CN115074436A - 一种肺癌早期诊断标志物在制备肺癌早期诊断试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺癌早期诊断标志物在制备肺癌早期诊断试剂中的应用，其中，所述肺癌早期诊断标志物为PPP1R14B‑AS1和LINC01833中的一种或两种。本发明首次发现了PPP1R14B‑AS1和LINC01833这两种分子标志物lncRNAs在肺癌患者中的差异表达，通过检测所述PPP1R14B‑AS1和LINC01833的表达水平，可以判断受试者是否患有肺癌，为肺癌的早期诊断提供分子手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种肺癌早期诊断标志物在制备肺癌早期诊断试剂中的应用。
背景技术
组织学上将肺癌分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)两大类，NSCLC又细分为鳞状细胞癌(squamouscell carcinoma,SCC)、腺癌(adenocarcinoma,AD)和大细胞肺癌(large cell lungcancer,LCLC)。其中又以肺腺癌最为常见，SCLC约占全部肺癌的15％，NSCLC占全部肺癌的80％以上。肺癌患者的生存率与早期诊断密切相关，早期肺癌手术治疗后的5年生存率大于40％，随着靶向药物及免疫检查点药物研究的不断进展，早期肺癌患者5年的生存率不断提高；而诊断为进展期肺癌的平均生存时间仅为8个月。因此，获取肺癌的早期诊断标志物对肺癌的五年生存率来讲非常重要。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肺癌早期诊断标志物在制备肺癌早期诊断试剂中的应用，通过检测肺癌早期诊断标志物的表达水平可以判断受试者是否患有肺癌的风险。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种肺癌早期诊断标志物在制备肺癌早期诊断试剂中的应用，所述肺癌早期诊断标志物为PPP1R14B-AS1和LINC01833中的一种或两种。
所述的应用，其中，当所述PPP1R14B-AS1和LINC01833中的一种或两种表达水平上调时，受试者患有肺癌。
有益效果：本发明首次发现了PPP1R14B-AS1和LINC01833这两种分子标志物lncRNAs在肺癌患者中的差异表达，通过检测所述PPP1R14B-AS1和LINC01833的表达水平，可以判断受试者是否患有肺癌，为肺癌的早期诊断提供分子手段。
附图说明
图1为通过RNA-Seq技术检测到的与肺癌相关的基因。
图2为已知肺癌相关基因PVT1和HOTAIR在3个不同RNA-Seq数据库中的表达结果图。
图3为发现和识别肺腺癌潜在的lncRNA预后生存标志物结果图。
图4为高表达PPP1R14B-AS1和LINC01833与肺腺癌患者预后相关性分析结果图。
图5为定量qPCR方法检测PPP1R14B-AS1和LINC01833这两种lncRNAs在肺腺癌组织中的表达水平结果图。
图6为应用ROC曲线对PPP1R14B-AS1和LINC01833这两种lncRNAs的qPCR结果分析图。
图7为应用另外收集的肺腺癌组织样本158例和正常对照48例作为验证检测样本，通过QPCR检测PPP1R14B-AS1和LINC01833这两种lncRNAs的表达水平结果图。
具体实施方式
本发明提供一种肺癌早期诊断标志物在制备肺癌早期诊断试剂中的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
随着基因组、蛋白组学的发展和大量靶向药物的研究应用，肺癌的治疗逐步向以基因为导向的个体化治疗转变。lncRNA具有显著的肿瘤组织特异性，因此在肿瘤细胞中表达异常的lncRNA有希望作为肿瘤早期诊断标志物(特别是在某些肿瘤发生的早期)，为癌症临床诊断提供无创、快捷、低成本的筛查手段。通过转录组测序技术(RNA-Seq)对不同亚型肺癌临床组织进行全基因组lncRNAs差异表达分析，发现及初步验证不同亚型肺癌组织特异性差异表达分析，基于差异表达的基因及lncRNAs在相关数据库的记载并通过肺癌组织或细胞系中进行验证，筛选出有望成为肺癌早期诊断标志物的组合，建立肺癌早期预警诊断检测技术，最终应用临床肿瘤组织和血液对早诊技术进行验证和评价。本发明的研究成果不仅有助于对基于分子靶点的肺癌分子分型和发生发展机制的认识，更重要的是为临床提供潜在的肺癌的早期诊断技术，用于肺腺癌的早期诊断和预后评测，惠及肿瘤患者。
通过上述方法，本发明筛选出了一种肺癌早期诊断标志物，其中，所述肺癌早期诊断标志物为PPP1R14B-AS1(ENSG00000256940)和LINC01833(ENSG00000259439)中的一种或两种。本发明提出的分子标志物将为肺癌早期的诊断和治疗提供新的思路和策略。
基于此，本发明还提供了一种肺癌早期诊断标志物在制备肺癌早期诊断试剂中的应用，所述肺癌早期诊断标志物为PPP1R14B-AS1和LINC01833中的一种或两种。当所述PPP1R14B-AS1和LINC01833中的一种或两种表达水平上调时，受试者患有肺癌。本发明首次发现了PPP1R14B-AS1和LINC01833这两种分子标志物lncRNAs在肺癌患者中的差异表达，通过检测所述PPP1R14B-AS1和LINC01833的表达水平，可以判断受试者是否患有肺癌，为肺癌的早期诊断提供分子手段。
