大鼠的前列腺组织进行高通量测序发现，其中miR-483-3p和miR-483-5p在良性前列腺增生中表达下调，进一步通过上调miR-483-3p和miR-483-5p的表达发现其可抑制人前列腺肌成纤维基质细胞和前列腺上皮细胞增殖，进而达到防治良性前列腺增生的作用，即miR-483-3p和miR-483-5p作为检测或治疗良性前列腺增生的新的分子药物靶点，为良性前列腺增生的的防治提供了新的思路和基因资源。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了miRNA作为分子靶点在筛选或制备用于预防和/或治疗良性前列腺增生的药物中的应用，所述miRNA选自miR-483-3p和/或miR-483-5p。
进一步的，所述药物抑制WPMY-1细胞和/或RWPE-1细胞的增殖。
进一步的，所述miR-483-3p和/或miR-483-5p在前列腺增生组织中表达下调。
本发明还提供了miRNA作为分子靶点在制备用于预防和/或治疗良性前列腺增生的筛药模型中的应用，所述miRNA选自miR-483-3p和/或miR-483-5p。
本发明还提供了一种miRNA检测试剂在制备良性前列腺增生的检测试剂盒中的应用，所述miRNA选自miR-483-3p和/或miR-483-5p。
本发明还提供了一种良性前列腺增生的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包括用于检测miR-483-3p和/或miR-483-5p表达情况的试剂。
进一步的，所述检测试剂盒中包括用于扩增miR-483-3p和/或miR-483-5p的引物。
进一步的，所述用于扩增miR-483-3p的引物如SEQ ID NO.3-4所示。
进一步的，所述用于扩增miR-483-5p的引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.4所示。
进一步的，所述miR-483-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述miR-483-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过对良性前列腺增生模型进行高通量测序发现miR-483-3p和miR-483-5p在良性前列腺增生中表达下调，进一步验证发现上调miR-483-3p和miR-483-5p的表达可抑制人前列腺肌成纤维基质细胞和前列腺上皮细胞的增殖，达到防治良性前列腺增生的作用，即本发明首次发现了来源于人的miR-483-3p和miR-483-5p可作为检测或治疗良性前列腺增生的新的分子药物靶点，可利用该靶点达到良性前列腺增生的检测或药物筛选的目的。这为良性前列腺增生的防治提供了新的思路以及基因资源。
附图说明
图1为本发明实施例1中良性前列腺增生组织和正常组织的miR-483-3p和miR-483-5p的读数结果；
图2为本发明实施例2中丙酸睾酮刺激WPMY-1细胞增生模型中hsa-miR-483-3p和hsa-miR-483-5p的表达情况；
图3为本发明实施例2中丙酸睾酮刺激RWPE-1细胞增殖模型中hsa-miR-483-3p和hsa-miR-483-5p的表达情况；
图4为本发明实施例3中上调hsa-miR-483-3p和hsa-miR-483-5p的表达对WPMY-1细胞增殖影响的结果图；
图5为本发明实施例3中上调hsa-miR-483-3p和hsa-miR-483-5p的表达对RWPE-1细胞增殖影响的结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1丙酸睾酮诱导的大鼠良性前列腺增生
(1)雄性Wistar大鼠(180-200g)由湖北省疾控中心提供。
(2)将大鼠于温度22±3℃，空气湿度50±10％，日夜周期12小时/12小时的环境中饲养。
(3)实验动物适应环境一周后，随机分为正常对照组和前列腺增生模型组，每组9只。大鼠前列腺增生模型通过手术去势(切除睾丸)后每日皮下注射5mg/kg/d丙酸睾酮(天津金耀药业有限公司，规格：1mL:25mg，批号：150822)，连续30天，建立良性前列腺增生模型。
(4)30天后，处死大鼠后分离前列腺组织(正常对照组n＝9,前列腺增生组n＝9)。微小RNA测序由华大基因BGISEQ-500测序平台完成。每个基因的P值再用Qvalue进行多重假设检验校正，对于符合差异在两倍及以上且Q-value值小于等于0.001，认为是显著的差异表达基因。根据差异miRNA检测结果，使用R软件中的pheatmap函数进行层次聚类分析，其中miR-483-3p和miR-483-5p读数结果如图1所示。结果显示，前列腺增生组织中miR-483-3p和miR-483-5p在正常对照组和前列腺增生模型组中差异表达，并且相对于正常组织，前列腺增生组织中miR-483-3p(P<0.0001)和miR-483-5p(P<0.0001)的表达水平显著性下降，即说明miR-483-3p和miR-483-5p与前列腺增生存在负相关。
实施例2丙酸睾酮刺激WPMY-1和RWPE-1细胞增生
(1)人前列腺肌成纤维基质细胞株(WPMY-1细胞)和人前列腺上皮细胞(RWPE-1细胞)由中国科学院干细胞库提供。
(2)将WPMY-1细胞于DMEM培养基中(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)培养；将RWPE-1细胞于角质形成细胞无血清(K-SFM)培养基(含5ng/mL的重组人表皮生长因子和0.01％庆大霉素)中培养。
(3)将WPMY-1细胞和RWPE-1细胞分别用8μg/mL丙酸睾酮孵育48小时，以刺激WPMY-1细胞和RWPE-1细胞增生。
(4)收集细胞，采用常规的qPCR方法检测来源于人体的hsa-miR-483-3p和hsa-miR-483-5p的表达水平。
其中hsa-miR-483-3p的序列如SEQ ID NO:1所示，长度为21bp；hsa-miR-483-5p的序列如SEQ ID NO:2所示，长度为22bp。
其中用于特异性扩增hsa-miR-483-3p和hsa-miR-483-5p的下游引物相同，均为：5’-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3’(如SEQ ID NO:4所示)；
而用于特异性扩增hsa-miR-483-3p的上游引物序列为：
5’-GGGTCACTCCTCCCCT-3’(如SEQ ID NO:3所示)；
用于特异性扩增hsa-miR-483-5p的上游引物序列为：
