CN111321147B - 一种基因抑制剂在制备抗胃癌转移制剂中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因抑制剂在制备抗胃癌转移制剂中的用途,属于生物医药技术领域。本发明通过实验证明长链非编码RNA LINC02033在胃癌组织中高表达,同时,本发明证明通过siRNA抑制剂抑制LINC02033表达能够显著的抑制胃癌细胞的迁移和侵袭,因此,LINC02033 siRNA能够用于制备抗胃癌转移制剂。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及一种基因抑制剂及其应用。
背景技术
胃癌是消化系统常见的一种恶性肿瘤,由于胃癌的发病机制十分复杂,且患者的早期症状不明显,导致胃癌患者的早期诊断率较低。胃癌是全球第四大恶性肿瘤,虽然,最近几年胃癌的发病率有所下降,但是患者的死亡率仍然没有有效的降低,在中国胃癌患者的死亡率仍然在所有肿瘤中位列第二。胃癌分为早期胃癌和进展性胃癌,大部分胃癌患者诊断时就已处于进展期。很多的早期胃癌患者都缺乏特异性的临床症状,患者通常并不会重视,从而致使胃癌被忽视。临床数据表明,晚期胃癌患者的术后5年生存率只有30%-40%,而早期胃癌患者的术后生存率则可以达到70-80%。
长链非编码RNA是一类大约200个核苷酸,缺少完整特异性阅读框的非编码能力的RNA分子。长链非编码RNA在细胞和组织中具有较强的特异性,且具有广泛的生物学功能,并且多数的长链非编码RNA在疾病中呈现为异常表达。现有的研究显示,长链非编码RNA在染色质水平、转录水平、转录后水平、翻译水平等均具有着重要的作用。按照长链非编码RNA在基因组内与相邻蛋白编码基因的相对位置差异,将长链非编码RNA分为5类,分别是:同义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、内含子lncRNA和基因间lncRNA。位置上的不同,将会使lncRNA发挥不同的作用。
目前的研究表明,长链非编码RNA在肿瘤的发生发展中扮演着重要的作用,因此,寻找新的与胃癌发生发展有关的长链非编码RNA,并设计相应的分子靶向药物对于胃癌的治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性抑制LINC02033的siRNA,用于制备抗胃癌制剂。
为实现上述目的,本发明提供了如下技术方案:
一种基因抑制剂,所述基因抑制剂为siRNA,所述siRNA抑制长链非编码 RNALINC02033的表达,所述siRNA用于制备抗胃癌制剂。
优选地,所述siRNA的正义链为GGAGCAAGAUCUAAGAUUAAA,siRNA的反义链为UAAUCUUAGAUCUUGCUCCAA。
此外,本发明提供了LINC02033基因抑制剂在制备抗胃癌药物中的用途。
优选地,所述用途包括LINC02033在制备抗胃癌转移制剂中的用途。
除此之外,本发明提供了一种抗胃癌转移的制剂,所述制剂包括LINC02033 的基因抑制剂。
优选地,所述基因抑制剂为LINC02033的siRNA。
优选地,所述siRNA的正义链为GGAGCAAGAUCUAAGAUUAAA,所述siRNA的反义链为UAAUCUUAGAUCUUGCUCCAA。
优选地,所述制剂还包括其他药学上可接受的药物载体。
本发明的有益效果在于:
本发明通过实验证明长链非编码RNA LINC02033在胃癌组织中高表达,同时,本发明证明通过siRNA抑制剂抑制LINC02033表达能够显著的抑制胃癌细胞的迁移和侵袭,因此,LINC02033 siRNA能够用于制备抗胃癌转移制剂,从而为开发新的胃癌药物提供了可能。
附图说明
图1 LINC02033在胃癌组织和癌旁组织中的表达差异
图2 si-LINC02033基因抑制剂对于LINC02033的抑制效果
图3细胞划痕实验检测抑制LINC02033对于胃癌细胞迁移的影响
图4 Transwell实验检测抑制LINC02033对于胃癌细胞迁移和侵袭的影响
图5 Western Blot实验检测抑制LINC02033对于胃癌细胞EMT相关蛋白的影响
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明,即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。
实施例1
检测LINC02033在胃癌组织和癌旁组织表达差异
1.研究对象
20例胃癌组织和20例相应的癌旁组织,组织来源于青岛市肿瘤医院,所有组织标本均通过医院伦理委员会审查和批准,所有组织标本来源患者均签署知情同意书。胃癌组织经病理检测证实为胃癌(胃癌组织切除时,患者尚未进行化疗,放疗等治疗)。
