CN116585342A - 包含miRNA的活性成分及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及包含miRNA的活性成分及其应用，该活性成分包含miR‑302/miR367家族的miRNA或经修饰的miR‑302/miR367家族的miRNA衍生物。该活性成分可以逆转已经衰老的细胞，使衰老细胞重新返回细胞周期而增殖，进而用于预防或治疗衰老相关疾病。
Description
技术领域
本申请属于生物医药领域，具体涉及包含miRNA的活性成分及其应用。
背景技术
衰老是所有生命不得不面对的一个过程，如何找到破解衰老的生物学机制以及找到延缓或逆转衰老的方法和药物，一直是科学界的热门领域，同时，也具有重大社会意义和巨大商业价值。衰老分为个体衰老、器官衰老、细胞衰老几个水平，个体与器官的衰老最终反应在细胞衰老上，从药物研发角度上，得到延缓或逆转细胞衰老的药物再应用于动物中是一种合理的方案。
肝脏是体内重要的糖和脂类代谢场所，对于维持糖和脂质的合成和分解代谢稳态至关重要。当这种动态平衡被打破时，比如饱和脂肪酸摄入过多或者合成增加，脂质合成过量，载脂蛋白合成减少，极低密度脂蛋白(VLDL)合成障碍等会引起肝脏脂肪累积增多，引发脂肪肝。脂肪肝包括NAFLD和酒精性脂肪肝(ALD)，其在世界范围内具有广泛的发病率。其中NAFLD是由多种因素(排除酒精)引起的以肝脏甘油三酯异位沉淀和脂肪变性为特征的临床病理综合征。NAFLD的确诊需要借助于影像学和组织活检，当病理检测肝脏出现超过5％的浸润性脂肪变性或者核磁共振成像质子密度脂肪分数(MRI-PDFF)超过5％时，可以判定为NAFLD。该疾病的发生和多种危险因素显著相关，包括血脂异常、高血压、高血糖、胰岛素抵抗、衰老等。由于NAFLD的发病因素复杂且和多种疾病串联发生，如二型糖尿病(T2DM)、肥胖、肠道菌群紊乱等，其确切的发病机制并未得到清晰阐明。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一种由内源基因编码的长度在18-25个核苷酸的非编码单链RNA分子。miRNA涉及多种生物学过程，一种方式是miRNA与靶基因互补结合，最终切割靶mRNA，第二种方式是与靶基因不完全互补结合，抑制靶基因翻译。
miRNA的种子序列是进化上最保守的序列，一般是5'端的第2～8个核苷酸。种子序列与靶序列的保守型构成了靶序列预测的模型基础，但目前预测得到的靶序列仍需要进行实验验证。
目前，缺乏逆转衰老和脂肪肝相关的有效治疗miRNA药物。
发明内容
基于此，本申请有必要提供一种活性成分，发现所述活性成分可以逆转衰老过程，例如，恢复衰老细胞重新进入细胞周期或恢复衰老细胞增殖能力。进一步，将其用于治疗衰老或衰老相关疾病中的应用。
本申请还提供了所述活性成分在制备治疗非酒精性脂肪肝产品中的应用，所述活性成分可以抑制高糖高脂压力下脂肪酸过度合成，进而抑制脂肪肝的发生。
具体技术方案如下：
本申请提供了一种活性成分，所述活性成分包括如下至少一组：
(1)miR-302/miR367家族的miRNA、或经修饰的miR-302/miR367家族的miRNA衍生物、或miR-302/miR367家族的miRNA模拟物；
(2)前体miRNA，所述前体miRNA能在宿主内加工成(1)中所述的miRNA；
(3)多核苷酸，所述多核苷酸能被宿主转录形成(2)中所述的前体miRNA，并加工形成(1)中所述的miRNA；
(4)表达载体，所述表达载体含有(1)中所述的miRNA、或(2)中所述的前体miRNA、或(3)中所述的多核苷酸；
(5).(1)中所述miRNA的激动剂。
在其中一个实施例中，所述miRNA来源于人或其他动物。可选的，所述其他动物包括灵长类及其他哺乳动物、两栖动物和鸟类中的一种或多种。可选的，所述其他动物包括猴子、小鼠和大鼠中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述miR-302/367家族的miRNA包括miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-302e、miR-302f和miR-367中的一个或多个。可选的，所述miR-302a包括miR-302a-3p和/或miR-302a-5p；所述miR-302b包括miR-302b-3p和/或miR-302b-5p；所述miR-302c包括miR-302c-3p和/或miR-302c-5p；所述miR-302d包括miR-302d-3p和/或miR-302d-5p；所述miR-367包括miR-367-3p和/或miR-367-5p。
在其中一个实施例中，所述miR-302/367家族的miRNA选自如下中的一种或多种：hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302c-3p.1、hsa-miR-302d-3p、hsa-miR-302e、bta-miR-302b、bta-miR-302c、bta-miR-302d、gga-miR-302b-3p、gga-miR-302c-3p、gga-miR-302d、mdo-miR-302a、mdo-miR-302b、mdo-miR-302c、mdo-miR-302d、mml-miR-302a-3p、mml-miR-302b、mml-miR-302c、mml-miR-302d、mmu-miR-302a-3p、mmu-miR-302b-3p、mmu-miR-302d-3p、ptr-miR-302a、ptr-miR-302b、ptr-miR-302c、ptr-miR-302d、ptr-miR-302e、hsa-miR-302a-5p、cfa-miR-302a、mmu-miR-302a-5p、hsa-miR-302b-5p、hsa-miR-302d-5p、cfa-miR-302b、cfa-miR-302d、gga-miR-302b-5p、mmu-miR-302b-5p、mmu-miR-302c-5p、mmu-miR-302d-5p、bta-miR-302a、gga-miR-302a、mmu-miR-302c-3p、hsa-miR-302c-5p、cfa-miR-302c、gga-miR-302c-5p、hsa-miR-302f、ptr-miR-302f、hsa-miR-367-5p、cfa-miR-367、mmu-miR-367-5p、hsa-miR-367-3p、mml-miR-367、mmu-miR-367-3p、ptr-miR-367、gga-miR-367、mml-miR-302a-5p和xtr-miR-367。
在其中一个实施例中，所述miR-302/367家族的miRNA的核苷酸序列包含如SEQ IDNo:1～14中的至少一条所示核苷酸序列。
本申请还提供了上述的活性成分在制备逆转衰老细胞的衰老进程的产品中的应用。
本申请还提供了上述的活性成分在制备恢复衰老细胞的细胞周期或细胞增殖能的产品中的应用。
本申请还提供了上述的活性成分在制备治疗细胞衰老所致的相关性疾病的产品中的应用。
本申请还提供了上述的活性成分在制备治疗非酒精性脂肪肝的产品中的应用。
相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：
本申请通过体外细胞试验和体内动物实验发现miR-302/367家族中的miRNA或功能与其基本相同、且具有相同的核心序列的miRNA可以逆转已经衰老的细胞，使衰老细胞重新返回细胞周期而增殖，即所谓的“返老还童”，其可以作为逆转衰老的活性成分，用于治疗衰老及其相关疾病。
进一步，本申请在脂肪肝小鼠模型中发现，肝特异性过表达miR-302可以抑制NAFLD发生，因此，将miR-302作为治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。
附图说明
图1A为流式荧光分选结果；图1B为p21-YFP-Neo细胞系衰老的检测荧光显微镜下p21-YFP的表达；图1C为β-gal染色图；
图2为mir-302b处理衰老细胞后的增殖情况；
图3为高内涵追踪miR-302b处理后的衰老细胞的增殖情况，每张图片时间间隔6小时；
图4为人源miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-302e、miR-302f、miR-367处理后衰老细胞后的增殖情况；
图5为流式细胞周期检测结果；图A为流式图，图B为A图的量化图；
图6为Ki67染色结果；
图7为pAAV-CMV-miR-302b构建流程；
图8为过表达miR-302b重组AAV病毒包装示意图；
图9为老年鼠给与mir-302b后的衰老缓解变化的图；
图10为器官β-gal染色结果；
图11为毛囊H&E染色结果；
图12为转棒实验和抓力结果；
图13为尿斑实验结果；
图14为环磷酰胺诱导小鼠化疗后脱发的治疗方法的流程示意图；
图15为miR-302b治疗环磷酰胺诱导小鼠化疗后脱发的结果，其中，图A为治疗前后的对比图，图B为毛发再生长面积随时间变化图；
图16为miR-302b治疗小鼠雄激素脱发，其中，图A为治疗方法的流程示意图；图B为治疗前后的对比图，C为毛发再生长面积随时间变化图；
图17中的图A为pAAV-TBG-miR-302b(mut 5bp)构建流程，图B为过表达miR-302b重组AAV病毒包装示意图；
图18为Minicircle plasmid的制备流程；
图19为miRNA序列设计的结构示意图；
图20为油红O染色结果，其中，图A～D分别为对照组、FFA-PBS、FFA-miR-302b和FFA-miR-302b-NC；
图21为流式分析结果，其中，图A为流式图，图B为A的统计图；
图22为Western blot检测mTORC2信号相关蛋白以及下游脂肪酸从头合成相关限速酶的表达结果，其中，图A为Western blot图，图B为A图的量化结果；
图23为构建策略及小鼠给药策略，其中，图A为肝脏特异性表达miR-302b的Minicircle质粒和腺相关病毒主质粒的构建模式图；图B为高糖高脂小鼠肝脏递送miR-302b程序；
图24为肝脏qPCR结果；
图25为小动物活体成像结果；
图26中的图A为肝脏重量，图B为肝脏TG含量；
