CN115044676A - 外泌体miRNA在预测非小细胞肺癌患者免疫治疗效果中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及外泌体miRNA在预测非小细胞肺癌患者免疫治疗效果中的应用。本发明提供用于非小细胞肺癌患者免疫治疗预后评估的外泌体miRNA标志物，所述外泌体miRNA标志物选自miR‑138‑5p、miR‑17‑5p、miR‑197‑3p和miR‑21‑5p中的至少一种。本发明为是否使用PD‑1/PD‑L1抑制剂进行免疫治疗和治疗后肿瘤的预后判断提供科学参考。本发明基于无创检测技术开发的非小细胞肺癌免疫治疗预后监控的方法，通过评估非小细胞肺癌患者的预后风险，从而预测出病人的预后情况，有效降低治疗费用，具有重要的应用价值。

Description

外泌体miRNA在预测非小细胞肺癌患者免疫治疗效果中的 应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及外泌体miRNA在预测非小细胞肺癌患者免疫治疗效果中的应用。
背景技术
肺癌是世界范围内最致命的实体癌之一，大约95％的肺癌被归类为非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌(SCLC)。随着疾病的进展，IV期疾病的生存率逐渐下降至四个月左右，因此早期干预十分重要。全身细胞化疗一直是晚期NSCLC的主要治疗方法，但化疗的获益已达到平台期，需要探索新的治疗形式。尽管现在对驱动突变在NSCLC中的作用已有了更深的了解，如表皮生长因子受体(EGFR)突变和间变性淋巴瘤激酶融合基因等，但治疗获益仍然有限。然而，癌症的生长和扩散不仅取决于肿瘤细胞的特征，还受到与免疫系统相互作用的影响。在使用免疫检查点抑制剂取得积极效果后，免疫疗法在抗肿瘤治疗方面取得了突破性进展。
抗肿瘤免疫治疗是一个大循环，为患者提供了广泛的潜在治疗靶点。随着对肺癌免疫逃逸、免疫监测、免疫编辑和重新激活癌症免疫更深入的了解，免疫治疗正慢慢成为可靠的肺癌疗法。考虑到肿瘤中PD-L1表达的异质性和动态特性，以及miRNA参与了肿瘤的发生发展、化疗药物的顺铂耐药性和患者对放疗和基因治疗的敏感性，外泌体miRNA有望成为非小细胞肺癌免疫治疗疗效监控和预后判断的潜在生物标志物，为患者的治疗和预后带来福音。
发明内容
本发明的目的是：对非小细胞肺癌患者的免疫检查点抑制剂治疗进行疗效预测。
发明人经过多年的研究，筛选获得了与非小细胞肺癌密切相关，能够用于临床免疫治疗疗效监控和预后判断的潜在RNA分子标志物组合，其包括四个miRNA：miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p。
本发明所提供的RNA分子标志物不论是单独使用还是部分或者全部的联合使用能够高灵敏性和特异性地指示非小细胞肺癌，具有优越的免疫疗效诊断性能，本发明提供的RNA分子标志物存在于外泌体中。
第一方面，本发明请求保护外泌体miRNA在预测非小细胞肺癌患者免疫治疗效果中的应用，所述外泌体miRNA选自miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p和miR-21-5p中的至少一种。
本发明所述外泌体miRNA来自于体液，例如血液、尿液、唾液或痰液。
在本发明所提供的应用中，检测miR-138-5p的引物探针组合如SEQ ID NO:1-3所示；检测miR-17-5p的引物探针组合如SEQ ID NO:4-6所示；检测miR-197-3p的引物探针组合如SEQ ID NO:7-9所示；检测miR-21-5p的引物探针组合如SEQ ID NO:10-12所示。
在本发明所提供的应用中，检测选自miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p中一种或多种RNA分子标志物的表达水平，并通过ROC曲线确定分子标志物的临界值，RNA分子标志物的表达水平高于所述临界值的患者为分子表达高水平组，RNA分子标志物的表达水平低于所述临界值的患者为表达低水平组，进行组间免疫疗效的比较，以判断所述非小细胞肺癌患者免疫治疗效果和/或预后情况，和/或非小细胞肺癌在治疗后的复发风险。
在本发明所提供的应用中，所述免疫治疗为接受抗PD 1抗体治疗；所述非小细胞肺癌患者为晚期非小细胞肺癌患者。
第二方面，本发明请求保护检测外泌体miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p或miR-21-5p的引物探针组合，其中，检测miR-138-5p的引物探针组合如SEQ ID NO:1-3所示；检测miR-17-5p的引物探针组合如SEQ ID NO:4-6所示；检测miR-197-3p的引物探针组合如SEQ ID NO:7-9所示；检测miR-21-5p的引物探针组合如SEQ ID NO:10-12所示。
第三方面，本发明请求保护，检测抗PD 1抗体治疗对晚期非小细胞肺癌患者治疗效果的试剂或试剂盒，含有检测外泌体miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p和miR-21-5p的引物探针组合。
本发明所提供的试剂或试剂盒中，含有上述的引物探针组合，还含有检测内参基因和外参基因的引物探针组合；优选地，所述内参基因为U6，所述外参基因为cel-miR-39。
根据本领域技术人员的理解，本发明请求保护外泌体miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p和/或miR-21-5pRNA或上述的试剂或试剂盒在非小细胞肺癌免疫疗效诊断、预后判断、疗效监测和/或复发监控中的应用。
