TW201326481A

TW201326481A - 預測易罹患卵巢贅瘤或卵巢癌預後之生物標記

Info

Publication number: TW201326481A
Application number: TW101131686A
Authority: TW
Inventors: Hung-Cheng Lai; Rui-Lan Huang
Original assignee: Nat Defense Medical Ct
Priority date: 2011-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2013-07-01
Also published as: EP2751288A1; JP2014525269A; SG11201400269YA; CA2847290A1; US20150072947A1; NZ622148A; CN104204222A; IL231206A0; AU2012301937A1; EP2751288A4; WO2013033333A1; HK1204482A1

Abstract

本發明利用甲基化分析並發現用以預測卵巢癌預後及偵測惡性卵巢癌的DNA甲基化生物標記。除了在以現行治療方案的病患中作為獨立預後因素外，這些DNA甲基化係為未來化學治療之個人化藥品(特別是去甲基製劑或其他表觀基因藥品)的重要生物標記。

Description

預測易罹患卵巢贅瘤或卵巢癌預後之生物標記

本發明係關於預測卵巢贅瘤之風險或易罹患性，及/或卵巢癌之預後與惡性之基因生物標記。更特定言之，本發明係利用DNA甲基化以選擇預測卵巢贅瘤之易罹患性及/或卵巢癌之預後及惡性之候選基因。

卵巢癌係一種嚴重性疾病，相較於其他女性生殖系統癌症，其造成更多死亡。因為該疾病之潛伏期且缺乏可信賴的篩檢測試，三分之二的患者於被診斷時業已為晚期，且縱然許多已擴散的腫瘤患者對手術及細胞毒殺性治療之組合初期有反應，將近90%之患者會復發且無可避免的死於他們的疾病。瞭解卵巢癌之分子基礎可能具有顯著完善診斷及處理該癌症之潛力，且發展出新穎、更具特異性及更有效之治療形式。有需要更好的預後指標來指引手術及輔助治療之強度與程度，特別在該疾病初期的患者。

DNA甲基化是表觀基因機制(epigenetic mechanisms)之一，在許多重要的生物程序中扮演角色，包含X染色體去活性化(X-inactivation)、沈默害蟲DNA元件(silencing parasitic DNA elements)、基因印記(genomic imprinting)、老化、男性不孕及癌症。DNA甲基化作用涉及多發現於二核苷酸CpG之胞嘧啶之複製後修飾，其散佈於整個基因組內，除了在一小部分名為CpG島(CpG islands)的位置。先前的研究已顯示在不同的癌症中，CpG島DNA高度甲基化(包含卵巢瘤)，同樣的經減少的整體性DNA甲基化程度與癌症亦有關連。在給定的細胞中之DNA甲基化作用模式與基因表現狀態的穩定性有關。本技術領域已知CpG甲基化之變化是累積性，並與卵巢癌進展成序列型相關模式(sequence-type dependent manner)，且CpG島微陣列(CpG island microarrays)可在卵巢癌之臨床樣本中迅速發現經CpG甲基化影響之新基因(George S Watts等人，“DNA methylation changes in ovarian cancer are cumulative with disease progression and identify tumor stage," BMC Medical Genomics 2008,1：47)。Caroline A.Barton等人提供癌症特異性DNA甲基化變化之檢測，預告在癌症診斷及預估預後及治療反應的一個令人興奮的新時代，並成為進一步調查的依據(Caroline A.Barton等人，"DNA methylation changes in ovarian cancer：Implications for early diagnosis,prognosis and treatment," Gynecologic Oncology,Volume 109,Issue 1,April 2008,pages 129-139)。Sahar Houshdaran等人指出就臨床及生物標記研究二者上，不同組織學型態之卵巢瘤之獨特甲基化作用，凸顯了不同組織學型態之卵巢癌應視為不同疾病治療之需求(Sahar Houshdaran等人，“DNA Methylation Profiles of Ovarian Epithelial Carcinoma Tumors and Cell Lines”；PLoS ONE,Volume 5,Issue 2,February 2010,e9359)。美國專利7507536提供23個標記，其於卵巢癌中被經表觀基因性沈默(epigenetically silenced)，且該標記可被診斷性、預後性、治療性使用並用以選擇治療方法，其係針對個別患者所訂製。

然而，經累積之高度甲基化及低度甲基化於卵巢癌發展及結果之角色仍屬未知。這些仍有待生物標記之發展用以在DNA甲基化作用之基礎上預測卵巢癌之預後。

本發明關於預測一種預測個體易罹患卵巢贅瘤之風險之方法，包含在獲自該個體的卵巢贅瘤樣本，評估一或多個下列基因之DNA甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2、ATG4A、ENG、HIST1H2BN、MGST2及THRB，及與其具有80%序列同一性之一多核苷酸序列；其中DNA甲基化之改變表示該個體係易於罹患卵巢贅瘤。

本發明亦關於一種預測經診斷患有卵巢贅瘤的個體之預後或惡性之方法，包含在獲自該個體的卵巢癌樣本，評估一或多個下列基因之DNA甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2、ATG4A、ENG、HIST1H2BN、MGST2及THRB，及其與具有80%序列同一性之多核苷酸序列；其中DNA甲基化之改變表示差的預後或惡性卵巢癌。

本發明亦關於一種檢測經診斷患有卵巢癌的個體之預後或惡性之方法，包含在獲自該個體的一卵巢癌樣本，評估一或多個下列基因之DNA甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2、ATG4A、ENG、HIST1H2BN、MGST2及THRB，及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列；其中下列情況表示一差的預後或一惡性卵巢癌：相較於在非癌細胞被觀察到的DNA甲基化作用，該個體具有一或多個下列基因之DNA高度甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、ATG4A、HIDT1H2BN、THRB及MGST2及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列，及/或相較於在非癌細胞被觀察到的DNA甲基化作用，該個體具有一或多個下列基因之DNA低度甲基化：CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2及ENG及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列。

本發明亦關於一種為患有卵巢癌之人類個體作成治療決定之方法，包含投藥有效劑量之去甲基化製劑至該個體，其中相較於在非癌細胞被觀察到的DNA甲基化作用，該個體呈現一或多個下列基因之高度甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、ATG4A、HIDT1H2BN、THRB及MGST2，及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列。

本發明進一步關於一種為差的預後或惡性之卵巢癌之個體決定治療方案之方法，包含提供化學治療於該個體，其中相較於在非癌細胞被觀察到的DNA甲基化作用，該個體具一或多個下列基因之DNA高度甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、ATG4A、HIDT1H2BN、THRB及MGST2，及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列，及/或相較於在非癌細胞被觀察之DNA甲基化作用，該個體具一或多個下列基因之DNA低度甲基化：CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2及ENG，及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列。

