CN112680512B - 一种环状RNA生物标志物circ-Glis3的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种环状RNA生物标志物circ‑Glis3的应用，具体包括：2型糖尿病的诊断引物及其用途，基于该诊断引物的诊断试剂盒及其用途，生物标志物circ‑Glis3的检测方法，生物标志物circ‑Glis3的用途。本发明可利用诊断引物/诊断试剂盒，通过检测环状RNA分子标志物circ‑Glis3来诊断2型糖尿病，检测方法操作简单，且灵敏度高，特异性强，对受检者的创伤性小，可用于早期和不同阶段2型糖尿病的诊断，具有明显的临床应用价值。

Description

一种环状RNA生物标志物circ-Glis3的应用

技术领域

本发明涉及一种环状RNA生物标志物circ-Glis3的应用，具体为circ-Glis3 在诊断早期2型糖尿病中的应用，属于细胞生物学和生物医学技术领域。

背景技术

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类广泛存在于生物体内，不具有3’端poly(A)和5’端帽子结构的、以共价键首尾相连的单链内源闭合环状RNA^[1]。circRNA主要是由pre-mRNA经可变剪切加工产生，实验研究表示可变剪接事件的发生表现出组织和发育阶段特异的表达模式^[2]。成熟的circRNA可以通过调控亲本基因的表达、结合并沉默miRNA和RNA结合蛋白、编码蛋白质和多肽，进而影响相关的生理功能和作用机制^[3-5]。由于circRNA的结构特点， circRNA不易被Rnase R降解，比mRNA和lncRNA具有更高的保守性和稳定性，容易在各种组织、血清和尿液中进行检测^[1,6]。而随着对circRNA研究的不断深入，人们发现其在糖尿病、高血压、肥胖症等代谢病的发生、发展中起着重要的作用。

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种常见的内分泌代谢紊乱性疾病，其特点是由于胰岛素分泌作用缺陷和(或)外周胰岛素抵抗而导致的慢性高血糖。胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病(type 2diabetes，T2DM)发病的重要机制之一^[7-9]。正常状态下，机体内胰岛β细胞处于增殖、分化以及凋亡的动态平衡^[10-11]。当营养物质摄入过剩，以及机体肥胖加重，胰岛β细胞的代偿机制不足以抵抗代谢压力，糖脂的利用平衡被打破，代谢灵活性失衡，表现为基础胰岛素水平增加，而细胞针对葡萄糖刺激而产生胰岛素的敏感性却下降，进而导致胰岛素分泌不足，逐渐步入失代偿阶段^[12-13]。而胰岛β细胞由胰岛素分泌代偿到失代偿的转变，则会加速肥胖到2型糖尿病的病程。大量的研究已经证明胰岛β细胞功能“代偿-失代偿”变化决定着糖尿病的发生发展。

在糖尿病患者及糖尿病并发症患者的相关研究中发现，circRNA能够响应血糖血脂变化及糖尿病并发症的发生发展^[14]。微阵列技术分析对比健康人群和2型糖尿病患者外周血中的circRNA水平，发现有489个circRNA的表达存在差异，尤其以hsa_circ_0054633上调最显著，并且具有作为前驱糖尿病和 2型糖尿病的诊断生物标志物的潜力^[15]。在健康人群和肥胖人群脂肪组织差异性表达的circRNA研究中发现，circARF3能够内源性吸附miR-103，促进线粒体吞噬减轻脂肪炎症^[16]。circHIPK3、circ_0005015则在并发症视网膜病变患者中显著上调，敲降后能够降低视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和血管的生成，减轻视网膜病变^[17-18]。此外，大量研究证明circRNA是参与调节β细胞生命活动的新调控因子；过表达CDR1as可通过吸附miR-7，促进Pax6 和Myrip的表达，刺激胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌^[19-20]。以上研究提示， circRNA在响应血糖血脂变化在维持胰岛细胞功能稳态发挥着重要作用，有可能通过circRNA表达水平反应出胰岛β细胞发生“代偿-失代偿”的变化，从而成为2型糖尿病早期诊断的生物标志物。

发明人课题组长年致力于糖尿病相关非编码RNA的研究，于2018.04.08 申请发明专利《胰岛长链非编码RNA 1810019D21Rik及其应用》，于2019.04.02 申请发明专利《一种2型糖尿病的诊断引物及试剂盒、以及非编码RNA分子标志物的应用》，并于2020.12.21申请发明专利《一种非编码RNA生物标志物lnc-βFaar的应用》。发明人课题组以最新获得的研究成果申请本专利。