第四方面，本发明请求保护一种非诊断目的检测抗PD 1抗体治疗对晚期非小细胞肺癌患者的治疗效果、预后判断、疗效监测和/或复发监控的方法，具体地，本发明所提供的方法采用上述的试剂或试剂盒，检测选自miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p中一种或多种RNA分子标志物的表达水平。
在本发明所提供的方法中，检测选自miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p中一种或多种RNA分子标志物的表达水平，并通过ROC曲线确定分子标志物的临界值，RNA分子标志物的表达水平高于所述临界值的患者为分子表达高水平组，RNA分子标志物的表达水平低于所述临界值的患者为表达低水平组，进行组间免疫疗效的比较，以判断所述非小细胞肺癌的治疗效果和/或预后情况。
作为本发明的一个具体实施方式，本发明提供的一种非小细胞肺癌诊断、预后判断、疗效监测和/或复发监控的方法，包括下列步骤：
(1)采集待检测对象的体液样本，例如血液、尿液、痰液和唾液，优先选择血浆；
(2)从上述体液样本中分离外泌体；
(3)提取外泌体RNA；
(4)检测选自miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p中一种或多种RNA。
在一个实施方案中，所述步骤(4)的检测包括反转录和定量PCR的步骤，优选地，所述定量PCR所使用的试剂为前述第二个方面所述的试剂。
在又一个实施方案中，步骤(4)还包括利用内参基因(例如：U6)和外参基因(例如：cel-miR-39)对所述表达水平进行归一化的步骤；优选地，进一步将上述归一化后的分子标志物的表达水平值进行逻辑(logistic)回归处理得到输出值，并通过ROC曲线确定分子标志物的临界值，RNA分子标志物的表达水平高于所述临界值的患者为分子表达高水平组，RNA分子标志物的表达水平低于所述临界值的患者为表达低水平组，进行组间免疫疗效的比较。
其中miR-138-5p表达低水平组的非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效佳，和/或在治疗后的复发风险低；而miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p表达高水平组的患者免疫治疗疗效佳，和/或在治疗后的复发风险低。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的上述外泌体RNA标志物和检测方法，实现了基于病人血浆的无创检测方法，就快速、高效的特点，病人依从性好，对非小细胞肺癌抗肿瘤免疫治疗提供了极高的灵敏度和特异性，为非小细胞肺癌免疫治疗疗效监控和预后判断的潜在生物标志物，为患者的治疗和预后带来福音。
本发明为是否使用PD-1/PD-L1抑制剂进行免疫治疗和肿瘤的预后判断提供科学参考。
本发明基于无创检测技术开发的非小细胞肺癌诊断及免疫治疗预后监控的方法，通过评估非小细胞肺癌患者的预后风险，从而预测出病人的预后情况，有效降低治疗费用，具有重要的应用价值。
附图说明
图1显示了外泌体miR-138-5p预测非小细胞肺癌患者免疫疗效的性能。
图2显示了外泌体miR-17-5p预测非小细胞肺癌患者免疫疗效的性能。
图3显示了外泌体miR-197-3p预测非小细胞肺癌患者免疫疗效的性能。
图4显示了外泌体miR-21-5p预测非小细胞肺癌患者免疫疗效的性能。
图5显示了外泌体miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p联合预测非小细胞肺癌患者免疫疗效的性能。
图6显示了外泌体miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p联合预测非小细胞肺癌患者免疫疗效的性能。
图7显示了外泌体miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p与整体生存相关性示意图。
图8显示了外泌体miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p与整体生存相关性示意图。
具体实施方式
本发明所要解决的技术问题是如何对非小细胞肺癌患者的免疫检查点抑制剂治疗进行疗效和预后预测。
还可进一步通过实施例来理解本发明，然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
术语“非小细胞肺癌”在本发明中，可以指代鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌。术语“RNA分子标志物”是与特定的疾病、适应症或者性状相关联，能够用于指示该特定疾病、适应症或性状的RNA分子。在本发明中，所述RNA分子标志物用于指示非小细胞肺癌，因此可作为非小细胞肺癌RNA分子标志物。
KM法即乘积极限法(product-limit method)是现在生存分析最常用的方法，是由Kaplan和Meier于1958年提出，因此称Kaplan-Meier法，通常简称KM法。根据步骤3.1中得到的cut-off值将所有样本分为两类进行生存概率分析。
ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线只能根据界值将变量划分为两类进行评分，疾病进展组、疾病无进展组。
无进展生存时间(progression-free survival，PFS)定义为患者自开始接受免疫单药治疗到疾病进展或死亡的时间。
实施例1与非小细胞肺癌相关的miRNA的筛选
本实施例提供，与非小细胞肺癌相关的外泌体miRNA标志物初步筛选，步骤如下：
1.1、在NCBI PUBMED数据库筛选非小细胞肺癌患者相比于对照组相关的外泌体miRNA，初步得到具有显著差异表达的10个miRNA分子标记物，具体如表1所示。
表1初步miRNA分子标志物列表
Figure BDA0003701256990000061
