JP2023528533A - 循環腫瘍核酸分子のマルチモーダル分析 - Google Patents

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Abstract

態様において、対象のがん細胞からｃｔＤＮＡが存在することを検出する方法であって、（ａ）対象からセルフリーＤＮＡの試料を得る工程、（ｂ）試料をライブラリ調製に供して、セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の配列決定を可能にする工程、（ｃ）第１の量のフィラーＤＮＡが試料に添加されていてもよく、フィラーＤＮＡの少なくとも一部がメチル化され、次いで、さらに、試料を変性されていてもよい工程、（ｄ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡを捕捉する工程、（ｅ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、（ｆ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用いて、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの配列を比較する工程、（ｇ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来のＤＮＡの存在を同定する工程を含み、捕捉する工程、比較する工程または同定する工程の少なくとも１つにおいて、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定される、方法が提供される。【選択図】図４

Description

相互参照
本願は、２０２０年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，１５１号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、日常的な臨床的な使用のための非侵襲的な腫瘍特異的バイオマーカーとしての可能性をいっそう実証している。ｃｔＤＮＡは、主に細胞死を経ている腫瘍細胞に由来し、血液を含む様々な体液の循環に放出される。ほとんどのがん患者において、血液由来のセルフリーＤＮＡの大部分は末梢血白血球（ＰＢＬ）に由来する。したがって、ｃｔＤＮＡの検出および定量には、腫瘍由来の遺伝的およびエピジェネティックな変化の同定が必要である。さらに、観察されたｃｔＤＮＡの画分は、腫瘍の原発部位および疾患の負荷を含むいくつかの因子に応じて、診断時の全セルフリーＤＮＡの０．１％未満～９０％の範囲であり得る。ｃｔＤＮＡは、腫瘍の分子状況および疾患の負荷に対する非侵襲的なアクセスをもたらしている。特に、低い存在量のｃｔＤＮＡを有する対象において、高感度でｃｔＤＮＡを検出する方法が、必要である。
参照による組み込み
個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることを示しているかのように、それと同程度に、本明細書にて言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
態様において、対象のがん細胞からｃｔＤＮＡが存在することを検出する方法であって、
（ａ）対象からセルフリーＤＮＡの試料を得る工程、
（ｂ）試料をライブラリ調製に供して、セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の配列決定を可能にする工程、
（ｃ）第１の量のフィラーＤＮＡが試料に添加されていてもよく、フィラーＤＮＡの少なくとも一部がメチル化され、次いで、さらに、試料を変性されていてもよい工程、
（ｄ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡを捕捉する工程、
（ｅ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
（ｆ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用いて、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの配列を比較する工程、
（ｇ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来のＤＮＡの存在を同定する工程
を含み、捕捉する工程、比較する工程または同定する工程の少なくとも１つにおいて、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定される、方法が提供される。
態様として、本開示は、対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定する方法を提供する。方法は、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルからなる群から選択される少なくとも１つのプロファイルを生成するために対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および前記対象が前記疾患を有するかまたは疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ナノグラム（ｎｇ）／ミリリットル（ｍｌ）未満の複数の核酸分子を含む、処理する工程を含む。
