CN110023510A - 作为卵巢癌预后诊断标志物的mmp1基因转录产物和检测方法 - Google Patents

作为卵巢癌预后诊断标志物的mmp1基因转录产物和检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110023510A
CN110023510A CN201780043531.0A CN201780043531A CN110023510A CN 110023510 A CN110023510 A CN 110023510A CN 201780043531 A CN201780043531 A CN 201780043531A CN 110023510 A CN110023510 A CN 110023510A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ovarian cancer
gene transcript
prognosis
marker
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780043531.0A
Other languages
English (en)
Inventor
落谷孝广
横井晓
加藤友康
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bms Biomimetic Medical Co
National Cancer Research Center National Research And Development Corp
Biomimetics Sympathies Inc
Original Assignee
Bms Biomimetic Medical Co
National Cancer Research Center National Research And Development Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bms Biomimetic Medical Co, National Cancer Research Center National Research And Development Corp filed Critical Bms Biomimetic Medical Co
Publication of CN110023510A publication Critical patent/CN110023510A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供一种卵巢癌预后预测用标志物和试剂盒、以及预后预测方法。其为含有基质金属蛋白酶（MMP）1基因转录产物的卵巢癌预后预测标志物、试剂盒以及使用上述标志物或试剂盒的卵巢癌预后预测方法，所述方法检测采自被检者生物试样中基质金属蛋白酶（MMP）1基因的表达水平、即含有基质金属蛋白酶（MMP）1基因转录产物的卵巢癌预后预测标志物，得到卵巢癌预后预测标志物的检测值。