本發明亦進一步關於一種為個體預測卵巢贅瘤之風險或易罹患性或為患有卵巢癌之個體預測預後，偵測惡性及/或作出治療決定之套組，包含對一或多個下列基因鑑別甲基化與非甲基化之胞嘧啶殘基之試劑：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、 CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2、ATG4A、ENG、HIST1H2BN、MGST2及THRB，及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列；其中下列情況表示一差的預後或惡性之卵巢癌：相較於在非癌細胞被觀察之DNA甲基化作用，一或多個下列基因呈現DNA高度甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、ATG4A、HIDT1H2BN、THRB及MGST2及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列，及/或相較於在非癌細胞被觀察之DNA甲基化作用，一或多個下列基因呈現DNA低度甲基化：CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2及ENG及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列。

本發明利用甲基分析並發現用以預測卵巢贅瘤之風險及易罹患性、及/或卵巢癌之預後並偵測惡性卵巢癌的DNA甲基化生物標記。除了在以現行治療方案的病患中作為獨立預後因素外，這些DNA甲基化係為未來化學治療之個人化藥品(特別是去甲基製劑或其他表觀基因藥品(epigenetic drugs))的重要生物標記。

要被瞭解的是本發明不限於如此描述之特定資料及方法。同樣要被瞭解的是如此所用的術語是為描述特定實施例為目的且非有意限制本發明之範圍，本發明僅受限於所附的申請專利範圍。

除非上下文另外明確規定，否則本文中所用的單數形式之「一」及「該」包括複數形式。

本文中所用的術語「生物標記(biomarker)」意指一核酸分子，其被表現在取自檢測人類癌症病患之一樣本，相較於獲自於對照組個體中之一可比較樣本(亦即診斷為陰性或無法偵測之癌症、正常或健康個體之人)。

本文中所用的術語「預測」意指病患對藥品或一組藥品將產生有利或不利的反應之可能性，及那些反應之程度。因此，治療預測性因素會隨著個別病患對於特定治療的反應而變動，為獨立的預後。

本文中所用的術語「表觀基因狀態(epigenetic state)」或「表觀基因狀況(epigenetic status)」意指除了初級核苷酸序列以外，在一核酸之分子層次上的任何結構特徵。舉例而言，一基因組DNA之表觀基因狀態可能包含它的經決定或經影響的二級或三級結構，例如它的甲基化模式或它與細胞蛋白質間的結合。

本文中所用的術語「甲基化圖譜(methylation profile)」或「複數甲基化狀態(methylation status)」意指於在一個體的基因組DNA中一或數個癌症標記基因的甲基化狀態。在一些實施例中，相較於一標準甲基化圖譜，該甲基化圖譜包含自一已知類型之樣本的一甲基化圖譜(亦即癌化或非癌化之樣本，或不同階段癌症之樣本)。在一些實施例中，甲基化圖譜是利用本發明之方法所產生。該圖譜可能是以一圖形顯示(亦即在紙上或在一電腦螢幕上)、以一實體顯示(亦即一凝膠或陣列)，或以一數位顯示儲存在電腦記憶體中。

本文中所用的術語「高度甲基化(hypermethylation)」意指相對於在一正常對照組DNA樣本中的相對應的CpG二核苷酸中所發現到的5-甲基胞嘧啶核苷酸(5-mCyt)的量，對應於測試DNA樣本的DNA序列中的一或複數個CpG二核苷酸中所增加存在的5-甲基胞嘧啶核苷酸(5-mCyt)的平均甲基化狀態。

本文中所用的術語「低度甲基化(hypomethylation)」意指相對於在一正常對照組DNA樣本中的相對應的CpG二核苷酸中所發現到的5-甲基胞嘧啶核苷酸(5-mCyt)的量，對應於在測試DNA樣本的DNA序列中的一或數個CpG二核苷酸中所降低存在的5-甲基胞嘧啶核苷酸(5-mCyt)的平均甲基化狀態。

本文中所用的術語「個體」應表示任何動物，例如一哺乳類，且應無限制地，包含老鼠及人類。

本文中所用的術語「贅瘤」意指因腫瘤導致之一異常性組織塊。腫瘤為異常增生之細胞。腫瘤細胞之生長超過且不協調於它周圍的正常組織。縱然在停止刺激之後，該生長仍持續以相同過度的方式。它通常會導致一腫塊或腫瘤。贅瘤可能是良性、癌變前(原位癌)，或惡性(癌)。依據本發明，該贅瘤樣本是獲自個體的樣本，較佳為人類個體，或表現在一個體之內，較佳為人類個體，包含組織、組織樣品，或細胞樣品(亦即組織切片，例如：針吸切片、刷拭切片、表面切片、針刺切片、鑽取切片、切除切片、切片手術、切開切片或內視鏡切片)、腫瘤、腫瘤樣品，或生物流體(亦即腹膜液、血液、血清、淋巴、脊髓液)。

本文中所用的術語「易罹患性(susceptibility)」意指身體之一體質或狀態，其使該組織以特殊的方式對特定外在刺激反應並因此傾向於使該個體較通常更易罹患特定疾病。

本文中所用的術語「風險」意指在一特定時間期間中，例如在未來10年內，或在一生中，罹患一疾病之經估計的機會。

本文中所用的術語「腫瘤細胞」應表示癌細胞在腫瘤之內，或源自腫瘤。腫瘤細胞不同於其他表現在腫瘤的非癌細胞，例如血管細胞。

本文中所用的術語「預後(prognosis)」意指癌症導致的死亡或發展之可能性之預測，包含腫瘤疾病例如卵巢癌之復發、移轉性擴散(metastatic spread)，及抗藥性。

本文中所用的術語「微陣列(microarray)」意指在基質上的有序性的雜交陣列分子(hybridizable array elements)排列，較佳為多核苷酸探針。

本文中所用的術語「偵測(detect)」或「偵測(detection)」意指辨識被偵測對象之存在、不存在或數量。

本文中所用的術語「治療(treatment)」意指為不適之預防發展或改變病理或症狀而有意進行之干預。從而，「治療」意指治療療法及防患或預防性措施二者。

在一方面，本發明提供一種預測個體易罹患卵巢贅瘤之風險之方法，包含在獲自該個體的樣本，評估一或多個下列基因之DNA甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2、ATG4A、ENG、HIST1H2BN、MGST2及THRB，及與其具有80%序列同一性之一多核苷酸序列；其中DNA甲基化之改變表示該個體係易於罹患卵巢贅瘤。較佳地，該DNA甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、ADRA1A、CACNB2、GATA4、KCNA6、POU4F2、HS3ST2、NEFH、CACYBP或Clorf158或其任意組合。更佳地，該DNA甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、ADRA1A、CACNB2、GATA4、KCNA6、POU4F2、HS3ST2或NEFH或其任意組合。更佳地，該DNA甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。更佳地，該DNA甲基化之基因為CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。更優選地，該DNA甲基化之基因為POU4F2、NEFH、HS3ST2或其任意組合。更佳地，該DNA甲基化之基因為CACYBP，或MLN或其一組合。

