CN1844387B - 抑制Sirt1基因表达的反义寡核苷酸结构和用途 - Google Patents
抑制Sirt1基因表达的反义寡核苷酸结构和用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1844387B CN1844387B CN2006100759756A CN200610075975A CN1844387B CN 1844387 B CN1844387 B CN 1844387B CN 2006100759756 A CN2006100759756 A CN 2006100759756A CN 200610075975 A CN200610075975 A CN 200610075975A CN 1844387 B CN1844387 B CN 1844387B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antisense oligonucleotide
- cell
- antisense
- oligonucleotide
- antisense oligonucleotides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及反义寡核苷酸的结构和用途,即根据Sirt1基因设计并制备的反义寡核苷酸。采用人肺癌(A549)细胞株对所设计、制备的10条反义寡核苷酸进行筛选及评价。同时考察了反义寡核苷酸对多种常见的癌细胞系在体外培养时的抑制作用。实验结果表明权利要求2中所述的寡核苷酸序列对人肺癌细胞生长有抑制作用,并阻断该基因表达,对肝癌和前列腺癌等的增殖也有抑制作用。故本发明是针对肿瘤的反义寡核苷酸结构及其作为治疗肿瘤、减少肿瘤及其相关性疾病危害性的新型药物。
Description
技术领域:
本发明涉及生物工程药物领域,具体地说是一种靶向Sirt1(silent mating typeinformation regulation2 homolog1)抑制肿瘤增殖的反义寡核苷酸(ASODN,antisenseoligodexynucleotide)的序列、结构及其治疗药物。
背景技术:
肿瘤分子生物学研究表明,肿瘤是由于基因异常引起的疾病。致病机理包括癌基因的激活和抑癌基因的失活以及细胞周期的异常。肿瘤发病分子机理的进一步阐明为肿瘤的基因治疗提供了可靠的理论依据。近年来肿瘤研究的热点是肿瘤的发生与细胞周期,细胞增殖,细胞凋亡及细胞衰老有密切关系。反义技术是近十几年兴起的生物技术,用反义技术封闭和抑制特定基因的表达是基因治疗的重要组成部分。ASODN是根据Watson-Crick碱基配对原理能够与mRNA的碱基对互补阻止其翻译成蛋白质的DNA。反义寡核苷酸具有定向合理设计,体内外作用高效和能人工大规模合成等药用特性,因而近年来成为治疗病毒感染,肿瘤及其它由于基因表达异常引起的疾病的一类潜在型药物,其中肿瘤相关基因可作为反义药物作用的靶标。国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。
本发明的目的是,根据已公开的sirt1基因mRNA序列,设计针对sirt1的ASODN,通过抑制sirt1的表达,抑制肿瘤增殖,为治疗肿瘤提供新的药物。
发明内容:
本发明根据Sirt1基因序列,通过基于靶基因多能级预测结构的人工神经网络预测算法设计靶向Sirt1基因的反义寡核苷酸序列,共设计10条寡核苷酸序列(见表1)。寡核苷酸序列采用Expedite8909system DNA合成仪合成并采用硫代修饰,经Micro Pure II反向柱(Solid Phase Science)纯化后,以此产物作为肿瘤的治疗药物。
本发明的主要内容是:选取了Sirt1基因作为靶标进行抗肿瘤反义寡核苷酸的筛选和评价,并考察了其对肝癌、前列腺癌和肺癌的体外抑制作用。Sirt1作为重要的转录因子参与了凋亡、衰老、周期调控和细胞能量代谢等多个生物过程,而且这些生物过程与癌症的发生、发展和临床治疗有密切关系,该基因的抑制物可抑制肿瘤生长,并导致肿瘤细胞凋亡。
在针对Sirt1基因的10条反义寡核苷酸中,A5、A8的体外抑制细胞增殖作用最强。在0.8μM给药浓度时,对肿瘤细胞(A549)增殖抑制率高于70%。
根据本发明,抑制sirt1的表达可特异性抑制肿瘤复制和表达,sirt1有可能成为治疗肿瘤相关疾病的新型药物作用靶点。
根据本发明,针对sirt1mRNA的ASODNs能特异性抑制肿瘤的增殖,有可能成为治疗肿瘤相关疾病的新型生物工程药物。
根据本发明,反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性,与靶序列结合亲和性及作用特异性等因素相关,A5和A8的长度根据实验确定,本发明包含了与A5和A8具有相同序列的任何长度寡核苷酸。
根据本发明,为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及组织靶向性等,本发明包含了A5和A8的硫代修饰。
根据本发明,本发明的寡核苷酸及其修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给药的制剂。
根据本发明,本发明的寡核苷酸及其修饰物治疗组成可应用单独的有效成分或组合物形式包括联合其他反义寡核苷酸及其衍生物形式。
根据本发明,本发明的治疗组成,依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等,以适宜的剂量给药。
本发明的实施对严重危害人类健康的肿瘤及其相关疾病的治疗具有重要的社会效益和经济效益。
表1反义寡核苷酸序列及特征
附图说明:
图1为设计的十条反义寡核苷酸及随机序列对A549细胞增殖抑制率;
图2为A5反义寡核苷酸对A549细胞增殖的特异性抑制;
图3为A8反义寡核苷酸对A549细胞增殖的特异性抑制;
图4为A5和A8反义寡核苷酸转染A549细胞后对靶基因Sirt1mRNA抑制的量效关系;
图5为A5和A8反义寡核苷酸以0.8μmol/l转染A549细胞后对靶基因Sirt1mRNA表达的特异性抑制;
图6为A5和A8反义寡核苷酸转染A549细胞后对靶基因Sirt1蛋白表达抑制的量效关系;
图7为A5和A8反义寡核苷酸以0.8μmol/l转染A549细胞后对靶基因Sirt1蛋白表达的特异性抑制;
