CN110819718B - miR-154-5p在前列腺癌骨转移的新应用 - Google Patents

miR-154-5p在前列腺癌骨转移的新应用 Download PDF

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Abstract

本发明首次发现miR‑154‑5p在前列腺癌骨转移组织中下调表达，并且miR‑154‑5p下调表达能预测无骨转移生存期较短，体内体外研究进一步确定了上调miR‑154‑5p抑制体内PCa的骨转移，上调miR‑154‑5p抑制PCa细胞的迁移、侵袭和增殖。基于以上结果，本发明提出了miR‑154‑5p在前列腺癌骨转移的新应用。

Description

miR-154-5p在前列腺癌骨转移的新应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体地涉及用于前列腺癌骨转移生物标志物miR-154-5p。
背景技术
前列腺癌(PCa)最优先转移的部位是骨，晚期PCa患者的发生率高达65％–80％。一旦癌细胞扩散到骨骼，它们就会严重破坏正常的骨骼重塑，导致骨折，神经压迫，疼痛和高钙血症。尽管在过去的几十年中，原发性PCa的治疗取得了很大进展，但远处的骨转移仍然是导致PCa患者生存时间短的主要问题。与原发性PCa患者相比，具有远处骨转移部位的PCa患者的5年相对存活率约为30％。预防骨转移是治疗的主要目标，阐明关键因素或验证PCa高骨转移倾向的分子机制至关重要。
微小RNA(miRNA)是一类非编码RNA，可作为靶基因的负调控子，已发现多种miRNA可以潜在地调节癌症发展和进程中的多个步骤。据报道miR-154-5p在多种癌症类型中经常被下调。但是，尚未报道miR-154-5p在PCa骨转移中的临床意义和生物学作用，以及miR-154-5p调节PCa骨转移的潜在分子机制。
骨转移会降低前列腺癌(PCa)患者的生活质量和生存时间，探索PCa骨转移的机制对于开发PCa骨转移的新型诊疗策略至关重要。寻找前列腺癌骨转移生物标志物，不仅有助于早期诊断和发现具有骨转移倾向的前列腺癌患者，而且能为其设计针对性的干预及治疗方案，改善其治疗效果以及其临床转归，最终达到预防与治疗骨转移的目标，具有极为重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的在于：
第一方面提供检测miR-154-5p水平的试剂在制备诊断前列腺癌患者是否发生骨转移的试剂的应用。
第二方面提供检测miR-154-5p水平的试剂在制备预测前列腺癌患者非骨转移生存时间和/或发生骨转移倾向的试剂的应用。
第三方面提供提高miR-154-5p水平的试剂在制备前列腺癌骨转移药物中的应用。
第四方面提供提高miR-154-5p水平的试剂在制备PI3K/AKT信号传导抑制剂中的应用。
第五方面提供提高miR-154-5p水平的试剂在制备EGFR抑制剂、FGFR1抑制剂中至少一种的应用。
本发明所采取的技术方案是：
检测miR-154-5p水平的试剂在制备诊断前列腺癌患者是否发生骨转移的试剂的应用。
可选的，检测miR-154-5p水平的试剂为特异性检测miR-154-5p的引物和/或探针。
检测miR-154-5p水平的试剂在制备预测前列腺癌患者非骨转移生存时间和/或发生骨转移倾向的试剂的应用。
可选的，检测miR-154-5p水平的试剂为特异性检测miR-154-5p的引物和/或探针。
提高miR-154-5p水平的试剂在制备前列腺癌骨转移药物中的应用，所述前列腺癌骨转移药物能够抑制和/或预防和/或治疗前列腺癌骨转移。
任选地，提高miR-154-5p水平的试剂含有以下物质的一种或多种：miR-154-5p分子、miR-154-5p的模拟物、miR-154-5p的修饰物、编码miR-154-5p的DNA、表达miR-154-5p的载体。
提高miR-154-5p水平的试剂在制备PI3K/AKT信号传导抑制剂中的应用。
提高miR-154-5p水平的试剂在制备EGFR抑制剂、FGFR1抑制剂中至少一种的应用。