图27为肝脏病理结果；(A)肝脏病理切片HE染色和油红染色结果；(B)肝脏脂肪变性评分，N＝6/组；(C)小叶性炎症评分，N＝6/组；(D)气球样变评分，N＝6/组；(E)纤维化评分，N＝6/组；数据统计用mean±s表示；**P＜0.01，***P＜0.001；
图28中的A～E图分别为肝功指标(ALT、AST)、血清TCHO和TG以及NAFLD评分；
图29中图A为Western blot检测mTORC2信号和脂肪酸从头合成信号相关蛋白表达量；图B为Western blot结果量化，N＝4/组。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
目前，衰老细胞定义为细胞周期永久终止，而本申请发现衰老细胞并非细胞周期永久终止，而是暂时性停止，可以通过外源miRNA重新恢复已经衰老的细胞重新进入细胞周期，此发现作为一项颠覆性结果，这将对衰老这一亟待解决重大问题带来新思路以及新的潜在药物。
基于此，本申请一实施方式提供了一种活性成分，该活性成分包括如下至少一组：
(1)包含如下至少一条核心序列，长度为16nt～28nt，且功能与miR-302或miR-367相同或基本相同的miRNA或经修饰miRNA衍生物或miRNA模拟物：
5’-AAGUGCU-3’，5’-CUUAAAC-3’，5’-CUUUAAC-3’，5’-AGUGCUU-3’，5’-UUAACAU-3’，5’-AAUUGCU-3’，5’-CUGUUGC-3’及5’-AUUGCAC-3’；
(2)前体miRNA，所述前体miRNA能在宿主内加工成(1)中所述的miRNA；
(3)多核苷酸，所述多核苷酸能被宿主转录形成(2)中所述的前体miRNA，并加工形成(1)中所述的miRNA；
(4)表达载体，所述表达载体含有(1)中所述的miRNA、或(2)中所述的前体miRNA、或(3)中所述的多核苷酸；
(5).(1)中所述miRNA的激动剂。
在一个具体示例中，(1)中所述miRNA可以为成熟的miRNA。
术语“miRNA及其前体”指微小RNA(microRNA，简称miRNA)是近年来在线虫，果蝇和植物，哺乳动物等真核生物中发现的一种内源性的长度为22个核苷酸左右的非编码单链小RNA。它在表达上具有组织和时间的特异性，通过与靶mRNA的碱基互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，是调节其他功能基因表达的重要调控分子。越来越多的证据表明miRNA虽然微小，但它通过与靶mRNA形成完全或者不完全互不配对从而对生物体的各种生命过程有着至关重要的作用。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间或更长。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
如本文所用，“功能与miR-302相同或基本相同”是指保留了miR-302b的≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％的逆转衰老进程的功能(例如，使衰老细胞的恢复细胞周期或细胞增殖)。
本申请还包括miRNA变体和衍生物。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miR-302进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、锁核苷酸修饰、核酸修饰、烃基修饰、糖基化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰等。
在一个具体示例中，miRNA的激动剂包括促进miRNA表达或促进miRNA功能活性的物质，例如，miRNA模拟物包含miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-302e、miR-302f和/或miR-367的初始miRNA(pri-miRNA)、前体miRNA(pre-miRNA)或成熟序列的多核苷酸。
在一个具体示例中，miRNA来源于人或其他动物；较佳地，其他动物为猴子、大鼠和小鼠中的一种或多种。
在一个具体示例中，包含所述5’-AAGUGCU-3’核心序列的miR-302/miR367家族选自如下组中的一个或多个：hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302c-3p.1、hsa-miR-302d-3p、hsa-miR-302e、bta-miR-302b、bta-miR-302c、bta-miR-302d、gga-miR-302b-3p、gga-miR-302c-3p、gga-miR-302d、mdo-miR-302a、mdo-miR-302b、mdo-miR-302c、mdo-miR-302d、mml-miR-302a-3p、mml-miR-302b、mml-miR-302c、mml-miR-302d、mmu-miR-302a-3p、mmu-miR-302b-3p、mmu-miR-302d-3p、ptr-miR-302a、ptr-miR-302b、ptr-miR-302c、ptr-miR-302d、ptr-miR-302e；和/或，包含所述5’-CUUAAAC-3’核心序列的miR-302/miR367家族选自如下组中的一个或多个：hsa-miR-302a-5p、cfa-miR-302a和mmu-miR-302a-5p；和/或，包含所述5’-CUUUAAC-3’核心序列的miR-302/miR367家族选自如下组中的一个或多个：hsa-miR-302b-5p、hsa-miR-302d-5p、cfa-miR-302b、cfa-miR-302d、gga-miR-302b-5p、mmu-miR-302b-5p、mmu-miR-302c-5p和mmu-miR-302d-5p；和/或，包含所述5’-AGUGCUU-3’核心序列的miR-302/miR367家族选自如下组中的一个或多个：bta-miR-302a、gga-miR-302a、mmu-miR-302c-3p；和/或，包含所述5’-UUAACAU-3’核心序列的miR-302/miR367家族选自如下组中的一个或多个：hsa-miR-302c-5p、cfa-miR-302c和gga-miR-302c-5p；和/或，包含所述5’-AAUUGCU-3’核心序列的miR-302/miR367家族选自hsa-miR-302f和/或ptr-miR-302f；和/或，包含所述5’-CUGUUGC-3’核心序列的miR-302/miR367家族选自hsa-miR-367-5p、cfa-miR-367、mmu-miR-367-5p；和/或，包含所述5’-AUUGCAC-3’核心序列的miR-302/miR367家族选自hsa-miR-367-3p、mml-miR-367、mmu-miR-367-3p、ptr-miR-367、xtr-miR-367。
在一个具体示例中，miRNA为miR-302/367家族中的miRNA，所述miR-302/367家族包括：miR-302和/或miR-367，或经修饰的miR-302或miR-367衍生物，其功能与miR-302b或miR-367相同或基本相同。其中，miRNA可以为成熟的miRNA，上述成熟的miRNA序列及其基因编码序列在不同物种之间会存在碱基的差异，但不影响其功能的发挥。
在一个具体示例中，miR-302包括miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-302e和miR-302f中的一个或多个；可选的，miR-302a包括miR-302a-3p和/或miR-302a-5p；miR-302b包括miR-302b-3p和/或miR-302b-5p；miR-302c包括miR-302c-3p和/或miR-302c-5p；miR-302d包括miR-302d-3p和/或miR-302d-5p；miR-367包括miR-367-3p和/或miR-367-5p；
在一个具体示例中，miRNA选自miR-302/367家族中的如下miRNA：
hsa-miR-302a-3p(MIMAT0000684)、hsa-miR-302b-3p(MIMAT0000715)、hsa-miR-302c-3p.1(MIMAT0000717)、hsa-miR-302d-3p(MIMAT0000718)、hsa-miR-302e(MIMAT0005931)、bta-miR-302b(MIMAT0009280)、bta-miR-302c(MIMAT0009281)、bta-miR-302d(MIMAT0009279)、gga-miR-302b-3p(MIMAT0003357)、gga-miR-302c-3p(MIMAT0003359)、gga-miR-302d(MIMAT0003360)、mdo-miR-302a(MIMAT0004182)、mdo-miR-302b(MIMAT0004180)、mdo-miR-302c(MIMAT0004181)、mdo-miR-302d(MIMAT0004183)、mml-miR-302a-3p(MIMAT0006259)、mml-miR-302b(MIMAT0006260)、mml-miR-302c(MIMAT0006261)、mml-miR-302d(MIMAT0006262)、mmu-miR-302a-3p(MIMAT0000380)、mmu-miR-302b-3p(MIMAT0003374)、mmu-miR-302d-3p(MIMAT0003377)、ptr-miR-302a(MIMAT0008086)、ptr-miR-302b(MIMAT0008087)、ptr-miR-302c(MIMAT0008088)、ptr-miR-302d(MIMAT0008089)、ptr-miR-302e(MIMAT0008090)、hsa-miR-302a-5p(MIMAT0000683)、cfa-miR-302a(MIMAT0009855)、mmu-miR-302a-5p(MIMAT0004579)、hsa-miR-302b-5p(MIMAT0000714)、hsa-miR-302d-5p(MIMAT0004685)、cfa-miR-302b(MIMAT0009856)、cfa-miR-302d(MIMAT0009858)、gga-miR-302b-5p(MIMAT0003356)、mmu-miR-302b-5p(MIMAT0003373)、mmu-miR-302c-5p(MIMAT0003375)、mmu-miR-302d-5p(MIMAT0017225)、bta-miR-302a(MIMAT0009278)、gga-miR-302a(MIMAT0001143)、mmu-miR-302c-3p(MIMAT0003376)、hsa-miR-302c-5p(MIMAT0000716)、cfa-miR-302c(MIMAT0009857)、gga-miR-302c-5p(MIMAT0003358)、hsa-miR-302f(MIMAT0005932)、ptr-miR-302f(MIMAT0008091)、hsa-miR-367-5p(MIMAT0004686)、cfa-miR-367(MIMAT0009859)、mmu-miR-367-5p(MIMAT0017214)、hsa-miR-367-3p(MIMAT0000719)、mml-miR-367(MIMAT0006292)、mmu-miR-367-3p(MIMAT0003181)、ptr-miR-367(MIMAT0008118)、gga-miR-367(MIMAT0003369)、mml-miR-302a-5p(MIMAT0026851)和xtr-miR-367(MIMAT0003638)。