Description

作为卵巢癌预后诊断标志物的MMP1基因转录产物和检测方法
技术领域
本发明涉及用于从罹患卵巢癌的患者中检测预后不良患者组的标志物及其检测方法。
背景技术
卵巢癌是妇科恶性肿瘤中预后最为不良的癌症种类，罹患率、死亡率均日趋上升。2010年，全世界约有16万人死于卵巢癌。已知卵巢癌细胞与腹膜的主要构成细胞、即间皮细胞的亲和性高，极容易发生腹膜转移，腹膜转移已成为重要的预后因子之一。目前尚未建立起针对腹膜转移的药物治疗，另外其分子机制也未彻底阐明。根据2014年的统计数据，女性的累计罹患风险在所有种类的癌症中为约46％(2人中有1人罹患癌症)，其中，卵巢癌为约1％(87人中有1人罹患癌症)。另外，女性的累计死亡风险在所有种类的癌症中为约16％(6人中有1人死于癌症)，其中，卵巢癌为约0.5％(188人中有1人死于癌症)。从而，卵巢癌被归属于罹患后预后差的癌症，已经认识到结合卵巢癌早期发现的特征选择合适处置的重要性。作为预后差的原因之一，卵巢癌在初期时大多缺乏自觉症状，在临床病期已经进展的阶段被发现；另一个原因是，卵巢癌进展快，即使在肿瘤较小的阶段也容易远端转移和转移到淋巴结，是一种恶性度高的肿瘤。
为了解决前者，需要建立有效的早期诊断标志物。目前在通过内检、回声检查发现后，通过影像诊断、测定血液肿瘤标志物来进行良性和恶性的判定。作为所使用的代表性的卵巢癌检查标志物，有CA125等，但在初期卵巢癌中，检测灵敏度为约50％，特异性为约70％，作为标志物而言，精度很难说充分。
另外，为了解决后者，重要的是准确地判定腹膜扩散、淋巴结转移的亚型，制定此后的合适治疗方案。如果能够进行卵巢癌的预后预测诊断、并判断其为进行标准治疗后不会恶性化的亚型，则能够避免对不必要的患者选择过度治疗，仅限于对预后恶化的高风险患者制定更积极的策略。进而，卵巢所产生的肿瘤中，除了良性和恶性以外，还存在组织学所见类似于良性、但会遵循与恶性类似的过程进展的交界恶性肿瘤，使治疗方案的选择处理变得复杂。从该观点而言，成为准确地判定预后差的类型的基准标志物将使治疗变得有效。
近年，作为比CA125更好的标志物候选物质，血液循环DNA(cfDNA)受到关注。cfDNA的检测灵敏度依然不够充分，需要灵敏度更优异的标志物，但就特异性而言，能够以高精度来判断卵巢癌患者(非专利文献1)。
作为卵巢癌预后预测标志物，对卵巢癌组织中特定的基因区域进行DNA甲基化谱分析，从而在高甲基化组和低甲基化组之间确认存在Kaplan-Meier生存曲线等的差异(专利文献1)。但是，DNA甲基化分析在用于常规诊断技术时存在分析原理上操作烦杂、检查费高昂等课题，并且由于在良性肿瘤与恶性肿瘤的辨别力方面不足令人担心假阳性问题等，因此关于癌症罹患后的预后预测标志物技术，需要技术方面的进一步突破。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利公报2014-525269
非专利文献
非专利文献1：PLoS One.2016 Jun 2；11(6):e0155495.doi:10.1371/journal.pone.0155495.Circulating Cell Free DNA as the Diagnostic Marker for OvarianCancer:A Systematic Review and Meta-Analysis.Zhou Q1,Li W1,Leng B1,Zheng W1,He Z1,Zuo M1,Chen A1.
发明概述
发明解决的课题
本发明的目的在于，提供一种判定卵巢癌的恶性度、高精度地预测预后过程的技术。需要说明的是，本发明优选提供在临床分期的初期(I期)中具有准确辨别力的标志物技术。
解决课题的办法
本发明的第一方面涉及卵巢癌的预后诊断标志物。具体地，该标志物为含有基质金属蛋白酶(MMP)1基因转录产物的卵巢癌预后预测标志物。
该标志物的优选例子为一种卵巢癌预后预测标志物，其用于：使用被检者体液试样中基质金属蛋白酶(MMP)1基因转录产物的表达量来评价被检者卵巢癌预后。
该标志物被用作卵巢癌预后预测用检查试剂盒的要素之一。因此，本发明还提供一种卵巢癌预后预测用检查试剂盒。
本发明的第二方面涉及一种用于预测卵巢癌预后的方法。该方法含有如下步骤：测定采自被检者生物试样中基质金属蛋白酶(MMP)1基因的表达水平。
具体地，测定基质金属蛋白酶(MMP)1基因表达水平的步骤含有如下步骤：检测含有基质金属蛋白酶(MMP)1基因转录产物的卵巢癌预后预测标志物，得到卵巢癌预后预测标志物的检测值。
生物试样的例子为被检者的腹水、从腹水回收的外泌体和卵巢癌组织样品中的任意1种或2种以上。
上述的方法优选还含有如下步骤：判定卵巢癌预后预测标志物的检测值是否为阳性。该步骤为如下步骤：比较卵巢癌预后预测标志物的检测值和生物试样中内标基因转录物(例如，GAPDH基因)的检测值，当卵巢癌预后预测标志物的检测值与生物试样中内标基因转录物的检测值相比为规定比率以上时，将卵巢癌预后预测标志物的检测值判定为阳性。
上述方法的例子是判定卵巢癌预后预测标志物的检测值是否为阳性的步骤，也含有与上述不同的步骤。该步骤为如下步骤：当卵巢癌预后预测标志物的检测值与良性肿瘤或卵巢癌转移阴性症例的卵巢癌预后预测标志物的检测值的平均值相比为规定比率以上时，将卵巢癌预后预测标志物的检测值判断为阳性。
发明效果
本发明可以提供卵巢癌预后预测标志物、以及含有此种标志物的试剂盒。进而，本发明还可以提供用于预测卵巢癌预后的方法。
通过测定腹水和从腹水回收的外泌体、或卵巢癌组织样品中的MMP1基因转录产物表达水平，可以判定卵巢癌患者的恶性度。例如，可以对卵巢癌分期为I期的患者进行如下诊断：MMP1基因转录产物表达量高的患者组复发所致的死亡风险高，MMP1基因转录产物表达量低的患者则不会复发、遵循治愈的过程。在目前的标准治疗中，卵巢癌分期为I期的患者大多为：摘除原发肿瘤，基本仅用外科手术疗法来完成治疗。已知卵巢癌细胞与腹膜的主要构成细胞即间皮细胞的亲和性高，极容易发生腹膜转移，腹膜转移已成为重要的预后因子之一。分期为I期的卵巢癌是指：癌症病灶仅止于单侧或两侧的卵巢的状态，表面上看5年生存率维持在高水平，但随着此后分期的进展而倾向于日趋恶性化。作为本发明的效果，通过把握早期卵巢癌患者的MMP1基因转录产物水平，能够判断是否应进行扩大手术(淋巴结大网膜切除等)、后续治疗(化学疗法)，通过这些追加治疗，对于妇科恶性肿瘤中预后最为不良的癌症之一即卵巢癌，能够改善患者预后。
