CN109457029B - Mettl3基因的应用及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种m6A甲基化修饰过程中关键基因(METTL3)的检测及其应用，根据提取的总RNA序列，设计并合成特异性PCR引物，利用real‑time PCR技术，发现METTL3在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中的表达显著上升，并且与类风湿关节炎的疾病活动性指标CRP、ESR呈明显正相关关系，故METTL3基因可应用于制备类风湿关节炎的辅助诊断、治疗或者预后评估的制剂；本发明同时设计并合成特异性过表达该基因的Lv‑METTL3序列，能够通过调控NF‑κB信号通路显著抑制巨噬细胞的增殖及LPS所诱导的巨噬细胞的炎症反应，可成为类风湿关节炎的分子靶向治疗工具。

Description

METTL3基因的应用及其检测方法
技术领域
本发明属于风湿病分子生物学领域，具体涉及一种m6A甲基化中关键基因METTL3的表达、应用及其检测方法，具体而言，本发明具体涉及METTL3基因在制备类风湿关节炎辅助诊断制剂、分子靶向治疗制剂或者预后评估制剂中的应用。
背景技术
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)，是一种常见的病因未明的炎症性、系统性自身免疫性疾病，以对称性手足小关节慢性炎症为主要临床表现，其主要病理特征是滑膜炎和血管炎(Scott DL,et al.Rheumatoid arthritis.Lancet.2010；376:1094-108.)。RA通常会造成关节以外的脏器损伤，例如，肺组织纤维化、心包炎、皮肤出现类风湿结节等(Turesson C.Extra-articular rheumatoid arthritis.Curr OpinRheumatol.2013；25:360-366.)。RA具有高度的致畸性和致残性，病程后期严重影响患者的生活品质。RA的发病机制不明，可能与传染、遗传、性激素分泌等有关(Glant TT,etal.Epigenetics in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.BMC Med.2014；12:35；Salemi S,et al.Could early rheumatoid arthritis resolve afterperiodontitis treatment only？:case report and review of theliterature.Medicine(Baltimore)2014；93:e195；Ayeldeen G,et al.Possible use ofmiRNAs-146a and -499 expression and their polymorphisms as diagnostic markersfor rheumatoid arthritis.Mol Cell Biochem.2018；449:145-156.)。尽快缓解患者的炎性症状，缓解疼痛，控制病情活动，延缓疾病的进展，减少疾病对患者造成致畸以及致残的伤害是RA治疗的关键。但是，目前RA的治疗药物包括改变病情抗风湿药、糖皮质激素等缺乏靶向性、针对性，长期服药副作用大，病人身体及心理负担重(Westhovens R,etal.Clinical efficacy and safety of abatacept in methotrexate-naive patientswith early rheumatoid arthritis and poor prognostic factors.Ann RheumDis.2009；68:1870-1877；Bathon J,et al.Sustained disease remission andinhibition of radiographic progression in methotrexate-naive patients withrheumatoid arthritis and poor prognostic factors treated with abatacept:2-year outcomes.Ann Rheum Dis 2011；70:1949-1956；Goekoop-Ruiterman YP,etal.Clinical and radiographic outcomes of four different treatment strategiesin patients with early rheumatoid arthritis(the BeSt study):A randomized,controlled trial.Arthritis Rheum 2008；58:S126-35；Goekoop-Ruiterman YP,etal.Comparison of treatment strategies in early rheumatoid arthritis:arandomized trial.Ann Intern Med 2007；146:406-415.)。因此，寻找RA早期诊断、靶向治疗和预后评估的生物标记物分子意义深重。