いくつかの実施形態では、セルフリー核酸試料は、１０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、セルフリー核酸試料は、５ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、セルフリー核酸試料は、１ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）に供する工程が、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からなる群から選択される少なくとも２つのプロファイルを生成する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのプロファイルは、前記メチル化プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのプロファイルは、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのプロファイルは、前記メチル化プロファイルおよび前記変異プロファイルを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）を供する工程が、前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを生成する。
別の態様では、本開示は、対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定する方法を提供する。方法は、複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、および前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するために、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを使用する工程を含む。
いくつかの実施形態では、疾患はがんを含む。いくつかの実施形態では、がんが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、扁平上皮癌、および頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択されるがんからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がんは扁平上皮癌である。いくつかの実施形態では、がんは頭頸部扁平上皮癌である。
いくつかの実施形態では、複数のセルフリー核酸分子は、循環腫瘍核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、循環腫瘍核酸は循環腫瘍ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、循環腫瘍核酸は循環腫瘍ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、メチル化プロファイルは、複数の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を含む。いくつかの実施形態では、複数のＤＭＲはｃｔＤＮＡ由来である。いくつかの実施形態では、末梢血白血球に由来する複数のＤＭＲがメチル化プロファイルから除去される。いくつかの実施形態では、複数のＤＭＲが、正常で健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して低メチル化レベルを有する少なくとも約５６のゲノム領域を含む。いくつかの実施形態では、複数のＤＭＲは、正常で健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して、過剰メチル化レベルを有する少なくとも約９４１のゲノム領域を含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲは、少なくとも約３００ｂｐのサイズを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲは、少なくとも約１００ｂｐ～少なくとも約２００ｂｐのサイズを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲは、少なくとも約１００ｂｐ～少なくとも約１５０ｂｐのサイズを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲが少なくとも８のＣｐＧゲノムアイランドを含む。いくつかの実施形態では、正常で健常な対象は、前記対象と同じリスク因子のセットを含む。
いくつかの実施形態では、変異プロファイルは、ミスセンス変異体、ナンセンス変異体、欠失変異体、挿入変異体、重複変異体、逆位変異体、フレームシフト変異体、または反復伸長変異体を含む。いくつかの実施形態では、複数の末梢血白血球から得られたゲノムＤＮＡ試料に存在する任意の変異体であって、前記複数の末梢血白血球が前記対象から得られ、前記変異プロファイルから除去される、変異体。いくつかの実施形態では、クローン造血に由来する任意の変異体が前記変異プロファイルから除去される。いくつかの実施形態では、変異プロファイルが、遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、またはＡＳＸＬ１の変異体を含まない。いくつかの実施形態では、変異プロファイルは、標準的ながんドライバ遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、変異プロファイルが非標準的がんドライバ遺伝子を含み、前記非標準的遺伝子がＧＲＩＮ３ＡまたはＭＹＣである。
いくつかの実施形態では、断片の長さプロファイルは、少なくとも約８０ｂｐ～１７０ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む。いくつかの実施形態では、断片の長さプロファイルは、少なくとも約１００ｂｐ～１５０ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む。いくつかの実施形態では、循環腫瘍核酸分子が濃縮される。