其中，括号内为accession序列号，可在mirbase数据库中查询。
在一个优选示例中，miRNA选自miR-302/367家族中的如下miRNA：hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302b-5p、hsa-miR-302c-3p、hsa-miR-302c-5p、hsa-miR-302d-3p、hsa-miR-302d-5p、hsa-miR-302e、hsa-miR-302f、hsa-miR-367-5p和hsa-miR-367-3p中的一种或多种，或选自与上述miRNA序列同源性≥75％的核苷酸，较佳地同源性≥85％，更佳地同源性≥95％，最佳地同源性≥99％。进一步的，miRNA包括如SEQ ID NO:1～14所示的核苷酸序列。
根据本申请所提供的miRNA序列，本领域普通技术人员可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸(构建物)，也即该多核苷酸(构建物)能够在体内上调相应的miRNA的功能。因此，本申请一实施方式还提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。
通常，多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本申请还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸(构建物)。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
在一个具体示例中，所述衍生物或所述多核苷酸所述或所述的表达载体包含式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向式I；
式I中，Seq正向为可在宿主中被加工成所述的miRNA-302/miRNA-367家族中的任意一个miRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在宿主中被加工成所述的miRNA-302/miRNA-367家族中的任意一个miRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq反向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
并且式I所示的结构在转入宿主后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
在一个优选示例中，所述的前体miRNA或所述的多核苷酸或所述的表达载体包含如SEQ ID No:1～14中任一个所示的核苷酸序列，例如，前体miR-302b的核苷酸序列如SEQID No:15所示。
在一个具体示例中，所述表达载体可以选自病毒载体或非病毒载体，其中，非病毒载体包括质粒、噬菌体、脂质纳米颗粒(LNP)、转染试剂和外泌体中的一种或多种。
可选的，质粒包括pCMV-myc、pcDNA3.0、pcDNA3.1和Minicircle中的一种或多种的组合。
优选的，质粒为Minicircle，该质粒能够以最小的bp数搭载目的基因，可以在动物体内持续表达。
可选的，病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体、杆状病毒和痘苗病毒中的一种或多种，优选的，腺相关病毒载体，例如AAV病毒。
本申请一实施方式还提供了检测上述miRNA的试剂在制备诊断脂肪肝的产品中的应用。
在一个具体示例中，试剂包括引物和/或探针。
本申请一实施方式还提供了上述的活性成分在制备治疗非酒精性脂肪肝的产品中的应用。进一步的，所述非酒精性脂肪肝为由高糖高脂压力引起的非酒精性脂肪肝。
在一个具体示例中，所述产品具有抑制高糖高脂压力下脂肪酸过度合成。
在一个具体示例中，所述产品能有效阻断高糖高脂引起的肝脏指数增加、肝脏TG含量增加、肝功指标(ALT、AST)异常、血清TCHO和TG异常。
本申请一实施方式还提供了上述的活性成分在制备逆转衰老细胞的衰老进程的产品中的应用。
本申请一实施方式还提供了上述的活性成分在制备恢复衰老细胞的细胞周期或细胞增殖能力的产品中的应用。
本申请一实施方式还提供了上述的活性成分在制备治疗细胞衰老所致的相关性疾病的产品中的应用。
在一个具体示例中，所述细胞衰老所致的相关性疾病包括皮肤老化、脱发、白发、高血压、心脑血管疾病、退行性关节病变、骨质疏松、糖尿病、脂代谢异常、脂肪肝、肝硬化、性腺萎缩、膀胱过度活动、肾功能障碍、抑郁症、帕金森氏病、老年痴呆、多脏器功能退化、白内障、牙齿脱落和听力障碍中的一种或多种。
在一个具体示例中，脂代谢异常具有脂肪酸过度合成、脂肪酸从头合成的信号通路(如mTORC2信号)异常及下游脂肪酸从头合成相关限速酶的表达异常中的一种或多种特征。
在一个具体示例中，膀胱过度活动具有尿频、尿急、伴随和不伴随急迫性尿失禁中的一个或多个特征。
本申请一实施方式还提供了上述的活性成分在制备治疗脱发或白发的产品中的应用。进一步的，所述脱发为化疗药物引起的脱发或雄性激素脱发。
在一个具体示例中，所述产品包括制剂和/或药物组。
在一个具体示例中，所述药物包括上述任一项所述的活性成分和药学上可接受的辅料或载体。
在一个具体示例中，所述辅料包括溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和释放阻滞剂中的一种或多种。
在一个具体示例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
通常药物剂型应与给药方式相匹配。在一个具体示例中，本申请药物的剂型包括注射剂、口服液体剂、悬浮液、乳化液、浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、栓剂、气雾剂、转染剂、片剂和胶囊剂中的一种或多种。
本申请所述的药物可以单独施用或者与其他能够治疗相同疾病的药物进行组合施用。
本申请一实施方式还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述任一项所述的活性成分。
本申请一实施方式还提供了一种逆转衰老的方法，使用上述活性成分或药物组合物逆转受试者的衰老。所述逆转衰老包括逆转个体的衰老或逆转衰老细胞的衰老。
在一个具体示例中，以编码上述miRNA的DNA序列为目的基因，例如miR-302b(SEQIDNo:15)，构建所述miRNA的过表达载体，制备含有miRNA的过表达载体的药物，通过离体施用或体内施用的途径给药。
具体的，本领域普通技术人员可以通过离体施用的途径给药：将上述miRNA过表达载体的药物在体外导入或转染入个体自身或异体细胞，经体外细胞扩增后输回个体。
具体的，本领域普通技术人员还可以通过体内施用的途径给药：将上述miRNA过表达载体的药物直接导入个体内。
本申请所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。其中，因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本申请一实施方式还提供了一种体外非治疗性逆转衰老的方法，或恢复衰老细胞的细胞周期或细胞增殖能力的方法，该方法包括：向培养的衰老细胞内加入本申请药物组合物或本申请活性成分，从而逆转已经衰老细胞的衰老进程，使衰老细胞重新返回细胞周期而增殖。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1Doxorubicin诱导p21-YFP-Neo细胞系衰老
发明人研究初期，利用CRISPR/Cas9技术，借助Cas9、gRNA、以及p21-YFP donor进行基因编辑。具体地，将编码YFP基因片段定点插入LO2细胞系的p21的终止子密码子的位置，并筛选出LO2-P21-YFP阳性细胞系。
具体的，构建CRISPR/Cas9载体：利用gRNA序列构建CRISPR/Cas9载体，所述gRNA的序列为GGCTTCCTGTGGGCGGATTA，SEQ ID No:25。
合成p21-YFP donor质粒：首先，将YFP编码基因的序列(SEQ.ID No:26所示的第3536～第4252位置的碱基)插入到Venus-P2A-Neo质粒中，制备YFP-P2A-Neo质粒。以LO2细胞基因组DNA和YFP-P2A-Neo质粒为模板，使用表1中的引物，扩增Vector片段、p21Upstream片段、YFP-NeoR片段、p21Downstream片段，使用Gibson反应体系将上述四个片段组装成p21-YFP donor质粒(donor质粒序列如SEQ.ID No:26所示)。上述实验均由生工生物完成。
表1
