CN106566884A - C17orf99在制备监控胰腺癌复发转移试剂中的应用 - Google Patents

C17orf99在制备监控胰腺癌复发转移试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测胰腺癌的分子标记物，所述标记物为C17orf99或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。本发明进一步公开了所述的分子标记物在制备监控胰腺癌转移复发试剂中的应用。本发明还公开了一种监控胰腺癌转移复发的试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增C17orf99的引物序列。利用上述分子标记物可以进行胰腺癌的诊断、治疗、监控及预后，对胰腺癌的预后和治疗具有重要意义。

Description

C17orf99在制备监控胰腺癌复发转移试剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及C17orf99在制备监控胰腺癌复发转移试剂中的应用。
背景技术
胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，在西方国家恶性肿瘤死亡率第四位,全球每年约250万人死于胰腺癌。我国胰腺癌发病率逐年上升，近20年增长迅速。胰腺癌的治疗主要为手术、化疗和放疗相结合的综合治疗，其五年生存率小于5％。由于胰腺的解剖学位置较深，腹部疼痛、体重减轻、黄疸等临床特异性的症状不易被发现，多数患者确诊时已发生癌症转移。胰腺癌发生肝转移较早，早期诊断、根治性手术切除是胰腺癌患者获得长期存活的唯一希望，但80％以上的患者就诊时已经失去了根治性切除的机会。因此，提高胰腺癌的早期诊断率，抑制肿瘤的生长和转移，提高药物的治疗效果，成为改善胰腺癌患者预后的关键因素。
目前临床上常用的胰腺癌肿瘤学标志物是CA19-9。CA19-9单独作为诊断胰腺癌的指标尚不精确，敏感性较低，并且在其他消化道肿瘤及良性疾病中也有升高，因此对胰腺癌早期诊断的价值有限。另外，一些基因肿瘤标志物也用于临床胰腺癌的早期诊断，但始终未能达到诊断的目的。
因此，寻找敏感性高、特异性强、结果稳定的肿瘤标志物仍是胰腺癌早期诊断、疗效评估或复发监控中亟待解决的问题。
发明内容
为了实现胰腺癌的早期诊断，预后评估，转移复发，个体化治疗，本发明的目的之一在于提供一种检测胰腺癌的分子标记物。
本发明的目的之二是在于提供所述分子标记物在制备监控胰腺癌转移复发试剂中的应用。
本发明的目的之三在于提供所述分子标记物在制备胰腺癌预后评估试剂中的应用。
本发明的目的之四是在于提供一种监控胰腺癌转移复发的试剂盒。
为实现上述目的，本发明首先提供一种检测胰腺癌的分子标记物，所述标记物为C17orf99或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。
优选地，所述的C17orf99或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在胰腺癌组织或血液中表达上调。
进一步地，本发明提供了所述的分子标记物在制备监控胰腺癌转移复发试剂中的应用。
进一步地，本发明提供了所述的分子标记物在制备胰腺癌预后评估试剂中的应用。
进一步地，本发明提供一种监控胰腺癌转移复发的试剂盒。
优选地，所述试剂盒包括：
(1)组织或血液样品提取总RNA试剂；
(2)反转录试剂；
(3)定量PCR试剂。
优选地，组织或血液样品提取总RNA试剂包括TRizol、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇和无酶水；所述反转录试剂包括5xPrimerScript Buffer、PrimeScript RT Enzyme Mix I、OligodT Primer、Random 6mers和RNase Free dH2O。
优选地，所述定量PCR试剂包括特异性扩增C17orf99的引物序列。
优选地，所述引物序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
优选地，所述定量PCR试剂还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBR Green荧光染料。
优选地，所述试剂盒含有人正常的胰腺组织或细胞的总RNA或DNA。
进一步地，本发明还提供了一种监控胰腺癌转移复发的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中C17orf99的表达水平；
(3)将测得的C17orf99的表达水平与受试者的患病与否关联起来，判断转移复发情况。
判断标准如下：疗程结束后不同时间的表达量与治疗后相比，比值>1判断为复发，比值≤1判断为未复发即无进展生存。
进一步地，本发明提供了一种评估对胰腺癌治疗效果的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中C17orf99的表达水平；
(3)将测得的C17orf99的表达水平与受试者的患病与否关联起来，判断治疗效果。
判断标准如下：治疗后C17orf99表达含量与治疗前相比，比值≥1判断为治疗无效，0.5＜比值＜1判断为病情改善，比值≤0.5判断为疗效显著。
优选地，所述受试者样品包括的胰腺癌组织样品或血液样品；所述受试者样品为治疗前的或治疗后的样品。优选地，所述治疗包括施用手术干涉，化疗，放疗，药物治疗或其组合。
优选地，所述的检测表达水平包括检测转录物水平。
本发明的有益效果如下：
本发明公开了一种与胰腺癌相关的C17orf99，并进一步证实C17orf99表达水平在胰腺癌组织或血液中表达上调。利用C17orf99检测胰腺癌不仅能够快速有效的做到早期检测、预后评估，转移复发监控，其精确度大大提高，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1 C17orf99在胰腺癌组织和癌旁组织的表达情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明基于TCGA数据库信息中160个胰腺癌患者的数据进行胰腺癌的生存分析筛选相关基因，筛选得到与生存时间相关C17orf99，通过单因素Cox回归分析发现C17orf99为风险性因素。并且进一步通过实时定量PCR检测C17orf99在胰腺癌组织和癌旁正常组织的表达，发现C17orf99在胰腺癌中表达升高。
本发明所述的基因是在本发明之前的已知基因，均来源于人类基因组。Genebank登录号：C17orf99：Gene ID:100141515。
C17orf99(chromosome 17 open reading frame 99，17号染色体开放阅读框99)是蛋白编码基因，位于17号染色体上。
本发明使用的术语“表达上调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体或从通过胰腺癌分期确定与胰腺癌不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一基因相比，所述基因在从患胰腺癌或通过胰腺癌分期确定的胰腺癌已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平降低。根据本发明，“表达上调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达降低，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低。
实施例1 基于TCGA数据库信息进行胰腺癌的生存分析筛选相关基因
1、临床信息筛选
检索TCGA数据库中的胰腺癌患者临床信息，截至2015年12月10日，TCGA数据库中总共记载了185例胰腺癌临床病例。对这些数据进行筛选，共有160例患者纳入研究。筛选时排除具有其他恶性肿瘤病史、曾接受过放疗或化疗的患者，同时纳入研究的患者需含临床信息和mRNA数据。
2、生存期研究样本统计
160例胰腺癌患者生存时间的统计结果如下表所示:
表1 160例胰腺癌患者生存时间统计
生存期时间t(年) 期初进入研究人数 期内死亡人数 期内失访人数
t<1 160 27 74
1≤t<2 59 22 15
2≤t<3 22 10 2