いくつかの実施形態では、方法は、前記セルフリー核酸試料をフィラーＤＮＡ分子と混合してＤＮＡ混合物を生じることをさらに含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡ分子は、約５０ｂｐ～８００ｂｐの長さを含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡ分子は、約１００ｂｐ～６００ｂｐの長さを含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡ分子は、少なくとも約５％のメチル化フィラーＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡ分子は、少なくとも約２０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡ分子は、少なくとも約３０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡ分子は、少なくとも約５０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、前記ＤＮＡ混合物を、メチル化ヌクレオチドに結合するように構成された結合剤とインキュベートして濃縮試料を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、結合剤は、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質はＭＢＤ２タンパク質である。いくつかの実施形態では、結合剤は抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は５－ＭｅＣ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は５－ヒドロキシメチルシトシン抗体である。いくつかの実施形態では、配列決定は亜硫酸水素塩配列決定を含まない。いくつかの実施形態では、セルフリー核酸試料は血液試料を含む。いくつかの実施形態では、血液試料は血漿試料を含む。いくつかの実施形態では、方法は、がん組織の起源を検出することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、前記対象の生存率の予後を含む報告を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、前記対象に治療を与えることをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記疾患の治療に続いて、方法は、前記治療が有効であるかどうかを示す第２の報告を与えることをさらに含む。
別の態様において、本開示は、対象が状態を有するか、または状態を有するリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、前記対象からの試料の少なくとも一部から得たセルフリー核酸分子をアッセイする工程、表５に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記メチル化レベルを、前記表５に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較する工程を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、セルフリー核酸分子はｃｔＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、方法は、配列決定分析を実施することを含み、前記配列決定分析がｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ｃｆＭｅＤＩＰ）配列決定を含む。いくつかの実施形態では、検出する工程が、表５に列挙される６つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上のＤＭＲに含まれる前記核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを測定することを含む。
別の態様では、本開示は、対象が疾患の治療を受けた後により高い生存率を有するかどうかを判定する方法であって、前記対象からの試料の少なくとも一部からのセルフリー核酸分子をアッセイする工程、表６に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記メチル化レベルを、表６に列挙される前記ＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルに処理することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、セルフリー核酸分子はｃｔＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、検出する工程は、複合体メチル化スコア（ＣＭＳ）を提供することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＳは、表６に列挙されたＤＭＲのβ値の合計を含む。いくつかの実施形態では、より高いＣＭＳは、前記対象の生存率がより低いことを示す。いくつかの実施形態では、ＣＭＳは、ｃｔＤＮＡの存在量に依存しない。いくつかの実施形態では、疾患は扁平上皮癌である。いくつかの実施形態では、がんは頭頸部扁平上皮癌である。
別の態様では、本開示は、対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するためのシステムであって、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも１つのプロファイルを生成するために前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および前記対象が前記疾患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、処理する工程を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含むシステムを提供する。