进一步的，将含有gRNA的CRISPR/Cas9载体和p21-YFP donor质粒共转染LO2细胞中，筛选LO2-P21-YFP阳性细胞系。
更进一步的，使用Doxorubicin诱导LO2-P21-YFP细胞系衰老，使用YFP进行流式荧光分选后，获得衰老细胞模型。
P21(cyclin-dependent kinase inhibitor p21，CDKN1A)是一个重要的衰老标志物，P21是磷酸化P53的下游CDKI，通过结合CDK2阻断细胞周期进入G1/S一直细胞周期。P21的高表达与衰老相关。
Doxorubicin是DNA拓扑异构酶抑制剂，常用于肿瘤治疗，在低浓度50nM下能够诱导细胞衰老。由于Doxorubicin分子中蒽环配基上的醌-氢醌结构，具有接受电子与提供中子的能力，插入DNA相邻碱基对之间，产生活性自由基，使DNA双股螺旋解旋，DNA链断裂，抑制核酸的模板活性，干扰转录过程，抑制mRNA合成。另外也可能引起细胞膜破裂，呈现细胞毒性作用，属细胞周期非特异性药物，对各期细胞均有作用，但对S期的早期最为敏感，M期次之，而对G1期最不敏感，对G1、S和G2期有延缓作用。
具体的，Doxorubicin诱导p21-YFP-Neo细胞系衰老的步骤包括如下：
(1)将0.3x106个p21-YFP-Neo细胞接种到35mm激光共聚焦细胞培养皿，培养12hour。
(2)细胞贴壁之后换液，加入含有50nM/L的Doxorubicin培养基。
(3)24hour之后，换成正常培养基。
(4)培养4day之后，使用YFP进行流式荧光分选，观察分选后的细胞中p21-YFP的表达情况。
(5)进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色。
其中，β-半乳糖苷酶染色方法，包括如下步骤：
将10X Fixative Solution稀释成1X，Staining Solution在37℃水浴中彻底溶解稀释成1X；将20mg的X-gal溶解于DMF中，避光储存于-20℃；配置染色液，6孔板每个孔加入1mL的染色液，930μL 1XStaining Solution、10μL 100X Staining Solution A、10μL 100XStaining Solution B和50μL 20mg/mL X-gal配成1mL染色液，并调节pH使pH＝6.0；去除细胞培养上清，加入PBS清洗两次，6孔板每个空加入1mL 1X Fixative Solution室温固定15min；去除固定液，PBS清洗一次，加入染色液，放入无二氧化碳的培养箱37℃染色12小时；将培养皿置于显微镜下观察染色的情况。
通过FITC荧光设门，选取YFP阳性细胞进行分选，结果如图1A所示。
将分选后的细胞铺板，每孔接种0.3×106个细胞接种于35mm细胞培养皿中，通过荧光显微镜成像如图1B所示，Doxorubicin能够诱导p21-YFP的表达。
β-半乳糖苷酶染色结果如图1C所示，表明加入Doxorubicin能够诱导LO2-p21-YFP细胞系发生衰老，说明成功构建细胞衰老模型。
实施例2miR-302b引起衰老细胞重新具备增殖能力
我们前期发现miR302/367家族在ES以及iPS外泌体中高表达(Youkun Bi et,al.Systemic proteomics and miRNA profile analysis of exosomes derived fromhuman pluripotent stem cells.Stem Cell Res Ther.2022Sep 5；13(1):449.)。之后经大量研究发现干细胞外泌体可促使衰老LO2细胞重返细胞周期，为进一步研究外泌体中小RNA是否有这种现象进行了以下实验：
由生工生物合成miR-302b mimic，配制成20μM溶液，-20℃保存6个月。
序列如下：
miR-302b-3p和miR-302b-5p的序列分别为：
5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG-3’，SEQ ID No:3和5’-ACUUUAACAUGGAAGUGCUUUC-3’，SEQ ID No:4；
使用实施例1中方法用50nM Dox诱导LO2细胞衰老，如图2中可见诱导24h后Dox组细胞明显变大，数量相较于对照组减少，分选衰老细胞。向Dox诱导的衰老细胞中加入7.5μLmiR-302b mimic(Dox-miR-302b组，终浓度50nM)培养2天后，发现细胞相较于Dox-Vehicle组(对照组)细胞显著增加。
为验证衰老细胞加入miR-302b是否产生了增殖现象，我们在35mm confocol皿中按照实施例1中的方法诱导细胞衰老，分选出衰老细胞，并分组为Dox+PBS组(3mL培养液中加入7.5μL PBS)和Dox+320B组(3mL培养液中加入7.5μL 20mM miR-302b mimic，使miR-302b mimic在培养液中的终浓度为50nM)，我们进一步通过高内涵激光共聚焦细胞成像分析系统(Opera Phenix，珀金埃尔默企业管理有限公司)活细胞工作站，如图3所示，我们追踪到加入50nM miR-302b mimic的单个细胞发生增殖现象。细胞衰老的定义是永久性的细胞周期终止状态，这也意味着衰老细胞定义将被改写，也即，衰老细胞并非细胞周期永久终止，而是暂时性停止，可以通过外源因子重新恢复细胞周期。
miR302/miR367家族进化保守，在多种物种如灵长类、其他哺乳动物、两栖动物、鸟类等都有表达。在人属中miR302/miR367家族分为miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-302e、miR-302f、miR-367。按照实施例1中方法培养并分选出衰老细胞，分别将人源miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-302e、miR-302f、miR-367以50nM量通过Lipo3000(Thermo公司)转染到衰老细胞中，统计细胞活力随时间变化，见图4所示，对照组(正常LO2细胞，Con)细胞活力接近100％，Dox处理组初始活力约50％，随后随时间逐渐下降到48小时约30％左右，转染miRNA组表现为活力逐渐提高(miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-302e)，或活力变化不大但不下降(miR-302f、miR-367)，这提示我们miR302/miR367家族均具备一定的逆转衰老能力。
序列如下，由生工生物合成相应双链miRNA mimic：
hsa-miR-302a-5p MIMAT0000683：
5’-ACUUAAACGUGGAUGUACUUGCU-3’，SEQ ID No:1；
hsa-miR-302a-3p MIMAT0000684：
5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA-3’；SEQ ID No:2；
miR-302b-3p_MIMAT0000715：
5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG-3’，SEQ ID No:3；
miR-302b-5p_MIMAT0000714：
5’-ACUUUAACAUGGAAGUGCUUUC-3’，SEQ ID No:4；
hsa-miR-302c-5p MIMAT0000716：
5’-UUUAACAUGGGGGUACCUGCUG-3’，SEQ ID No:5；
hsa-miR-302c-3p MIMAT0000717：
5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUCAGUGG-3’，SEQ ID No:6；
hsa-miR-302d-5p MIMAT0004685：
5’-ACUUUAACAUGGAGGCACUUGC-3’，SEQ ID No:7；
hsa-miR-302d-3p MIMAT0000718：
5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGU-3’，SEQ ID No:8；
hsa-miR-302e MIMAT0005931：
正向序列：5’-UAAGUGCUUCCAUGCUU-3’，SEQ ID No:9；
反向序列：5’-AUUCACGAAGGUACGAA-3’，SEQ ID No:10；
hsa-miR-302f MIMAT0005932：
正向序列：5’-UAAUUGCUUCCAUGUUU-3’，SEQ ID No:11；
反向序列：5’-AUUAACGAAGGUACAAA-3’，SEQ ID No:12；
hsa-miR-367-3p MIMAT0000719：
5’-AAUUGCACUUUAGCAAUGGUGA-3’，SEQ ID No:13；
hsa-miR-367-5p MIMAT0004686：
5’-ACUGUUGCUAAUAUGCAACUCU-3’，SEQ ID No:14。
实施例4miR-302b引起衰老细胞重新进入细胞周期
根据实施例1方法诱导细胞衰老，经流式细胞术筛选出Dox诱导的衰老细胞。
将衰老细胞铺板，每孔接种0.3×106个细胞，Dox-miR-302b组中每孔加入50nMmiR-302b mimic，处理3d；Dox-PBS中每孔加入5μl的PBS溶液，处理3d，并设置LO2正常细胞组(Con)做对照，收集细胞进行细胞周期检测。
具体地，胰酶替代物消化细胞，1000×g离心5min。用1mL预冷的生理盐水清洗细胞，1000xg离心5min，小心吸取上清，吸取的时候残留50μl的上清，避免将细胞吸走，轻弹离心管底部以适当分散细胞，避免细胞成团。加入1mL的预冷的70％乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定24小时。1000×g离心5min，弃掉上清，吸取的时候残留50μl的上清，避免将细胞吸走。加入1mL预冷的生理盐水清洗细胞一次。每管样品中加入0.5mL的PI染色液，缓慢充分重悬细胞，37℃避光染色30min。染色完成后，用流式细胞仪进行检测，激发光波长为488nm。
其中，PI染色液的配制：染色缓冲液500μl，PI染色液(20×)25μl，RNaseA 10μl，总体积535μl。