在另一方面，本發明提供一種預測經診斷患有卵巢贅瘤的個體之預後或惡性之方法，包含在獲自該個體的卵巢癌樣本，評估一或多個下列基因之DNA甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2、ATG4A、ENG、HIST1H2BN、MGST2及THRB，及其與具有80%序列同一性之多核苷酸序列；其中DNA甲基化之改變表示差的預後或惡性卵巢癌。較佳地，該DNA甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、ADRA1A、CACNB2、GATA4、KCNA6、POU4F2、HS3ST2、NEFH、CACYBP或Clorf158或其任意組合。更佳地，該DNA甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、ADRA1A、CACNB2、GATA4、KCNA6、POU4F2、HS3ST2或NEFH或其任意組合。更佳地，該DNA甲基化之基因為CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。更佳地，該DNA甲基化之基因為POU4F2、NEFH、HS3ST2或其任意組合。更優選地，該DNA甲基化之基因為CACYBP，或MLN或其一組合。

在一實施例中，本發明提供一種預測經診斷患有卵巢贅瘤的個體之預後或惡性之方法，包含評估獲自該個體之一卵巢癌樣本之一或多個下列基因之DNA甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、 CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2、ATG4A、ENG、HIST1H2BN、MGST2及THRB，及與其具有80%序列同一性之一多核苷酸序列；其中下列情況表示一差的預後或一惡性卵巢癌：相較於在非癌細胞被觀察到的DNA甲基化作用，該個體具有一或多個下列基因之DNA高度甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、ATG4A、HIDT1H2BN、THRB及MGST2及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列，及/或相較於在非癌細胞被觀察到的DNA甲基化作用，該個體具有一或多個下列基因之DNA低度甲基化：CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2及ENG及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列。較佳地，該DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、ADRA1A、CACNB2、GATA4、KCNA6、POU4F2、HS3ST2或NEFH或其任意組合。更佳地，該DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。更佳地，該DNA高度甲基化之基因為POU4F2、NEFH、HS3ST2或其任意組合。更佳地，該DNA高度甲基化之基因為CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。較佳地，該DNA低度甲基化之基因為CACYBP或Clorf158或其任意組合。

本發明比較具有不同存活結果之個體之甲基化圖譜來選擇候選基因作為卵巢贅瘤之風險或易罹患性及/或預後預測及/或卵巢癌之偵測之用的生物標記。這些目的是透過至少一個或多個基因之CpG甲基化狀態之分析來達成。

本發明之特定實施例提供甲基化程度分析之一種新應用及/或可精確預測卵巢癌預後之基因模式，並從而達成增進的的治療。本發明特別佳為預後之預測及卵巢癌惡性之檢測。本發明方法使醫生及病患得作出更好且更具資訊性的治療決定。這些目的是透過至少一個或多個基因之CpG甲基化狀態之分析來達成。

根據本發明，預後可能是存活的長度，例如特定疾病之存活或總存活長度。預後亦可能為復發前的時間長度。

DNA甲基化為藉由名為甲基轉化酶(methyltransferases)之酵素進行的一種DNA化學修飾，其中甲基(m)被加到DNA之特定胞嘧啶(C)上。這種非突變(表觀基因(epigenetic))的過程(mC)在基因表達調控上為一重要因素。已顯示DNA甲基化為常見於癌症的改變，其導致廣範圍基因之增加或降低表現(Jones,P.A.,Cancer Res.65：2463(1996))。因在許多癌症中DNA甲基化與特定基因表現之程度具有關連，故它可作為腫瘤的表現情況的有用指標(Toyota,M.等人，Blood 97：2823(2001),Adorjan,P.等人Nucl.Acids.Res.10：e21(2002))。藉由進行差異化甲基分析，本發明已發現一組基因表現出DNA高度甲基化或DNA低度甲基化，其表示卵巢贅瘤之風險或易罹患性及/或卵巢癌之較差預後及/或卵巢癌之惡性。

這些基因及其序列如下表所列：

在上表的基因中，並無先前技術描述Clorf158、CACNB2、CACYBP、IGSF21、KCNA6、OR2L13、TBX20、MLN、ATG4A、HIST1H2BN、THRB、STC2、ENG及MGST2 與癌症及基因甲基化有關。一些先前文獻揭露A4GALT(J Biol Chem.2002 Mar 29；277(13)：11247-54.Epub 2002 Jan 8；BMB Rep.2009 May 31；42(5)：310-4)、ADRA1A(PLoS One.2009 Sep 18；4(9)：e7068；PLoS One.2008；3(11)：e3742.Epub 2008 Nov 17)及CD248(BMC Cancer.2009 Nov 30；9：417)與卵巢癌以外的癌症有關。一些先前文獻指出HS3ST2(Oncogene.2003 Jan 16；22(2)：274-80)及TWIST1(Cancer Prev Res(Phila).2010 Sep；3(9)：1053-5.Epub 2010 Aug 10)與基因甲基化有關。一些先前文獻揭露BNIP3(Tumori.2010 Jan-Feb；96(1)：138-42；BMC Cancer.2009 Jun 9；9：175；World J Gastroenterol.2010 Jan 21；16(3)：330-8)及NEFH(PLoS One.2010 Feb 3；5(2)：e9003；Cancer.2009 Aug 1；115(15)：3412-26)、POU4F2(Oncogene.2008 Jan 3；27(1)：145-54.Epub 2007 Jul 16；FEBS Lett.2007 May 29；581(13)：2490-6.Epub 2007 May 2；BMC Med Genomics.2009 Aug 17；2：53)與癌症及卵巢癌以外之甲基化有關。

雖然高度甲基化或低度甲基化在各種各樣的癌症中屬公知，它仍未被廣泛的研究作為一預後指標，且惡性卵巢癌基因之高度甲基化或低度甲基化在本技術領域仍未知。本技術領域並無資訊表示在上述表格中的基因能夠被用來作為易罹患或預後指標，以及區分良性及惡性腫瘤。