別の態様では、本開示は、対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するシステムであって、複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、および前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するために、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを使用する工程を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含む、システムを提供する。
本発明の好ましい実施形態のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照する以下の詳細な説明においてより明らかになるであろう。
ＣＡＰＰ－ＳｅｑによるｃｔＤＮＡの検出のためのＰＢＬフィルタリングの利用。Ａ）一致した患者の血漿および／またはＰＢＬにおいて同定された候補のＳＮＶの変異対立遺伝子画分。ピアソンの相関を、一致した患者の血漿およびＰＢＬの両方に厳密に見出されるＳＮＶに対して行った。患者の血漿にのみ見られる候補ＳＮＶを破線の赤い箱の内部に示す。Ｂ）一致した患者の血漿およびＰＢＬの両方において同定された候補ＳＮＶの発症。上段のヒストグラムは、患者ごとのＳＮＶの数を示し、右側のヒストグラムは、特定の遺伝子が変異している患者の数を示す。Ｃ）ＰＢＬ関連ＳＮＶの除去前後のＨＮＳＣＣ患者のｃｆＤＮＡ（赤色円）およびＰＢＬ（青色円）にわたる候補ＳＮＶの平均ＭＡＦ。ＰＢＬフィルタリング後に存在しないＳＮＶを有する患者は、ｃｔＤＮＡの偽陽性検出を示す。Ｅ）２０／３２のＨＮＳＣＣ患者において同定された選択されたＰＢＬフィルタリングされたＳＮＶの発症。上のヒストグラムおよび右のヒストグラムは、（Ｂ）で前述したようなヒストグラムを示す。Ｆ）すべてのＨＮＳＣＣ患者にわたるＰＢＬ濾過されたＳＮＶの平均変異対立遺伝子のパーセンテージ。患者ごとの各ＳＮＶについて、変異対立遺伝子のパーセンテージを、ＳＮＶ塩基対の位置と重複するネイティブ配列を含むリードと比較して、目的のＳＮＶを含むリードの画分によって計算した。 ＣＡＰＰ－ＳｅｑによるｃｔＤＮＡの検出のためのＰＢＬフィルタリングの利用。Ｂ）一致した患者の血漿および／またはＰＢＬにおいて同定された候補のＳＮＶの変異対立遺伝子画分。ピアソンの相関を、一致した患者の血漿およびＰＢＬの両方に厳密に見出されるＳＮＶに対して行った。患者の血漿にのみ見られる候補ＳＮＶを破線の赤い箱の内部に示す。Ｃ）一致した患者の血漿およびＰＢＬの両方において同定された候補ＳＮＶの発症。上段のヒストグラムは、患者ごとのＳＮＶの数を示し、右側のヒストグラムは、特定の遺伝子が変異している患者の数を示す。Ｄ）ＰＢＬ関連ＳＮＶの除去前後のＨＮＳＣＣ患者のｃｆＤＮＡ（赤色円）およびＰＢＬ（青色円）にわたる候補ＳＮＶの平均ＭＡＦ。ＰＢＬフィルタリング後に存在しないＳＮＶを有する患者は、ｃｔＤＮＡの偽陽性検出を示す。Ｅ）２０／３２のＨＮＳＣＣ患者において同定された選択されたＰＢＬフィルタリングされたＳＮＶの発症。上のヒストグラムおよび右のヒストグラムは、（Ｂ）で前述したようなヒストグラムを示す。Ｆ）すべてのＨＮＳＣＣ患者にわたるＰＢＬ濾過されたＳＮＶの平均変異対立遺伝子のパーセンテージ。患者ごとの各ＳＮＶについて、変異対立遺伝子のパーセンテージを、ＳＮＶ塩基対の位置と重複するネイティブ配列を含むリードと比較して、目的のＳＮＶを含むリードの画分によって、計算した。 ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡの検出のための情報領域の同定。Ｂ）ＦａＤｕゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）［１×１×５２の比較］、一致しないＰＢＬのｇＤＮＡ［１×５１×５２の比較］、および一致するＰＢＬのｇＤＮＡ［１×１×５２の比較］ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルに対する、患者および健常なドナー由来の８以上のＣｐＧとの３００ｂｐの非重複ウィンドウのピアソンの相関（ｎ＝５２）。Ｃ）健常なドナー（右）およびＨＮＳＣＣ（左）のＰＢＬ ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルにおけるインシリコのＰＢＬ枯渇のパフォーマンス。絶対的なメチル化スコアを、ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑカウントからＭｅＤＥＳｔｒａｎｄ（方法）によって計算した。ＰＢＬ枯渇前の３００ｂｐの非重複ウィンドウ（青色）は、８以上のＣｐＧを有する１番染色体から２２番染色体までのすべてのウィンドウに対応する（ｎ＝７０２，４８８）。ＰＢＬ枯渇後の３００ｂｐの非重複ウィンドウ（赤色）は、健常なドナーのＰＢＬにわたる絶対的なメチル化の中央値が＜０．１である追加のフィルターを含む（ｎ＝９９，９９７）。Ｄ）ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルの差次的メチル化分析によるｃｔＤＮＡ検出のワークフロー。ＨＮＳＣＣ関連ｃｆＤＮＡメチル化を同定するために、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ（すなわち、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性、ｎ＝２０）による検出可能なＳＮＶを有するＨＮＳＣＣ患者からのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを、ＰＢＬ枯渇ウィンドウ内で健常なドナー（ｎ＝２０）と比較した。過剰メチル化領域および低メチル化領域は、ＦＤＲ＜１０％で健常なドナーと比較して、ＨＮＳＣＣコホートにおいてメチル化がより高いまたはより低い領域として示される。Ｅ）ＣｐＧ部位によって注釈付けされた過剰メチル化領域の順列分析（ｎ＝１０，０００の全順列）。