Figure BDA0003701256990000071
实施例2差异表达的外泌体miRNA的筛选
本实施例提供差异表达的外泌体miRNA的筛选，步骤如下：
2.1、样本的收集和资料的整理
本研究为回顾性、非干预性临床研究。本研究已通过中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会批准(审批号：19/147-1925)，按照赫尔辛基宣言的原则进行，并已获得所有受试者的知情同意。
本发明主要纳入自2019年6月-2021年6月在连云港医院肿瘤科接受抗PD 1抗体治疗的晚期非小细胞肺癌的患者。
入组标准为：1)临床诊断局限晚期或晚期的非小细胞肺癌患者；2)首次接受免疫治疗，但不限治疗线数。
排除标准为：1)胸腺癌、胸膜间皮瘤等其他类型胸部肿瘤；2)无基线治疗血标本。纳入研究的患者是每三周接受抗PD-1抗体免疫治疗一次(卡瑞利珠单抗是3mg/kg/次或240mg/次，每三周治疗一次；信迪利单抗和特瑞普利单抗是200mg/次，每三周治疗一次)。通常患者是每六周进行一次颈胸腹部增强CT评估治疗效果，必要时增加头颅增强MRI完善疗效评价。
以上资料均通过查询住院病历及电话随访获得。本研究的末次随访时间是2021年12月31日。
2.2、qPCR验证差异表达的外泌体miRNA(基于荧光定量PCR平台的miRNA检测体系)
2.2.1、血浆外泌体和血浆外泌体总RNA提取
采用Qiagen公司商业化ExoEasy试剂盒或恩泽康泰公司Exosupur进行血浆外泌体分离，分离后的外泌体用Qiagen miReasy mini kit试剂盒提取外泌体中的总RNA，并利用Agilent 2100检测RNA浓度和质量，记录RNA浓度。
2.2.2、反转录体系
采用TAKARA公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)和PremixEx TaqTM(Probe qPCR)试剂盒进行反转录和qPCR检测。
按表2所列组份配制反转录反应体系(反应液配制在冰上进行)，然后放入PCR仪进行反应，反应条件为37℃60min，85℃5s，12℃∞，反转录结束后加入50μL DEPC H2O稀释，取3μL作为模板，进行PCR反应。
表2反转录反应体系
Figure BDA0003701256990000081
2.2.3、qPCR反应体系
检测外泌体miRNA分子标志物的引物和探针如表3所述，包括：
用于检测miR-138-5p的引物和探针：如SEQ ID NO：1所示的上游引物序列，以及如SEQ ID NO:2所示的下游引物序列；探针序列如SEQ ID NO:3所示；
用于检测miR-17-5p的引物和探针：如SEQ ID NO：4所示的上游引物序列，以及如SEQ ID NO:5所示的下游引物序列；探针序列如SEQ ID NO:6所示；
用于检测miR-197-3p的引物和探针：如SEQ ID NO：7所示的上游引物序列，以及如SEQ ID NO:8所示的下游引物序列；探针序列如SEQ ID NO:9所示；
用于检测miR-21-5p的引物和探针：如SEQ ID NO：10所示的上游引物序列，以及如SEQ ID NO:11所示的下游引物序列；探针序列如SEQ ID NO:12所示；
用于内参基因U6的引物为：如SEQ ID NO：13所示的上游引物序列，以及如SEQ IDNO:14所示的下游引物序列；探针序列如SEQ ID NO:15所示；
外参基因cel-miR-39的引物为：如SEQ ID NO：16所示的上游引物序列，以及如SEQID NO:17所示的下游引物序列；探针序列如SEQ ID NO:18所示；
表3引物探针序列
Figure BDA0003701256990000091
Figure BDA0003701256990000101
按表4下列组分配制qPCR反应体系(反应液配制在冰上进行)，设置无模板对照作为阴性对照。然后放入实时荧光PCR仪(ABI7500)并按如下表5反应条件进行扩增检测。
表4qPCR反应体系
Figure BDA0003701256990000102
表5qPCR反应条件
Figure BDA0003701256990000103
2.2.4、QPCR验证差异表达的外泌体miRNA结果
采用基于荧光定量PCR平台的miRNA检测体系，根据步骤2.2.2-2.2.3对步骤1.1中提取的血浆外泌体RNA进行QPCR验证差异表达检测。
分别检测实施例1中十个初始miRNA分子标志物和内参、外参基因的Ct值。进一步，根据所有目标RNA的Ct值及参考基因RNA、U6和Cel-39-3p的Ct值和相对定量公式2-ΔΔCt计算相对表达量的倍数变化，即可知晓每个RNA分子标志物相对于参照基因的相对表达量。最终得到本发明具有显著差异表达的4个miRNA分子标记物，具体如表6所示。
表6qPCR反应条件
Figure BDA0003701256990000111
实施例3分析血浆外泌体RNA分子标志物进行非小细胞肺癌免疫疗效的预测
本实施例分析血浆外泌体RNA分子标志物进行非小细胞肺癌免疫疗效的预测结果。
3.1、ROC特征曲线分析获得CUT-off界值
对实施例2得到的显著差异miRNA分子标志物(miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p)CT值使用相对定量公式值2-ΔΔCt，计算RNA分子标志物相对表达量的倍数变化，即可知晓每个RNA分子标志物相对于参照基因的相对表达量。在此基础上，进一步采用逻辑回归进行训练(使用R语言glm函数)，并使用ROC特征曲线和AUC(使用R语言roc函数)来评估上述RNA分子标志物单独使用或者联合应用来检测非小细胞肺癌免疫疗效的准确性。
ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线能根据界值将变量划分为两类。ROC曲线是以灵敏度为y轴、以I-特异度为x轴，由不同界值产生不同的点。