结果如图5，结果可见，LO2正常细胞(LO2-PBS组)约有22％处于S期，LO2细胞经Dox诱导衰老后约有2％左右处于S期(LO2-Dox-PBS组)，LO2细胞经Dox诱导后的衰老细胞加入miR-302b后约有8％处于S期(LO2-Dox-miR-302组)，显著高于LO2-Dox-PBS组。这与前述结果一致，即miR-302b可以逆转衰老。
进一步地，进行Ki67染色，Ki67是一种胞核蛋白，是一种细胞增殖标志物。结果如图6所示说明LO2-Dox-miR-302组细胞多处于增殖状态，而LO2-Dox-PBS组几乎无细胞处于增殖状态。
实施例5全身表达mir-302b腺相关病毒制备
(1)miR-302b-3p和miR-302b-5p的序列分别为：5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG-3’，SEQ ID No:3和5’-ACUUUAACAUGGAAGUGCUUUC-3’，SEQ ID No:4；设计前体序列(WT)如下： 上游Flanking序列(200bp)，下游Flanking序列(200bp)以及最终合成序列如：
(2)采用和元生物技术股份有限公司提供的AAV载体rAAV-CMV-sfGFP-3×FLAG-WPRE用于构建过表达miR-302b的重组载体，将上述最终合成序列采用同源重组的方法插入表达载体中CMV启动子下游，构建重组质粒(具体构建方法参考图7)，挑取克隆送公司测序，将测序正确的质粒命名为AAV-miR-302b。
(3)将步骤(2)中构建的重组载体转染HEK293T细胞，24h后收细胞样品，提取miRNA，加尾法实时定量PCR测定细胞中miR-302b含量。
(4)7×106个HEK293T细胞/孔接种15cm培养皿，细胞培养基为含10％FBS的DMEM，置于37℃，5％CO2培养箱24h左右，使细胞汇合度达到70％～80％；细胞转染前，将完全培养基更换为Opti-DMEM培养基；按照转染试剂TubofectTM Transfection Reagent(Invitrogen，Cat#R0532)的操作说明进行转染，具体步骤如下：取5mL DNase/RNase-free离心管，加入500μL Opti-DMEM培养基，将重组表达质粒rAAV-TBG-miR-302b(20μg)，血清型质粒rAAV2/8-Rep/Cap(10μg)以及病毒包装辅助质粒rAAV-Helper(30μg)加入上述离心管，旋涡混匀；另取5mL DNase/RNase-free离心管，加入500μL Opti-DMEM培养基，按照质粒质量：转染试剂体积＝1：2的关系加入120μL Tubofect，旋涡混匀；将两管溶液混匀，室温静置15min；将静置后的液体缓慢加入之前准备好的HEK293T细胞，以同心圆方式滴加，边加边轻微晃动，随后置于37℃，5％CO2培养箱，12h后将Opti-DMEM替换为完全培养基，重组AAV包装流程见图8。
(5)观察细胞状态，期间可以向培养皿中添加适量完全培养基，转染72h后收集包装病毒，具体步骤如下：将细胞上清连同细胞收集到同一个离心管，室温条件下2100×g离心10min，随后将上清转移到新的离心管，PEG 8 000沉淀过夜(每100mL上清加入2.33gNaCl，8.5g PEG 8000)，第二天，3 500×g、4℃离心30min，立刻弃去上清，防止病毒回溶，加入2mL PBS+0.001％PF68重悬；将上述离心的细胞沉淀用2mL PBS+0.001％PF68重悬，-80℃、37℃条件反复冻融3次，加入5M NaCl 2mL(高压灭菌)；将上述PEG沉淀的细胞上清和重悬的细胞沉淀混匀，振荡超声(超声30s，停8～10s)，AMPL 30％超声3～4次，如果样品粘稠度降低转为AMPL 20％超声1次(转换超声强度是为了防止超声强度过强影响病毒活性)；超声后的液体3500×g、4℃离心30min，将上清转移至新的离心管。
(6)利用碘克沙醇梯度离心法纯化制备的AAV，具体方法如下：配置不同浓度的碘克沙醇(碘克沙醇和无菌水按照质量/体积比进行配制(表2)，后过0.22μm滤膜)；取高压灭菌处理的超离管，逐层加入不同浓度的碘克沙醇，由下到上依次为4.2mL 60％层，5mL 40％层，6mL 25％层，9mL 15％层(加入不同浓度的碘克沙醇要倾斜离心管，避免串层，其中15％层和25％层密度差异小，要特别注意)，全程在生物安全柜中进行；将步骤(5)制备的病毒缓慢加入上层，离心管配平(控制误差在0.01g)，准备VTi50转子，48000rpm、4℃离心150min。
表2碘克沙醇密度梯度离心溶液配制。
(7)超离结束后，用针头刺破超离管底部，弃去滴下的2mL液体，收集第3～7mL液体，收集的病毒加入双抗，37℃处理1h，随后用PBS+0.001％PF68稀释到适当体积，过0.22μm滤膜除菌；将滤液转移入100KD超滤管，3500rpm、4℃离心30min；将超滤管中剩余液体吹打混匀，吸出转移至病毒收集管，用PBS+0.001％PF68 150μL清洗浓缩管2次，剩余液体转移至病毒收集管，标记好名称和日期，-80℃长期保存。
(8)取10μL病毒进行滴度测定。实时定量PCR是常用的测定纯化病毒颗粒数的方法，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知拷贝数标准品绘制标准曲线，然后计算测定病毒的颗粒数。具体操作步骤如下：将病毒样品稀释10倍，配制Mixture(DNase/RNase-free ddH2O 4μL，DNAasel 1μL，10×DNAasel Buffer 1μL，病毒稀释液4μL)，37℃孵育30min，95℃5min使DNA酶失活；加入1μL蛋白酶K(5μg/μL)，37℃孵育30min，再加入30μL超纯水，95℃加热5min使蛋白酶K失活，12000rpm，离心2min，取上清进行qPCR检测；取离心上清5μL，10倍稀释，取2μL稀释液作为模板进行qPCR；病毒颗粒数的计算：病毒颗粒数(VP/mL)＝与标准品相对值×1000。
实施例6mir-302b逆转小鼠衰老
使用24月龄C57BL/6小鼠20只，均匀分为两组，尾静脉分别给与AAV-miR-302b，50μl/次每周给药1次共计2周，结果如图9所示，30月龄时，相较于老年鼠组，给与miR-302b组老年小鼠弓背、脱毛现象明显缓解，进一步提示miR-302b在动物体内具有逆转衰老能力。
对小鼠多器官病理切片进行β-gal染色结果，结果如图10所示，老年鼠组在肺、肝及脾脏出现β-gal染色阳性，miR-302b治疗后显著缓解。
毛囊H&E染色结果如图11所示，结果显示miR-302b治疗后老年鼠毛囊萎缩情况得到缓解。
动物行为学实验：在第29-30月龄进行了转棒实验，如图12所示，将小鼠放在转棒上，保持转棒以25rpm速度，统计小鼠在转棒上时间，待学习4天后，第五天进行实验，结果如图12左图所示，miR-302b治疗组约持续65s，显著高于对照组约28s的时间。进一步地，进行了抓力测试，三次抓力结果取平均后除以体重，每两天测一次，结果如图12右图显示miR-302b治疗组均优于对照组。以上结果显示miR-302b治疗组衰老明显缓解。
尿斑实验：
随着衰老的发生小鼠和人往往伴随膀胱过度活动，表现为尿频、尿急、伴随或不伴随急迫性尿失禁，小鼠表现为会有小尿班(直径≤5mm)出现。各组的每只小鼠进行如下操作：将鼠笼底除去垫料并擦干后放入12cm×25cm的滤纸，并粘于鼠笼底。放入小鼠适应两小时后揭下滤纸后，重新铺相同滤纸进行记录，此过程允许小鼠自由取食但不给水，三小时后取出滤纸用凝胶成像系统进行拍照。拍照参数为：紫外反射光，光圈85，焦距50，聚焦100，增益35.03dB，对比度0，伽马1.1，曝光时间1.1s。
Aging-PBS组、Aging+miR-302b组中的其中一只小鼠的尿斑图像如图13所示。经统计，Aging-PBS组尿斑数量为46.25±13.75(N＝4)，Aging+miR-302b组的小鼠的尿斑数量为10.25±2.66(N＝4)，统计图如图13右图所示。结果显示miR-302b治疗显著缓解了衰老动物的膀胱过度活动症状。
实施例7mir302b治疗脱发与白发
1.mir-302b治疗环磷酰胺诱导小鼠化疗后脱发
环磷酰胺诱导小鼠化疗后脱发模型建立：
策略：先对小鼠进行脱毛处理，诱导小鼠毛囊处于生长期，再给与化疗药。
造模方法：C57BL/6小鼠麻醉后，将1:1混合的松香和石蜡加热融化后涂于背部，凝固变硬后揭去，诱导毛囊处于生长期，毛发生长，每只小鼠脱毛区域为背部。9天后可见小鼠背部皮肤长出新毛发。
实验分组：分为化疗后脱发模型组(CIA组)和化疗后脱发模型加mir-302b治疗组(CIA+mir-302b组)，每组各6只小鼠。
治疗实验方法的流程见图14：CIA+mir-302b组第-3天和第-1天分别在小鼠背部多点皮下注射20μl。第0天使用蜡纸对12只小鼠进行脱毛处理，第9天后尾静脉注射环磷酰胺构建小鼠化疗后脱发模型(CIA)，皮下注射环磷酰胺150mg/kg，诱导严重的毛发脱落，观察直至20天评估小鼠毛发生长情况。
结果如图15所示，第18天结果显示，CIA组重新长出的毛发出现稀疏、白发等情况；而CIA+miR-302b组毛发生长更多，背部以黑色毛发为主。miR-302b治疗后毛发显著增加显示出miR302b有促进毛发生长能力；CIA组出现部分白发(3/6)可能由于黑色素干细胞受损或迁移能力受限，而miR-302b治疗后白毛情况明显缓解显示出miR-302b保护了黑色素干细胞。
2.mir-302b治疗小鼠雄激素脱发
雄性激素脱发(AGA)是指皮脂过量溢出继而发生弥漫性脱发最终永久性脱发临床表现始于青春期或青春后期的慢性、非瘢痕的、与年龄相关性的进行性毛囊微小化的脱发疾病。男性表现在前额、双侧额角、双侧鬓角发际线后移，头顶部毛发减少和变细甚至露头皮，女性表现为头顶部与发际边缘毛发进行性减少和变细，少部分表现弥漫性稀少。
造模方法：颈后皮下注射丙酸睾丸酮5mg/ml 0.1ml每日一次直至21天，治疗(miR-302b)或不治疗(PBS)。
实验分组：实验组AGA+miR-302b，对照组AGA，各6只。