有意な濃縮／枯渇は、０．０５未満のｐ値により観察されたｚスコアとして示される。Ｆ、ＴＣＧＡ由来の腫瘍特異的メチル化シトシン内の過剰メチル化領域の順列分析（ｎ＝合計１０００の順列）。有意な濃縮／枯渇は、０．０５未満のｐ値により観察されたｚスコアとして示される。 ＣＡＰＰ－ＳｅｑプロファイルとｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルとの間のｃｔＤＮＡ検出および存在量の一致。Ａ）ＣＡＰＰ－ｓｅｑによるＨＮＳＣＣ患者にわたる検出されたＳＮＶの断片の長さの中央値。各患者について、各ＳＮＶおよび一致する参照対立遺伝子の断片の長さの中央値を測定した。各変異または一致した参照対立遺伝子についての断片の長さの中央値の分布を患者ごとに示す。箱および中心線の端部は、それぞれ上側および下側の四分位および中央値を定義する。単一のＳＮＶを有する場合、色付きの線は、それぞれＳＮＶまたは一致した参照対立遺伝子を含む断片の長さの中央値を示す。Ｂ）ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるＨＮＳＣＣ過剰メチル化領域内の断片の長さの分布。健常なドナー由来の断片の長さを分析前にプールし、その後の各箱は個々のＨＮＳＣＣのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを示す。箱および中心線の端部は、それぞれ上側および下側の四分位および中央値を定義する。個々のＨＮＳＣＣ試料は、過剰メチル化領域内のメチル化（ＲＰＫＭ）の平均の増加に基づいて並べられる。破線の青色線は、すべての健常なドナーにわたる断片の長さの中央値を定義する。Ｃ）１００～２２０ｂｐの断片による過剰ＤＭＲ領域の濃縮と比較した、１００～１５０ｂｐの断片による過剰ＤＭＲ領域の濃縮の比。比率は、解釈を容易にするために増加／減少パーセントに変換した。Ｄ）１００～２２０ｂｐの断片による過剰ＤＭＲ領域の濃縮と比較した、１００～１５０ｂｐの断片による過剰ＤＭＲ領域の濃縮の比。＋の符号は、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによって検出可能なｃｔＤＮＡを有するＨＮＳＣＣ患者を示す（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性）。Ｅ）ＨＮＳＣＣの過剰メチル化領域にわたる対数変換されたＲＰＫＭの値による、１００ｂｐ～１５０ｂｐに限定されたｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルの教師あり階層的分類。各ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルのＲＰＫＭの値を、ユークリッド変換の前にｌｏｇ２変換し、Ｗａｒｄの方法を使用してクラスター化した。メチル化クラスターは、ｋ＝４の閾値で定義された。Ｆ）それぞれＣＡＰＰ－ｓｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ（１００～１５０ｂｐに限定）による、同定されたＳＮＶおよび過剰メチル化領域からの変異対立遺伝子頻度の平均およびＲＰＫＭの平均の関係。点は、ＨＮＳＣＣまたは健常なドナーの血漿由来の個々の試料を示す。実線の赤色線および影付きの灰色領域は、それぞれフィッティングされた線形回帰モデルおよび関連する９５％信頼区間を示す。Ｇ）ＨＮＳＣＣを健常なドナーのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルと比較する、ＨＮＳＣＣの過剰メチル化領域内のメチル化の値（１００～１５０ｂｐに限定）に基づくＡＵＲＯＣ分析。ｃｔＤＮＡの検出は、メチル化の平均が健常なドナーにわたる最大値を超えた場合と定義した。Ｈ）メチル化クラスター４と比較した、メチル化クラスター１＋２＋３内の患者の全生存のカプラン・マイヤー曲線分析。Ｉ＋Ｊ）ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルからの断片の長さの中央値（Ｉ）と、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑからの断片の長さの中央値と、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルからの１００～１５０：１５１～２２０ｂｐの比（Ｊ）との比較。点は、メチル化クラスター１および２内部の個々のＨＮＳＣＣ試料を定義した。実線の赤色線および網掛けの灰色領域は、それぞれフィッティングされた線形回帰モデルおよび９５％信頼区間を示す。 ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって検出されるｃｔＤＮＡ内の特定のメチル化領域の予後の有用性。Ａ）それぞれＣＡＰＰ－ｓｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ（１００～１５０ｂｐに限定）による、同定された変異および過剰メチル化領域からの変異対立遺伝子画分の平均およびＲＰＫＭの平均の関係。点は、ＨＮＳＣＣまたは健常対照血漿からの個々の試料を示す。実線の赤線：フィッティングされた線形回帰モデル。灰色の境界：９５％信頼区間。Ｂ）ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑの両方による検出可能なｃｔＤＮＡを有する患者の全生存を示すカプラン・マイヤー解析（過剰ＤＭＲ内での健常対照を上回るメチル化の平均）Ｃ）ＴＣＧＡによって提示されるＨＮＳＣＣ原発腫瘍にわたる多変量コックス比例ハザード回帰分析による疾患特異的生存に基づく予後領域の同定（ｎ＝５２０）。領域は、前述のように３００ｂｐウィンドウとして定義した。ヒトメチル化の４５０ＫのデータをＴＣＧＡから得て、各領域と重複するプローブＩＤからのβ値を平均した。予後解析のための候補領域を、固形の隣接する正常組織（ｎ＝５０）と比較した原発腫瘍（ｎ＝５２０）にわたるメチル化の上昇に基づいて選択した（ウィルコクソン検定、調整されたｐ値＜０．