依據本發明，上述表格中的一或多個基因之DNA甲基化之變化表示一個體是易罹患卵巢贅瘤。

在上述表格中的基因，相較於在非癌細胞被觀察之DNA甲基化，一或多個下列基因之DNA高度甲基化表示卵巢癌之差的預後：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、ATG4A、HIST1H2BN、THRB及MGST2。較佳地，該DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、ADRA1A、CACNB2、GATA4、KCNA6、POU4F2、HS3ST2或NEFH或其任意組合。更佳地，該DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。更佳地，該DNA高度甲基化之基因為POU4F2、NEFH、HS3ST2或其任意組合。更佳地，該DNA高度甲基化之基因為CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。或者，相較於在非癌細胞被觀察之DNA甲基化，一或多個下列基因之DNA低度甲基化表示卵巢癌之差的預後或惡性卵巢癌：CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2及ENG。較佳地，該DNA低度甲基化之基因為CACYBP或Clorf158或其任意組合。在本發明之實施例中，做為表示卵巢癌之差的預後或惡性卵巢癌之具DNA高度甲基化之較佳基因為ATG4A、HIST1H2BN、CEACAM4、GATA4、NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3或KCNA6或其任意組合。較佳地，該具DNA高度甲基化之基因為 ATG4A、HIST1H2BN、ADRA1A、CACNB2、GATA4、KCNA6、POU4F2、HS3ST2或NEFH或其任意組合。較佳地，該具DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。較佳地，該具DNA高度甲基化之基因為POU4F2、NEFH、HS3ST2或其任意組合。較佳地，該具DNA高度甲基化之基因為CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。用以表示在卵巢癌之差的預後或惡性卵巢癌之具DNA低度甲基化之較佳基因為CACYBP或C1orf158或其任意組合。用以表示在卵巢癌之差的預後或惡性卵巢癌之具DNA低度甲基化之較佳基因為CACYBP，或MLN或其一組合。

在上述表格所列之生物標記基因包括不只在公開可得的數據庫中被發現之特定序列，還有這些序列之變體，包含對偶基因型變異體(allelic variants)。變異序列與該數據庫之序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或99%之序列同一性。為決定同一性百分比的電腦程式在本技術領域是可取得的，包含可從美國國家生物科技資訊中心(National Center for Biotechnology Information)取得之基礎區域排比搜尋工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)。

傳統用於DNA甲基化檢測之方法是利用甲基化特異性及/或甲基化敏感性限制酶(methylation sensitive restriction enzymes)作為限制性地標分析(restriction landmark analysis)。許多先進技術已被發展作為DNA甲基化檢測，包含亞硫酸氫鹽定序(bisulfite sequencing)、甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR)、MethyLight、微陣列、場效電晶體(field effect transistor，FET)為基礎之電子電荷偵測器。用以檢測甲基化狀態之方法已被揭露在，例如美國專利號6,214,556、5,786,146、6,017,704、6,265,171、6,200,756、6,251,594、5,912,147、6,331,393、6,605,432及6,300,071中及美國專利申請公開號20030148327、20030148326、20030143606、20030082609及20050009059之中，這些所有在此已被併入以供參考。其他以陣列為基礎之甲基化分析方法被揭露於美國專利申請號11/058,566(20050196792 A1)及11/213,273(20060292585 A1)中，這些在此已被以全文方式併入本案以供參考。其他一些偵測甲基化的方法，參酌Oakeley,E.J.,Pharmacology & Therapeutics 84：389-400(1999)。可用的方法包含但不限於：反相HPLC、薄層色層分析、SssI甲基移轉酶與併入經標記之甲基基團、氯乙醛(chloroacetaldehyde)反應、差異性敏感限制酶、聯氨或高錳酸鹽處理法(m5C可被高錳酸鹽處理法所切割但不被聯氨處理法所切割)、亞硫酸氫鈉、結合重亞硫酸鹽與限制性內切酶分析法(combined bisulphate-restriction analysis)、甲基化敏感的單核酸引子延長反應、甲基化特異性PCR(MSP)、CpG島微陣列(CpG island microarrays)及Infinium甲基化分析。

在另一方面，本發明提供一種為患有卵巢癌之人類個體作成治療決定之方法，包含投藥有效劑量之去甲基化製劑至該個體，其中相較於在非癌細胞被觀察到的DNA甲基化作用，該個體呈現一或多個下列基因之高度甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、ATG4A、HIDT1H2BN、THRB及MGST2，及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列。較佳地，該具DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、ADRA1A、CACNB2、GATA4、KCNA6、POU4F2、HS3ST2或NEFH或其任意組合。更佳地，該具DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。更佳地，該具DNA高度甲基化之基因為POU4F2、NEFH、HS3ST2或其任意組合。更佳地，該具DNA高度甲基化之基因為CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。

依據本發明，適合的去甲基製劑包含但不限於5-氮雜-2'-去氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine)、5-氮雜-胞苷(5-aza-cytidine)、Zebularine、普魯卡因(procaine)，及L-乙硫氨酸(L-ethionine)。

在進一步的方面，本發明提供一種為差的預後或惡性之卵巢癌之個體決定治療方案之方法，包含提供化學治療於該個體，其中相較於在非癌細胞被觀察到的DNA甲基化作用，該個體具一或多個下列基因之DNA高度甲基化： NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、ATG4A、HIDT1H2BN、THRB及MGST2，及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列，及/或相較於在非癌細胞被觀察之DNA甲基化作用，該個體具一或多個下列基因之DNA低度甲基化：CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2及ENG，及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列。較佳地，該具DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、ADRA1A、CACNB2、GATA4、KCNA6、POU4F2、HS3ST2或NEFH或其任意組合。更佳地，該具DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。更佳地，該具DNA高度甲基化之基因為POU4F2、NEFH、HS3ST2或其任意組合。更佳地，該具DNA高度甲基化之基因為CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。較佳地，該具DNA低度甲基化之基因為CACYBP或Clorf158或其任意組合。更佳地，該具DNA低度甲基化之基因為CACYBP，或MLN或其一組合。

依據本發明，該方法可能進一步包含為患有卵巢癌之個體作出治療決定，例如對具有差的預後之個體給予化學治療，或對具有良好預後之個體不給予化學治療。該方法可能進一步包含對前述個體施以輔助性化學治療。