附图简单说明
图1示出从腹水纯化出的外泌体中MMP1基因转录产物，所述腹水是通过手术采集自良性肿瘤、交界恶性肿瘤、恶性肿瘤的3种患者组。
图2示出以卵巢癌分期1期患者为对象评价MMP1基因转录产物作为卵巢癌预后预测因子的性能结果。
图3示出对高度转移型(ES-2)和非转移型(RGM-1)卵巢癌细胞株的原位移植小鼠模型中肿瘤进展进行比较的结果。
图4示出在中度转移型卵巢癌细胞株(A2780)原位移植小鼠模型中移植来自卵巢癌细胞株的外泌体，A2780细胞株对原发肿瘤的影响和转移促进作用的评价结果。
图5示出高度转移型(ES-2)和非转移型(RMG-1)卵巢癌细胞株中的细胞和外泌体中MMP1基因转录产物的表达量的检验结果。进而示出：这些MMP1基因转录产物为全长型。
具体实施方式
本发明的第一方面涉及一种卵巢癌预后预测标志物。该卵巢癌预后预测标志物含有基质金属蛋白酶(MMP)1基因转录产物。也就是说，卵巢癌患者的MMP1基因转录产物可以高精度地判定预后不良风险高的患者组和预后不良风险低的患者组。
卵巢癌例如分为：上皮性肿瘤、生殖细胞肿瘤、性索间质肿瘤、转移性卵巢肿瘤和基于组织学的分类(浆液性腺癌、透明细胞腺癌、子宫内膜样腺癌、过渡性上皮癌、粘液腺癌和混合型)。另外，卵巢癌也与其它癌症同样地被基于进展程度分为I期～IV期。本发明的预后预测标志物可以通过比较各癌症患者的转录产物与健康人或良性肿瘤患者的转录产物，来确定卵巢癌患者转归为恶性化的风险。
卵巢中所形成的肿瘤中，大部分为良性肿瘤，也存在恶性度较低的被称为交界型恶性肿瘤的卵巢癌。这些之外者则为恶性肿瘤。良性肿瘤基本没有恶性化的危险性，但交界型恶性肿瘤则存在分期进展、需要与恶性肿瘤同样的手术操作、化学疗法的情况。当被诊断为交界型恶性肿瘤或恶性肿瘤时，则开腹探查并根据病理学所见确定分期，进行与组织型、分期相应的治疗，但由于不能进行合适的预后预测，卵巢癌治疗的效果比其它癌症差。
卵巢癌的预后是指：关于卵巢癌的发展过程的医学预测。预后预测是指：患者对药物反应较好或反应不好的可能性、这种反应的程度、原发癌在经手术除去和/或化学疗法后在一定期间内不复发而生存的可能性中的任一者。通过将本发明的方法用于临床对特定的患者选择最合适的治疗方法，从而可以确定治疗方法。卵巢癌的预后预测的时期可以为卵巢癌的治疗前、治疗中、和治疗后中的任一者。
在本发明中，“长期生存”是指手术或其它治疗之后生存3年以上，优选为5年以上，更优选为8年以上，最优选为10年以上。
标志物是所谓的肿瘤标志物。本发明的标志物，例如是成为卵巢癌细胞或由卵巢癌细胞分泌的外泌体的标记(标志物)的物质，是作为卵巢癌的预后诊断和治疗的判断基准起作用的物质的总称。成为标志物的物质的例子为：作为基因转录产物的RNA链。基因转录产物是指例如：以基因的DNA为模板而转录得到的RNA链即由RNA聚合酶合成的RNA链，和转录后在细胞内修饰的RNA链。转录产物中所包括的RNA链的例子是信使RNA(mRNA)。这些RNA链也包括转录后在细胞内经过加工的RNA链。
基质金属蛋白酶(MMP)1基因转录产物的例子除了具有使用序列号3和4的引物对扩增出的碱基序列的序列以外，还有具有使用序列号5和6的引物对扩增出的碱基序列的序列。
本发明还提供一种试剂盒，其含有卵巢癌预后预测标志物。该试剂盒可以适宜地含有针对作为预后相关基因MMP1基因转录产物的引物和核酸探针。MMP1基因的GenBank登录号为NM001145938等，MMP1基因转录产物的定量中所使用的引物序列可以通过在基因序列区域内设计出的正向引物和反向引物的组合来决定。
在本说明书中，“MMP1基因”是指编码基质金属蛋白酶1蛋白的基因。MMP1基因编码能够分解I型、II型和III型间质胶原蛋白的分泌型酶。该基因是位于人染色体11q22.3上MMP基因簇的一部分。
基质金属蛋白酶1(MMP1，别名：CLG，CLGN，EC3.4.24.7)也以成纤维细胞胶原酶、间质胶原酶、基质金属肽酶-1或基质金属蛋白酶-1(HGNC：71551；Entrez Gene：43122；UniProtKB：P039563；Ensembl：ENSG000001966117；GenBank登录号：NM＿002421)的名字而被熟知。
用于扩增将基质金属蛋白酶(MMP)1基因转录产物逆转录而成的cDNA的正向引物和反向引物的例子如下：即序列号3和4的引物对以及序列号5和6的引物对。
本发明的卵巢癌预后预测试剂盒可以至少含有成为本发明标志物基因的表达分析用试剂。并且，该试剂盒可以含有用于实施本发明的卵巢癌检查方法所需要的各种设备材料、耗材、试剂和用于基因扩增的引物类以及基因扩增相关试剂等。
此种基因表达分析用的试剂的例子还包括核酸提取液、各种酶类、缓冲液、洗涤液、溶出液等。具体而言，至少含有：用于在纯化核酸时将被检体悬浮的提取液、以及用于检测基因转录产物的逆转录反应用引物、PCR用引物、逆转录酶、实时PCR用酶等。作为试剂盒要素，还可以包括：能够进行同时处理多个被检体的微量滴定板、DNA扩增用设备等所需的一系列耗材等。
试剂盒中所含的引物没有特别限定，只要能够进行MMP1基因转录产物的扩增和检测。例如，引物的大小为至少约12碱基长度以上，优选为约15～100碱基长度，更优选为约16～50碱基长度，进而更优选为约18～35碱基长度。另外，最佳的扩增片段的大小根据基因扩增法的种类而不同。因此，试剂盒中所含的引物的设计位置不作特别限定。此种引物可以利用公知的方法来制作。