０５、ｌｏｇ２ＦＣ＞１）。Ｇ～Ｈ）特定の３００ｂｐ領域（箱）のメチル化から特定の転写産物のＲＮＡ発現までのスピアマンの相関。絶対的なＲ値が０．３以上の領域（灰色の破線で示す）を有意な関連性としてラベル付けした。ＴＣＧＡによって提示されるＨＮＳＣＣ患者の疾患特異的生存についての予後予測であったメチル化領域（ｎ＝５２０）は、赤い輪郭で示されている。ＲＮＡ発現にさらに関連した予後領域を実線の赤色で示す。ＲＮＡ発現に関連する予後メチル化領域の例；（Ｇ）ＯＳＲ１、（Ｈ）ＬＩＮＣ０１３９１を備える。Ｅ）それぞれＺＮＦ３２３／ＺＳＣＡＮ１、ＬＩＮＣ０１３９１、ＧＡＴＡ－ＡＳ１、ＯＳＲ１、およびＳＴＫ３／ＭＳＴ２の発現に影響を及ぼす５つの領域にわたる全メチル化に基づくＨＮＳＣＣ－ＴＣＧＡ患者の全生存期間のカプラン・マイヤー曲線。すべての原発腫瘍にわたって（Ｄ）で以前に同定された５つの領域の全メチル化の中央値より下（Ｂｌｗ ｍｅｄ．青）または上（Ａｂｖ ｍｅｄ．赤）のいずれかであることに基づいて、患者を層別化した。Ｆ）ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによる検出可能なｃｔＤＮＡを有するＨＮＳＣＣ血漿コホートについての（Ｅ）に記載されるような全生存のカプラン・マイヤー曲線。予後との関連性を有する５つの遺伝子にわたる総メチル化を計算するために、ＲＰＫＭの値を、生存分析の前に先行して同定されたすべての過剰ＤＭＲ領域にわたって適宜スケーリングした。 長期モニタリングのためのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡ検出の臨床的有用性。Ａ）ｃｔＤＮＡ動態は、典型的には、治療全体を通して患者にわたって観察される。完全なクリアランスを、診断時の検出されたｃｔＤＮＡから、最初に利用可能な治療中／治療後の時点での検出閾値（すなわち、０．２％）未満のｃｔＤＮＡ存在量の減少への変化と定義した。部分クリアランスは、診断時の検出されたｃｔＤＮＡから、最初に利用可能な治療中／治療後の時点で検出閾値を超えるｃｔＤＮＡ存在量の減少（９０％以上）への変化と定義した。クリアランスなしは、診断時と比較した、治療中／治療後試料におけるｃｔＤＮＡ存在量の増加と定義した。ｌａｓｔＦＵ＝最後のフォローアップ時の試料採取、ＲＴ＝放射線療法。Ｂ）診断時のｃｔＤＮＡ存在量の、ＨＮＳＣＣ患者にわたる最初に利用可能な治療中／治療後の時点までの変化（ｎ＝３０）。赤い線はクリアランスなしの動態を示した患者、灰色の線はクリアランス／部分クリアランスの動態を有する患者を表示する。Ｃ、無再発生存のカプラン・マイヤー曲線。クリアランスの動態（すなわち、クリアランスなし対クリアランス／部分クリアランス）に基づいて患者を層別化した。 すべてのまたはｃｔＤＮＡが濃縮された断片に対して行われたｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ分析の比較。ｃｔＤＮＡ濃縮断片は、長さが１００～１５０ｂｐの範囲の断片として定義される。Ａ）すべての断片（左）またはｃｔＤＮＡ濃縮断片（右）を含むｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルにおける以前に同定されたＨＮＳＣＣの過剰ＤＭＲのＣＡＰＰ－Ｓｅｑ対ＲＰＫＭの平均値によって同定された変異の変異対立遺伝子頻度。Ｂ）健常なドナーに対するＨＮＳＣＣのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性のみ：赤色、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性および陰性：青色）におけるｃｔＤＮＡ検出についての曲線下面積分析（ＡＵＲＯＣ）。ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性患者を用いた交差検証分析の結果も示す（反復＝５０）。すべての断片（左）またはｃｔＤＮＡ濃縮断片（右）を用いたｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルについて分析を示す。Ｃ）すべての断片（左）またはｃｔＤＮＡ濃縮断片を用いた縦断的ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイリングに基づく無再発生存のカプラン・マイヤー分析。患者は、以前に同定された０．２％を超える過剰ＤＭＲ内のメチル化存在量を実証した場合、治療後のｃｔＤＮＡについて陽性であると分類された。 本明細書で提供される方法を実施するようにプログラムさもなければ構成することができるコンピュータシステムを示す。 ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーから単離されたセルフリーＤＮＡの試料の特性。Ａ）血液単離の時点を定義する概略図。Ｂ）ＨＮＳＣＣ患者ならびに健常なドナー（すなわち、「正常」）についての諸時点にわたる（血漿１ｍＬあたりに対して正規化された）ｃｆＤＮＡ収量。 ＣＡＰＰ－ＳｅｑセレクタによってカバーされるＨＮＳＣＣ患者ごとのＳＮＶの数の分析であって、ＨＮＳＣのＴＣＧＡコホートにおける３６４名すべての患者の中で評価されるか（青色の菱形）、または一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ；赤い四角）を使用して評価される分析。 ２０／３２のＨＮＳＣＣ患者において同定されたすべてのＰＢＬフィルタリングされたＳＮＶの発症（図２Ｅに関連）。 情報領域を同定するための関連性のある図である（図３Ｂおよび図３Ｃに関連）。Ａ）ｎ個以上のＣｐＧに基づくゲノムワイド（染色体１～２２）３００ｂｐの重複しないビンのＲＰＫＭの中央値。Ｂ）図２Ｂおよび方法に記載されるようなＰＢＬ枯渇ウィンドウ内のＨＮＳＣＣと健常なドナーのＰＢＬとの間における差次的メチル化分析。低メチル化領域（すなわち、健常なドナーのＰＢＬにおいてメチル化が上昇している領域）を青色で示す。 