具体来讲，本发明通过对前期67例临床肺腺癌组织样本和6例癌旁组织对照的转录组学数据进行深度分析。(所述67例临床肺腺癌组织样本和6例癌旁组织均来源于1991至2012年密西根大学医院的外科手术样本。)测序结果每百万读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数(reads per kilobase per million mapped reads，RPKM)来估计基因的表达水平。用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析，使用R语言软件对归一化后的表达数据进行统计分析。结果发现包括蛋白编码基因、假基因、长链非编码RNA等在内的55400个转录本。随后我们通过下列条件对转录本进行了筛选以期寻找出在肺癌中特异性表达的转录本:转录本的FPKM值至少在4个样品中大于0，同时其中最少有1个样品的值大于4。筛选后一共得到21560个基因，包括16017个蛋白编码基因(占74％)，1726个假基因(占8％)和3136个lncRNA(占15％)，如图1所示。
接着，选择已知的肺癌相关的lncRNAs:HOTAIR,PVT1作为RNA-seq的质检指标，同时选择两个已经发表的独立RNA-Seq数据库(Seo和TCGA)，验证临床肺腺癌肿瘤组织RNA-Seq的结果。结果如图2所示，从图2可以看出，HOTAIR，PVT1在三个数据库肺腺癌中均高表达，且p值均小于0.001。证明了RNA-Seq检测结果的可靠性。
通过肺腺癌组织与正常肺组织lncRNAs表达水平的比较，筛选出281个肺腺癌特异性表达的lncRNAs。采用COX比例风险模型分析和Kaplan-Meier曲线对单个lncRNAs分别进行统计学分析，总生存率的计算以手术治疗后五年生存期为限。希望能从281个备选lncRNAs中找到与肺腺癌预后相关的lncRNAs。通过对RNA-Seq数据进行分析，共发现有281个备选lncRNAs中有127个与生存密切相关的lncRNAs。为了证实所得结果的可信度，本发明应用已发表的Okayama肺腺癌数据库(Affymetrix U133plus 2.0array方法测得，包括226例一期和二期肺腺癌组织)对结果进行了验证，发现127个lncRNAs中有54个在Okayama数据库中也与肺腺癌病人生存相关，其中34个lncRNAs的p值小于0.05，如图3所示。所述34个lncRNAs包括肺癌相关基因ENSG00000249859(PVT1)、ENSG00000228630(HOTAIR)、ENSG00000237523(LINC00857)、ENSG00000204949(FAM83A-AS1)、ENSG00000256940(PPP1R14B-AS1)、和ENSG00000259439(LINC01833)等。
本发明通过生信分析发现，PPP1R14B-AS1和LINC01833在肺腺癌组织中显著高表达且与患者不良预后相关。将以上两种lncRNAs在三个数据库中进行分析，发现其在肺癌等肿瘤发生发展中具有重要作用，结合ROC曲线结果，本发明提出PPP1R14B-AS1和LINC01833有望成为肺腺癌早期诊断的标志物，如图4所示，从图4Kaplan-Meier生存曲线可以看出，高表达lncRNA(ENSG00000256940和ENSG00000259439)基因与肺腺癌患者的不良预后密切相关，提示这些lncRNAs可用于肺腺癌患者的预后判断。
采用QPCR方法验证筛选出的lncRNAs在肺腺癌组织中的表达，设计lncRNAs中PPP1R14B-AS1和LINC01833的特异性引物，经过BLAST进行特异性比对，建立和优化QPCR检测方法，收集肺腺癌组织样本提取的RNA 101例，正常肺组织19例进行QPCR反应，结果显示这两种lncRNAsPPP1R14B-AS1和LINC01833在肺腺癌组织中显著高表达，如图5所示。ROC曲线表明PPP1R14B-AS1和LINC01833这两种lncRNAs对肺腺癌组织的特异性和敏感性均较好(如图6所示)，能够成为检测标志物，与转录组学数据一致。
为进一步评价PPP1R14B-AS1和LINC01833这两种lncRNAs在肺腺癌诊断和预后评价中的意义，本发明另外收集了158例肺腺癌组织和48例癌旁组织，提取总RNA，通过QPCR反应检测和分析两种lncRNAs的表达水平，并与肺癌患者预后进行了相关性分析，ROC曲线显示这两种lncRNAs指标的可靠性和特异性均达到成为潜在的预后评价指标，如图7所示，其中，A为ENSG00000256940在组织样本中的表达水平及其统计学结果；B为ENSG00000259439在组织样本中的表达水平及其统计学结果；C为ENSG00000256940和ENSG00000259439的ROC分析曲线。
综上所述，本发明通过对肺腺癌肿瘤样本全转录组学检测，GEO富集分析发现肿瘤组织与癌旁正常组织差异表达的lncRNAs，结合临床数据资料联合分析，筛选出PPP1R14B-AS1和LINC01833这两种lncRNAs与肺腺癌预后显著相关。通过设计特异性引物，采用QPCR验证选出的差异表达的lncRNAs在肿瘤组织和正常组织中的表达水平，结果显示，这两种lncRNAs在肺腺癌组织中检测结果的特异性和敏感性均较好，有望作为肺腺癌预后的标志物。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (2)
1.一种肺癌早期诊断标志物在制备肺癌早期诊断试剂中的应用，所述肺癌早期诊断标志物为PPP1R14B-AS1和LINC01833中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当所述PPP1R14B-AS1和LINC01833中的一种或两种表达水平上调时，受试者患有肺癌。
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