具体组织情况如下
2.组织RNA提取
(1)将50mg胃癌组织或癌旁组织放入到研钵中,加入少量的液氮,进行迅速的研磨,组织变软后,再次加入少量液氮进行研磨,重复三次;
(2)加入1mL Trizol,使用电动匀浆器匀浆2分钟,之后,将组织转移至离心管中,室温放置5分钟;
(3)离心机12000r/min离心5分钟,保留上清,去除沉淀;
(4)在离心管中加入200μl氯仿,震荡混匀后,室温放置5分钟;
(5)离心机12000r/min,4℃,离心15min;
(6)吸取上清转移至另一离心管中,加入500μl预冷的异丙醇混匀,混匀之后冰上静置10分钟;
(7)离心机12000r/min,4℃,离心10min,去除上清,保留沉淀;
(8)在沉淀中加入1ml 75%乙醇,温和的震荡离心管,悬浮沉淀;
(9)离心机8000r/min,4℃,离心5min,小心去除上清;
(10)室温静置10分钟,待RNA干燥后,使用50μl DEPC水溶解RNA,并使用微量紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度。
3.荧光定量PCR检测
(1)去除基因组DNA
反应条件:42℃2分钟,4℃。
(2)逆转录反应
反应条件:37℃15分钟,85℃5秒,4℃。
4.荧光定量PCR检测
反应条件:95℃5min;95℃60s,62℃40s 40个循环;72℃5min。
LINC02033引物序列为
Forward 5’-GGCCTTCTCCAGCAGCCTAA-3’(SEQ NO:1)
Reverse 5’-TCTGCAGCACCAGGAGGAAG-3’(SEQ NO:2)
GAPDH引物序列为
Forward 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ NO:3)
Reverse 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ NO:4)
采用2-△△ct方法处理实时定量PCR数据,计算LINC02033的表达变化。
实验结果
实验结果如图1所示,从图中可以看出,胃癌组织中LINC02033的相对表达量(2.394±0.168)明显高于癌旁组织中,且差异具有统计学意义,说明相较于癌旁组织,LINC02033在胃癌组织中高表达,因此,LINC02033可以作为胃癌治疗的靶点。
实施例2
荧光定量PCR检测LINC02033基因抑制剂的效果
1.细胞培养
人胃癌细胞MKN-45采用高糖DMEM培养液培养(10%胎牛血清),置于37℃, 5%CO2恒温细胞培养箱培养。
2.si-RNA转染
(1)转染前一天将2×105的MKN-45细胞接种于6孔板中,37℃,5%CO2 恒温细胞培养箱培养24h,参照Lipofectamine2000说明书进行转染;
(2)实验分组为对照组(空转),si-NC组,si-LINC02033组。
(3)荧光PCR检测步骤同实施例1。
si-LINC02033的序列为
正义链为5’-GGAGCAAGAUCUAAGAUUAAA-3’(SEQ ID NO.5)
反义链为5’-UAAUCUUAGAUCUUGCUCCAA-3’(SEQ ID NO.6)
实验结果
实验结果如图2所示,从图中可以看出si-LINC02033组的LINC02033相对表达量显著降低,说明si-LINC02033基因抑制剂能够有效的抑制LINC02033 的表达,抑制率为81.7%。
实施例3
细胞划痕实验
(1)将转染si-NC和si-LINC02033的MKN-45细胞接种至6孔板中;
(2)当细胞密度达到85%时,使用200μL枪头在培养孔的垂直方向轻轻滑过贴壁细胞层,并且使用PBS洗去脱落下来的细胞;
(3)分别于0h和24h在倒置显微镜下拍摄划痕。
实验结果
实验结果如图3所示,从图中可以看出,si-LINC02033组细胞发生迁移的距离要显著的小于si-NC组,说明si-LINC02033基因抑制剂能够有效的抑制胃癌细胞MKN-45的细胞迁移能力。
实施例4
细胞侵袭实验
(1)将固体Matrigel胶置于4℃过夜融化为液态;
(2)用移液器吸取200μL无血清培养基,加入40μL Matrigel胶,冰上混匀,在Transwell小室的上室加入100μL混匀后的Matrigel胶,放入培养箱中孵育4小时,至Matrigel胶完全变为固态;
(3)将转染si-NC和si-LINC02033的MKN-45细胞消化,并且使用PBS 洗涤细胞,之后使用无血清培养基悬浮细胞,并进行细胞计数;