随着分子生物学技术的进步及在医学领域的广泛应用，越来越堵的研究者发现，一些循环非编码RNA分子特异性存在于RA患者外周循环中，成为潜在的RA生物标记物，譬如微小RNA、长链非编码RNA分子等(Dunaeva M,et al.Circulating serum miR-223-3p andmiR-16-5p as possible biomarkers of early rheumatoid arthritis.Clin ExpImmunol 2018；193:376-385；Xu D,et al.Exosome-encapsulated miR-6089 regulatesinflammatory response via targeting TLR4.J Cell Physiol.2019；234:1502-1511；Davis JM,et al.My treatment approach to rheumatoid arthritis.Mayo ClinProc.2012；87:659-673；Zhang Y,et al.Long noncoding RNA expression profile infibroblast-like synoviocytes from patients with rheumatoidarthritis.Arthritis Res Ther.2016；18:227；Yang CA,et al.lncRNA NTT/PBOV1 AxisPromotes Monocyte Differentiation and Is Elevated in Rheumatoid Arthritis.IntJ Mol Sci.2018；19.)。RNA作为生命活动中重要的调节分子和修饰分子，也存在着很多种转录后化学修饰。目前经研究已经发现了100多种mRNA核苷酸修饰，其中m6A甲基化修饰占到了80％左右(Yin X,et al.mRNA-Seq reveals novel molecular mechanisms and arobust fingerprint in Graves' disease.J Clin Endocrinol Metab.2014；99:E2076-83；Wu Y,et al.Mettl3-mediated m(6)A RNA methylation regulates the fate ofbone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis.Nat Commun.2018；9(1):4772；Wu X,et al.N6-methyladenine RNA modification and cancers.Am J CancerRes.2018；8:1957-1966；Lobo J,et al.The Emerging Role of Epitranscriptomics inCancer:Focus on Urological Tumors.Genes(Basel).2018；9(11).pii:E552；Anders M,et al.Dynamic m(6)A methylation facilitates mRNA triaging to stressgranules.Life Sci Alliance.2018；1:e201800113.)。近年来，m6A甲基化修饰成为肿瘤学、免疫学等领域的研究热点，与免疫、炎症、肿瘤等的调控密切相关(Zhao BS,etal.Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.Nat Rev MolCell Biol.2017；18:31-42；Gilbert WV,et al.Messenger RNA modifications:Form,distribution,and function.Science.2016；352:1408-1412.)。
目前，m6A甲基化修饰在RA等风湿病中的研究报道甚少，其机制更是不明确。在RNAm6A甲基化修饰过程中，目前已知的总共有三种甲基转移酶复合物中具有酶活功能的组分METTL3、METTL14、WTAP，其中METTL3是其中最为重要的一种RNA甲基转移酶。人的METTL3基因位于14q11.2，有9个外显子(Liu J et al.A METTL3-METTL14 complex mediatesmammalian nuclear RNA N6-adenosine methylation.Nat Chem Biol 2014；10:93-95)。研究发现，METTL3可以通过调控某些关键分子的翻译和表达、影响免疫炎症细胞的增殖、分化及其功能的发挥(Geula S,et al.Stem cells.m6A mRNA methylation facilitatesresolution of
Figure BDA0001931712620000031
pluripotency toward differentiation.Science 2015；347:1002-1006.)。然而METTL3介导的RNA m6A甲基化修饰过程具有一定的组织和细胞特异性，在不同的组织和细胞中其发挥的作用机制是不同的(Gilbert WV,et al.Messenger RNAmodifications:Form,distribution,and function.Science.2016；352:1408-1412；GeulaS,et al.Stem cells.m6A mRNA methylation facilitates resolution of
Figure BDA0001931712620000032