治疗实验方法的流程见图16A：AGA+miR-302b组第-3天和第-1天分别在小鼠背部多点皮下注射20μl。第0天使用蜡纸对12只小鼠进行脱毛处理，并在颈后皮下注射丙酸睾丸酮5mg/ml 0.1ml每日一次，持续观察到21天。
结果如图16B-C所示，第12天结果显示AGA组小鼠几乎无毛发生长，AGA+miR-302b组小鼠已经有部分毛发生长出来，显示miR-302b对雄激素脱发有效。
实施例8肝脏特异性过表达mir-302b腺相关病毒制备
(1)miR-302b-3p和miR-302b-5p的序列分别为：5’-UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG-3’和5’-ACUUUAACAUGGAAGUGCUUUC-3’；设计前体序列(WT)如下：5’-GCTCCCTTCAACTTTAACATG GAAGTGCTTTCTGTGACTTTAAAAGTAAGTGCTTCCATGTTTTAGTAGGAGT-3’；将前体序列突变3个碱基作为对照，序列如下：GCTCCCTTCAATCCTAACATGGAAGTGCTTTCTGTGACTTTAAAAGTAAGTGCTTCCA TGTTTTAGTAGGAGT(下划线为miR-302b及字体加粗序列为3个突变碱基)。上游Flanking序列(200bp)，下游Flanking序列(200bp)以及最终合成序列。
(2)采用和元生物技术股份有限公司提供的AAV载体rAAV-TBG-sfGFP-3×FLAG-WPRE用于构建过表达miR-302b的重组载体，将上述最终合成序列采用同源重组的方法插入表达载体中肝脏特异性启动子TBG下游，构建重组质粒，挑取克隆送公司测序，将测序正确的质粒命名为AAV-miR-302b；按照同样的方法构建miR-302b中5个碱基突变的重组质粒，命名为AAV-miR-302b-Mut(构建流程参见图17-A)。
(3)将(2)中构建的重组载体转染HEK293T细胞，24h后收细胞样品，提取miRNA，加尾法实时定量PCR测定细胞中miR-302b含量。
(4)7×106个HEK293T细胞/孔接种15cm细胞培养皿中，细胞培养基为含10％FBS的DMEM，置于37℃，5％CO2培养箱24h左右，使细胞汇合度达到70％～80％；细胞转染前，将完全培养基更换为Opti-DMEM培养基；按照转染试剂TubofectTM Transfection Reagent(Invitrogen，Cat#R0532)的操作说明进行转染，具体步骤如下：取5mL DNase/RNase-free离心管，加入500μL Opti-DMEM培养基，将重组表达质粒rAAV-TBG-miR-302b(20μg)，血清型质粒rAAV2/8-Rep/Cap(10μg)以及病毒包装辅助质粒rAAV-Helper(30μg)加入上述离心管，旋涡混匀；另取5mL DNase/RNase-free离心管，加入500μL Opti-DMEM培养基，按照质粒质量：转染试剂体积＝1：2的关系加入120μL Tubofect，旋涡混匀；将两管溶液混匀，室温静置15min；将静置后的液体缓慢加入之前准备好的HEK293T细胞，以同心圆方式滴加，边加边轻微晃动，随后置于37℃，5％CO2培养箱，12h后将Opti-DMEM替换为完全培养基，重组AAV包装流程见图17-B。
(5)观察细胞状态，期间可以向培养皿中添加适量完全培养基，转染72h后收集包装病毒，具体步骤如下：将细胞上清连同细胞收集到同一个离心管，室温条件下2100×g离心10min，随后将上清转移到新的离心管，PEG 8000沉淀过夜(每100mL上清加入2.33gNaCl，8.5g PEG 8000)，第二天，3500×g、4℃离心30min，立刻弃去上清，防止病毒回溶，加入2mL PBS+0.001％PF68重悬；将上述离心的细胞沉淀用2mL PBS+0.001％PF68重悬，-80℃、37℃条件反复冻融3次，加入5M NaCl 2mL(高压灭菌)；将上述PEG沉淀的细胞上清和重悬的细胞沉淀混匀，振荡超声(超声30s，停8～10s)，AMPL 30％超声3～4次，如果样品粘稠度降低转为AMPL 20％超声1次(转换超声强度是为了防止超声强度过强影响病毒活性)；超声后的液体3500×g、4℃离心30min，将上清转移至新的离心管。
(6)利用碘克沙醇梯度离心法纯化制备的AAV，具体方法如下：配置不同浓度的碘克沙醇(碘克沙醇和无菌水按照质量/体积比进行配制(表2)，后过0.22μm滤膜)；取高压灭菌处理的超离管，逐层加入不同浓度的碘克沙醇，由下到上依次为4.2mL 60％层，5mL 40％层，6mL 25％层，9mL 15％层(加入不同浓度的碘克沙醇要倾斜离心管，避免串层，其中15％层和25％层密度差异小，要特别注意)，全程在生物安全柜中进行；将(5)制备的病毒缓慢加入上层，离心管配平(控制误差在0.01g)，准备VTi50转子，48000rpm、4℃离心150min。
(7)超离结束后，用针头刺破超离管底部，弃去滴下的2mL液体，收集第3～7mL液体，收集的病毒加入双抗，37℃处理1h，随后用PBS+0.001％PF68稀释到适当体积，过0.22μm滤膜除菌；将滤液转移入100KD超滤管，3500rpm、4℃离心30min；将超滤管中剩余液体吹打混匀，吸出转移至病毒收集管，用PBS+0.001％PF68 150μL清洗浓缩管2次，剩余液体转移至病毒收集管，标记好名称和日期，-80℃长期保存。
(8)取10μL病毒进行滴度测定。实时定量PCR是常用的测定纯化病毒颗粒数的方法，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知拷贝数标准品绘制标准曲线，然后计算测定病毒的颗粒数。具体操作步骤如下：将病毒样品稀释10倍，配制Mixture(DNase/RNase-free ddH2O 4μL，DNAasel 1μL，10×DNAasel Buffer 1μL，病毒稀释液4μL)，37℃孵育30min，95℃5min使DNA酶失活；加入1μL蛋白酶K(5μg/μL)，37℃孵育30min，再加入30μL超纯水，95℃加热5min使蛋白酶K失活，12 000rpm，离心2min，取上清进行qPCR检测；取离心上清5μL，10倍稀释，取2μL稀释液作为模板进行qPCR；病毒颗粒数的计算：病毒颗粒数(VP/mL)＝与标准品相对值×1000。
实施例9Minicircle表达质粒的构建
Minicircle plasmid缺少抗生素抗性以及复制起始位点，可以实现体内和体外的瞬时表达，而且不会引起由细菌骨架蛋白引起的免疫反应。Minicircle DNA可以实现体外和体内的持续性表达，并且实现了比常规质粒相比10～1000倍的增强，可能是由于骨架质粒存在甲基化和转基因沉默诱导的异染色质有关。SBI公司的MC-Easy系统能够以简单、可重复和高效率的方式产生高质量的Minicircle plasmid，并且以ATP依赖的DNAse试剂降解污染的基因组DNA，有效去除基因组DNA，而不影响环状DNA质粒的产生(制备过程见图18)。
本实施例制备过表达miR-302b-3p的Minicircle plasmid的步骤如下：
(1)双链miR-302b-3p序列的设计：Minicircle亲本质粒pMC.CMV-MCS-EF1α-GFP-SV40-polyA Parental Minicircle Cloning Vector(SBI，Cat#MN511A-1)包含CMV驱动MCS区外源基因的表达，EF1α启动子驱动GFP的表达，同时带有嘌呤霉素抗性。在MSC区域插入的miR-302b-3p序列必须正义链和反义链，并且在转录后形成茎环结构。正义链和反义链之间存在发夹结构，常用的12-nt的loop序列为5’-CTTCCTGTCAGA-3’。添加TTTTT终止子序列(RNA聚合酶III识别序列)，同时添加BamH I和EcoR I限制性内切酶位点。注意：如果为H1启动子，不需要在正义链的第一个位置添加G，RNA聚合酶III可以从H1启动子的任何+1(第二个)核苷酸开始转录；如果为U6启动子，需要在正义链的第一个位置前添加G，以便RNA聚合酶III优先识别(图19)。将设计的序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(2)双链miR-302b-3p的制备：把待退火的DNA oligo用灭菌水配置成50μM，按照如下体系配置混合液：Nuclease-Free water 40μL，Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)(碧云天，Cat#D0251)20μL，DNA oligo A(50μM)20μL，DNA oligo B(50μM)20μL；按照如下PCR反应程序进行退火反应：95℃2min，每8s下降0.1℃直到降至25℃(大约90min)，4℃forever。
(3)双链miR-302b-3p连接线性化亲本质粒：使用BamH I(NEB，Cat#R0136)和EcoRI(NEB，Cat#R0101)按照操作说明线性化亲本质粒，37℃消化过夜，胶回收试剂盒(Vazyme，Cat#DC301-01)回收DNA片段；将退火得到的双链miR-302b-3p序列连接线性化亲本质粒，插入片段：载体按照3：1的比例进行，按照DNA连接酶AnzaTMT4 DNA Ligase Master Mix(Thermo，Cat#IVGN2104)的操作说明进行操作，16℃过夜连接。
(4)连接产物转化ZYCY10P3S2T E.coil：该感受态是由Kay et al.改造菌株BW27783制备的，其能稳定表达诱导型组装酶ФC31和I-SceI归巢核酸内切酶。连接产物转化感受态的步骤如下：取出感受态，冰上冻融；加入5μL连接产物到100μL感受态中，旋涡混匀；冰上孵育30min，42℃热激30s，不要晃动，冰上作用2min。上述反应产物加入200μLS.O.C.培养基，250rpm、37℃摇菌90min。同时设置亲本质粒空载对照，250rpm、37℃摇菌60min即可。将200μL菌液涂抹在Kan+抗性的LB固态培养基上(含卡那霉素50μg/mL)，培养板预先加热37℃(过冷的培养会降低感受态的转化效率)，培养板37℃培养过夜。注意：将剩余菌液保存在室温，不要污染，如果第二天没有看到菌落，可以将剩余菌液涂抹在新的培养板上。挑取3～5克隆至2mL Kan+LB培养基，37℃过夜摇菌，提取质粒，送公司测序，将鉴定正确菌液一部分转接Kan+LB培养基扩增，提取质粒并测定浓度，一部分添加甘油，-80℃冻存备用。