发明内容

本发明的主要目的是：针对现有技术存在的问题，基于发明人课题组的研究成果，提出一种环状RNA生物标志物circ-Glis3的应用，具体包括：2 型糖尿病的诊断引物及其用途，基于该诊断引物的诊断试剂盒及其用途，生物标志物circ-Glis3的检测方法，生物标志物circ-Glis3的用途。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种2型糖尿病的诊断引物，其特征是，包括circ-Glis3发散引物对；所述circ-Glis3发散引物对由正向引物SEQ ID NO:2以及反向引物SEQ ID NO:3 构成。

该circ-Glis3发散引物对可用以检测环状RNA分子标志物circ-Glis3的表达水平，从而为诊断早期2型糖尿病提供依据。

优选地，所述诊断引物还包括：circ-Glis3收敛引物对；所述circ-Glis3收敛引物对由正向引物SEQ ID NO:4以及反向引物SEQ ID NO:5构成。

该circ-Glis3收敛引物对与circ-Glis3发散引物对两相结合，可以更好地鉴定环状RNA生物标志物circ-Glis3。

本发明还提出：

一种2型糖尿病的诊断试剂盒，其特征是，包括前文所述的诊断引物。

优选地，所述诊断试剂盒还包括：作为阳性对照的环状RNA分子标志物，所述环状RNA分子标志物为序列如SEQ ID NO:1所示的circ-Glis3。

采用该试剂盒，可通过检测circ-Glis3的表达水平为2型糖尿病的早期诊断提供依据。

本发明还提出：

一种环状RNA分子标志物的检测方法，其特征是，采用前文所述的诊断引物，或采用前文所述的诊断试剂盒；所述环状RNA分子标志物为序列如 SEQ ID NO:1所示的circ-Glis3。

优选地，所述检测方法包括以下步骤：

S1.提取血清样本总RNA；

S2.采用S1提取到的总RNA，经逆转录获得cDNA；

S3.采用诊断引物，以实时荧光定量PCR法检测S2所得cDNA中circ-Glis3 的表达量；所述实时荧光定量PCR法采用染料法。

本发明还提出：

前文所述诊断引物的用途，其特征是，所述用途为用于制备预防或治疗2 型糖尿病的药物，或者为用于筛选预防或治疗2型糖尿病的药物，或者为用于制备或筛选诊断2型糖尿病的产品。

前文所述诊断试剂盒的用途，其特征是，所述用途为用于制备预防或治疗2型糖尿病的药物，或者为用于筛选预防或治疗2型糖尿病的药物，或者为用于制备诊断2型糖尿病的医疗工具。

一种环状RNA分子标志物的用途，其特征是，所述环状RNA分子标志物为序列如SEQID NO:1所示的circ-Glis3；所述用途为用于制备预防或治疗 2型糖尿病的药物，或者为用于筛选预防或治疗2型糖尿病的药物，或者为用于制备或筛选诊断2型糖尿病的产品，或者为用于制备诊断2型糖尿病的检测标志物；所述产品包括前文所述诊断引物、或前文所述诊断试剂盒。

优选地，所述药物为原料药、药物制剂；所述产品为制剂、芯片、试剂、试剂盒；所述诊断2型糖尿病包括2型糖尿病的早期诊断；所述药物的作用包括调节胰岛素分泌、调节胰岛β细胞凋亡。

发明人经调研发现，血液中存在着上万种非编码RNA(含环状RNA)，具有丰度高、性质稳定、便于检测、且与特异性疾病存在着显著关联性等特点。血液中的非编码RNA由组织分泌，因此，血液中的非编码RNA的含量应能间接反映组织中的表达水平；在此基础上，通过无创性或低创性抽取血样的手段，以快速、灵敏、特异性的定量检测方法，筛选2型糖尿病患者血液中特异性表达或异常表达的非编码RNA作为分子标志物，有望作为糖尿病早期的辅助诊断技术手段，为糖尿病的早发现、早诊断做出重要的社会贡献。