ＰＢＬ枯渇ウィンドウ内のＨＮＳＣＣと健常なドナーのｃｆＤＮＡ試料との間の差次的メチル化分析の結果に関連する図（図２Ｄ）。Ａ）ＤＭＲは、初期分析に使用した元の３００ｂｐの非重複ウィンドウに基づいて定義した。互いに直接隣接するＤＭＲをそれぞれの幅（すなわち、２つの３００ｂｐウィンドウは、それぞれ独立して、６００ｂｐの長さを有すると定義される）にビニングした。Ｂ）低メチル化領域に基づく、図２Ｅに定義されるＣｐＧ特徴の順列分析。 がん特異的な差次的メチル化シトシンの同定に基づくＴＣＧＡ原発腫瘍の教師あり階層的クラスター化。Ｃａｎｃｅｒ＿ｔｙｐｅ（列）は、各原発腫瘍またはＰＢＬ試料の分類を指し、ｃａｎｃｅｒ＿ＤＭＣｓ（行）は、各がんタイプについて同定されたがん特異的な差次的メチル化シトシン（ＰＢＬは除外される）を指す。 図４と関連性のある図である。Ａ）平均変異対立遺伝子画分と比較した、患者ごとのＣＡＰＰ－Ｓｅｑによる同定されたＳＮＶＳの断片の長さの中央値。Ｂ）過剰ＤＭＲのＲＰＫＭの平均と比較した、患者ごとのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる過剰ＤＭＲＳ内の断片の長さの中央値。 ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ一致分析の関連性のある図である（図４Ｅ）。Ａ）ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ試料と健常なドナーとの間の差次的メチル化領域呼び出しの交差検証分析（ｎ＝５０）から得られた曲線下面積の値。Ｂ）ＣＡＰＰ－ＳｅｑによるｃｔＤＮＡの検出に基づくＨＮＳＣＣ患者の全生存のカプラン－ミール分析。Ｃ）およびＤ）メチル化クラスターに基づいて層別化されたＨＮＳＣＣ患者の試料のＲＰＫＭの平均および変異対立遺伝子画分の平均（図４Ｄ）。 潜在的な臨床的有用性の領域の同定（図６に関連）。Ａ）ＴＣＧＡ内のＨＮＳＣＣ原発腫瘍ならびに本発明者らのＨＮＳＣＣコホートからの血漿由来過剰ＤＭＲと重複する市販の液体生検試験で現在使用されている遺伝子のゲノムトラック。矢印を有する下の濃い青色のバーは、特定の遺伝子の転写の方向を示す。赤色のバーは、本発明者らのＨＮＳＣＣコホートの血漿由来の過剰ＤＭＲならびにＴＣＧＡ由来の原発性腫瘍と重複する３００ｂｐのウィンドウの位置を示す。Ｂ～Ｄ）特定の３００ｂｐ領域（箱）のメチル化から特定の転写産物のＲＮＡ発現までのスピアマンの相関。絶対的なＲ値が０．３以上の領域（灰色の破線で示す）を有意な関連性としてラベル付けした。ＴＣＧＡによって提示されるＨＮＳＣＣ患者の疾患特異的生存についての予後予測であったメチル化領域（ｎ＝５２０）は、赤い輪郭で示されている。ＲＮＡ発現にさらに関連した予後領域を実線の赤色で示す。ＲＮＡ発現に関連する、予後メチル化領域を含む５つすべての遺伝子について図を作成した。（Ｂ）ＧＡＴＡ２－ＡＳ１、（Ｃ）ＺＮＦ３２３、（Ｄ）、ＳＴＫ３。 すべてのＨＮＳＣＣ患者についての治療全体にわたる、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡ存在量の変化を示す、図６Ａの拡大図である（ｎ＝３２）。
以下の説明では、本発明の完全な理解をもたらすために、多数の具体的な詳細が記載される。しかし、本発明は、これらの具体的な詳細がなくとも実施され得ることが理解される。
本開示は、高感度および／または高い特異度で、対象ががんを有する可能性を判定する際のｃｔＤＮＡのマルチモーダル分析のための方法、システムおよびキットを提供する。さらに、本開示は、がんの治療後の微小残存病変（ＭＲＤ）を検出し、そのようながんの治療が治療上有効であるかどうかを評価するための方法、システムおよびキットを提供する。
治療前にｃｔＤＮＡから特定の分子的特徴を同定することは、予後について知らせることができ、および／または治療に対する予測応答であり得るが、治療後のｃｔＤＮＡの検出は、ＭＲＤの同定を促し、再発および／または死亡のリスクが高い患者の同定を補助し得る。安定した感度を成し遂げるために、ほとんどの臨床研究は、少数の領域を調べるｃｔＤＮＡ検出方法、一致した腫瘍プロファイリング、および／または高いｃｔＤＮＡ存在量の事例を利用している。しかし、低レベルのｃｔＤＮＡを有するか、または患者全体で共通する／既知の異常を欠くがんについては、似た程度の感受性を達成するために、追加の戦略を利用し得る。ゲノムワイドなプロファイリング技術は、極めて多くの領域を網羅することにより、感度を改善するのに役立ち得る。しかし、１％未満の断片の検出を達成するために必要なセルフリーＤＮＡの量および配列決定深度は、法外なコストを要してきた。
高感度のｃｔＤＮＡ検出が可能な２つの個別化ゲノムワイドプロファイリング技術が記載されている。１つ目のＣＡｎｃｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）は、１００を超える遺伝子を標的とする広範なハイブリッド捕捉プローブを利用して、対立遺伝子の低頻度変異を同定する。第２の、ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）は、抗５－メチルシトシン（抗５ｍＣ）抗体を使用することによって、メチル化ｃｆＤＮＡ断片を濃縮する。これらのそれぞれの方法による変異または高メチル化事象の同定は、それぞれの利点を有する。適切なエラー抑制ツールが使用され、クローン造血からの変異のいずれかの寄与が考慮されるならば、変異は、それらの不可逆的な性質のためにｃｔＤＮＡをセルフリーＤＮＡの健常な源と区別することができる。ＤＮＡ高メチル化事象は、潜在的に、がんにおけるより多い数の再発性ゲノム領域に影響を及ぼし、セルフリーＤＮＡ分析によって腫瘍の起源を知らせるそれらの能力に寄与する。さらに、がんドライバ遺伝子の近傍での高メチル化事象は、それらの発現に影響を及ぼし、それによって潜在的にがんの挙動を反映し、予後の値を提示し得る。現在までのところ、変異に基づく方法とメチル化に基づく方法との両方の組み合わせを、限局性のがんにおけるｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブでの検出および特性評価の改善に利用した研究はない。