在另外更進一步的方面，本發明提供一種為個體預測卵巢贅瘤之風險或易罹患性或為患有卵巢癌之個體預測預後，偵測惡性及/或作出治療決定之套組。該套組為測試甲基化之試劑之組合。它通常是在一包裝內，其含有所有的元件，視需要包含說明書。該包裝可能被分開以便元件不會被混和直到被需要時。元件可能會存在於不同的物理狀態下。例如，一些元件可能被凍乾且一些於水溶液中。一些可能被冷凍。個別元件可能被分開包裝於套組中。該套組可能含有試劑，如上所述用於鑑別甲基化和非甲基化胞嘧啶殘基。理想中該套組將包含寡核苷酸引子，其特異地雜交於藉由本發明辨識出的基因之轉錄起始位置之區域。通常該套組包含單一基因之順向及逆向引子二者。特定的雜交通常是藉由具有至少12、14、16、18，或20個相鄰的核苷酸之一引子所完成，其為互補於該目標模版。通常該引子為100%相同於該目標模版。若有足夠的互補性區域，亦即12、15、18或20個核苷酸，則該引子可能亦包含額外的核苷酸殘基，其不會干擾雜交但可能對其他操作有益。這類其他殘基之實例可能是為限制內切酶切割之位置、為配位體結合之位置或為因子結合或連結體之位置。該寡核苷酸引子可能是或可能不是特定於經修飾之經甲基化的殘基。該套組可選擇性包含寡核苷酸探針。該探針可能特定為包含經修飾之甲基化的殘基之序列或為包含非甲基化的殘基之序列。如上述之引子，特異性雜交是透過對該標的具有一足夠互補性區域所完成。該套組可視需要包含修飾經甲基化的胞嘧啶殘基之試劑。該套組亦可包含進行放大之元件，例如DNA聚合酶及去氧核糖核苷酸。用以檢測之方法可被提供在該套組中，包含在引子或探針上的可檢測性標記。套組亦可包含用以檢測本發明之標記中之一個的基因表現之試劑。該試劑可包含例如探針、引子或抗體。在酶或配位體的情形下，基質或結合伴體(binding partners)可被用來評估該標的之存在。

用於本發明之方法的材料適合於依據公知常規所製造的套組之製備。本發明因此提供包含試劑的套組，其可包含基因特異性或基因選擇性的探針及/或引子，用以定量用以預測預後結果或惡性程度的該已揭露的基因之表現。該套組可視需要包含自腫瘤樣本中萃取RNA的試劑，特別是被固定包埋於石蠟的組織樣本及/或用於RNA放大的試劑。除此之外，該套組可視需要包含試劑與關於在本發明之方法使用的辨識說明或標籤或指示。該套組可包含容器(包括適合用於一自動化執行該方法之微滴定皿)，用於該方法之各與一或數個之各種試劑(通常以濃縮形式)，包含例如預組式微陣列(pre-fabricated microarrays)、緩衝液、適當的三磷酸核苷(亦即dATP、dCTP、dGTP及dTTP；或rATP、rCTP、rGTP及UTP)、逆轉錄酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶，及本發明之一或多個探針及引子(亦即適當長度的poly(T)或連接到與該RNA聚合酶反應的一個啟動子的隨機引子)。被用於估計或量化預後性或預測性的資訊之數學算法亦為套組之適當地可能元件。

本申請案所提及的所有出版物、專利文件都是為所有目的而以全文引用的方式併入供參考，其引用程度就如同將每一個別出版物或專利文件特定且個別地以全文引用的方式併入。透過這些不同的文獻之引註於本文件，申請人並不承認任何特定文獻為他們發明的「先前技術」。

實例 實例1 本發明之25個生物標記基因之辨識

本實例是為發現為卵巢癌預後預測及篩檢之新穎DNA甲基化生物標記。組織樣本是收集自臺灣臺北國防醫學中心三軍總醫院之知情且同意的病患。本研究是經機構審查委員會(Institutional Review Board)審核並使用61位獨立病患的卵巢樣本，包括49個惡性及12個良性組織。這些樣本是在手術中取得並立即被冷凍於液態氮中並存放於攝氏零下80度直到分析。惡性細胞之存在是藉由病理組織學檢查確認。婦科病理學家審查了所有用以評估組織學的樣本。無疾病存活時間(progression free survival，PFS)被定義為自首次手術至疾病進展(progressive disease)的時間。自第一線標準治療後呈現持續病灶(persistent disease)之病患已被PFS分析排除在外。整體存活(overall survival，OS)被定義為自首次手術至因上皮性卵巢癌(EOC)導致之死亡之時間。

基因組DNA是利用一商業化DNA萃取套組(QIAmp Tissue Kit；Qiagen,Hilden,Germany)自組織樣本中萃取出。基因組血清DNA是利用一商業化DNA血液迷你套組(QIAmp DNA Blood Mini Kit；Qiagen)依據該使用者手冊所描述之協議自1毫升血清中萃取出。

在該基因組DNA中，1微克是依據該製造者的建議利用CpGenome快速DNA修飾套組(Chemicon-Millipore,Bedford,MA,USA)被亞硫酸氫鈉(bisulfate)修飾，並再溶解於70毫升的無核酸水中。我們利用亞硫酸氫鈉修飾(Bisulfite modification)定量性甲基化特異性PCR(quantitative methylation-specific PCR，QMSP)比較了具有上皮性卵巢癌、良性及正常卵巢組織的病患之啟動子甲基化狀態，並經焦磷酸定序(pyrosequencing)分析確認。QMSP是利用LightCycler 480即時性PCR系統(Roche,Indianapolis,IN,USA)在一個TaqMan探針系統中被執行。該DNA甲基化程度是以方程式：10,000×2[(Cp of COL2A)-(Cp of Gene)]估計以供甲基化指標(M-index)。測試結果COL2A的Cp值大於36者被定義為檢測失敗。為焦磷酸定序的引子經PyroMark Assay Design 2.0軟體(Qiagen)設計以放大並定序經亞硫酸氫鹽處理的DNA。該通用並放大的引子是依據先前公開文獻所獲得。該經生物素接合的PCR(biotinylated PCR)產物被接合至鏈黴抗生物素蛋白膠體珠(streptavidin sepharose beads)、沖洗及變性。在加上定序引子至單股PCR產物後，該焦磷酸定序藉由PyroMark Q24軟體(Qiagen,German)依據該製造者指示被進行。

Infinium甲基化分析(Infinium Methylation Assay)被用於分析每個臨床樣本的甲基化圖譜(Laurent L.,Wong E.,LiG.,Huynh T.,Tsirigos A.等人，2010,“Dynamic changes in the human methylome during differentiation,”Genome Res 20：320-331)。包含不同存活結果的病患之甲基化圖譜的差異性甲基化分析被執行以選擇候選基因(PavlidisP,Noble WS,001,“Analysis of strain and regional variation in gene expression in mouse brain,”Genome Biol 2：RESEARCH0042)。一系統性方法顯示於下表以確認在卵巢癌細胞株庫(in pools ovarian carcinoma mad cell lines)的甲基化DNA。每個病人的樣本都在一卵巢群組(ovarian cohort)中被驗證。