(1)miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p分别单独检测结果
如图1、图2、图3及图4所示，单独应用每个RNA分子标志物时，基于2.2.4的检测结果，采用R语言进行t检测分析得到p≤0.05，表明其中每一个RNA分子标志物的表达量均单独与非小细胞肺癌显著相关。miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p诊断非小细胞肺癌免疫疗效的AUC分别为0.47、0.76、0.77和0.71，具有良好的灵敏性和特异性。
(2)miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p的联合检测
如图5所示，联合应用miR-138-5p、miR-17-5p和miR-197-3p时，基于2.2.4的检测结果，采用R语言进行t检测分析得到p≤0.05，说明miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p的联合表达量与非小细胞肺癌免疫疗效显著相关。联合标志物检测展现了更好的灵敏性和特异性(AUC＝0.8523)。
(3)miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p的联合检测
如图6所示，联合应用miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p时，基于2.2.4的检测结果，对检测结果采用R语言进行t检测分析得到p≤0.05，说明四种标志物联合应用时，与非小细胞肺癌免疫疗效显著相关，联合标志物检测展现了更好的灵敏性和特异性(AUC＝0.8693)。
3.2、KM法分析生存概率
根据步骤3.1ROC分析计算得到的不同miRNA(miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p)的CUT-off值将非小细胞肺癌患者分别分为两组进行分析，通过KM生存分析验证该miRNA的预后能力。
(1)根据miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p三个标志物的最佳界值，将入组的非小细胞肺癌患分为基线表达高水平组(高于界值)和基线表达低水平组(低于或等于界值)。然后再根据进展状态和无进展生存时间绘制生存曲线，结果如图7所示，分析结果提示，相同随访时间下，miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p表达水平高组的无进展生存率极显著增加(p＜0.001)。
(2)根据miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p四个标志物的最佳界值，将入组的非小细胞肺癌患分为基线表达高水平组(高于界值)和基线表达低水平组(低于或等于界值)。然后再根据进展状态和无进展生存时间绘制生存曲线，结果如图8所示，分析结果提示，相同随访时间下，miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p表达水平高组的无进展生存率极显著增加(p＜0.001)。
上述实施例结果表明，本公开提供的RNA分子标志物miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p，不论是单独使用还是部分或者全部的联合使用，均能够有效地作为预测或辅助预测临床非小细胞肺癌免疫治疗疗效的标志物；其次还可以有效地作为预测或辅助预测免疫治疗非小细胞肺癌后的无进展生存时间的长短。
本发明的实验证明，血浆外泌体RNA可能具有预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效的潜力，而且PD-L1抑制剂可能会通过解除机体的免疫抑制状态，进而增强免疫治疗的抗肿瘤作用。
本发明的实验证明，血浆外泌体RNA还可能作为临床非小细胞肺癌疾病治疗的某种干预，比如：免疫治疗、服药、手术、化疗等。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 连云港市第一人民医院 北京恩泽康泰生物科技有限公司
<120> 外泌体miRNA在预测非小细胞肺癌患者免疫治疗效果中的应用
<130> KHP221117332.2
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtagctggt gttgtgaatc a 21
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccggcct 50
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcgcactgg atacgaccgg cc 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgcactgga tacgacctac ctg 23
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctacct 50
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgccaaagtg cttacagtgc 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgcttcacc accttctc 18
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgctggg 50