试剂盒中所含的核酸探针不作特别限定，只要能够检测预后相关基因的转录产物。核酸探针可以是DNA、RNA、修饰核酸或它们的嵌合分子等，考虑到安定性、简便性等而优选为DNA探针，考虑到灵敏度则优选为RNA探针。此外核酸探针可以为单链或双链中的任一种。核酸探针的大小不作特别限定，只要能与预后相关基因的转录产物特异性杂交，例如为约15或16碱基长度以上，优选为约15～1000碱基长度，更优选为约20～500碱基长度，进而更优选为约20～80碱基长度。核酸探针可以以核酸阵列之类的固定在基板上的形态来提供。此种核酸探针可以利用本身公知的方法来制作。
试剂盒可以含有测定MMP1基因转录产物与试剂的复合体的单元。这种情况下，试剂盒中所含的试剂和测定单元可以以彼此隔离的形态、例如收纳于不同容器的形态来提供。测定用单元根据试剂的种类而可以为标记性物质标记后的检测物质。标记性物质的例子为：FITC和FAM等荧光物质；鲁米诺、荧光素和光泽精等发光物质；3H、14C、32P、35S和123I等放射性同位素；以及生物素和链霉亲和素等亲和性物质。试剂盒可以还含有逆转录酶、核酸提取液或核酸提取装置。试剂盒可以还含有可从卵巢癌患者采集生物试样的单元。
特别优选使用腹水和从腹水回收的外泌体、或者卵巢癌组织样品测定本发明的卵巢癌预后预测标志物。
本发明的卵巢癌预后预测标志物对于良性肿瘤不会显示假阳性，可以高精度地检测交界型恶性肿瘤和恶性肿瘤患者中预测为预后不良的患者。
当以I期患者为对象应用本发明时，即使对癌症早期的I期患者，也可以对卵巢癌的进展准确地判定预后。
然后，对卵巢癌预后预测方法进行说明。该方法是检测已罹患卵巢癌对象的预后恶性程度的方法。该方法测定来自对象的试验样品中MMP1基因转录产物的表达水平。
可使用公知的常规分子生物学方法来实施测定MMP1基因转录产物的表达水平的方法。此种方法的例子为实时RT-PCR、微阵列分析法、RNA印迹分析法和新一代测序法。
然后对卵巢癌患者的腹水和从腹水回收的外泌体、或卵巢癌组织样品中MMP1基因转录产物的表达量进行定量。就定量的方法而言，可以用转录产物的表达量相对于作为内标的GAPDH基因等的相对值精度良好地进行判定。在以GAPDH基因转录产物为内标时，如果MMP1基因转录产物的表达量相对于GAPDH基因转录产物超过规定的阈值，则可以判定为卵巢癌预后不良的高风险对象。这种情况下的预后不良对象的阈值可以设为0.7％。
实施例
实施例基于以下的方针进行。为了实施本发明，由对象的腹水制备外泌体，利用实时RT-PCR法测定MMP1基因转录产物的表达量。当MMP1基因转录产物的表达量相对于GAPDH基因等的转录产物的表达量超过所设定的阈值即0.7％时，判定为卵巢癌预后不良的高风险对象。
该阈值例如也可以在0.5％以上且1.5％的范围内进行变更。
良性肿瘤的对象则显示为阈值即0.7％以下。作为其设定根据，将分期为I期的卵巢癌患者的卵巢肿瘤组织分为MMP1基因转录产物表达量高的组和表达量低的组，并对两组的Kaplan-Meier生存曲线进行分析，确认表达量高的组的生存率显著降低，另一方面，低表达组则未确认到生存率降低。
不仅是卵巢肿瘤组织本身，存在于腹水中的外泌体也可成为用于卵巢癌的预后预测评价的试验样品，作为显示这一点的实施例，使用小鼠实施了评价。在此确认：移植时，将来自显示预后不良的卵巢癌细胞的高转移株的外泌体给予在小鼠中移植中等转移株而成的卵巢癌腹膜扩散模型时，促进卵巢癌细胞株向腹腔的转移，而将来自卵巢癌细胞非转移株的外泌体给与在小鼠中移植中等转移株而成的卵巢癌腹膜扩散模型时则未确认到此种转移促进。进而，与来自非转移株的外泌体相比，在来自高转移株的外泌体中确认到显著的MMP1基因产物的高表达。确认外泌体中MMP1基因产物的高表达为用于评价成为腹膜扩散等转归的风险的预后不良标志物。
[实施例1]
对交界型恶性肿瘤、恶性肿瘤的卵巢癌患者，以及卵巢中形成有良性肿瘤的患者，实施MMP1基因转录产物的表达分析。将其结果示于图1。
外泌体的分离：以交界型恶性肿瘤7名，恶性肿瘤41名和良性肿瘤12名为对象，将外科手术摘出肿瘤时采集的腹水或通过腹壁穿刺采集的腹水供于2,000×g(4℃/10分钟)的离心分离。将除去沉淀组分而得的上清组分供于0.45μm过滤器，供于用TSL-55转子(Beckman Coulter,Inc.)的49,000rpm(4℃/35分钟)的离心分离。将沉淀组分用PBS(-)洗涤，再次供于49,000rpm(4℃/35分钟)的离心分离，作为外泌体组分。
总RNA的纯化：使用QIAzol和miRNeasy Mini Kit(Qiagen)按照使用说明书从外泌体提取总RNA，测定总RNA浓度。
实时RT-PCR：利用高通量cDNA反转录试剂盒(High Capacity cDNA ReverseTranscription Kit)(Applied Biosystems公司)由所纯化的1μg总RNA合成cDNA，使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG(Invitrogen公司)并且使用StepOne Real-Time PCR System(Applied Biosystems公司)的实时PCR设备实施实时RT-PCR。分析中，用GAPDH基因转录产物进行标准化。所使用的PCR引物如下所述。
序列号1)GAPDH-Fw：gcaccgtcaaggctgagaac
序列号2)GAPDH-Rv：tggtgaagacgccagtgga
序列号3)MMP1-Fw：aggtctctgagggtcaagca
序列号4)MMP1-Rv：ctggttgaaaagcatgagca
按照下述PCR反应条件来实施。
50℃/2分钟
↓95℃/2分钟
↓(95℃/15秒→60℃/30秒)×40循环
预后风险评价：算出MMP1基因转录产物的表达量相对于GAPDH基因转录产物的表达量的比率。描绘出交界型恶性肿瘤组(LPM)、恶性肿瘤组(癌症)和良性肿瘤组(对照)各自的表达量的比率的图。表明恶性肿瘤组(癌症)中被橙色包围的对象组相对于良性肿瘤组(对照)存在MMP1基因转录产物高表达的情况。表明其比例为恶性肿瘤组(癌症)整体的27％。根据这些结果，作为对它们进行判定的基准值，在MMP1基因转录产物相对于GAPDH基因转录产物的表达比率为0.7％以上的对象中，这些MMP1基因转录产物高表达对象可以判定为有此后卵巢癌预后变得不良的风险的对象(图1)。