任选地，提高miR-154-5p水平的试剂含有以下物质的一种或多种：miR-154-5p分子、miR-154-5p的模拟物、miR-154-5p的修饰物、编码miR-154-5p的DNA、表达miR-154-5p的载体。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现miR-154-5p在前列腺癌骨转移组织中下调表达，并且miR-154-5p下调表达能预测无骨转移生存期较短，体内体外研究进一步确定了上调miR-154-5p抑制体内PCa的骨转移，上调miR-154-5p抑制PCa细胞的迁移、侵袭和增殖。miR-154-5p通过靶向EGFR和FGFR1抑制PI3K/AKT信号传导的活性，从而抑制前列腺癌骨转移。
附图说明
图1：不同前列腺癌组织的miR-154-5p相对表达量，其中，PCa/nBM表示前列腺癌无骨转移患者的组织(163例)，PCa/BM表示前列腺癌骨转移患者的组织(29例)；
图2：不同细胞的miR-154-5p相对表达量；
图3：miR-154-5p表达水平与前列腺癌患者生存时间的关系，图A为miR-154-5p表达水平与无骨转移生存时间的关系，图B为miR-154-5p表达水平与总生存时间的关系；miR-154-5p-low表示miR-154-5p低表达组，miR-154-5p-high表示miR-154-5p高表达组；
图4：上调miR-154-5p对体内小鼠骨转移的影响，图A为BLI成像示意图，图B为骨X射线图，图C为骨H&E染色图，图D为X射线骨转移评分结果，图E为BLI信号，图F为无骨转移生存曲线，图G为总生存曲线；其中vector为转染对照质粒的细胞；miR-154-5p表示转染miR-154-5p过表达载体的细胞；
图5：上调miR-154-5p对体外侵袭和迁移的影响；其中vector为转染对照质粒的细胞；miR-154-5p表示转染miR-154-5p过表达载体的细胞；
图6：上调miR-154-5p对细胞增殖的影响；其中vector为转染对照质粒的细胞；miR-154-5p表示转染miR-154-5p过表达载体的细胞；
图7：上调miR-154-5p对AKT活性的影响；其中vector为转染对照质粒的细胞；miR-154-5p表示转染miR-154-5p过表达载体的细胞；
图8：上调miR-154-5p对AKT磷酸化的影响；其中vector为转染对照质粒的细胞；miR-154-5p表示转染miR-154-5p过表达载体的细胞；
图9：上调miR-154-5p对潜在靶标mRNA的影响；其中vector为转染对照质粒的细胞；miR-154-5p表示转染miR-154-5p过表达载体的细胞；
图10：上调miR-154-5p对潜在靶标蛋白表达的影响；其中vector为转染对照质粒的细胞；miR-154-5p表示转染miR-154-5p过表达载体的细胞；
图11：萤光素酶检测miR-154-5p的潜在靶标；其中vector为转染对照质粒的细胞；miR-154-5p表示转染miR-154-5p过表达载体的细胞；
图12：免疫沉淀分析miR-154-5p靶向EGFR，FGFR1的结果；其中vector为转染对照质粒的细胞；miR-154-5p表示转染miR-154-5p过表达载体的细胞；
图13：上调的EGFR和FGFR1对miR-154-5p抑制AKT信号、迁移、侵袭的影响；其中vector为转染对照质粒的细胞；miR-154-5p表示转染miR-154-5p过表达载体的细胞；miR-154-5p+EGFR表示转染miR-154-5p过表达载体和EGFR过表达载体的细胞，miR-154-5p+FGFR1表示转染miR-154-5p过表达载体和FGFR1过表达载体的细胞。
具体实施方式
本发明通过多种算法、测序和转录组分析，令人意外地发现miR-154-5p在前列腺癌骨转移组织中下调表达，并且这种差异表达的结果决定了miR-154-5p能作为诊断前列腺癌患者是否发生骨转移的标志物。为此，本发明提出检测miR-154-5p水平的试剂在制备诊断前列腺癌患者是否发生骨转移的试剂的应用。
前列腺癌患者发生骨转移的依据是miR-154-5p水平低于设定阈值。在一些实施方案中，诊断前列腺癌患者是否发生骨转移是指从确诊为前列腺癌的患者中检测miR-154-5p水平，若测得来自前列腺癌患者的样品中miR-154-5p水平低于设定阈值，则判定为发生骨转移。这里所述的阈值通常是根据前列腺癌非骨转移患者群体中miR-154-5p表达水平所设定。本领域可以确定前列腺癌非骨转移患者应当包括未发生任何转移的前列腺癌群体以及发生转移但转移部位不是骨的前列腺癌群体。