pluripotency toward differentiation.Science.2015；347:1002-1006；Yoon KJ,etal.Temporal Control of Mammalian Cortical Neurogenesis by mAMethylation.Cell.2017；171:877-889；Meyer KD.Rethinking mA Readers,Writers,andErasers.Annu Rev Cell Dev Biol.2017；33:319-342.)。目前，METTL3基因与类风湿关节炎检测、治疗中的应用尚未见报道。
发明内容
针对目前RA的治疗药物缺乏靶向性、针对性，长期服药副作用大的现状，本发明首先提供了一种METTL3基因在制备类风湿关节炎(RA)检测制剂、制备类风湿关节炎预后评估制剂中的应用。
其次，本发明提供了一对用于检测METTL3基因的引物对，该引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
第三，本发明提供了一种类风湿关节炎检测制剂，该试剂包括核苷酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对；进一步，该检测试剂包括：10ul 2×SYBR Premix ExTaq II、1.6ul 50×ROX Reference Dye、2ul cDNA(2.5ng/ul)、浓度为10umol/L的SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2各1ul,，ddH2O补足至20ul。
第四，本发明提供一种METTL3基因的检测方法，包括外周血单个核细胞提取、TRIzol法提取总RNA、RNA浓度和纯度的测定、cDNA合成及PCR扩增，其具体步骤如下：
1、样品外周血单个核细胞提取
采用Ficoll淋巴细胞分离液进行密度-梯度离心法PBMCs的分离。取4ml淋巴细胞分离液加入离心管中，吸取样品全血，沿管壁缓慢加于分离液上，二者比例为1：1，然后将离心管置于水平式离心机内，2000rpm离心30min。沿管壁周缘吸出富含单个核细胞的白膜层，移入另一离心管中，加入PBS洗涤，1500rpm离心10min；反复洗涤2次。弃去上清，加入1mlTrizol后，剧烈振荡，转移至1.5ml EP管中，置-80℃冰箱保存。(具体方法参见：Wang Y,etal.MiR-548a-3p regulates inflammatory response via TLR4/NF-κB signalingpathway in rheumatoid arthritis.J Cell Biochem.2018.)
2、TRIzol法提取总RNA
将细胞浓度调为1×107/个加入1ml TRIzol试剂，用1ml移液器反复轻吹至液体澄清而且无细胞团块状态(置于冰上融化)；加200ul体积的氯仿颠倒混匀，置于冰上5min；4℃12000rmp离心15min；转移上层水相于另一新的1.5ml EP管中，加等体积(1：1)异丙醇，混匀，4℃，12000rmp离心10min，弃上清；然后加入预冷的75％乙醇1ml，4℃，7500rmp离心5min，弃上清；将提取物溶于10ul DEPC水中，立即保存于-80℃超低温冰箱中备用(具体方法参见：Xu D,et al.IL-29 Enhances LPS/TLR4-Mediated Inflammation in RheumatoidArthritis.Cell Physiol Biochem.2015；37:27-34.)。
3、RNA浓度和纯度的测定
用移液器取RNA样品1μl至缓冲液中，测定其在260nm和280nm处吸光值；根据吸光值及稀释倍数测定RNA的浓度，以保证后续实验顺利进行。
具体测定方法参见文献：“徐栋花.乳酸杆菌对LPS诱导THP-1细胞炎症性细胞因子释放的调节作用及可能机制[D].南京医科大学,2011.”。
4、cDNA合成及PCR反应
严格按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)说明书进行,步骤如下：
(1)将步骤2获得的总RNA混匀，2000rpm离心20s；
(2)取经灭菌处理的PCR管进行逆转录反应合成cDNA:依次加入5×PrimeScriptBuffer(for Real Time)，PrimeScript RT Enzyme Mix I，Oligo dT Primer(50μM)，Random 6 mers(100μM)，总RNA 0.5ug，用DEPC水补至20ul；
(3)按照如下逆转录反应程序进行cDNA合成：37℃,15min(反转录反应)；85℃，5s(反转录酶失活反应)；将获得的cDNA置于-20℃环境中保存，备用；
(4)PCR扩增METTL3基因，PCR扩增体系：取经灭菌处理的PCR管，依次加入2×SYBRPremix Ex Taq II 10ul，50×ROX Reference Dye 1.6ul，cDNA(2.5ng/ul)2ul，10umol/LForward primer(SEQ ID NO.1)1ul,10umol/L Reverse primer(SEQ ID NO.2)1ul,ddH2O补足至20ul；混匀后离心20s，转速为2000rpm；
ABI Step one plus Real time-PCR system上进行PCR扩增反应，反应条件为：反应条件：95℃30秒，随后在95℃5秒和60℃30秒进行40个循环；
按照顺序，一个样本基因做3个复孔；