发明人在实践研究中，首先通过高通量测序研究不同模型小鼠(C57BL/6J 和HFD)胰岛组织中差异表达的circRNA，结果显示mmu_circ_0000943(命名为circ-Glis3)在肥胖小鼠胰岛组织显著高表达；该circ-Glis3可以改善胰岛β细胞功能；之后，经大样本qRT-PCR检测2型糖尿病患者与正常人的血清样本，最终发现circ-Glis3在2型糖尿病患者血清样本中表达水平随血糖水平升高而升高，表明circ-Glis3参与2型糖尿病的发生、发展，为临床检测诊断及治疗2型糖尿病提供新的生物靶标。在此基础上，发明人最终得出了前文所述的检测方法、诊断引物、诊断试剂盒以及相关的用途。

与现有技术相比，本发明可利用诊断引物/诊断试剂盒，通过检测环状 RNA分子标志物circ-Glis3来诊断早期2型糖尿病，检测方法操作简单，且灵敏度高，特异性强，对受检者的创伤性小，可用于早期和不同阶段2型糖尿病的诊断，具有明显的临床应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中差异表达circRNA的聚类分析结果图。

图2为本发明实施例1中circ-Glis3在不同血糖小鼠胰岛组织中的表达水平验证结果图，其中A图为不同血糖条件下circ-Glis3的相对表达水平结果图； B图为不同血糖条件下circ-Glis3的表达丰度结果图。

图3为本发明实施例1中circ-Glis3来源于亲本基因Glis3第三外显子的剪接模式图。

图4为本发明实施例1中序列保守性分析结果图。

图5为本发明实施例1中circ-Glis3环化结构鉴定结果图，其中A图为发散引物和收敛引物分别以cDNA和gDNA为模板进行PCR后的琼脂糖电泳结果图；B图为用Rnase R酶解处理总RNA样本后，circ-Glis3和内参Actin的表达水平变化图。

图6为本发明实施例2中circ-Glis3在MIN6细胞系及胰岛原代细胞内的转染效率验证结果图。

图7为本发明实施例2中circ-Glis3过表达或敲除48小时后，流式细胞术检测细胞凋亡率的结果图。

图8为本发明实施例2中circ-Glis3过表达或敲除48小时后，ELISA检测胰岛素分泌结果图。

图9为本发明实施例3中qRT-PCR检测糖尿病患者及正常人血清样本中 circ-Glis3的表达差异结果图。

具体实施方式

下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

实施例1

本实施例为小鼠实验研究。

一、主要实验材料

小鼠：高脂饮食喂养16周的C57BL/6J小鼠(HFD组)、同龄正常饮食喂养的C57BL/6J小鼠(NCD组)，每组小鼠数量为12只。

主要试剂：HΒSS(10X)(Invitrogen公司)，胶原酶Ⅴ(sigma公司)，Trizol 裂解液(Invitrogen公司)，Rneasy plus universal mini kit(qiagen)，Rnase R (epicentre公司)。

二、实验方法

2.1、不同模型小鼠胰岛组织的提取。

脱颈椎处死小鼠，置于体视显微镜下，用胶带固定，于剑突下作横向切口，开口尽量大，暴露肝脏、胃、十二指肠和脾脏。镊子夹起十二指肠，向下翻转，暴露出十二指肠大乳头(白色凸起)和胆囊。夹起脾脏使胰尾充分暴露以免受到压迫影响灌注。从胆囊向下找到胆管、肝管和胰管交汇的Y型三角区。在Y型区靠近胰腺部位结扎一次，并在结扎处上方2mm处再次结扎防止灌注时漏液。在十二指肠大乳头处结扎胰总管，先不扎紧，留出进针的空间。用2.5mL注射器吸取2mL配好的胶原酶V，从十二指肠肠管进针，再从肠内壁刺入十二指肠大乳头，并轻轻插入胰总管约0.8-1cm，保持针头平直，扎紧胰总管的结扎线，将针头连同胰管一同扎紧，防止倒流。一人轻推注射器活塞将胶原酶注入胰腺导管，另一人双手拉紧进针处的结扎线防止液体倒流。此时胰腺应逐渐膨胀，胰尾开始充盈。注射完毕后，从胰尾开始轻轻分离胰腺包膜。将与胃体、十二指肠、小肠各部位相连的胰腺轻轻分离，置入3mL胶原酶V溶液中(用50mL离心管作容器)。于37℃，60rpm消化 28min，至均匀细沙状(颗粒小于1立方毫米)终止消化。加入5mL含10％胎牛血清Hanks液终止消化。倒入10cm皿中，在倒置显微镜下手工挑取胰岛，置入Hanks液中，以10mL管作容器。用Hanks液离心洗涤2遍，1000rpm， 4℃，2min，取沉淀。沉淀重悬于4mL 25％Ficoll中(以10mL管作容器)，在其上沿管壁缓慢、均匀加入23％、21％、11％Ficoll溶液，各2mL。此时各浓度间应有明显分界面。用4℃离心机800g离心20min。吸出Ficoll溶液，胰岛主要集中于11％和21％浓度的Ficoll中，23％Ficoll中也有少量较大的胰岛。用Hanks液洗涤2遍，用适量Hanks液重悬胰岛后再次倒入10cm皿中进行精细的挑取并置入适当容器中，此时即可得到较纯净的胰岛。