(5)Minicircle plasmid的诱导：按照Minicircle plasmid诱导试剂盒MC-EasyMinicircle DNA Production Kit(SBI，Cat#MN925A-1)操作说明进行诱导。100μL阳性菌液加入2mL Kan+LB培养基，30℃、250rpm摇菌4～6h，然后取500μL转接到200mL 1×Growthmedium(SBI，Cat#MN910A-1-SBI)，30℃、250rpm过夜摇菌。注意：菌液必须新鲜，Kan+LB培养板存放在4℃的时间不能超过5天，菌液过夜摇菌不能超过16h，过老的菌体会引起亲本质粒和基因组DNA的污染。过夜摇菌后，测定pH和OD600，如果OD600>8且pH<6.5，建议从新启动Protocol，并检查温箱的温度和通风是否正常；如果OD600介于4和6之间，将200mL过夜培养的菌液和200mL新鲜1×Induction medium(SBI，Cat#MN910A-1-SBI)混合；如果OD600介于6和8之间，则将200mL过夜培养的菌液和400mL新鲜1×Induction medium混合；将混合物继续30℃、250rpm摇菌3h，随后提高温度到37℃，250rpm摇菌1h。总共的摇菌时间为4h，不要过长时间摇菌，否则会导致菌体死亡和基因组DNA污染。取1mL菌体培养物，质粒小提，进行限制性内切酶消化鉴定，鉴定无误的菌株可以进行大规模的质粒提取。
上述Minicircle plasmid的诱导方法是按照SBI公司的MC-Easy Minicircle DNAProduction Kit进行操作的，这里提供另一种诱导方法，具体如下：阳性菌液过夜培养使菌液OD600介于3.5～4.2，pH大约为6.5，将400mL菌液和400mL新鲜LB培养基，16mL NaOH(40g/L)，0.4mL 20％L-阿拉伯糖(SBI，Cat#MN850A-1)混匀，32℃、250rpm摇菌5h。取1mL菌体培养物，质粒小提，进行限制性内切酶消化鉴定，鉴定无误的菌株可以进行大规模的质粒提取。
(6)去除基因组和亲本质粒DNA污染：利用Snapegene software筛选合适的内切酶用于消化亲本骨架质粒而不影响Minicircle plasmid的稳定性。利用Minicircle-safeDNase(SBI，Cat#MN925A-1)消化线性化的亲本质粒DNA和基因组DNA，反应体系如下：25mMATP，20μL；10×Reaction Buffer，50μL；DNase，20μL；提取质粒，410μL；37℃过夜孵育；70℃孵育30min失活DNase。取2μL上述DNase处理的质粒和未处理的质粒用筛选的限制性内切酶进行消化鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测，如果只出现Minicircle DNA，说明基因组和亲本质粒DNA去除成功。
(7)Minicircle plasmid的再沉淀：该步的目的是去除DNase和限制性内切酶污染，具体步骤为：向DNase处理的Minicircle plasmid溶液中添加其1/10体积的Precipitation Buffer，移液枪吹打混匀；加入2倍Minicircle plasmid溶液体积的100％乙醇或者0.7倍体积的100％异丙醇，移液枪吹打混匀；冰上静置30min，4℃、15 000×g离心15min，小心去除上清；加入1mL 70％乙醇，4℃、15 000×g离心5min；室温干燥5min；加入1～2mL DNAse-free ddH2O溶解，-80℃保存备用。
(8)去除ATP和dNTPs(选做)：用2mL DNA离心管Ultra-2mL CentrifugalFilters(Sigma，Cat#C86533)来清除dNTPs，引物，其他的大分子成份，盐离子和buffers。具体步骤如下：将Centrifugal Filter插入收集管，加入2mL样品，角转子3000×g、4℃离心10min；加入2mL Wash buffer，角转子3000×g、4℃离心10min；分离Centrifugal Filter和收集管，立即倒置Centrifugal Filter，放入收集管中，300～1 000×g、4℃离心2min，将浓缩样品转移到收集管中；NanoDrop测定收集Minicircle plasmid浓度、A260和A280，A260/A280的比值应该为1.8～1.9，收集Minicircle plasmid，-80℃保存备用。
(9)Minicircle plasmid的体外表达验证：1.5×105NCTC1469细胞/孔接种12孔板；37℃、5％CO2培养箱培养过夜，细胞达到70％左右的汇合度；100μL DMEM加入1μgMinicircle plasmid，涡旋混匀后加入2.5uL Tubofect转染试剂，继续涡旋混匀，室温静置15min；将混合液以顺时针同心圆的方式滴加，十字摇匀，转染24h后，使用FV3000激光共聚焦显微镜(奥林巴斯)观察GFP信号，并采集照片。
实施例10小鼠肝脏原代细胞分离
试剂准备：D-Hanks液，Hanks液，PBS，1640完全培养基(10％FBS，1％双抗)，William E培养基(10％FBS，1％双抗)，胶原酶II，5％水合氯醛，无菌手术器械，100mm培养皿，15mL/50mL离心管，200目滤网，20mL注射器，头皮针，移液器，75％酒精。
操作程序：
(1)37℃预热灌流液I(D-Hanks液加入EDTA 0.058g/L，HEPES 2.383g/L)，以及酶液(II液加入0.025％胶原酶II和0.5％BSA)。
(2)培养皿包被液处理培养皿1h，然后吸弃晾干。
(3)小鼠麻醉，75％酒精消毒，四肢固定打开腹腔，止血钳结扎肝前上腔静脉，从下腔静脉进针，缓慢推进灌流液I，确认液体流入血管，肝脏变大后立即剪断门静脉，低速均匀灌注，约为20mL/10min，以灌干净血液为准。
(4)换用20mL含有0.025％胶原酶II的酶液，20mL/5min，完成后原位消化3min(消化好的肝脏表现为按压后回弹变慢)。
(5)取下肝脏，加入10mL预冷的1640培养基于100mm皿中，用镊子轻轻敲碎肝组织。
(6)滤网过滤，利用少量培养基清晰残余组织块，控制总体积为30mL。
(7)50g离心3min(4℃)，所得上清为非实质细胞，沉淀为实质细胞。
(8)弃去上清，用10mL 1640培养基重悬沉淀，800rpm离心5min。重悬一次。
(9)胎盼蓝染色计数，细胞稀释至2×105个/ml，活力状态好的细胞在3h后会出现贴壁，细胞贴壁后吸取上清，去除未贴壁细胞，换用William E培养基培养。
实施例11脂肪肝细胞模型的建立
(1)溶液配制：称取7.21g果糖于10mL DMEM高糖培养基中，配制4M母液。
(2)高脂完全培养基的配制：以2：8比例混合F12和DMEM培养基，加入配置的果糖溶液，使其终浓度为4mM，50倍稀释油酸(OA)存储液，100倍稀释棕榈酸(PA)存储液，加入上述培养基制备高脂完全培养基，现配现用。
(3)将实施例10中分离的细胞按照1×104～1×105个细胞接种到6孔板，普通完全培养基培养12h。
(4)PBS清洗2次，加入高脂完全培养基2mL，24h后，进行油红O染色观察，结果见图20A-B，相较于Contro组，FFA-PBS组模型组油红显示大量脂滴，建模成功。
实施例12miR-302b抑制高糖高脂压力下脂肪酸过度合成
将合成的miR-302b mimic转染至实施例11步骤(4)制备的脂肪肝细胞的同时转染miR-302bmimic，24小时后进行油红O染色。
油红O染色结果见图20所示，图20C为脂肪肝模型+miR-302b治疗结果，结果显示未见大量脂滴，而图20D为脂肪肝模型+miR-302b-NC结果，显示突变3个碱基后脂滴聚集明显。
所述miR-302b-NC对照序列如下：
正向：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，SEQ.ID No.27，
反向：ACGUGACACGUUCGGAGAATT,SEQ.ID No.28。
表明miR-302b转染可以有效阻断高糖高脂压力引起的细胞内脂肪酸(FFA)聚集。
进一步经BDOIPY染色后流式分析。BDOIPY染色后的流式细胞术分析结果见图21，进一步支持了miR-302b可以抑制脂肪酸在细胞内的聚集。
研究表明mTORC2信号可以调控脂肪酸的从头合成，我们利用Western blot检测了mTORC2信号相关蛋白以及下游脂肪酸从头合成相关限速酶的表达情况。如图22所示，结果发现miR-302b转染可以有效降低磷酸化AKT以及磷酸化GSK3β的表达量。另外，SREBP1c可以激活糖酵解和脂肪生成相关基因的转录，在机体脂代谢和葡萄糖稳态的调控中起到了重要作用。mTORC2信号抑制后，SREBP1c的表达量也显著降低，其下游脂肪酸从头合成相关的限速酶(pACLY、ACC、FASN、SCD)表达量显著下降，这些结果表明miR-302b可以抑制mTOCR2信号进而抑制肝细胞内脂肪酸的从头合成。
实施例13小鼠脂肪肝模型建立
我们利用高脂饮食的方法构建了糖尿病相关脂肪肝模型(Bi Y,Guo X,Zhang Met al.Bone marrow derived-mesenchymal stem cell improves diabetes-associatedfatty liver via mitochondria transformation in mice)，在原有基础上，结合现有研究报道，我们优化了构建方法，利用高脂饮食配合果糖饮水的方法构建疾病模型，具体处理方法如下：