(5)以GAPDH为作为内参基因，荧光实验结果采用2-ΔΔCT的数据统计方法分析METTL3基因的相对表达。
第五，本发明还提供了一种METTL3基因在制备类风湿关节炎靶向治疗制剂中的应用，具体而言，即根据METTL3基因制备特异性过表达序列SEQ ID NO.3,用于在细胞中过表达METTL3基因。
第六，本发明提供了一种类风湿关节炎靶向治疗制剂，所述制剂包括特异性过表达序列Lv-METTL3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该特异性过表达序列Lv-METTL3是针对METTL3的全长序列设计并合成，其可用于感染巨噬细胞，使METTL3基因在细胞中过表达。具体病毒包装及细胞感染方法如下：(1)293T细胞铺板培养，密度调整至1×105/ml；(2)制备慢病毒包装转染体系转染液1、2及3：二者混匀后室温放置20～25min；将上述三种质粒磷酸钙混合转染液加入含293T细胞中，轻摇培养皿至转染液分布均匀，放入培养箱中培养；(3)6～8h后，弃去细胞上清，加入10ml新鲜培养液，继续培养；(4)24h后，在荧光显微镜下观察293T细胞的转染效率；(5)48h后，收集293T细胞上清液至15ml离心管中，并于4℃,1500rpm离心5min，弃掉细胞沉淀，0.45μm滤器过滤后转移至1.5ml离心管，-80℃冰箱冻存；(6)在六孔板中接种待感染重组慢病毒的巨噬细胞，密度为5～8×105/孔培养；(7)吸尽培养液，加入1mL重组慢病毒液，及8μLpolybrene(终浓度1μg/μL)，放入培养箱培养；(8)4h后半量换液；(9)24h后，全量换液；(10)48h后，在荧光显微镜下观察巨噬细胞的感染效率。
结果显示，该过表达序列能显著提高巨噬细胞中Lv-METTL3的表达水平，并且可导致巨噬细胞的增殖能力较之前明显减弱，LPS诱导的炎性细胞因子产生减少，NF-κB的磷酸化及核转位明显减少(图4与图5)。
本申请系统地探究RA中m6A甲基化修饰相关酶与调节基因的表达，实施例研究证实：与健康对照组相比，RA患者外周血单个核细胞中METTL3的表达明显增高，且与疾病活动性指标呈正相关关系。METTL3过表达载体显著抑制巨噬细胞的增殖及LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。本申请发现并验证了RA中的RNAm6A甲基化修饰关键酶METTL3的表达及功能。这一发现将有望进一步丰富和完善RA发病机制的研究，也为研发RA早期诊断、靶向治疗及预后评估的新型生物标志物带来希望。
附图说明
图1为RNA m6A甲基化相关基因在RA患者和健康对照组中的表达情况示意图。
图2为METTL3表达与RA患者的ESR和CRP之间关联性示意图。
图3为LPS诱导巨噬细胞炎症反应影响METTL3的表达与活性的示意图。
图4 METTL3过表达抑制巨噬细胞增殖及炎性细胞因子产生的示意图。
图5 METTL3过表达抑制NF-κB磷酸化及核转位的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明的相关原理及步骤，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解，在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常是按照常规条件或按照厂商所建议的条件进行实施检测。
实施例1
为了探究RA患者外周血单个核细胞中RNA m6A甲基化修饰相关关键酶及调节蛋白(METTL3、METTL4、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2)的表达情况。
申请人在项目通过伦理委员会审核之后，系统研究人RA新的诊断和治疗靶点，通过抽取RA患者的外周血，提取PBMCs，real-time PCR法检测METTL3、METTL4、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2基因的表达。
本实施例共收集RA活动期患者血液样本47例，对照组健康人血液样本30例，共77例样本(来源于47个患者具体信息见表1，样本特点见表2)
表1样本信息1
Figure BDA0001931712620000071
Figure BDA0001931712620000081
Figure BDA0001931712620000091
表2样本信息2
Figure BDA0001931712620000092
Figure BDA0001931712620000101
本实施例用real-time PCR技术检测了47例RA和30例健康对照外周血来源的单个核细胞，具体检测步骤如下：
1)外周血单个核细胞提取
采用Ficoll淋巴细胞分离液进行密度-梯度离心法PBMCs的分离。取4ml淋巴细胞分离液加入离心管中，吸取全血，沿管壁缓慢加于分离液上，二者比例为1：1，然后将离心管置于水平式离心机内，2000rpm离心30min。沿管壁周缘吸出富含单个核细胞的白膜层，移入另一离心管中，加入PBS洗涤，1500rpm离心10min；反复洗涤2次。弃去上清，加入1ml Trizol后，剧烈振荡，转移至1.5ml EP管中，置-80℃冰箱保存。(具体方法参见：WangY,et al.MiR-548a-3p regulates inflammatory response via TLR4/NF-κB signaling pathway inrheumatoid arthritis.J Cell Biochem.2018.)