我們評估為了各個基因之甲基化狀態之臨界值(cutoff value)之極端區別(extreme discrimination)以藉由計算接收器運作指標(receiver operating characteristic，ROC)曲線下面積(AUC)區分復發及非復發病患。我們利用相同策略來估計最佳化臨界值(optimal cutoff value)以區分死亡及存活病患。依據自AUC分析之最佳化臨界值，我們定義所有甲基化值為高及低的二項式碼(binomial codes)以進行進一步統計。不同群組的類別性變項間的關連被利用卡方檢驗、費雪精確性檢定(Fisher’s exact test)或曼惠特尼U考驗(Mann-Whitney U test)來決定。無疾病存活時間(PFS)及整體存活(OS)描述該存活函數以供Kaplan-Meier存活分析(Kaplan-Meier survival analysis)、單變量及多變量之COX回歸分析(COX regression analysis)。單變量COX回歸分析計算危險比(Hazard ratios，HR)及95%信賴區間(confidence interval，CI)以供評估各候選基因的臨床病理特徵風險。透過對數秩測試(log-rank test)計算中位存活時間給於候選基因具高或低甲基化的病患。該多變量Cox比例風險模型(Cox proportional hazards model)被執行以決定年齡、DNA甲基化狀態、DNA甲基化狀態、階段、等級及組織學類型之獨立預後值。整體的統計資料將雙邊檢定(two-sided test)及p值小於0.05者視為顯著。所有統計性計算主要是利用供供視窗作業系統的SPSS統計軟體版本17.0(SPSS,Inc.,Chicago,IL)來執行。

在短期與長期存活之間，具有統計上顯著性及大規模的差異性甲基化之25個基因被偵測到。表1顯示聚合酶連鎖反應和亞硫酸氫鈉焦磷酸定序引子的總結。表2顯示在25個基因中整體存活之單變量COX回歸分析。表3顯示在良性與惡性腫瘤間差異性甲基化程度。表4顯示為無疾病存活時間(PFS)及整體存活(OS)之甲基化及臨床病理學因子之多變量分析。

圖1顯示具不同預後(長期及短期存活)病患之差異性甲基化分析。該病患以3年的存活期被區分為兩個群組。如圖1所示，在第一第二區塊的點表示差異性經甲基化(右)或未經甲基化(左)之基因。該最顯著的點係為進一步評估之經選擇之候選基因。圖2顯示候選基因之DNA甲基化與存活期之關連。該結果顯示19個基因在高度甲基化狀態下具有高危險，且其他6個基因在低度甲基化下具有較高危險。如圖2(a)所示，具差的預後之DNA高度甲基化被列在右邊。具差的預後之DNA低度甲基化被列在左邊。圖2(b)顯示在患有卵巢癌的病患之Kaplan-meier存活估計之整體存活(OS)。就POU4F2及HS3ST2，依據0.4 AVG值，病患被區分為高甲基化(H)及低甲基化(L)，且高甲基化病患呈現短期存活時間。就CACYBP及Clorf158，依據0.4 AVG值，病患被區分為高甲基化(H)及低甲基化(L)，且低甲基化病患呈現短期存活時間。圖2(c)顯示在患有卵巢癌的病患中Kaplan-meier存活預估之無疾病存活時間(PFS)。NEFH及HS3ST2的高甲基化為危險因子，而POU4F2的低甲基化為危險因子。如左側所示，具有這些甲基化狀態之任何危險因子的病患(病患可能有一、二或三個危險因子)將具有差的預後。如右側所示，不具有這些甲基化狀態之任何危險因子的病患將具有較好的預後。如左側所示，病患具有該三個危險因子之任何二者(病患可能有二或三個危險因子)將具差的預後。不具任何危險因子或僅具一危險因子之病患具有較好的預後。

實例2 本發明之6個生物標記基因之鑑定

組織樣本為經知情後同意的病患於臺灣臺北國防醫學中心三軍總醫院所蒐集。本研究係經機構審查委員會(Institutional Review Board)審核。該病患包含110位患有上皮性卵巢癌(EOS)、60位患有一良性卵巢腫瘤及28位具正常卵巢組織，其診斷包含組織學類型和等級。這些樣本是在手術中獲得並立刻被冷凍於液態氮中並儲存在攝氏零下80度直到分析。惡性細胞之存在係經組織學檢驗所確認。婦科病理學家審查了所有用以評估組織學的樣本。無疾病存活時間(progression free survival，PFS)被定義為自首次手術至疾病進展(progressive disease)之時間。自第一線標準治療後呈現持續病灶(persistent disease)之病患已被PFS分析排除於外。整體存活(overall survival，OS)被定義為自首次手術至因上皮性卵巢癌(EOC)導致之死亡之時間。

基因組DNA萃取、QMSP、Infinium甲基化分析、差異性甲基化分析及Kaplan-Meier存活分析被執行如例1所述。具有統計上顯著性的6個基因及在短期與長期存活間之大規模差異甲基化被偵測到。該亞硫酸氫鈉焦磷酸定序引子被顯示在表5。

這些DNA甲基化之預後顯著性係經測試。為無疾病存活時間(PFS)及整體存活(OS)之單一變量COX回歸分析結果被顯示於表7。如預期中，FIGO階段及組織學等級與PFS及OS有關。ATG4A低甲基化與PFS(HR=2.50；95% CI 1.18-5.26)及OS(HR=2.09；95% CI 1.08-4.04)顯著相關。HIST1H2BN甲基化之存在與復發之間的邊緣性顯著關連被觀察到。具有HIST1H2BN低甲基化的病患之預後與一較差存活具有些微關連；該HR值為6.08(95% CI,0.83-44.45)。為癌症病患的PFS及OS之Kaplan-Meier分析揭露具有ATG4A或HIST1H2BN之低甲基化的病患相較於具有高甲基化的病患在追蹤期間內，呈現顯著較短的PFS(圖3A及3B；分別為P=0.01 and 0.06)及較易死亡(圖3C及3D；分別為P=0.03 and 0.05)。具有順鉑(cisplatin)抗藥性的病患與ATG4A(表6)低甲基化有顯著關連。在多變量Cox比例風險回歸分析(multivariate Cox proportional hazards regression analysis)中，為相關因子調整後，HIST1H2BN甲基化顯示為對PFS及OS(表7)之一獨立影響。有HIST1H2BN低甲基化的病患具5.16的PFS風險比例(hazard ratio)(95% CI,1.22-21.94)及8.08的OS風險比例(95% CI,1.10-59.37)。雖然ATG4A低甲基化在單變量分析中為死亡之一顯著預測指標，然而這種效果在多變量分析中不再明顯。再者，我們用ATG4A及HIST1H2BN共同定義低甲基化群組當該二基因為低甲基化，且其他為高甲基化群組。在圖3E及3F(數秩P分別為0.002及0.004)，這些顯示良好的區別在低及高甲基化癌症病患的PFS與OS。