7周龄C57BL/6雄性小鼠在标准SPF级条件下饲养，5只/笼，12h循环光照，湿度40～60％，恒温22℃，给予自由饮食和饮水。适应性饲养1周后，动物被随机分为2组：正常组给予4％脂肪维持饲料，正常饮水(ND组)；对照组给予60％脂肪含量的高脂饲料，配合5％果糖饮水(HFD-PBS组)。实验过程中，每2周测定1次小鼠体重和血糖，同时利用毛细管收集小鼠眼眶静脉血100μL用于生化指标测定。结果显示：HFD-PBS组小鼠从第6周开始到试验终点，其体重均显著高于ND组，试验终点观察小鼠体型肥胖，平均体重为(46.42±3.51)g；从第14周开始，HFD-PBS组内小鼠最低体重超过40g；血糖监测发现HFD-PBS组小鼠从第12周开始，血糖浓度开始迅速上升，第14周开始血糖浓度极显著高于ND组，试验终点平均血糖浓度为(14.36±0.91)mM；GTT试验发现，HFD-PBS组小鼠腹腔注射葡萄糖后血糖浓度显著上升，2h后血糖浓度依然高于11.1mM，ITT试验发现，小鼠腹腔注射胰岛素后HFD-PBS组血糖浓度依然显著高于ND组，且在60min后又迅速回升，这些结果显示HFD-PBS组小鼠胰岛功能受损，出现胰岛素抵抗。根据诊断标准，连续4周小鼠体重超过40g，空腹血糖超过6.1mM，腹腔注射葡萄糖2h后血糖浓度超过11.1mM即为II型糖尿病(T2D)，因此我们成功建立了T2D模型的诱导方法。
实施例14肝特异性过表达miR-302b抑制NAFLD的发生
为了验证miR-302b对NAFLD的干预效果，我们分别用AAV和Minicircle plasmid(MC)两种系统递送miR-302b，使其在小鼠肝脏特异性过表达(图23A)。实验设计共分为6组：ND组，正常饮食饮水；MC-miR-302b组，高糖高脂饮食，尾静脉注射1.5μg/g MC-miR-302b，混合适当比例的Lipo3000转染试剂(Thermo公司)，总体积为200μL，每周一次；AAV-miR-302b组，高糖高脂饮食，尾静脉注射1.0E+11/200μL AAV-miR-302b，注射一次；Control组，高糖高脂饮食，尾静脉200μL PBS，每周一次；MC-miR-302b-Mut组：高糖高脂，尾静脉注射1.5μg/g MC-miR-302b-Mut(种子序列突变5个碱基)，混合适当比例的Lipo3000转染试剂，总体积为200μL，每周一次；AAV-miR-302b-Mut组：高糖高脂，尾静脉注射1.0E+11/200μL AAV-miR-302b-Mut，注射一次(图23B)，第9周作为实验终点进行检测分析。
qPCR检测发现MC-miR-302b组和AAV-miR-302b组小鼠肝脏具有高丰度的miR-302b(图24)。小动物活体成像显示AAV-miR-302b和MC-miR-302b尾静脉注射9周后在肝脏部位仍有荧光信号存在(图25)。9周后检测小鼠肝脏重量(图26A)及肝脏TG含量(图26B)。
肝脏病理分析结果如图27所示，发现高糖高脂引起的肝脏脂肪变性程度和脂肪聚集也被miR-302b的高表达阻断，NAFLD评分中脂肪变性、小叶性炎症、气球样变和纤维化也都被miR-302b高表达阻断。
肝脏递送miR-302b能有效阻断高糖高脂饲喂引起的小鼠肝脏指数增加、肝脏TG含量增加、肝功指标(ALT、AST)异常、血清TCHO和TG异常，见图28。
此外，肝脏递送miR-302b后抑制mTORC2信号，pAKT以及pGSK3β表达丰度降低，其下游转录组因子SREBP1c表达量降低，脂肪酸从头合成的限速酶pACLY、ACC、FASN以及SCD表达量也受到抑制(图29)。
总的来说，miR-302b可以抑制mTORC2活性调控的脂肪酸的从头合成。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (17)
1.一种活性成分，其特征在于，所述活性成分包括如下(1)～(5)中至少一组：
(1)miR-302/miR367家族的miRNA、经修饰的miR-302/miR367家族的miRNA衍生物、或miR-302/miR367家族的miRNA模拟物；
(2)前体miRNA，所述前体miRNA能在宿主内加工成(1)中所述的miRNA；
(3)多核苷酸，所述多核苷酸能被宿主转录形成(2)中所述的前体miRNA，并加工形成(1)中所述的miRNA；
(4)表达载体，所述表达载体含有(1)中所述的miRNA、或(2)中所述的前体miRNA、或(3)中所述的多核苷酸；
(5).(1)中所述miRNA的激动剂。
2.根据权利要求1所述的活性成分，其特征在于，所述miRNA来源于人或其他动物；
可选的，所述其他动物包括灵长类及其他哺乳动物、两栖动物和鸟类中的一种或多种；
可选的，所述其他动物包括猴子、小鼠和大鼠中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的活性成分，其特征在于，所述miR-302/367家族的miRNA包括miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-302e、miR-302f和miR-367中的一个或多个；
可选的，所述miR-302a包括miR-302a-3p和/或miR-302a-5p；所述miR-302b包括miR-302b-3p和/或miR-302b-5p；所述miR-302c包括miR-302c-3p和/或miR-302c-5p；所述miR-302d包括miR-302d-3p和/或miR-302d-5p；所述miR-367包括miR-367-3p和/或miR-367-5p。
4.根据权利要求3所述的活性成分，其特征在于，所述miR-302/367家族的miRNA选自如下中的一种或多种：
hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302c-3p.1、hsa-miR-302d-3p、hsa-miR-302e、bta-miR-302b、bta-miR-302c、bta-miR-302d、gga-miR-302b-3p、gga-miR-302c-3p、gga-miR-302d、mdo-miR-302a、mdo-miR-302b、mdo-miR-302c、mdo-miR-302d、mml-miR-302a-3p、mml-miR-302b、mml-miR-302c、mml-miR-302d、mmu-miR-302a-3p、mmu-miR-302b-3p、mmu-miR-302d-3p、ptr-miR-302a、ptr-miR-302b、ptr-miR-302c、ptr-miR-302d、ptr-miR-302e、hsa-miR-302a-5p、cfa-miR-302a、mmu-miR-302a-5p、hsa-miR-302b-5p、hsa-miR-302d-5p、cfa-miR-302b、cfa-miR-302d、gga-miR-302b-5p、mmu-miR-302b-5p、mmu-miR-302c-5p、mmu-miR-302d-5p、bta-miR-302a、gga-miR-302a、mmu-miR-302c-3p、hsa-miR-302c-5p、cfa-miR-302c、gga-miR-302c-5p、hsa-miR-302f、ptr-miR-302f、hsa-miR-367-5p、cfa-miR-367、mmu-miR-367-5p、hsa-miR-367-3p、mml-miR-367、mmu-miR-367-3p、ptr-miR-367、gga-miR-367、mml-miR-302a-5p和xtr-miR-367。
5.根据权利要求4所述的活性成分，其特征在于，所述miR-302/367家族的miRNA的核苷酸序列包含如SEQ ID No:1～14中的至少一条所示核苷酸序列。
6.根据权利要求1或2所述的活性成分，其特征在于，(2)中所述的前体miRNA或(3)中所述的多核苷酸或(4)中所述的表达载体包含如SEQ ID No:1～14中至少一条所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求1或2所述的活性成分，其特征在于，(4)中所述的表达载体包括：病毒载体和非病毒载体；
可选的，所述病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体、杆状病毒和痘苗病毒中的一种或多种；可选的，腺相关病毒载体包括AAV病毒；
可选的，所述非病毒载体包括质粒、噬菌体、脂质纳米颗粒、转染试剂和外泌体中的一种或多种；
可选的，质粒包括Minicircle。
8.权利要求1～7任一项所述的活性成分在制备逆转衰老细胞的衰老进程的产品中的应用。
9.权利要求1～7任一项所述的活性成分在制备恢复衰老细胞的细胞周期或细胞增殖的产品中的应用。
10.权利要求1～7任一项所述的活性成分在制备治疗细胞衰老所致的相关性疾病的产品中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述细胞衰老所致的相关性疾病包括皮肤老化、脱发、白发、高血压、心脑血管疾病、退行性关节病变、代谢相关疾病、骨质疏松、糖尿病、脂代谢异常、脂肪肝、肝硬化、性腺萎缩、膀胱过度活动、肾功能障碍、抑郁症、帕金森氏病、老年痴呆、多脏器功能退化、白内障、牙齿脱落和听力障碍中的一种或多种。
12.权利要求1～7任一项所述的活性成分在制备治疗非酒精性脂肪肝的产品中的应用。
13.权利要求12所述的应用，其特征在于，所述产品具有如下作用：
能抑制脂肪酸过度合成，和/或
能有效阻断肝脏指数增加、肝脏TG含量增加、肝功指标异常、血清TCHO和/或TG异常。
14.根据权利要求8～13任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括制剂和/或药物。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述药物包括权利要求1～7任一项所述的活性成分和药学上可接受的辅料。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述辅料包括溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和释放阻滞剂中的一种或多种。
17.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、口服液体剂、悬浮液、乳化液、浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、栓剂、气雾剂、转染剂、片剂和胶囊剂中的一种或多种。
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