3≤t<4 10 2 2
4≤t<5 6 0 1
5≤t 5 4 1
3、mRNA表达数据生存分析研究方案
(1)对胰腺癌高通量mRNA转录组数据检索、数据下载及样本挑选和归类。由下载的转录组数据通过生物信息学分析筛选得出与胰腺癌生存时间相关的mRNA。
(2)用Cytoscape软件构建由mRNAs组成的生物信息网络，通过DAVID对生物信息网络中与胰腺癌生存时间相关的mRNA进行GO分析和Pathway分析。
4、胰腺癌mRNA表达数据的生存分析结果
将胰腺癌组织的转录组数据下载后，去除read count＝0小于20％的mRNA后用做下一步分析，包括17100个mRNA。提取mRNA基因表达量和胰腺癌TCGA数据库生存时间数据，采用survival包的coxph函数完成，经单因素Cox回归分析，筛选得到单因素Cox回归中p值<0.05的mRNA有580个，包括328个风险性mRNA和252个保护性mRNA。Coef值是回归系数，HR＞1为风险性因素，HR＜1为保护性因素。
为了更好的研究与生存时间相关的mRNA的功能，我们通过GORILLA和GeneCodis软件对胰腺癌生存时间相关的mRNA进行GO功能富集和KEGG通路富集，筛选标准皆为FDR<0.05。其中C17orf99的p值为0.048909，HR>1，为胰腺癌风险性mRNA。
实施例2 RT-PCR验证胰腺癌组织及癌旁组织中基因表达情况
1、材料
收集经外科手术切除、并经病理学检查确诊的35例胰腺癌患者组织及对应癌旁组织标本，癌旁组织定义为距肿瘤边缘3cm以外的胰腺组织。取样来源于北京协和医院2010年10月到2015年12月期间确诊为胰腺癌并接受外科术切除的病人。手术切除胰腺癌组织后在病理科医生的指导下立即取胰腺癌及癌旁组织放入液氮，编号后置-80℃低温冰箱保存。
2、方法
2.1 对组织样本进行总RNA提取
依据编号分别对35例胰腺癌组织及对应的癌旁组织进行总RNA提取，采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5分钟；
②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；
③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；
④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
2.2 RNA样品的质量分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
2.3 逆转录合成cDNA
采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.4 Real-Time PCR
2.4.1 仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCt法进行数据相对定量分析。采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI：NM_001163075.1(C17orf99)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
表2 引物序列
操作过程如下：
表3 Real Time反应体系
组分 加入量
2×mix 10μL
上游引物(10uM) 0.5μL
下游引物(10uM) 0.5μL
模板 2μL
加入灭菌蒸馏水 至25μL
(一)反应体系：用PowerGreen PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。
扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40个循环。
(二)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(三)样品Real Time-PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
3、实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较C17orf99在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，C17orf99在胰腺癌患组织中的表达水平高于癌旁组织中，具体情况见图1。
实施例3 试剂盒制备
本实施例提供了用于监控胰腺癌转移复发的试剂盒，该试剂盒包括：
RNA提取试剂包括TRizol、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇和无酶水；
反转录试剂包括5xPrimerScript Buffer、PrimeScript RT Enzyme Mix I、OligodT Primer、Random 6mers和RNase Free dH2O；
定量PCR试剂包括特异扩增C17orf99的引物对如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；和特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；包括SYBRGreen聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCl，2.5mM MgCl2，200mM(NH4)2SO4；还包括胰腺正常组织cDNA：作为阴性对照与检测样本cDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本cDNA相同量。
反转录体系如表4所示。反应程序为：37℃孵育15min，85℃灭活5s。
表4 反转录体系
组分 加入量
5xPrimerScript Buffer 2μL
PrimeScript RT Enzyme MixI 0.5μL
OligodTPrimer(50μM) 0.5μL
Random 6 mers(100μM) 0.5μL
Total RNA 1ul
RNase Free dH2O 至10μL
定量PCR反应体系如表5所示。反应程序为：95℃预变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。
表5 定量PCR反应体系
实施例4 C17orf99检测用于胰腺癌复发转移监控
1、样本收集
从北京协和医院自2010年10月到2015年12月收集6例早期胰腺癌患者的化疗后血液样品。
2、试剂盒监测
用实施例3制备的试剂盒分别检测样品中C17orf99表达含量，并对患者进行跟踪随访，分别于疗程结束后六周、3个月、6个月、9个月采用同样方法检测样品中C17orf99表达含量，根据以下公式计算P值：P＝疗程结束后不同时间的表达量/化疗后表达量，P>1判断为复发，P≤1判断为未复发即无进展生存，将P值判断结果与这6名患者在疗程结束后9个月的临床评价结果进行比较，考察血液C17orf99用于胰腺癌复发监控的效果。
3、结果分析
由表6数据分析可知，血液C17orf99检测获得的胰腺癌复发监控结果显示，6例胰腺癌患者中有1例在疗程结束后6周复发，有3例在疗程结束后3个月复发，而在疗程结束后9个月2例无进展生存，而临床评价结果显示，6例胰腺癌患者在疗程结束后9个月仅3例复发，说明血液C17orf99表达量的升高早于临床症状和体征的发现，血液C17orf99检测可以为医生提前干预提供指导。从表6结果可以看出，检测血液中C17orf99获得的胰腺癌复发的准确度为83.3％。
表6 C17orf99检测单独用于胰腺癌复发监控
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 邱宾涛
<120> C17orf99在制备监控胰腺癌复发转移试剂中的应用
<130> p16yxa76
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctaggaggtt ctcactgccc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagcaggtta tgagcaccca 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (9)