在一些实施方案中，检测miR-154-5p水平的试剂为特异性检测miR-154-5p的引物的形式包括但不限于单链核酸、带二级结构(如环、茎)核酸、修饰的核酸(如锁核酸修饰)。
在一些实施方案中，检测miR-154-5p水平的试剂为与miR-154-5p杂交的探针，探针的形式包括但不限于单一探针、微阵列。
本发明结合临床病例特征分析，发现miR-154-5p低表达能预测无骨转移生存期较短，骨转移发生倾向较大。这决定了检测miR-154-5p水平的试剂能在制备预测前列腺癌患者非骨转移生存时间和/或发生骨转移倾向的试剂的应用。具体地，miR-154-5p水平低于设定阈值，则非骨转移生存时间短，发生骨转移倾向高。在一些实施方案中，预测前列腺癌患者非骨转移生存时间是指对确诊为前列腺癌的患者进行miR-154-5p水平检测，若测得来自前列腺癌患者的样品中miR-154-5p水平低于阈值，则判定非骨转移生存时间短，发生骨转移倾向高。这里所述的阈值通常是根据前列腺癌群体miR-154-5p表达水平中位值进行设定。本领域可以确定前列腺癌非骨转移患者应当包括未发生任何转移的前列腺癌群体以及发生转移但转移部位不是骨的前列腺癌群体。
在一些实施方案中，检测miR-154-5p水平的试剂为特异性检测miR-154-5p的引物的形式包括但不限于单链核酸、带二级结构(如环、茎)核酸、修饰的核酸(如锁核酸修饰)。
在一些实施方案中，检测miR-154-5p水平的试剂为与miR-154-5p杂交的探针，探针的形式包括但不限于单一探针、微阵列。
在一些实施方案中，本发明对前列腺癌患者检测miR-154-5p水平的样品选自从患者中分离的体液样品、肿瘤样品、细胞样品；体液包括但不限于血液、血浆、血清、淋巴液、脑脊髓液、滑液、尿液、唾液、粘液等；肿瘤样品的形式包括但不限于活体组织、石蜡包埋组织、冰冻组织等形式；细胞样品选自外周血单个核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、循环肿瘤细胞等。
本发明结合体内和体外实验，进一步确认了上调miR-154-5p抑制体内PCa的骨转移，上调miR-154-5p抑制PCa细胞的迁移、侵袭和增殖，由此明确了上调miR-154-5p的试剂能够作为前列腺癌骨转移药物。本发明提出提高miR-154-5p水平的试剂在制备前列腺癌骨转移药物中的应用，所述前列腺癌骨转移药物能够抑制和/或预防和/或治疗前列腺癌骨转移。
在一些实施方案中，提高miR-154-5p水平的试剂含有以下物质的一种或多种：miR-154-5p分子、miR-154-5p的模拟物、miR-154-5p的修饰物、编码miR-154-5p的DNA、表达miR-154-5p的载体。
本发明进一步发现miR-154-5p通过靶向EGFR和FGFR1抑制PI3K/AKT信号传导的活性，从而抑制前列腺癌骨转移。本发明提出提高miR-154-5p水平的试剂在制备PI3K/AKT信号传导抑制剂中的应用。还提出提高miR-154-5p水平的试剂在制备EGFR抑制剂、FGFR1抑制剂中至少一种的应用。在一些实施方案中，提高miR-154-5p水平的试剂含有以下物质的一种或多种：miR-154-5p分子、miR-154-5p的模拟物、miR-154-5p的修饰物、编码miR-154-5p的DNA、表达miR-154-5p的载体。
本发明术语“非骨转移”在医学领域是指未发生伴骨转移，通常来说，对收集的肿瘤样本进行分析，如果肿瘤样本未发生骨转移，则归类为非骨转移肿瘤样本，本领域技术人员应该知晓，非骨转移肿瘤样本包括未发生任何转移的肿瘤样本和发生了其他非骨转移(如肝、脑、肺等)的肿瘤样本。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
下述实验例中所使用的实验方法或实验条件，如无特殊说明，均按常规方法或厂家说明书进行，下述实验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
细胞培养
正常前列腺上皮细胞RWPE-1和人PCa细胞株22RV1，PC-3，VCaP，DU145，LNCaP均来自中国科学院上海细胞研究所。RWPE-1细胞在SFM培养基(1x)(Invitrogen)中培养。PC-3，LNCaP和22Rv1细胞在补充有10％胎牛血清、100U/ml的青霉素的RPMI-1640培养基中培养，并在5％CO2的湿润气氛下于37℃培养。DU145和VCaP细胞在补充了10％FBS的Dulbecco改良的Eagle's培养基(Invitrogen)中生长。C4-2B细胞系购自MD Anderson癌症中心，并在补充有10％FBS的T培养基(Invitrogen)中生长。所有细胞系均在37℃的5％CO2湿润气氛下生长。