ATG4A及HIST1H2BN之甲基化狀態在臨床試驗資料中利用qMSP(圖3A及3B)被進一步確認，該臨床資料包含正常卵巢組織、良性及惡性腫瘤組織之。良性及惡性腫瘤相較於正常卵巢組織賦予顯著較高的甲基化程度。

圖1顯示volvano圖說明在微陣列的差異性甲基化。

圖2顯示直方圖說明利用單變量COX比例風險回歸分析(univariate COX proportional hazard regression analysis)之25個基因甲基化之風險比(危險比，HR)。(a)具差的預後之DNA高度甲基化列在右側且具具差的預後之DNA低度甲基化列在左側。(b)在有卵巢癌病患中Kaplan-Meier存活預估之總存活(overall survival)。(c)顯示在有卵巢癌病患中Kaplan-meier存活預估之無疾病存活(progression-free survival，PFS)。

圖3顯示在卵巢癌病患中無疾病存活(A)(B)(E)及總存活(C)(D)(E)之機率的Kaplan-Meier曲線。藉由ATG4A及HIST1H2BN之甲基化狀態將卵巢癌患者之無疾病存活及總存活分層顯示，如藉由Kaplan-Meier曲線及數秩測試所預估。直線：高甲基化；粗線：低甲基化。該低甲基化定義為二基因低甲基化且高甲基化為在(E)(F)至少一基因甲基化。