2.2、胰岛组织RNA提取。

不同小鼠胰岛组织按照Rneasy plus universal mini kit(qiagen)试剂盒的要求提取：

(1)样本中加入900μL aiazol lysis reagent，室温静置5min，加入100μl gDNAEliminator solution剧烈混匀15s。

(2)加入180μL三氯甲烷，剧烈涡旋混匀15s，室温静置2-3min。

(3)4℃12000g离心15min，吸上清。

(4)加入1倍体积(上清体积)的70％乙醇，充分混匀。

(5)分次将液体加入mini spin colum收集管，每次最大体积为700μL， 8000g室温离心1min。

(6)在吸附柱内加入700μL Buffer RWT，8000g室温离心1min。

(7)加入500μL Buffer rpe到吸附柱内，8000g室温离心1min，重复一次。

(8)将吸附柱放入一个新的收集管，加入30μL无RNA酶的水洗脱，即得总RNA提取物。

2.3、总RNA经Rnase R酶解消化。

(1)每个RNA样品各取2μg配制Rnase R酶解体系。

(2)RNase R处理(按20μL体系)：RNase R 4U/μg，Buffer(10x)1.6 μL，RNA 2μg，补齐无酶水至16μL，混匀后37℃孵育15min除去线性RNA， 70℃孵育2min灭活。

2.4、逆转录获得cDNA。

(1)在不同离心管中分别加入下列试剂盒中的试剂，分别进行逆转录。

表1.1、circRNA逆转录体系

表1.2、mRNA逆转录体系

(2)在冰上混合好上述试剂后，按照顺序进行标准逆转录程序：

25℃30min，42℃30min，85℃5min。完成后4℃备用。

2.5、circ-Glis3环化结构鉴定。

(1)按照以下表格配制PCR反应体系：

表1.3、PCR反应体系

(2)琼脂糖核酸电泳：配制1％琼脂糖凝胶，即称取0.4g琼脂糖加入40 mL 1×TAE，加热溶解后，加入4μL核酸染料，待凝固后以120V电压进行电泳25分钟。

注：此处以circ-Glis3的发散引物和收敛引物相结合，即可鉴定circ-Glis3 环化结构。

2.6、染料法检测非编码RNA分子标志物的含量。

(1)按照以下表格配制qRT-PCR反应体系：

表1.4、qRT-PCR反应体系

(2)上述试剂混合完毕后，于Roche480II型qRT-PCR仪上执行qRT-PCR 反应：预变性为95℃3min，变性为95℃12s，退火为60℃40s。退火时采集荧光信号。变性和退火两步进行35次循环。

注：此处的circRNA发散引物和内参引物分别对应Rnase R酶解消化后的逆转录产物和未酶解处理的逆转录产物作为模板，以实现circRNA的相对定量。circRNA发散引物用于circ-Glis3剪接位点PCR鉴定及表达水平qPCR检测，内参引物用于qPCR实验检测内参基因Actin的表达水平。

三、实验结果与讨论

3.1、筛选差异表达的circRNA。

通过RNA-seq测序分析C57BL/6J小鼠(NCD组)、模型小鼠(HFD组) 胰岛组织中差异表达的circRNA，筛选出包括circ-Glis3在内的表达变化最大的100个circRNA，结果显示，mmu_circ_0000943(命名为circ-Glis3)在HFD 组小鼠胰岛组织显著高表达(如图1所示)。