图8为A8对肺癌(A549)、前列腺癌(Du145)、肝癌(HepG2)和人胚肺成纤维细胞(Helf)细胞系体外增殖的抑制;
具体实施方式:
实施例一:体外抗肺癌活性反义寡核苷酸序列的筛选和评价
1.材料和方法
1.1反义寡核苷酸的设计:
本研究选取了Sirt1基因作为靶标进行抗肿瘤反义寡核苷酸的筛选和评价,基因序列由Genbank获得。采用本实验室专利的,基于靶基因多能级预测结构的人工神经网络预测算法及本实验室设计的反义在线设计软件AODesigner(软件著作权号:2005SR12155)设计了十条反义寡核苷酸序列,A1到A10。
1.2反义寡核苷酸的合成:
根据已确定的10个反义位点,合成10条(A1-A10)反义序列(具体序列见表1)。反义硫代寡聚核苷酸为无色粉末状,合成后浓氨水55℃脱保护15小时,然后用反向柱(购自solidphase science公司)层析纯化。体外实验用无双抗的1640培养基配制。
1.3细胞培养、脂质体转染及细胞增殖抑制活性测定:
人肺癌细胞株(A549)由军事医学科学院提供。用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的1640培养液,于37℃、5%CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好,培养至对数生长期后,将A549细胞悬液接种在96孔培养板中,每孔接种培养液100μL,含4×103细胞。待40-60%的细胞融合后,吸去培养液,用无血清无双抗的1640培养基洗2次,在无血清状态下,采用脂质体Lipofectin(GIBCO,1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行硫代反义寡核苷酸的转染。每条反义寡核苷酸设置0.2μmol/l、0.4μmol/l、0.8μmol/l三个浓度,每个浓度重复5个孔,并设细胞和脂质体单独处理作对照。转染6小时后,换含10%胎牛血清的1640培养液继续培养72h,每孔加20μlMTS(CellTiter96Aqueous one solution cellprol iferation assay,Promega)并继续避光培养90min,在多标记酶联免疫检测仪(VICTORTMWallac 1420 Multilabel Counter,Wallac)上测定490nm处吸光值A,计算细胞增殖抑制率。
1.4反义寡核苷酸在体外对靶基因mRNA表达的影响:
选取细胞水平抑制效果较好的A5、A8硫代反义寡核苷酸,检测其对靶mRNA表达的抑制作用。A549细胞培养条件同上。将A549细胞悬液接种在6孔培养板中,每孔接种培养液2mL,含1.5×105细胞。待40-60%的细胞融合后,吸去培养液,进行硫代反义寡核苷酸的转染(操作过程同上)。反义寡核苷酸的浓度分别为0.2μmol/l、0.4μmol/l、0.8μmol/l,并设细胞对照(ctrl)、脂质体对照(lipofectin)。为了证明As5和As8对靶基因的抑制的特异性,这两条序列对应的正义序列(sense)和错配序列(mismatch)也以0.8μmol/l转染A549细胞,并在mRNA水平上检测其对靶mRNA表达的抑制作用。将反义寡核苷酸转染A549细胞6h后,换含10%胎牛血清的1640培养液继续培养48h后,TRIZOL法(Gibco)提细胞总RNA,紫外定量并将各组提取物调至相同浓度。采用Reverse transcription system(Promega)进行反转录,及PCR扩增靶基因Sirt1。以看家基因GAPDH作为内标进行双重PCR。扩增产物用2%琼脂糖胶(Sigma)电泳检查。
1.5反义寡核苷酸在体外对靶基因蛋白表达的影响:
选取抑制效果较好的硫代反义寡核苷酸A5和A8,检测其对靶蛋白表达的抑制作用。A549细胞培养条件同上。将A549细胞悬液接种在6孔培养板中,每孔接种培养液2mL,含1.5×105细胞。硫代反义寡核苷酸的转染(操作过程同上)。反义寡核苷酸的浓度分别为0.2μmol/l、0.4μmol/l、0.8μmol/l,设细胞对照和脂质体对照。为了证明As5和As8对靶基因的抑制的特异性,这两条序列对应的正义序列(sense)和错配序列(mismatch)也以0.8μmol/l转染A549细胞,并在蛋白水平上检测其对靶蛋白表达的抑制作用。将反义寡核苷酸转染转染6h后,换含10%胎牛血清的1640培养基继续培养72h,RIPA-PICT(Pharmacia)提细胞总蛋白,蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。每孔50μg总蛋白,12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后,并进行Western bloting观察靶基因蛋白表达情况。
2.实验结果
2.1反义寡核苷酸作用靶位的筛选:
通过基于靶基因多能级预测结构的人工神经网络预测算法设计反义序列A1-A10(序列见表1)。如图1所示,A1、A2以及随机序列R对肿瘤细胞没有明显的抑制作用,而其余8条序列对细胞的生长均有不同程度的抑制作用。0.8μM给药时,A5和A8对肿瘤细胞增殖的抑制率高于70%,因此选择A5和A8进行进一步的分子水平分析。针对A5和A8设计了相应的正义和错配的寡核苷酸序列以检验A5和A8对A549细胞增殖抑制的特异性。结果如图2、图3所示,正义和错配序列对A549细胞的增殖抑制较弱,说明A5和A8序列有较好的靶基因特异性。2.2反义寡核苷酸对靶基因转录及翻译水平的影响:
反义药物是通过抑制其靶基因的表达来实现药效作用,同时观察靶基因的表达情况也是评价和衡量反义药物作用特异性的一个重要指标。由图4可以看出,候选反义寡核苷酸A5和A8以给药后均能对靶基因mRNA的表达起到较好的抑制作用,且量效关系明显。脂质体对照(Lipofectin)与正常细胞(Ctrl)相比无显著抑制效应。特异性实验表明(图5),A5和A8相应的正义和错配序列在0.8μM浓度转染时,对靶基因表达的抑制较弱或不明显。
由图6可见,反义寡核苷酸A5和A8以给药后均能对靶基因蛋白的表达起到较好的抑制作用,且量效关系明显,其中以A8抑制效果较好。脂质体对照(Lipofectin)与正常细胞(Ctrl)相比无显著抑制效应。由图7可见,在0.8μM转染时,A5和A8相应的正义序列和错配序列对靶基因表达的抑制较弱或不明显。