2)TRIzol法提取总RNA
将细胞浓度调为1×107/个加入1ml TRIzol试剂，用1ml移液器反复轻吹至液体澄清而且无细胞团块状态(置于冰上融化)；加200ul体积的氯仿颠倒混匀，置于冰上5min；4℃12000rmp离心15min；转移上层水相于另一新的1.5ml EP管中，加等体积(1：1)异丙醇，混匀，4℃，12000rmp离心10min，弃上清；然后加入预冷的75％乙醇1ml，4℃，7500rmp离心5min，弃上清；将提取物溶于10ul DEPC水中，立即保存于-80℃超低温冰箱中备用(具体方法参见：Xu D,et al.IL-29Enhances LPS/TLR4-Mediated Inflammation in RheumatoidArthritis.Cell Physiol Biochem.2015；37:27-34.)。
3)RNA浓度和纯度的测定
用移液器取RNA样品1μl至缓冲液中，测定其在260nm和280nm处吸光值；根据吸光值及稀释倍数测定RNA的浓度(具体方法参见：徐栋花.乳酸杆菌对LPS诱导THP-1细胞炎症性细胞因子释放的调节作用及可能机制[D].南京医科大学,2011.)。
4)cDNA合成及PCR反应
严格按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)说明书进行。(1)将提取的总RNA混匀，2000rpm离心20s；(2)取经灭菌处理的PCR管，按照表1依次加入5×PrimeScript Buffer(for Real Time)，PrimeScript RT Enzyme Mix I，Oligo dT Primer(50μM)，Random 6mers(100μM)，Total RNA(0.5ug)，用DEPC水补至20ul；(3)混匀，短暂离心20s，转速为2000rpm/min；(4)按照表2cDNA扩增反应条件进行扩增，获得的cDNA冻存在-20℃备用；(5)按照表3依次加入2×SYBR Premix Ex Taq II 10ul，50×ROX Reference Dye1.6ul，cDNA(5ng)2ul，10umol/L Forward primer(SEQ ID NO.1)1ul,10umol/L Reverseprimer(SEQ ID NO.2)1ul,ddH2O补足至20ul；(6)按照顺序，一个样本基因做3个复孔；(7)混匀，短暂离心20s，转速为2000rpm；(8)按照如下反应条件在ABI Step one plus Realtime-PCR system上进行PCR扩增反应，反应条件为：反应条件：95℃30秒，随后在95℃5秒和60℃30秒进行40个循环。(9)以GAPDH为作为内参基因，荧光实验结果采用2-ΔΔCT的数据统计方法分析基因的相对表达。
反应体系及扩增条件见表1、2、3。
表1 cDNA扩增反应体系
Figure BDA0001931712620000111
表2 cDNA扩增反应条件
Figure BDA0001931712620000112
表3 Real-time PCR反应体系
Figure BDA0001931712620000113
Figure BDA0001931712620000121
反应条件如下：95℃30秒，随后在95℃5秒和60℃30秒进行40个循环。
实验结果如图1所示，图1中，A-F分别METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2real-time PCR检测结果示意图，结果发现，与健康对照组相比，RA患者中METTL3的mRNA表达显著上调(P<0.001)，其它基因的mRNA表达没有明显统计学差异。
皮尔森相关分析显示，METTL3的mRNA表达水平与RA患者的疾病活动性指标ESR、CRP的水平呈正相关，结果如图2。
实施例2 METTL3过表达序列及其应用
本实施例针对METTL3的全长序列设计并合成其特异性过表达序列Lv-METTL3(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，感染巨噬细胞，使METTL3基因在细胞中过表达，并进一步将该过表达基因载体应用于调控巨噬细胞的增殖及炎症反应(图3、4与5)。