具体而言，图1的A图结果显示，与NCD组相比，circ-Glis3随血糖升高而升高，但当血糖高于15.0mmol/L后，circ-Glis3表达量下降；图1的B 图结果显示，当血糖水平不高于12.0mmol/L时，circ-Glis3表达丰度随血糖升高而升高，并且存在线性正相关关系。

3.2、不同小鼠体重胰岛组织中circ-Glis3表达趋势验证。

通过分离NCD组小鼠及不同血糖的HFD小鼠胰岛细胞，提取RNA并进行RT-qPCR验证，发现在血糖升高的前期阶段，circ-Glis3的表达含量随血糖的增加而增加(如图2所示)。

3.3、讨论。

circ-Glis3来源于亲本基因Glis3第三外显子(exon 3)，全长共1114bp。人源的circ-Glis3和小鼠源circ-Glis3同源性高达80.83％(如图4所示)。

注：图3为使用circ-Glis3剪接来源模式图，表示circ-Glis3来源于亲本基因Glis3的第三外显子剪接环化，测序结果同时证明该剪接位点与数据库中的信息符合；图4为DNAman分析小鼠源circ-Glis3与人源circ-Glis3的序列保守性；图5为circ-Glis3剪切位点及环状结构鉴定结果，A图为circ-Glis3 发散引物和收敛引物分别以cDNA和gDNA为模板进行PCR后的琼脂糖电泳结果图；B图为用Rnase R酶解处理总RNA样本后，circ-Glis3和内参Actin 的表达水平变化，结果显示被Rnase R酶处理后，内参Actin表达含量显著下降，而circ-Glis3表达量无显著变化，二者共同说明研究对象circ-Glis3环化结构成立且剪接位点序列信息与数据库中来源一致。

以上述事实为基础，发明人认为后续有必要继续研究人源circ-Glis3在2 型糖尿病患者、正常人血清样本中是否有表达差异。

实施例2

本实施例为MIN6细胞以及胰岛原代细胞实验研究。

一、利用Lipofectamine 2000在胰岛β细胞系MIN6细胞以及胰岛原代细胞转染circ-Glis3过表达载体或circ-Glis3的敲除载体。

具体操作如下：

(1)将2μg的circ-Glis3过表达载体、2μg的过表达对照质粒pEX3-control、 2μlcirc-Glis3-siRNA、2μl si-NC与50μL高糖DMEM双无培养基孵育5min (a)；同时将2μL/孔的Lipofectamine 2000与50μL双无DMEM培养基孵育 5min(b)；

(2)5min后将(a)和(b)孵育液混匀，继续孵育20min；

(3)20min后，将100μL孵育液加入至MIN6细胞以及胰岛原代细胞，在37℃,5％CO₂条件下培养4h；

(4)4h后换成高糖DMEM完全培养基(15％FBS，50μM β-mercaptoethanol，1％双抗)继续培养48h；

(5)转染48h后收集细胞，按照实施例1的2.2和2.3操作，提取细胞总RNA和circRNA；

(6)按照实施例1的2.4和2.5进行操作，通过qRT-PCR检测circ-Glis3 的转染效率，结果显示过表达circ-Glis3时，其表达水平升高约40倍，而敲除circ-Glis3时，敲除效率约为80％(如图6所示)。

二、流式细胞检测circ-Glis3对β细胞凋亡的影响。

具体实施方法如下：

(1)采用MIN6细胞分别转染pEX3-control、circ-Glis3、circ-Glis3-siRNA、 si-NC后，同时加入1μM吉西他滨(Gemcitabine)，诱导48h，用无EDTA的胰酶消化细胞，获得单细胞悬液，向各组样本中加入5μL Annexin V和5μL FITC染液；

(2)室温避光孵育15min，用0.1M PBS洗涤两次，最后加入300μL PBS 重悬细胞，通过流式细胞仪选择FITC和PI检测细胞的凋亡情况。

结果显示，当过表达circ-Glis3时β细胞凋亡率下降，而敲除circ-Glis3 后，β细胞凋亡率升高，说明circ-Glis3抑制β细胞凋亡(如图7所示)。

三、已葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(GSIS)检测circ-Glis3对胰岛素分泌的影响。