圖4顯示在卵巢組織中藉由qMSP決定ATG4A(A)及HIST1H2BN(B)之引子甲基化狀態。^＊p<0.05。

<110> 國防醫學院

<120> 預測易罹患卵巢贅瘤或卵巢癌預後之生物標記

<130> A66629/PC0029

<160> 129

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Clorf158

<400> 1

<210> 2

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IGSF21

<400> 2

<210> 3

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HFE2

<400> 3

<210> 4

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRNN

<400> 4

<210> 5

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CACYBP

<400> 5

<210> 6

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OR2L13

<400> 6

<210> 7

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CACNB2

<400> 7

<210> 8

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BNIP3

<400> 8

<210> 9

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD248

<400> 9

<210> 10

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KCNA6

<400> 10

<210> 11

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HS3ST2

<400> 11

<210> 12

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM4

<400> 12

<210> 13

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NEFH

<400> 13

<210> 14

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A4GALT

<400> 14

<210> 15

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POU4F2

<400> 15

<210> 16

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C1QTNF3

<400> 16

<210> 17

<211> 5458

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIST1H3C

<400> 17

<210> 18

<211> 5439

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIST1H2AJ

<400> 18

<210> 19

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MLN

<400> 19

<210> 20

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TWIST1

<400> 20

<210> 21

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NPTX2

<400> 21

<210> 22

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GATA4

<400> 22

<210> 23

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADRA1A

<400> 23

<210> 24

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TNNI1

<400> 24

<210> 25

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TBX20

<400> 25

<210> 26

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ATG4A

<400> 26

<210> 27

<211> 5449

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIST1H2BN

<400> 27

<210> 28

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THRB

<400> 28

<210> 29

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> STC2

<400> 29

<210> 30

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ENG

<400> 30

<210> 31

<211> 6000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MGST2

<400> 31

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADRA1A

<400> 32

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BNIP3

<400> 33

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Clorf158

<400> 34

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CACNB2

<400> 35

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CACYBP

<400> 36

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM4

<400> 37

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HFE2

<400> 38

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIST1H3C

<400> 39

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HS3ST2

<400> 40

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IGSF21

<400> 41

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KCNA6-1252F/1467R

<400> 42

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MLN

<400> 43

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NEFH

<400> 44

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POU4F2-78F/299R

<400> 45

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TWIST1

<400> 46

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADRA1A

<400> 47

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BNIP3

<400> 48

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Clorf158

<400> 49

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CACNB2

<400> 50

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CACYBP

<400> 51

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CEACAM4

<400> 52

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HFE2

<400> 53

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIST1H3C

<400> 54

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HS3ST2

<400> 55

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IGSF21

<400> 56

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KCNA6-1252F/1467R

<400> 57

<210> 58

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MLN

<400> 58

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NEFH

<400> 59

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POU4F2-78F/299R

<400> 60

<210> 61

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TWIST1

<400> 61

<210> 62

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADRA1A_py06

<400> 62

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BNIP3_py03

<400> 63

<210> 64

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BNIP3_py05

<400> 64

<210> 65

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BNIP3_py07

<400> 65

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Clorf158_py04

<400> 66

<210> 67

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CACNB2_py04,05,06

<400> 67

<210> 68

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CACYBP_03,04

<400> 68

<210> 69

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD248_py02

<400> 69

<210> 70

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD248_py03,04

<400> 70

<210> 71

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HS3ST2_py02,03,04

<400> 71

<210> 72

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HS3ST2_py06

<400> 72

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IGSF21_py01

<400> 73

<210> 74

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IGSF21_py02

<400> 74

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KCNA6_py01

<400> 75

<210> 76

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MLN_py02

<400> 76

<210> 77

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MLN_py07

<400> 77

<210> 78

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NEFH_py05

<400> 78

<210> 79

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NEFH_py07

<400> 79

<210> 80

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OR2L13_py05

<400> 80

<210> 81

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POU4F2_py06,07

<400> 81

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TBX20_py05,07

<400> 82

<210> 83

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TWIST1_py04

<400> 83

<210> 84

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADRA1A_py06

<400> 84

<210> 85

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BNIP3_py03

<400> 85

<210> 86

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BNIP3_py05

<400> 86

<210> 87

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BNIP3_py07

<400> 87

<210> 88

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Clorf158_py04

<400> 88

<210> 89

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CACNB2_py04,05,06

<400> 89

<210> 90

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CACYBP_03,04

<400> 90

<210> 91

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD248_py02

<400> 91

<210> 92

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD248_py03,04

<400> 92

<210> 93

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HS3ST2_py02,03,04

<400> 93

<210> 94

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HS3ST2_py06

<400> 94

<210> 95

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IGSF21_py01

<400> 95

<210> 96

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IGSF21_py02

<400> 96

<210> 97

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KCNA6_py01

<400> 97

<210> 98

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MLN_py02

<400> 98

<210> 99

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MLN_py07

<400> 99

<210> 100

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NEFH_py05

<400> 100

<210> 101

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NEFH_py07

<400> 101

<210> 102

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OR2L13_py05

<400> 102

<210> 103

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POU4F2_py06,07

<400> 103

<210> 104

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TBX20_py05,07

<400> 104

<210> 105

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TWIST1_py04

<400> 105

<210> 106

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIST1H2BN

<400> 106

<210> 107

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ATG4A

<400> 107

<210> 108

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THRB

<400> 108

<210> 109

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> STC2

<400> 109

<210> 110

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ENG

<400> 110

<210> 111

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MGST2

<400> 111

<210> 112

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIST1H2BN

<400> 112

<210> 113

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ATG4A

<400> 113

<210> 114

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THRB

<400> 114

<210> 115

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> STC2

<400> 115

<210> 116

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ENG

<400> 116

<210> 117

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MGST2

<400> 117

<210> 118

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIST1H2BN

<400> 118

<210> 119

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ATG4A

<400> 119

<210> 120

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THRB

<400> 120

<210> 121

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> STC2

<400> 121

<210> 122

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ENG

<400> 122

<210> 123

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MGST2

<400> 123

<210> 124

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HIST1H2BN

<400> 124

<210> 125

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ATG4A

<400> 125

<210> 126

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> THRB

<400> 126

<210> 127

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> STC2

<400> 127

<210> 128

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ENG

<400> 128

<210> 129

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MGST2

<400> 129

Claims

一種預測個體易罹患卵巢贅瘤之風險之方法，包含在獲自該個體的卵巢贅瘤樣本，評估一或多個下列基因之DNA甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2、ATG4A、ENG、HIST1H2BN、MGST2及THRB，及與其具有80%序列同一性之一多核苷酸序列；其中DNA甲基化之改變表示該個體係易於罹患卵巢贅瘤。
一種預測經診斷患有卵巢贅瘤的個體之預後或惡性之方法，包含在獲自該個體的卵巢癌樣本，評估一或多個下列基因之DNA甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2、ATG4A、ENG、HIST1H2BN、MGST2及THRB，及其與具有80%序列同一性之多核苷酸序列；其中DNA甲基化之改變表示差的預後或惡性卵巢癌。
如請求項1或2之方法，其中下列情況表示差的預後：相較於非癌細胞被觀察到的DNA甲基化，一種或多個下列基因具DNA高度甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、 HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、ATG4A、HIDT1H2BN、THRB及MGST2，及/或相較於非癌細胞被觀察到的DNA甲基化，一或多個下列基因具低度甲基化：CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2及ENG。
如請求項3之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIDT1H2BN、ADRA1A、CACNB2、GATA4、KCNA6、POU4F2、HS3ST2或NEFH或其任意組合。
如請求項3之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIDT1H2BN、CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。
如請求項3之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。
如請求項3之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為POU4F2、NEFH、HS3ST2或其任意組合。
如請求項3之方法，其中該DNA低度甲基化之基因為CACYBP，或C1orf158或其組合。
如請求項3之方法，其中該DNA低度甲基化之基因為CACYBP，或MLN或其組合。
一種為患有卵巢癌之人類個體作成治療決定之方法，包含投藥有效劑量之去甲基化製劑至該個體，其中相較於在非癌細胞被觀察到的DNA甲基化作用，該個體呈現一或多個下列基因之高度甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、ATG4A、HIDT1H2BN、THRB及MGST2，及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列。
如請求項10之方法，其中該去甲基化製劑為5-氮雜-2’-脫氧胞苷、5-氮雜-胞苷、澤布拉濱(Zebularine)、普魯卡因(procaine)，或L-乙硫氨酸。
如請求項10之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、CEACAM4、GATA4、NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3或KCNA6或其任意組合。
如請求項10之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、ADRA1A、CACNB2、GATA4、KCNA6、POU4F2、HS3ST2或NEFH或其任意組合。
如請求項10之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。
如請求項10之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。
如請求項10之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為POU4F2、NEFH、HS3ST2或其任意組合。
一種為差的預後或惡性之卵巢癌之個體決定治療方案之方法，包含提供化學治療於該個體，其中相較於在非癌細胞被觀察到的DNA甲基化作用，該個體具一或多個下列基因之DNA高度甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、ATG4A、HIDT1H2BN、THRB及MGST2，及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列，及/或相較於在非癌細胞被觀察之DNA甲基化作用，該個體具一或多個下列基因之DNA低度甲基化：CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2及ENG，及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列。
如請求項17之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為CEACAM4、GATA4、NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3或KCNA6或其任意組合。
如請求項17之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為ATG4A、HIST1H2BN、ADRA1A、CACNB2、GATA4、KCNA6、POU4F2、HS3ST2或NEFH或其任意組合。
如請求項17之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為CEACAM4、GATA4或IGSF21或其任意組合。
如請求項17之方法，其中該DNA高度甲基化之基因為POU4F2、NEFH或HS3ST2或其任意組合。
如請求項17之方法，其中該DNA低度甲基化之基因為CACYBP、HIST1H2AJ或C1orf158或其任意組合。
如請求項17所述之方法，其中該DNA低度甲基化之基因為CACYBP或C1orf158或其任意組合。
如請求項17之方法，其中該DNA低度甲基化之基因為CACYBP，或MLN或其組合。
如請求項17之方法，其中該化學治療為輔助性化學治療。
一種為個體預測卵巢贅瘤之風險或易罹患性或為患有卵巢癌之個體預測預後，偵測惡性及/或作出治療決定之套組，包含對一或多個下列基因鑑別甲基化與非甲基化之胞嘧啶殘基之試劑：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2、ATG4A、ENG、HIST1H2BN、MGST2及THRB，及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列；其中下列情況表示一差的預後或惡性之卵巢癌：相較於在非癌細胞被觀察之DNA甲基化作用，一或多個下列基因呈現DNA高度甲基化：NPTX2、TNNI1、POU4F2、HS3ST2、CACNB2、TBX20、OR2L13、IGSF21、CD248、ADRA1A、NEFH、BNIP3、C1QTNF3、KCNA6、CEACAM4、CRNN、HFE2、TWIST1、GATA4、ATG4A、HIDT1H2BN、THRB 及MGST2及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列，及/或相較於在非癌細胞被觀察之DNA甲基化作用，一或多個下列基因呈現DNA低度甲基化：CACYBP、HIST1H2AJ、C1orf158、A4GALT、MLN、HIST1H3C、STC2及ENG及與其具有80%序列同一性之多核苷酸序列。
如請求項1、2、8、13及19之任一請求項之方法，其中該贅瘤樣本係獲自個體或存在於個體之樣本。
如請求項1、2、8、13及19之任一請求項之方法，其中該贅瘤樣本係獲自組織、組織樣本，或細胞樣本、腫瘤、腫瘤樣本、生物流體、腹膜液、血液、血清、淋巴，或脊髓液。