[实施例2]
在用于提供各种癌症临床检查基因表达分析数据的公共微阵列数据组Kaplan-Meier生存图中，从1582名卵巢癌患者中抽取卵巢癌分期为I期的74名患者组，实施MMP1基因转录产物的Kaplan-Meier生存曲线分析(MMP1探针：204475＿at)。将其结果示于图2。在I期卵巢癌患者中，发现肿瘤组织中MMP1基因的高表达与此后的预后恶化有极强的相关性(风险比：3.6×108,对数秩检验:p＝0.014)。
[实施例3]
将导入了荧光素酶基因的人卵巢癌细胞株RMG-1和ES-2原位移植到CB17/icr-scid/scidJcl小鼠的左卵巢，用IVIS系统经时地进行在体成像，最长至8周为止。由此评价非转移株RMG-1和高转移株ES-2在小鼠中的增殖性和浸润性。
细胞制备：用添加有10％灭活FBS和1％抗菌-抗真菌溶液(Invitrogen公司)的DMEM/F12培养基培养RMG-1细胞株，用添加有10％灭活FBS和1％抗菌-抗真菌溶液(Invitrogen公司)的McCoy’s 5A培养基培养ES-2细胞株。培养条件设定为37℃/5％CO2浓度。两种细胞使用的是导入了荧光素酶基因、从而可表达荧光素酶蛋白的改造细胞。
细胞移植：将所制备的RMG-1细胞株和ES-2细胞株原位移植到T细胞缺损且B细胞缺损的免疫缺陷小鼠CB17/icr-scid/scidJcl小鼠的左卵巢。关于移植细胞数，以1×106细胞进行移植。
在体成像：卵巢癌细胞株移植后1周起，每周用IVIS Spectrum成像系统(CaliperLife Science公司)检测荧光素酶的发光，由此评价癌症细胞的增殖和浸润。为了检测荧光素酶活性，将D-荧光素以150mg/kg进行腹腔内给药，约10分钟后检测小鼠全身的发光，用LIVINGIMAGE 4.4软件(Caliper Life Science公司)进行影像分析。将其结果示于图3。如图3所示，在高转移株ES-2中，在细胞移植起2周后观察到原发肿瘤和向腹腔的转移浸润，在另一者即非转移株RMG-1中，在8周的观察期内仅观察到原发肿瘤的增大。由此确认，RGM-1为非转移性的低恶性度卵巢癌细胞株，而ES-2为高转移性的高恶性度卵巢癌细胞株。
[实施例4]
通过转移方面恶性度不同的卵巢癌细胞株和来自人卵巢表层上皮细胞的外泌体来评价对卵巢癌细胞的转移浸润造成的影响。
细胞制备：用添加有10％灭活FBS和1％抗菌-抗真菌溶液(Invitrogen公司)的RPMI-1640培养基培养A2780细胞株。培养条件设定为37℃/5％CO2浓度。A2780细胞株使用的是导入了荧光素酶基因、从而可表达荧光素酶蛋白的改造细胞。
外泌体的制备：用添加了10％灭活FBS和1％抗菌-抗真菌溶液(Invitrogen公司)的DMEM/F12培养基培养人卵巢表层上皮细胞(HOSE1)和RGM-1，用添加了10％灭活FBS和1％抗菌-抗真菌溶液(Invitrogen公司)的McCoy’s 5A培养基培养ES-2细胞株。培养条件设定为37℃/5％CO2浓度。在细胞达到约90％的增殖度的时刻，将细胞用PBS(-)洗涤并置换为无血清培养基。对ES-2使用高级DMEM培养基，对RGM-1和HOSE1使用高级DMEM/F12。然后培养48小时，回收培养上清。培养上清供于2,000×g(4℃/10min)的离心分离，除去细胞残渣等，将上清组分供于0.22μm过滤器(Millipore公司)而净化。将该上清组分供于使用SW41Ti转子(Beckman Coulter,Inc.)的35,000rpm(4℃/70分钟)的离心分离。将沉淀组分用PSB(-)洗涤，再次供于35,000rpm(4度/70分钟)的离心分离，作为外泌体组分。
模型小鼠的制作：将制备的A2780细胞株原位移植到T细胞缺损和B细胞缺损的免疫缺陷小鼠CB17/icr-scid/scidJcl小鼠的左卵巢。关于移植细胞数，以1×106细胞进行移植。对该种小鼠以5μg腹腔内给药由ES-2、RGM-1、HOSE1制备的外泌体。给药次数和频度设为从A2780细胞移植起的3天后至13天后为止每天(共计6次：总给药外泌体量30μg)(图4a)。
转移的评价：在移植A2780细胞21天后，进行原发肿瘤和转移肿瘤的评价。具体而言，使用IVIS Spectrum成像系统(Caliper Life Science公司)检测A2780细胞株的荧光素酶发光，由此评价癌症细胞的增殖和浸润。为了检测荧光素酶活性，将D-荧光素以150mg/kg进行腹腔内给药，约10分钟后检测小鼠全身的发光。检测中，对小鼠的全身、摘出的原发肿瘤和摘出了原发肿瘤后的腹腔进行检验，用LIVINGIMAGE 4.4软件(Caliper Life Science公司)进行影像分析。将其结果示于图4b。结果是：来自HOSE1的外泌体给药组、RMG-1外泌体给药组的腹腔转移与PBS(-)给药组的中值基本相同，与此相对地，来自ES-2的外泌体给药组的腹腔转移则被显著促进。另一方面，就原发肿瘤的肿瘤增大而言，在来自HOSE1的外泌体给药组、RMG-1外泌体给药组，来自ES-2的外泌体给药组的组间未检测到显著差异。
[实施例5]
对卵巢癌细胞株和来自它们的外泌体组分中所含的MMP1基因转录产物的表达量进行了比较。
细胞的制备：将添加有10％灭活FBS和1％抗菌-抗真菌溶液(Invitrogen公司)的DMEM/F12培养基培养人卵巢表层上皮细胞(HOSE1)和RGM-1，用添加有10％灭活FBS和1％抗菌-抗真菌溶液(Invitrogen公司)的McCoy’s 5A培养基培养ES-2细胞株。培养条件设定为37℃/5％CO2浓度。
外泌体的制备：在细胞达到约90％的增殖度的时刻，将细胞用PBS(-)洗涤，置换为无血清培养基。对ES-2使用高级DMEM培养基，对RGM-1和HOSE1使用高级DMEM/F12。然后培养48小时，回收培养上清。培养上清供于2,000×g(4℃/10min)的离心分离，除去细胞残渣等，将上清组分供于0.22μm过滤器(Millipore公司)而净化。将该上清组分供于使用SW41Ti转子(Beckman Coulter,Inc.)的35,000rpm(4℃/70分钟)的离心分离。将沉淀组分用PSB(-)洗涤，再次供于35,000rpm(4℃/70分钟)的离心分离，作为外泌体组分。