实施例二:A8反义寡核苷酸序列体外抗肿瘤活性评价
1材料和方法
选取A8,以0.16μmol/l、0.24μmol/l、0.56μmol/l和0.8μmol/l的浓度按上述转染方法处理肺癌(A549)、前列腺癌(Du145)、肝癌(HepG2)和人胚肺成纤维细胞系(Helf),考察了As8对多种癌细胞增殖的抑制。细胞来源于军事医学科学院。
2实验结果
如图8所示A8对不同的癌细胞系有不同程度的抑制。其中对肺癌和前列腺癌的抑制较为明显,对肝癌的抑制率较低。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
<120>抑制Sirt1基因表达的反义寡核苷酸结构和用途
<130>
<160>10
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>
<400>1
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>
<400>2
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>
<400>3
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>
<400>4
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>
<400>5
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>
<400>6
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>
<400>7
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>
<400>8
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>
<400>9
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>
<400>10
Claims (3)
1.一种靶向human silent mating type information regulation 2 homolog 1的反义寡核苷酸,其序列如下:5’-CAA TGG GAG ACA TGT ACT TT-3’。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸,其特征是该反义寡核苷酸经过硫代化学修饰。
3.权利要求1或2中所述的反义寡核苷酸在制备抗肝癌、前列腺癌和肺癌药物中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2006100759756A CN1844387B (zh) | 2006-04-26 | 2006-04-26 | 抑制Sirt1基因表达的反义寡核苷酸结构和用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2006100759756A CN1844387B (zh) | 2006-04-26 | 2006-04-26 | 抑制Sirt1基因表达的反义寡核苷酸结构和用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1844387A CN1844387A (zh) | 2006-10-11 |
CN1844387B true CN1844387B (zh) | 2011-02-02 |
Family
ID=37063357
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2006100759756A Expired - Fee Related CN1844387B (zh) | 2006-04-26 | 2006-04-26 | 抑制Sirt1基因表达的反义寡核苷酸结构和用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1844387B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103751805B (zh) * | 2014-01-23 | 2015-09-23 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 干扰sirt1表达试剂在制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物中的应用 |
CN103751806B (zh) * | 2014-01-23 | 2015-10-14 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 干扰sirt1表达试剂在制备抑制肝癌干细胞干性转录因子表达的试剂中的应用 |
CN104873500A (zh) * | 2015-04-29 | 2015-09-02 | 中国人民解放军第四军医大学 | 化合物zln005的用途 |
-
2006
- 2006-04-26 CN CN2006100759756A patent/CN1844387B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
GenBank Accession No. NM_012238.2001, * |
吴琦玮.反义核酸基因治疗中电子计算机的辅助设计.中国实验血液学杂志12 3.2004,12(3),387-391. |
吴琦玮.反义核酸基因治疗中电子计算机的辅助设计.中国实验血液学杂志12 3.2004,12(3),387-391. * |
熊鹰等.反义寡核苷酸设计策略与学习记忆研究.中国行为医学科学8 1.1999,8(1),73-75. |
熊鹰等.反义寡核苷酸设计策略与学习记忆研究.中国行为医学科学8 1.1999,8(1),73-75. * |
袁守军.反义药物设计方法研究进展.解放军药学学报20 2.2004,20(2),126-129. |