5’-GGGAAGACGGGAGAAGA-3’(如SEQ ID NO:5所示)；
(5)统计学分析采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P<0.05为有显著性差异。结果采用均值±标准差进行描述。
检测结果如图2和图3所示，其中图2为丙酸睾酮刺激WPMY-1细胞增殖模型中hsa-miR-483-3p和hsa-miR-483-5p的表达情况，图3为丙酸睾酮刺激RWPE-1细胞增殖模型中hsa-miR-483-3p和hsa-miR-483-5p的表达情况。根据测定结果，相较于正常对照组，良性前列腺增生模型组的表达水平均显著下调，说明良性前列腺增生可能与hsa-miR-483-3p和hsa-miR-483-5p的表达水平负相关，hsa-miR-483-3p和hsa-miR-483-5p可作为良性前列腺增生的药物防治靶点。
实施例3上调hsa-miR-483-3p和/或hsa-miR-483-5p的表达对WPMY-1细胞和RWPE-1细胞增殖的影响
(1)将WPMY-1细胞和RWPE-1细胞分别分为：空白对照组(A组)、丙酸睾酮组(B组)、丙酸睾酮+hsa-miR-483-3p组(C组)、丙酸睾酮+hsa-miR-483-5p组(D组)和丙酸睾酮+hsa-miR NC组(E组)。
(2)各丙酸睾酮干预组的WPMY-1细胞和RWPE-1细胞分别用8μg/mL丙酸睾酮孵育48小时。
(3)hsa-miR-483-3p干预采用hsa-miR-483-3p孵育48小时。
(4)hsa-miR-483-5p干预采用hsa-miR-483-5p孵育48小时。
(5)hsa-miR NC干预采用hsa-miR NC孵育48小时。
将各组细胞培养48小时后，采用常规的CCK8法检测各组细胞的存活。
统计学分析采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P<0.05为有显著性差异。结果采用均值±标准差进行描述。分析各组相比于丙酸睾酮组(B组)的存活率差异。
检测分析结果如图4和图5所示。其中图4为上调hsa-miR-483-3p和hsa-miR-483-5p的表达对WPMY-1细胞增殖影响的结果图，图5为上调hsa-miR-483-3p和hsa-miR-483-5p的表达对RWPE-1细胞增殖影响的结果图。结果显示，相较于丙酸睾酮干预的良性前列腺增生模型组，通过上调hsa-miR-483-3p和/或hsa-miR-483-5p的表达，可以显著抑制WPMY-1细胞和RWPE-1细胞增殖，进而达到抑制良性前列腺增生的目的。即miR-483-3p和miR-483-5p可作为检测或治疗良性前列腺增生的新的分子药物靶点，可利用该靶点实现良性前列腺增生的检测或药物筛选，进而达到预防或治疗良性前列腺增生的作用。这为良性前列腺增生的防治提供了新的思路以及基因资源。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江汉大学
<120> miRNA作为检测或治疗良性前列腺增生的药物靶点的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
ucacuccucu ccucccgucu u 21
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
aagacgggag gaaagaaggg ag 22
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggtcactcc tcccct 16
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aactggtgtc gtggagtcgg c 21
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggaagacgg gagaaga 17

Claims (10)

1.miRNA作为分子靶点在筛选或制备用于预防和/或治疗良性前列腺增生的药物中的应用，其特征在于，所述miRNA选自miR-483-3p和/或miR-483-5p。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物抑制WPMY-1细胞和/或RWPE-1细胞的增殖。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-483-3p和/或miR-483-5p在前列腺增生组织中表达下调。
4.miRNA作为分子靶点在制备用于预防和/或治疗良性前列腺增生的筛药模型中的应用，其特征在于，所述miRNA选自miR-483-3p和/或miR-483-5p。
5.一种miRNA检测试剂在制备良性前列腺增生的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNA选自miR-483-3p和/或miR-483-5p。
6.一种良性前列腺增生的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括用于检测miR-483-3p和/或miR-483-5p表达情况的试剂。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括用于扩增miR-483-3p和/或miR-483-5p的引物。
8.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述用于扩增miR-483-3p的引物如SEQ ID NO.3-4所示。
9.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述用于扩增miR-483-5p的引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.4所示。
10.根据权利要求1-5任一项所述的应用或权利要求6-9任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述miR-483-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述miR-483-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
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