总RNA的纯化：使用QIAzol和miRNeasy Mini Kit(Qiagen)，按照使用说明书从外泌体提取总RNA，测定总RNA浓度。
实时RT-PCR：利用高通量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems公司)由纯化后的1μg总RNA合成cDNA，使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG(Invitrogen公司)并且使用StepOne Real-Time PCR System(Applied Biosystems公司)的实时PCR设备来实施实时RT-PCR。分析中，用GAPDH基因转录产物进行标准化。所使用的PCR引物如下。
序列号1)GAPDH-Fw：gcaccgtcaaggctgagaac
序列号2)GAPDH-Rv：tggtgaagacgccagtgga
序列号3)MMP1-Fw：aggtctctgagggtcaagca
序列号4)MMP1-Rv：ctggttgaaaagcatgagca
按照PCR反应条件来实施。
50℃/2分钟
↓95℃/2分钟
↓(95℃/15秒→60℃/30秒)×40
定量结果：对MMP1基因转录产物的表达量进行比较的结果是：就高转移卵巢癌细胞株ES2而言，细胞和外泌体中MMP1基因转录产物的表达量与RMG-1、HOSE1相比分别显示约22倍和约65倍的高表达(图5)。
MMP1基因转录产物的确认：为了验证外泌体中含有的MMP1基因转录产物为全长型，按照厂商的说明书中所记载的方法使用SuperScriptIII First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR(Invitrogen公司)由总RNA来合成cDNA。以所合成的cDNA为模板，用Takara Ex Taq(Takara Bio公司)进行PCR反应。所使用的PCR引物如下，扩增的DNA片段为1,528碱基对。
序列号5)MMP1-Full-Fw：gatattggagcagcaagagg
序列号6)MMP1-Full-Rv：caccttctttggactcacac
按照下述PCR反应条件来实施。
(98℃/10秒→60℃/30秒→72℃/2分钟)×30循环
其结果是，来自ES2的外泌体含有全长型MMP1基因转录产物。
整理上述实施例的要点如下：实施例2中示出：在I期卵巢癌的预后不良组的卵巢肿瘤组织中，MMP1基因转录产物为高表达，另外实施例2中示出：就来自卵巢癌恶性肿瘤患者腹水的外泌体而言，在约27％的患者中检测到在良性肿瘤患者中观察不到的MMP1基因转录产物的高表达。进而显示：关于实施例3中显示为腹腔高转移性卵巢癌细胞株ES2，来自ES2的外泌体具有促进中等转移性卵巢癌细胞株A2780向腹腔转移的功能，而在来自非转移性卵巢癌细胞株RMG-1的外泌体中看不到此功能。即实施例5中发现：来自ES-2的外泌体与来自RMG-1的外泌体相比，MMP1基因转录产物极其高表达。将上述多样的见解组合，本发明发现：在来自患有卵巢癌对象的腹水和从腹水回收的外泌体、或卵巢癌组织样品中，MMP1基因转录产物可以作为卵巢癌患者的高精度预后预测标志物使用。
产业上的可利用性
本发明涉及罹患卵巢癌后预后风险评价，通过使用本发明标志物的检查等可以检测预期预后不良的患者。在卵巢癌诊疗中，腹水采集是通常实施的必要检查，因此不需要进行新的侵入性取样，容易使用现有的诊疗所产生的生物样品得到腹水或腹水中的外泌体，因此不会增大患者负担，为在医疗现场容易接受的检查。在此取得的信息可成为重要的信息，其对于判断为了改善预期预后不良患者的转归而在此后进行积极的治疗介入而言很重要。因此，在医疗检查产业、医疗设备产业、医疗用分析产业以及癌症治疗领域的医疗产业等中，可以有效地利用本发明。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1：对GAPDH基因转录产物特异的PCR引物。
SEQ ID NO:2：对GAPDH基因转录产物特异的PCR引物。
SEQ ID NO:3：对MMP-1基因转录产物特异的PCR引物。
SEQ ID NO:4：对MMP-1基因转录产物特异的PCR引物。
SEQ ID NO:5：对MMP-1基因转录产物特异的PCR引物。
SEQ ID NO:6：对MMP-1基因转录产物特异的PCR引物。
序列表
<110> BMS仿生医疗株式会社
国立研究开发法人国立癌研究中心
<120> 作为卵巢癌预后诊断标志物的MMP1基因转录产物和检测方法
<140> 2017800435310
<141> 2017-06-20
<150> JP2016-121392
<151> 2016-06-20
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
gcaccgtcaa ggctgagaac 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
tggtgaagac gccagtgga 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
aggtctctga gggtcaagca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
ctggttgaaa agcatgagca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
gatattggag cagcaagagg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
caccttcttt ggactcacac 20