(4)在Transwll下室中加入600μL含10%血清的培养基,上室加入100 μL包含2.5×104个细胞的细胞悬液,继续在细胞培养箱中培养24小时;
(5)用镊子小心的将Transwell小室取出,吸干上室液体,之后将 Transwell小室转移到加入800μL甲醇的培养板中,室温固定30分钟;
(6)将Transwell小室取出,吸干上室固定液,转移到预先加入800μL Giemsa染液的孔中,室温染色20分钟;
(7)用清水冲洗浸泡3次,取出Transwell小室,吸去上室液体,用棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞,置于显微镜下进行拍照。
实验结果
实验结果如图4所示,从图中可以看出,si-LINC02033组通过Transwell 小室的细胞数量少于si-NC组,说明si-LIN02033能够抑制胃癌细胞MKN-45 的细胞侵袭。
实施例5
Western Blot实验
(1)转染前一天将2×105的MKN-45细胞接种到6孔培养板上,37℃, 5%CO2细胞培养箱中培养24h后,参照Lipofectamine 2000说明书对细胞进行转染,实验分组为si-NC组,si-LINC02033组,每组重复3次;
(2)转染48h后,PBS洗涤细胞,每孔加入100μl RIPA细胞裂解液,裂解30分钟;
(3)充分裂解后,将裂解液转移至离心管中,10000g/min,4℃离心10 分钟,取上清至新的离心管;
(4)吸取2μl,使用BCA法进行蛋白定量,加入5×上样缓冲液调整蛋白样品为2μg/μl,沸水水浴煮5分钟;
(5)12000rpm/min离心5分钟,得到制备好的蛋白样品;
(6)组装好电泳槽,配置5%上层胶和12%下层胶;
(7)每孔加入20μg蛋白样品和蛋白Marker指示剂;
(8)电泳槽加入新配置的电泳缓冲液,按照上层胶电压80v,下层胶120v 条件下开始电泳,待溴酚蓝指示剂移至胶底时,结束电泳;
(9)组装转膜夹子,装入倒满转移液的转移槽中,250mA,转膜1.5h;
(10)将转膜后的PVDF膜转移至5%的脱脂奶粉中,室温,封闭1h;
(11)TBST洗膜3次,每次5min,孵育β-actin,E-cadherin,N-cadherin 和Vimentin一抗稀释液,4℃摇床孵育过夜;
(12)TBST洗膜3次,每次5min,孵育二抗,室温,摇床孵育1h;
(13)暗室中,快速将发光液滴加至PVDF膜上,进行显像。
实验结果
实验结果如图5所示,从图中可以看出,转染si-LINC02033之后,促EMT 转化的N-cadherin,Vimentin的表达量下调,而抑制EMT转化的E-cadherin 的表达上调,说明抑制LINC02033能够通过抑制EMT来促进胃癌细胞的转移和侵袭。
序列表
<110> 青岛思拓新源细胞医学有限公司
<120> 一种基因抑制剂在制备抗胃癌转移制剂中的用途
<130> 2020.3.20
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggccttctcc agcagcctaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctgcagcac caggaggaag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtgaag gtcggagtc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaagatggtg atgggatttc 20
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggagcaagau cuaagauuaa a 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uaaucuuaga ucuugcucca a 21
Claims (1)
1.LINC02033基因抑制剂在制备胃癌转移治疗药物中的用途,其特征在于,所述抑制剂为siRNA,
所述siRNA的正义链序列为5’-GGAGCAAGAUCUAAGAUUAAA-3’;
所述siRNA的反义链序列为5’-UAAUCUUAGAUCUUGCUCCAA-3’。
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- 2020-03-24 CN CN202010212233.3A patent/CN111321147B/zh active Active
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