具体病毒包装及细胞感染方法如下：(1)293T细胞(上海中科院细胞库购买)铺板培养，密度调整至1×105/ml；(2)制备慢病毒包装转染体系质粒磷酸钙混合转染液，室温放置20～25min；将上述三种质粒磷酸钙混合转染液加入含293T细胞中，轻摇培养皿至转染液分布均匀，放入培养箱中培养；(3)6～8h后，弃去细胞上清，加入10ml新鲜RPMI1640培养液，继续培养；(4)24h后，在荧光显微镜下观察293T细胞的转染效率；(5)48h后，收集293T细胞上清液至15ml离心管中，并于4℃,1500rpm离心5min，弃掉细胞沉淀，0.45μm滤器过滤后转移至1.5ml离心管，-80℃冰箱冻存，即获得重组慢病毒液；(6)在六孔板中接种待感染重组慢病毒的pTHP-1巨噬细胞(上海中科院细胞库购买)，密度为5～8×105/孔培养；(7)吸尽培养液，加入1mL重组慢病毒液，及8μL polybrene(终浓度1μg/μL)，放入培养箱培养；(8)4h后半量换液；(9)24h后，全量换液；(10)48h后，在荧光显微镜下观察巨噬细胞的感染效率。如此便获得METTL3过表达的pTHP-1巨噬细胞株(具体操作方法参见：徐栋花.PTPRO对LPS/TLR4介导的肝损伤的调控作用[D].南京医科大学,2015.)。
如图3所示，pTHP-1在无血清培养基中培养过夜后，加入1ug/ml LPS分别刺激6、12、24小时后，用real-time PCR及蛋白免疫印迹技术检测METTL3 mRNA和蛋白的表达水平，结果如图3A及3B所示，发现，LPS刺激能够提高METTL3的mRNA及蛋白表达；
用m6A甲基化试剂盒检测巨噬细胞的总甲基化水平，结果如图3C所示，发现，LPS能够促进巨噬细胞总体甲基化率，即增强METTL3的活性。
LPS刺激巨噬细胞后，分别在刺激后的12、24、48小时后用CCK-8来检测巨噬细胞的增殖情况，结果如图4A所示；图4A中，与METTL3-control对照组相比，METTLE过表达的METTL3-overpressed组中，巨噬细胞的增殖被明显抑制。如图4B和4C所示，与METTL3-control对照组相比，LPS刺激能够促进炎性细胞因子IL-6和TNF-α在细胞内的mRNA和蛋白质水平表达，但是，与METTL3-control-LPS刺激组相比，METTL3-overpresse-LPS组中METTL3过表达后能够显著抑制炎性细胞因子IL-6和TNF-α在细胞内的mRNA和蛋白质水平表达。依赖NF-κB信号通路来抑制pTHP-1巨噬细胞的炎性反应。
在经LPS刺激4小时后，与METTL3-control对照组相比，巨噬细胞中NF-κB的发生明显的磷酸化(图5A)及核转位(图5B)，但是，如图5A所示，与METTL3-control-LPS刺激组相比，METTL3-overpresse-LPS组中METTL3过度表达的巨噬细胞NF-κB磷酸化被明显抑制，而且，在巨噬细胞内，NF-κB的核转位效应也受到了明显的抑制，结果如图5B所示。
由此可见，METTL3对于LPS介导的巨噬细胞炎症反应的抑制作用主要是通过NF-κB信号通路来实现的，METTL3能够抑制pTHP-1巨噬细胞的增殖和活化。
序列表
<110> 王增艳
<120> METTL3基因的应用及其检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaatccaga ggcagcattg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagcatcagt gggcaatgtt 20
<210> 3
<211> 1979
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attttccggt tagccttcgg ggtgtccgcg tgagaattgg ctatatcctg gagcgagtgc 60
tgggaggtgc tagtccgccg cgccttattc gagaggtgtc agggctggga gactaggatg 120
tcggacacgt ggagctctat ccaggcccac aagaagcagc tggactctct gcgggagagc 180
tgcagcggag gcggaagcag gactcggggc acttggatct acggaatcca gaggcagcat 240
tgtctccaac cttccgtagt gacagcccag tgcctactgc acccacctct ggtggcccta 300
agcccagcac agcttcagca gttcctgaat tagctacaga tcctgagtta gagaagaagt 360
tgctacacca cctctctgat ctggccttaa cattgcccac tgatgctgtg tccatctgtc 420
ttgccatctc cacgccagat gctcctgcca ctcaagatgg ggtagaaagc ctcctgcaga 480
agtttgcagc tcaggagttg attgaggtaa agcgaggtct cctacaagat gatgcacatc 540
ctactcttgt aacctatgct gaccattcca agctctctgc catgatgggt gctgtggcag 600