Claims (2)

1.一种用于预测卵巢癌预后的方法，其含有如下步骤：得到采自被检者的腹水或从腹水回收的外泌体中的全长型基质金属蛋白酶(MMP)1基因转录产物的检测值，由此测定全长型基质金属蛋白酶(MMP)1基因的表达水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其还含有如下步骤：比较所述全长型基质金属蛋白酶(MMP)1基因转录产物的检测值和采自所述被检者的腹水或从腹水回收的外泌体中的内标基因转录物的检测值，当所述全长型基质金属蛋白酶(MMP)1基因转录产物的检测值与采自所述被检者的腹水或从腹水回收的外泌体中的内标基因转录物的检测值相比为规定比率以上时，将所述全长型基质金属蛋白酶(MMP)1基因转录产物的检测值判断为阳性。
CN201780043531.0A 2016-06-20 2017-06-20 作为卵巢癌预后诊断标志物的mmp1基因转录产物和检测方法 Pending CN110023510A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016121392A JP6143920B1 (ja) 2016-06-20 2016-06-20 卵巣がんの予後診断マーカーとしてのｍｍｐ１遺伝子転写産物と検査法
JP2016-121392 2016-06-20
PCT/JP2017/022680 WO2017221927A1 (ja) 2016-06-20 2017-06-20 卵巣がんの予後診断マーカーとしてのｍｍｐ１遺伝子転写産物と検査法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110023510A true CN110023510A (zh) 2019-07-16