1.一种检测胰腺癌的分子标记物，其特征在于，所述标记物为C17orf99或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。
2.如权利要求1所述的分子标记物，其特征在于，所述的C17orf99或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在胰腺癌组织或血液中表达上调。
3.如权利要求1所述的分子标记物在制备监控胰腺癌转移复发试剂中的应用。
4.如权利要求1所述的分子标记物在制备胰腺癌预后评估试剂中的应用。
5.一种监控胰腺癌转移复发的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)组织或血液样品提取总RNA试剂；
(2)反转录试剂；
(3)定量PCR试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述定量PCR试剂包括特异性扩增C17orf99的引物序列。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物序列包括SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2。
8.一种监控胰腺癌转移复发的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中C17orf99的表达水平；
(3)将测得的C17orf99的表达水平与受试者的患病与否关联起来，判断转移复发情况。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的判断标准为：疗程结束后不同时间的表达量与治疗后相比，比值>1判断为复发，比值≤1判断为未复发即无进展生存。
CN201610961826.3A 2016-11-04 2016-11-04 C17orf99在制备监控胰腺癌复发转移试剂中的应用 Withdrawn CN106566884A (zh)

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CN108949976A (zh) * 2018-07-06 2018-12-07 中国医学科学院北京协和医院 C12orf70和/或C17orf107基因在胰腺癌检测产品中的用途

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