RNA提取，逆转录和实时定量PCR
使用RNA分离试剂盒(Qiagen)从组织或细胞中提取总RNA。使用RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher)根据制造商的规程从总mRNA逆转录mRNA和miRNA。使用iQ SYBR Green(BIO-RAD)在CFX96系统(BIO-RAD)上扩增和定量cDNA，U6、GAPDH和miR-154-5p的引物由广州RiboBio公司设计、合成和纯化，选用2-ddCt相对定量法进行荧光定量检测计算。
质粒和转染
从基因组DNA中扩增人miR-154基因，并将其克隆到pMSCV-puro逆转录病毒载体(Clontech)中，构建miR-154-5p过表达载体。从基因组DNA中扩增人EGFR和FGFR1的3'非翻译区(3'UTR)区域，并将其克隆到pmirGLO载体(Promega)中。转染采用Lipofectamine 3000试剂盒。
免疫印迹
使用细胞分级分离试剂盒(Cell Signaling Technology)根据制造商的说明分离核/细胞质分级分离，并用RIPA Buffer(Cell Signaling Technology)提取全细胞裂解液。Western blotting按常规条件操作，EGFR抗体，FGFR1抗体，IGF1R抗体，p-AKT(S473)抗体，p-AKT(T308)抗体和AKT抗体购自Cell Signaling Technology，此外，α-tubulin抗体(Sigma-Aldrich)作为上样对照。
萤光素酶报告基因检测
转染后36h，使用双重荧光素酶报告试剂盒(Promega)根据制造商的方案测量荧光素酶和海肾信号。
miRNA免疫沉淀
用HA-Ago2共转染细胞，然后使用抗HA-抗体进行HA-Ago2免疫沉淀。对免疫沉淀材料进行实时PCR分析，以测试EGFR，FGFR1，IGF1R和MET的mRNA与RISC复合物的关联。
Akt活性检测
为了测量细胞或肿瘤组织中Akt激酶的活性，将免疫复合物与生物素化的肽底物孵育，该底物在活化的Akt存在下被磷酸化。然后用包含识别磷酸化底物肽的一抗的K-LISAAkt活性试剂盒(Calbiochem，Darmstadt)对反应提取物中Akt激酶活性的磷酸化底物进行定量。
侵袭和迁移实验
侵袭和迁移实验是使用Transwell室进行的，该室由8mm膜滤芯(Corning)组成，带有或不带有包被的Matrigel(BD Biosciences)，用胰蛋白酶消化细胞并将其悬浮在无血清培养基中。上室添加1.5×105个细胞，下室为含有10％胎牛血清的培养基，孵育24～48h后，用4％多聚甲醛固定，并用苏木精染色，在显微镜下计数(100×)。
动物实验
骨转移采用BALB/c-nu小鼠(5-6周龄，18-20克)，实验前进行麻醉，接左心室接种1×105个(100μL PBS)PC-3细胞。用生物发光成像系统(BLI)监测骨转移进展，X射线监测溶骨性病变的透射性损伤。用Metamorph图像分析系统和软件测量溶骨性病变的面积，每只动物的骨破坏程度表示为平方毫米，根据以下标准对骨转移进行评分：0：无转移；1：骨损伤覆盖骨宽度小于1/4；2：骨损伤覆盖骨宽度1/4～1/2；3：骨损伤覆盖骨宽度1/2～3/4；4：骨损伤覆盖骨宽度大于3/4；每只动物的骨转移评分来自四肢评分综合，每天监测动物的体征，当出现体重减轻10％、瘫痪、头歪斜等痛苦症状时选择安乐死。
肿瘤组织
从2008年1月至2016年12月获得了192份PCa组织，包括29份发生骨转移的PCa组织和163份未发生骨转移的PCa组织，根据临床和病理学证据对患者进行了诊断。标本立即速冻并保存在液氮罐中。PCa组织中miR-154-5p表达的中值用于区分miR-154-5p的高表达和低表达。
MTT实验
将细胞以0.2×104个细胞/孔的初始密度一式三份地接种到96孔板中。在各个时间点，将细胞组与100μl 0.5mg/ml无菌MTT孵育；在37℃下放置4小时。然后除去培养基，并加入150μl的DMSO(Sigma)。使用655nm作为参考波长在570nm下测量吸光度值。