具体实施方法如下：

(1)体外分离胰岛后(30个胰岛/96孔板)，于含有10％血清的1640培养基内培养12h；

(2)MIN6细胞(20-30代)接种于48孔板(1x10⁶)，在含有15％血清， 1％双抗，50μMβ-巯基乙醇的高糖DMEM培养基培养24h；

(3)利用脂质体转染法将circ-Glis3过表达载体和si-circ-Glis3转染MIN6 细胞或胰岛原代细胞，转染48h后弃完全培养基，用300μL洗涤液(2％血清，2.5mM葡萄糖的KRBH缓冲液)洗涤3次，弃洗涤液，将胰岛在200μL 饥饿液中孵育12h(10％血清，2.5mM葡萄糖的KREB缓冲液)；

(4)饥饿12h后用洗涤液洗涤3次，分别用200μL 2.5mM葡萄糖，33.3 mM葡萄糖诱导2h；

(5)取细胞上清于12000rpm离心5min，用小鼠胰岛素ELISA试剂盒检测胰岛素的分泌，同时用胰酶将细胞全部消化，然后用BCA试剂盒定量总蛋白含量，将ELISA试剂盒检测获得的胰岛素含量除以细胞总蛋白量得到每微克总蛋白分泌胰岛素的能力。

结果显示，当过表达circ-Glis3时胰岛素分泌显著升高，而敲除circ-Glis3 后，胰岛素分泌降低，说明circ-Glis3促进胰岛素分泌(如图8所示)。

实施例3

本实施例为人血清样本实验研究。

采用本发明的诊断引物、诊断试剂盒、以及检测方法。

各具体序列如下所示：

SEQ ID No:1：

gtccgttattttgcaagagtctctggtgtccacgactttgagtctgacagagagtcaatcagccttgagtgtgaag caagagtggtctcagagctacagggctttcccttcactttcatccagccacagttcccagaatggcacggacctagggg accttcttagcttgcctccaggcacgccagtgtctggcaacagcgtctccaactcgttgccaccctaccttttcggcatg gaaaatagccactctccttaccctagccctcggcactcagcaaccagggcccactccacccgctctaagaagagagc attgtccttgtcgccactgtcagatggcatcgggatcgacttcaacactatcatccgtacttcacccacatccttggtcgc ctacatcaacggaccaagagcctccccagccaacctgtccccacagtcagaggtctatgggcatttcctgggtgttcgt ggcagctgcatcccccagtcttgtgcagtggccagcgggcagaaaggcatattggttgccagtggagggcatacgct gccgggctatggagaggacggtacactggagtatgaacgcatgcagcagcttgagcatggtggcctgcaacccgga cctgtaaacaacatggtgttgcagcctggcctaccgggccaggatggccagacagccaacatgctcaaaacagagc gcctggaggagttccccgccagtgccttggacctgccctctgctctgcctctccctcttcctccgcctcagggtccccca cccccataccatgcccatccacaccttcatcacccagagctcctgcctcacacccaatcgctgtccctggcccagactg gcctggaagaggatggggagatggaagactcaggggggaagcactgctgccgttggatagactgcagtgccctttat gaccagcaggaggaactggtgaggcacatcgagaaggtccacatagaccaacgcaagggggaagacttcacgtgc ttctggactggctgccctagaagatacaagcctttcaacgcacggtataaactgctgatccacatgagggtccactctg gggagaagcccaacaagtgtacg。

SEQ ID No:2：agtgtacggtccgttattttgcaag。

SEQ ID No:3：gaaagccctgtagctctgagaccac。

SEQ ID No:4：gtccgttattttgcaagagtctc。

SEQ ID No:5：cgtacacttgttgggcttctcc。

采用大量的2型糖尿病患者群及正常人群血清样本及样本临床信息，来自各医院且符合相关规定。

具体实验过程：

1、按如下过程进行血清样本总RNA提取。

血清样本总RNA按照miRNeasy Serum/Plasma kit(Qiagen)试剂盒的要求提取：

(1)200μL血清样本中加入1000μL qiazol lysis reagent，室温静置5min，加入Eliminator solution并剧烈混匀15s。

