JPWO2019117270A1 - 頭頸部がんの検出を補助する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1) 生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号162、160、145、143、146、140、141、1〜139、142、144、147〜159および161のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (LincRNA、MiscRNA)の少なくとも1種の存在量を指標とする頭頸部がんの検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号1〜71、118〜136のいずれかで示される少なくとも1種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号72〜117、137〜162のいずれかで示される少なくとも1種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも少ないことが、頭頸部がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法。
(2) 塩基配列が配列番号162、160、145、143、146、140、141のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (LincRNA、MiscRNA)の少なくとも1種の存在量を指標とする(1)記載の方法。
(3) 塩基配列が配列番号92、2、74、73、75、84、32、77、18、1、3〜31、33〜72、76、78〜83、85〜91、93〜116のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体又は転移RNA断片の少なくとも1種の存在量を指標とする(1)記載の方法。
(4) 塩基配列が配列番号115または116のisomiRの存在量を指標とする(3)記載の方法。
(5) 塩基配列が配列番号11のmiRNAと塩基配列が配列番号30のmiRNAの存在量を指標とする(3)または(4)に記載の方法。
(6) 塩基配列が配列番号11のmiRNAと塩基配列が配列番号26のmiRNAの存在量を指標とする(3)または(4)に記載の方法。
(7) 塩基配列が配列番号11のmiRNAと塩基配列が配列番号117のmiRNAの存在量を指標とする(3)または(4)に記載の方法。
(8) 塩基配列が配列番号30のmiRNAと塩基配列が配列番号118のmiRNAの存在量を指標とする(3)または(4)に記載の方法。
(9) 塩基配列が配列番号157のmiRNAと塩基配列が配列番号162のmiRNAの存在量を指標とする(1)記載の方法。
(10) 前記頭頸部がんが、舌がんである(3)〜(8)のいずれかに記載の方法。
これらのmiRNA等は、頭頸部がん患者の血清又はエクソソーム中の存在量と、健常者の血清又はエクソソーム中の存在量との比の対数(底が2の対数で「log FC」(FCは、fold change)と呼ばれる)の絶対値が1.00以上のものが多く、統計学的に有意(t検定でp<0.05)のものである。
すなわち、頭頸部がんが疑われる又は頭頸部がんに罹患するヒトの被検試料中の塩基配列が配列番号162、160、145、143、146、140、141、1〜139、142、144、147〜159および161のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (LincRNA、MiscRNA)の少なくとも1種の存在量を検出する方法であって、
ヒトから血液試料を得る工程、及び
次世代シーケンサーまたはqRT-PCRを用いて、前記血液試料内のmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、又は非コードRNA断片 (LincRNA、MiscRNA)の存在量を測定する工程を含み、
ここで、塩基配列が配列番号1〜71、118〜136のいずれかで示される少なくとも1種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも多い、又は塩基配列が配列番号72〜117、137〜162のいずれかで示される少なくとも1種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも少ない、方法、も提供される。
1. 材料及び方法
(1) 臨床検体
頭頸部がん患者24例、健常者10例の血漿を用いた。
血清中 RNA の抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。
1) 凍結した血漿サンプルを融解し、10000 rpm で 5 分間、室温で遠心し、凝集タンパク質や血球成分を沈殿させた。
2) 上清 200 μL を新しい 1.5 mL チューブ に移した。
3) 1000 μL の QIAzol Lysis Reagent を加えて十分に混和し、タンパク質成分を変性した。
4) RNA 抽出のコントロール RNA として 0.05 nM cel-miR-39 を 10 μL 加え、ピペッティングで混和した後、室温で 5 分間静置した。
5) 水層と有機溶媒層の分離促進のため、200μLのクロロホルムを加え、十分に混和し、室温で 3 分間静置した。
6) 12000 xg、15分間、4℃で遠心し、上層の水層650μLを新しい2mLチューブ に移した。
7) RNA を析出させるため、975μLの 100% エタノールを加え、ピペッティングで混和した。