aaaagaaggg ccctggggag gtagcaggga ctgtcacagg gcagaagcgg cgtgcagaac 660
aggactcgac tacagtagct gcctttgcca gttcgttagt ctctggtctg aactcttcag 720
catcggaacc agcaaaggag ccagccaaga aatcaaggaa acatgctgcc tcagatgttg 780
atctggagat agagagcctt ctgaaccaac agtccactaa ggaacaacag agcaagaagg 840
tcagtcagga gatcctagag ctattaaata ctacaacagc caaggaacaa tccattgttg 900
aaaaatttcg ctctcgaggt cgggcccaag tgcaagaatt ctgtgactat ggaaccaagg 960
aggagtgcat gaaagccagt gatgctgatc gaccctgtcg caagctgcac ttcagacgaa 1020
ttatcaataa acacactgat gagtctttag gtgactgctc tttccttaat acatgtttcc 1080
acatggatac ctgcaagtat gttcactatg aaattgatgc ttgcatggat tctgaggccc 1140
ctggcagcaa agaccacacg ccaagccagg agcttgctct tacacagagt gtcggaggtg 1200
attccagtgc agaccgactc ttcccacctc agtggatctg ttgtgatatc cgctacctgg 1260
acgtcagtat cttgggcaag tttgcagttg tgatggctga cccaccctgg gatattcaca 1320
tggaactgcc ctatgggacc ctgacagatg atgagatgcg caggctcaac atacccgtac 1380
tacaggatga tggctttctc ttcctctggg tcacaggcag ggccatggag ttggggagag 1440
aatgtctaaa cctctggggg tatgaacggg tagatgaaat tatttgggtg aagacaaatc 1500
aactgcaacg catcattcgg acaggccgta caggtcactg gttgaaccat gggaaggaac 1560
actgcttggt tggtgtcaaa ggaaatcccc aaggcttcaa ccagggtctg gattgtgatg 1620
tgatcgtagc tgaggttcgt tccaccagtc ataaaccaga tgaaatctat ggcatgattg 1680
aaagactatc tcctggcact cgcaagattg agttatttgg acgaccacac aatgtgcaac 1740
ccaactggat cacccttgga aaccaactgg atgggatcca cctactagac ccagatgtgg 1800
ttgcacggtt caagcaaagg tacccagatg gtatcatctc taaacctaag aatttataga 1860
agcacttcct tacagagcta agaatccata gccatggctc tgtaagctaa acctgaagag 1920
tgatatttgt acaatagctt tcttctttat ttaaataaac atttgtattg tagttggga 1979

Claims (2)

1.一种检测METTL3基因表达量的制剂在制备类风湿关节炎检测制剂中的应用，其特征在于，所述检测METTL3基因表达量的制剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO .2所示的引物对。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测METTL3基因表达量的制剂进一步包括：10μl 2×SYBR Premix Ex Taq II、1.6μl 50 X ROX Reference Dye、浓度为2.5ng/μl的cDNA 2ul、浓度均为10umol/L的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO .2各1μl，ddH2O补足至20μl。
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