实施例1、miR-154-5p在骨转移的前列腺癌中下调表达
通过分析29例骨转移的PCa组织(PCa/BM)和163例无骨转移的PCa组织(PCa/nBM)，如图1所示，我们发现与PCa/nBM相比，PCa/BM中miR-154-5p的表达水平明显下调。在体外细胞水平上，如图2所示，与RWPE-1相比，其他6个PCa细胞中的miR-154-5p的表达水平明显下调。可见，miR-154-5p在骨转移的前列腺癌中下调表达。
实施例2、低水平miR-154-5p预测前列腺癌患者无骨转移生存期较短
Kaplan-Meier生存分析表明，如图3所示，与高miR-154-5p表达的患者相比，miR-154-5p表达低的PCa患者与较短的无骨转移生存相关，但对总体生存期无影响，可见，低水平miR-154-5p可预测前列腺癌患者无骨转移生存期较短，即骨转移倾向高。
实施例3、上调miR-154-5p抑制体内PCa的骨转移
在小鼠的骨转移模型中进一步研究了miR-154-5p对PCa体内骨转移的影响，在该模型中分别接种荧光素酶标记的载体或转染了过表达miR-154-5p载体的PC-3细胞，检测骨转移情况如图4所示，BLI和X射线显示，与载体对照组相比，miR-154-5p显着抑制了PC-3细胞在体内的骨转移能力，H&E染色显示，上调miR-154-5p可显着减少骨骼中的肿瘤负担。而且，与载体对照组相比，上调miR-154-5p表达降低了转移性肿瘤的骨转移评分和溶骨区域，并延长了总体和无骨转移的生存期。这些发现表明，miR-154-5p的上调在体内抑制了PCa的骨转移。
实施例4、上调miR-154-5p抑制PCa细胞的迁移、侵袭和增殖能力
为了确定miR-154-5p在PCa骨转移中的生物学功能，通过迁移侵袭实验，结果如图5所示，上调miR-154-5p抑制PCa细胞的侵袭和迁移能力。进行MTT实验以研究miR-154-5p对PCa细胞的增殖能力，如图6所示，上调miR-154-5p减少PCa细胞的增殖能。因此，我们的结果证明，上调miR-154-5p可以消除PCa细胞的侵袭，迁移和增殖能力。
实施例5、miR-154-5p抑制PI3K/AKT信号通路
检测不同PCa细胞中的AKT活性，结果如图7所示，在miR-154-5p过表达的细胞中AKT活性降低，免疫印迹结果如图8所示，miR-154-5p的上调降低了S473和T308的磷酸化水平。因此，这些结果表明miR-154-5p抑制骨转移性PCa细胞中的AKT信号传导活性。
实施例6、miR-154-5p靶向EGFR，FGFR1抑制AKT信号传导活性，从而抑制前列腺癌骨转移
实时PCR分析如图9显示，上调miR-154-5p减少EGFR，FGFR1和IGF1R的mRNA表达水平，但不降低FGFR2，ERBB4和INSR的mRNA表达水平；蛋白质印迹以检查miR-154-5p对EGFR，FGFR1和IGF1R的蛋白表达水平的影响，结果如图10所示，上调miR-154-5p降低EGFR和FGFR1的蛋白表达水平，但对IGF1R不起作用。该发现表明miR-154-5p抑制EGFR，FGFR1表达。结合萤光素酶检测显示(图11所示)，上调miR-154-5p减少EGFR和FGFR1转录本3'UTR的报告基因活性，但对突变体报告基因活性无影响。RNA免疫沉淀(IP)分析表明miR-154-5p与EGFR和FGFR1转录本具有选择性关联(图12)。此外，如图13所示，独立地上调的EGFR和FGFR1逆转了前列腺癌细胞中miR-154-5p过表达所抑制的AKT活性，侵袭，迁移。这些结果表明，miR-154-5p通过抑制PCa细胞中的EGFR和FGFR1表达来抑制AKT信号传导活性，这进一步抑制了PCa细胞的增殖和迁移。

Claims (2)

1.检测miR-154-5p水平的试剂在制备诊断前列腺癌患者是否发生骨转移的试剂中的应用，若测得来自前列腺癌患者的样品中miR-154-5p水平低于设定阈值，则判定为发生骨转移，所述阈值根据前列腺癌非骨转移患者群体中miR-154-5p表达水平所设定，所述样品为肿瘤样品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：检测miR-154-5p水平的试剂为特异性检测miR-154-5p的引物和/或探针。
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