(2)加入200μL三氯甲烷，剧烈涡旋混匀15s，室温静置2-3min。

(3)4℃12000g离心15min，吸上清。

(4)加入900μL的100％乙醇，充分混匀。

(5)分次将液体加入mini spin colum收集管，每次最大体积为700μL， 8000g室温离心1min。

(6)在吸附柱内加入700μL Buffer RWT，8000g室温离心1min。

(7)加入500μL Buffer rpe到吸附柱内，8000g室温离心1min，重复一次。

(8)将吸附柱放入一个新的收集管，加入10μL无RNA酶的水洗脱，即得总RNA提取物。

2、后续处理如下：

按照实施例1的2.3，2.4和2.6进行操作(其中，采用的引物为circ-Glis3 发散引物对，即SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)，最终通过qRT-PCR检测 circ-Glis3的表达差异，结果显示，与正常人血清样本相比，circ-Glis3在糖尿病患者人群血清样本中显著升高(如图9所示)。

此外，若需鉴定circ-Glis3环化结构，则采用circ-Glis3发散引物对(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)以及circ-Glis3收敛引物对(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)，按照实施例1的2.5操作即可。

由以上结果可知：

对于未知的人血液样本，检测其中环状RNA分子标志物circ-Glis3的表达量，并与已获知的正常人血液样本中circ-Glis3的表达量进行比较，根据比较结果可以诊断该样本是否为或是否可能为2型糖尿病患者。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

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序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种环状RNA生物标志物circ-Glis3的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1114

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtccgttatt ttgcaagagt ctctggtgtc cacgactttg agtctgacag agagtcaatc 60

agccttgagt gtgaagcaag agtggtctca gagctacagg gctttccctt cactttcatc 120

cagccacagt tcccagaatg gcacggacct aggggacctt cttagcttgc ctccaggcac 180

gccagtgtct ggcaacagcg tctccaactc gttgccaccc taccttttcg gcatggaaaa 240

tagccactct ccttacccta gccctcggca ctcagcaacc agggcccact ccacccgctc 300

taagaagaga gcattgtcct tgtcgccact gtcagatggc atcgggatcg acttcaacac 360

tatcatccgt acttcaccca catccttggt cgcctacatc aacggaccaa gagcctcccc 420

agccaacctg tccccacagt cagaggtcta tgggcatttc ctgggtgttc gtggcagctg 480

catcccccag tcttgtgcag tggccagcgg gcagaaaggc atattggttg ccagtggagg 540

gcatacgctg ccgggctatg gagaggacgg tacactggag tatgaacgca tgcagcagct 600

tgagcatggt ggcctgcaac ccggacctgt aaacaacatg gtgttgcagc ctggcctacc 660

gggccaggat ggccagacag ccaacatgct caaaacagag cgcctggagg agttccccgc 720

cagtgccttg gacctgccct ctgctctgcc tctccctctt cctccgcctc agggtccccc 780

acccccatac catgcccatc cacaccttca tcacccagag ctcctgcctc acacccaatc 840

gctgtccctg gcccagactg gcctggaaga ggatggggag atggaagact caggggggaa 900

gcactgctgc cgttggatag actgcagtgc cctttatgac cagcaggagg aactggtgag 960

gcacatcgag aaggtccaca tagaccaacg caagggggaa gacttcacgt gcttctggac 1020

tggctgccct agaagataca agcctttcaa cgcacggtat aaactgctga tccacatgag 1080

ggtccactct ggggagaagc ccaacaagtg tacg 1114

<210> 2

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtgtacggt ccgttatttt gcaag 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaagccctg tagctctgag accac 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtccgttatt ttgcaagagt ctc 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtacacttg ttgggcttct cc 22

Claims (6)

1.一种2型糖尿病的诊断引物，其特征是，由circ-Glis3发散引物对和circ-Glis3收敛引物对构成；所述circ-Glis3发散引物对由正向引物SEQ ID NO:2以及反向引物SEQ IDNO:3构成；所述circ-Glis3收敛引物对由正向引物SEQ ID NO:4以及反向引物SEQ ID NO:5构成。

2.一种2型糖尿病的诊断试剂盒，其特征是，包括权利要求1所述的诊断引物。

3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征是，所述诊断试剂盒还包括：作为阳性对照的环状RNA分子标志物，所述环状RNA分子标志物为序列如SEQ ID NO:1所示的circ-Glis3。

4.权利要求1所述诊断引物在制备诊断2型糖尿病的试剂盒中的应用。

5.权利要求1所述诊断引物在制备诊断2型糖尿病的芯片中的应用。

6.权利要求2或3所述诊断试剂盒在制备诊断2型糖尿病的医疗工具中的应用。

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