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcgcactgg atacgacgct gg 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcgcgtagct tatcagactg a 21
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcaaca 50
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttcgcactgg atacgactca acatca 26
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agaagattag catggcccct gcgca 25
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgctcaccgg gtgtaaatc 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgctcaccgg gtgtaaatc 19
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
attcgcactg gatacgacca agct 24
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtgcagggtc cgaggt 16

Claims (10)

1.外泌体miRNA在预测非小细胞肺癌患者免疫治疗效果中的应用，所述外泌体miRNA选自miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p和miR-21-5p中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测miR-138-5p的引物探针组合如SEQ IDNO:1-3所示；检测miR-17-5p的引物探针组合如SEQ ID NO:4-6所示；检测miR-197-3p的引物探针组合如SEQ ID NO:7-9所示；检测miR-21-5p的引物探针组合如SEQ ID NO:10-12所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，检测选自miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p中一种或多种RNA分子标志物的表达水平，并通过ROC曲线确定分子标志物的临界值，RNA分子标志物的表达水平高于所述临界值的患者为分子表达高水平组，RNA分子标志物的表达水平低于所述临界值的患者为表达低水平组，进行组间免疫疗效的比较；
优选地，miR-138-5p表达低水平组的非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效佳，和/或在治疗后的复发风险低；而miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p表达高水平组的患者免疫治疗疗效佳，和/或在治疗后的复发风险低。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述免疫治疗为接受抗PD 1抗体治疗；所述非小细胞肺癌患者为晚期非小细胞肺癌患者。
5.检测外泌体miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p或miR-21-5p的引物探针组合，其特征在于，检测miR-138-5p的引物探针组合如SEQ ID NO:1-3所示；检测miR-17-5p的引物探针组合如SEQ ID NO:4-6所示；检测miR-197-3p的引物探针组合如SEQ ID NO:7-9所示；检测miR-21-5p的引物探针组合如SEQ ID NO:10-12所示。
6.检测抗PD 1抗体治疗对晚期非小细胞肺癌患者治疗效果的试剂或试剂盒，其特征在于，含有检测外泌体miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p和miR-21-5p的引物探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂或试剂盒，其特征在于，含有权利要求5所述的引物探针组合，还含有检测内参基因和外参基因的引物探针组合；优选地，所述内参基因为U6，所述外参基因为cel-miR-39。
8.外泌体miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p和/或miR-21-5p或权利要求6-7任一项所述的试剂或试剂盒在非小细胞肺癌免疫疗效诊断、预后判断、疗效监测和/或复发监控中的应用。
9.一种非诊断目的检测抗PD 1抗体治疗对晚期非小细胞肺癌患者的治疗效果、预后判断、疗效监测和/或复发监控的方法，其特征在于，采用权利要求6-7任一项所述的试剂或试剂盒，检测选自miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p中一种或多种RNA分子标志物的表达水平。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，检测选自miR-138-5p、miR-17-5p、miR-197-3p、miR-21-5p中一种或多种RNA分子标志物的表达水平，并通过ROC曲线确定分子标志物的临界值，RNA分子标志物的表达水平高于所述临界值的患者为分子表达高水平组，RNA分子标志物的表达水平低于所述临界值的患者为表达低水平组，进行组间免疫疗效的比较，以判断所述非小细胞肺癌的治疗效果和/或预后情况。
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