8) 650 μL の 7) を miRNeasy Mini spin column (以下、カラム) に移し、室温で 1 分間静置後、8000 xg、15 秒間、室温で遠心し、RNA をカラムのフィルターに吸着させた。カラムから通過した溶液は廃棄した。
9) 7) の溶液を全てカラムに通すまで 8) を繰り返し、全ての RNA をフィルターに吸着させた。
10) フィルターに付着した夾雑物の除去のため、650 μL の Buffer RWT をカラムに加え、 8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
11) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μL のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
12) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μL のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、2 分間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
13) フィルターに付着している溶液を完全に除去するため、カラムを新しい 2 mL collection チューブ に移し、10000 xg、1 分間、室温で遠心した。
14) カラムを 1.5 mL チューブ に移し、50 μL の RNase-free water を加え、室温で 1 分間静置した。
15) 8000 xg、1 分間、室温で遠心し、フィルターに吸着した RNA を溶出した。溶出した RNAは、そのまま次の実験に用い、残りは -80 ℃ で保存した。
血清中のエクソソームは、次のようにして回収した。
サーモフィッシャーサイエンティフィック社の_Total Exosome Isolation (from serum)で精製した。回収したエクソソームからのRNAの抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。
miRNA等の定量は、次のようにして行った。
二群等でmiRNA等の定量を行う場合は、同様の方法で回収した細胞外小胞(エクソソームを含む)を用いて同様の方法でRNAを精製してcDNAライブラリーを作成して次世代シークエンス解析を行う。次世代シークエンス解析は、配列を読む機器であれば機器を限定しない。
定量結果からのカットオフ値及びAUCの算出は、具体的に次のようにして行った。JMP Genomics 8を用いてロジスティック回帰分析を実施し、ROC曲線とAUCの算出を行った。また、ROC曲線の左上隅の点(感度1.0, 特異度 1.0)との距離が最小となる点をカットオフ値とした。
結果を表2−1〜表2−10に示す。
Claims (10)
- 生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号162、160、145、143、146、140、141、1〜139、142、144、147〜159および161のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、若しくは非コードRNA断片 (LincRNA、MiscRNA)の少なくとも1種の存在量を指標とする頭頸部がんの検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号1〜71、118〜136のいずれかで示される少なくとも1種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号72〜117、137〜162のいずれかで示される少なくとも1種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも少ないことが、頭頸部がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法。
- 塩基配列が配列番号162、160、145、143、146、140、141のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体、転移RNA断片 (tRF)、若しくは非コードRNA断片 (LincRNA、MiscRNA)の少なくとも1種の存在量を指標とする請求項1記載の方法。
- 塩基配列が配列番号92、2、74、73、75、84、32、77、18、1、3〜31、33〜72、76、78〜83、85〜91、93〜116のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR)、miRNA前駆体若しくは転移RNA断片の少なくとも1種の存在量を指標とする請求項1記載の方法。
- 塩基配列が配列番号115または116のisomiRの存在量を指標とする請求項3記載の方法。
- 塩基配列が配列番号11のmiRNAと塩基配列が配列番号30のmiRNAの存在量を指標とする請求項3または4に記載の方法。
- 塩基配列が配列番号11のmiRNAと塩基配列が配列番号26のmiRNAの存在量を指標とする請求項3または4に記載の方法。
- 塩基配列が配列番号11のmiRNAと塩基配列が配列番号117のmiRNAの存在量を指標とする請求項3または4に記載の方法。
- 塩基配列が配列番号30のmiRNAと塩基配列が配列番号118のmiRNAの存在量を指標とする請求項3または4に記載の方法。
- 塩基配列が配列番号157のmiRNAと塩基配列が配列番号162のmiRNAの存在量を指標とする請求項1記載の方法。
- 前記頭頸部がんが、舌がんである請求項3〜8のいずれか1項に記載の方法。
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