袁守军.反义药物设计方法研究进展.解放军药学学报20 2.2004,20(2),126-129. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1844387A (zh) | 2006-10-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wu et al. | CircIRAK3 sponges miR-3607 to facilitate breast cancer metastasis | |
Yang et al. | Inhibition of cancer stem cell-like properties and reduced chemoradioresistance of glioblastoma using microRNA145 with cationic polyurethane-short branch PEI | |
Yang et al. | MiR-221/222 promote human glioma cell invasion and angiogenesis by targeting TIMP2 | |
Liu et al. | MicroRNA-21 acts as an oncomir through multiple targets in human hepatocellular carcinoma | |
Jia et al. | SRp20 is a proto-oncogene critical for cell proliferation and tumor induction and maintenance | |
Amero et al. | Conversion of RNA aptamer into modified DNA aptamers provides for prolonged stability and enhanced antitumor activity | |
Song et al. | MicroRNA-9 inhibits vasculogenic mimicry of glioma cell lines by suppressing Stathmin expression | |
JP2010516249A (ja) | 腫瘍治療のためのミクロrnaに関する組成物及び方法 | |
Milani et al. | Targeting miR‑155‑5p and miR‑221‑3p by peptide nucleic acids induces caspase‑3 activation and apoptosis in temozolomide‑resistant T98G glioma cells | |
CN107108685A (zh) | miR‑29模拟物及其用途 | |
EP2077326A1 (en) | Novel nucleic acid | |
Selem et al. | Let-7a/cMyc/CCAT1/miR-17–5p Circuit Re-sensitizes Atezolizumab Resistance in Triple Negative Breast Cancer through Modulating PD-L1 | |
CN1844387B (zh) | 抑制Sirt1基因表达的反义寡核苷酸结构和用途 | |
Mlakar et al. | Electric pulses used in electrochemotherapy and electrogene therapy do not significantly change the expression profile of genes involved in the development of cancer in malignant melanoma cells | |
CN100471862C (zh) | 抑制hif-1表达的反义寡核苷酸 | |
Nayyab et al. | Piceatannol mediated regulation of deregulated signaling pathways in different cancers: Tumbling of the ninepins of molecular oncology | |
CN101445534A (zh) | 一种高效的siRNA在制备抑制肿瘤迁移药物中的用途 | |
Gambari et al. | Peptide nucleic acid-based targeting of microRNAs: possible therapeutic applications for glioblastoma | |
KR20150140598A (ko) | 이중가닥 마이크로 rna를 유효성분으로 포함하는 암 예방용 또는 치료용 조성물 | |
Navarro et al. | An indirect role for the oncomir-519b in the expression of truncated neurokinin-1 in breast cancer cells | |
Liu et al. | Effects of miR-222 on cisplatin resistance of renal cancer cell strains and related mechanisms | |
Tang et al. | Cooperative inhibitory effects of antisense oligonucleotide of cell adhesion molecules and cimetidine on cancer cell adhesion | |
CN102140471B (zh) | 一种抑制肿瘤生长的寡聚核酸及其应用 | |
CN117286252B (zh) | 一种诊断和预后评估肺癌的生物标志物组合及其应用 | |
CN1184316C (zh) | 细胞增殖受体igfir基因靶标的反义寡核苷酸结构和用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110202 Termination date: 20130426 |