Family

ID=59012109

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780043531.0A Pending CN110023510A (zh) 2016-06-20 2017-06-20 作为卵巢癌预后诊断标志物的mmp1基因转录产物和检测方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20190316205A1 (zh)
EP (1) EP3473729A4 (zh)
JP (1) JP6143920B1 (zh)
CN (1) CN110023510A (zh)
AU (1) AU2017282420A1 (zh)
CA (1) CA3067527A1 (zh)
SG (1) SG11201811433TA (zh)
WO (1) WO2017221927A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114752673B (zh) * 2022-04-30 2023-07-28 重庆大学附属肿瘤医院 一种检测isyna1表达水平的试剂在制备卵巢癌干性鉴别试剂中的应用
WO2024009946A1 (ja) * 2022-07-08 2024-01-11 国立大学法人東海国立大学機構 卵巣癌に対するｐａｒｐ阻害剤の有効性を検査する方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003048734A2 (en) * 2001-12-03 2003-06-12 Oncomedx, Inc. Detection of matrix metalloproteinase rna in plasma and serum
CN103582815A (zh) * 2011-02-24 2014-02-12 佛米利昂公司 用于卵巢癌的生物标志物组、诊断方法和测试试剂盒
US20150322530A1 (en) * 2012-10-17 2015-11-12 Cedars-Sinai Medical Center Molecular signatures of ovarian cancer

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201326481A (zh) 2011-08-30 2013-07-01 Nat Defense Medical Ct 預測易罹患卵巢贅瘤或卵巢癌預後之生物標記

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003048734A2 (en) * 2001-12-03 2003-06-12 Oncomedx, Inc. Detection of matrix metalloproteinase rna in plasma and serum
US20050032063A1 (en) * 2001-12-03 2005-02-10 Michael Kopreski Detection of matrix metalloproteinase rna in plasma and serum
CN103582815A (zh) * 2011-02-24 2014-02-12 佛米利昂公司 用于卵巢癌的生物标志物组、诊断方法和测试试剂盒
US20150322530A1 (en) * 2012-10-17 2015-11-12 Cedars-Sinai Medical Center Molecular signatures of ovarian cancer

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MILLIMAGGI等: ""Tumor vesicle-associated CD147 modulates the angiogenic capability of endothelial cells"", 《NEOPLASIA》 *
WANG等: ""MMP-1-PAR1 axis mediates LPA-induced epithelial ovarian cancer (EOC) invasion"", 《GYNECOLOGIC ONCOLOGY》 *
周岱翰等, 中国中医药出版社 *
谷欢等: ""联合检测腹水、血清肿瘤标志物及其比值对鉴别良恶性腹水的诊断价值"", 《中国现代医学杂志》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20190316205A1 (en) 2019-10-17
JP2017225352A (ja) 2017-12-28
EP3473729A4 (en) 2020-02-26
CA3067527A1 (en) 2017-12-28
AU2017282420A1 (en) 2019-02-07
JP6143920B1 (ja) 2017-06-07
SG11201811433TA (en) 2019-01-30
EP3473729A1 (en) 2019-04-24
WO2017221927A1 (ja) 2017-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106414774B (zh) 胆道癌的检测试剂盒或装置以及检测方法
EP2734636B1 (en) Micro-rna biomarkers for identifying risk of and/or for diagnosing lung tumour
CN106755344A (zh) 用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物及其应用
CN106350600A (zh) Loc80054在胰腺癌诊断或预后中的用途
CN109468382B (zh) lncRNA在肺腺癌诊疗中的应用
US20220093251A1 (en) Novel biomarkers and diagnostic profiles for prostate cancer
CN106967719B (zh) 一种长链非编码rna作为前列腺癌分子标志物的应用
Dwivedi et al. Application of single-cell omics in breast cancer
CN106755343A (zh) 胰腺癌预后诊断分子标记物
CN109402252A (zh) 急性髓系白血病风险评估基因标志物及其应用
CN106381342A (zh) 用于胰腺癌诊断或预后的生物标记
CN110023510A (zh) 作为卵巢癌预后诊断标志物的mmp1基因转录产物和检测方法
CN109628600A (zh) 一种用于早期乳腺癌诊断的生物标志物
CN106755309A (zh) 分子标记物在制备胰腺癌预后评估产品中的应用
US20190316207A1 (en) Mir-320e and colorectal cancer
CN108753981A (zh) Hoxb8基因的定量检测在结直肠癌预后判断中的应用
Zhao et al. Off the fog to find the optimal choice: Research advances in biomarkers for early diagnosis and recurrence monitoring of bladder cancer
CN109628594B (zh) 一种与肝癌相关的长链非编码rna及其应用
CN108728439A (zh) 小rna组成的指纹图谱及其在膀胱癌诊断中的应用
CN106367509A (zh) Loc100128675作为检测前列腺癌的分子标记物及其在诊断试剂盒中的应用
CN106282366A (zh) 一种与前列腺癌相关的分子标记物及其应用
Dong et al. Identification of potential biomarkers for progression and prognosis of renal clear cell carcinoma by comprehensive bioinformatics analysis
CN106282374A (zh) Fam13aos作为检测前列腺癌的分子标记物及其应用
Ding et al. The downregulation of linc-RECK-3 in T1 stage non small cell lung cancer
CN106566884A (zh) C17orf99在制备监控胰腺癌复发转移试剂中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20191204

Address after: Floor 1-2, building 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai

Applicant after: Shanghai shengzimao Biotechnology Co., Ltd

Address before: Tokyo, Japan

Applicant before: National Cancer Research Center, national research and Development Corporation

Applicant before: BMS Biomimetic Medical Company

TA01 Transfer of patent application right