予後の判定、リスク層別化、および疾患の監視のための流体ベースのバイオマーカーの利用は、侵襲的腫瘍サンプリングを必要とせずに治療の決定を導くことによって、患者の転帰を改善し得る。循環腫瘍（ｃｔ）ＤＮＡは、特に液体生検ツールとして有望であることが示されているが、限局性非転移性がんを有する患者などの疾患の負荷が低い患者では、対の腫瘍プロファイリングが頻繁に必要とされる。本発明者らは、血漿のセルフリーＤＮＡ由来の遺伝的およびエピジェネティックな特徴のマルチモーダル解析が、腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡプロファイリングの広範な適用を可能にし得ると仮定した。変異およびメチル化に基づくプロファイリングにより、限局性頭頸部がん患者の６５％において、ｃｔＤＮＡが同定された。両方のアプローチからの結果は定量的であり、強く相関しており、それらを組み合わせた分析により、腫瘍由来ＤＮＡ断片の共通の特徴が明らかになった。さらに、ｃｔＤＮＡメチルームは、腫瘍組織学、推定予後バイオマーカー、および治療の応答の動的なパターンを明らかにした。これらの知見は、将来の非侵襲的バイオマーカー発見の取り組みを助け、限局性のがんに対するｃｔＤＮＡの臨床的実施について知らせる。
セルフリーメチル化ＤＮＡを捕捉する特定の方法は、本出願人の国際公開第２０１７／１９０２１５号パンフレットおよび国際公開第２０１９／０１０５６４号パンフレットに記載されており、両方とも参照により組み込まれる。
具体的には、本発明者らは、ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑの両方を利用して、限局性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）患者のコホート内で、腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡ検出を行う。ＨＮＳＣＣは、根治的治療後に頻繁に再発する臨床的に不均一な疾患であり、治療の決定および疾患の管理をより良く知らせるために、ｃｔＤＮＡ検出から大きく利益を得ることができる３３。本発明者らは、両方の方法を並行して利用すること、ならびに一致したＰＢＬプロファイリングが、高信頼性の腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡ検出を達成し得ることを実証する。さらに、本発明者らは、組み合わせせた分析が腫瘍由来のＤＮＡ断片の共通する分子的な特徴を明らかにすることを示す。最後に、本発明者らは、ｃｔＤＮＡメチルームが腫瘍組織学、推定予後バイオマーカー、および治療反応の動的なパターンを明らかにし、他の疾患の状況での将来のバイオマーカー研究のための青写真を授けることを示す。
態様において、対象のがん細胞からｃｔＤＮＡが存在することを検出する方法であって、
（ａ）対象からセルフリーＤＮＡの試料を得る工程、
（ｂ）試料をライブラリ調製に供して、セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の配列決定を可能にする工程、
（ｃ）第１の量のフィラーＤＮＡが試料に添加されていてもよく、フィラーＤＮＡの少なくとも一部がメチル化され、次いで、さらに、試料を変性されていてもよい工程、
（ｄ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡを捕捉する工程、
（ｅ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
（ｆ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用いて、捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの配列を比較する工程、
（ｇ）捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来のＤＮＡの存在を同定する工程
を含み、捕捉する工程、比較する工程または同定する工程の少なくとも１つにおいて、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定される、方法が提供される。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やそれに続くサンガーシーケンシングなどの様々なシーケンシング技術が当業者に公知である。また、ハイスループット配列決定としても知られる次世代配列決定（ＮＧＳ）技術も利用可能であり、これには様々な配列決定技術が含まれる、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、Ｒｏｃｈｅ ４５４配列決定、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ：Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭ配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、ロングリードシーケンシング（Ｏｘｆｏｒｄ ＮａｎｏｐｏｒｅおよびＰａｃｔｂｉｏ）が含まれる。ＮＧＳは、以前に使用されていたサンガー配列決定よりもはるかに迅速かつ安価にＤＮＡおよびＲＮＡの配列決定を可能にする。いくつかの実施形態では、前記配列決定は、ショートリードシーケンシングのために最適化される。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。したがって、方法および本明細書に記載されるのは、ヒトおよび獣医学疾患ならびに動物モデルの両方に適用可能である。好ましい対象は、「患者」、すなわち、疾患または状態のために治療または医療が必要であるかどうかを判定するために調査されている、または疾患もしくは状態（例えば、がん）のための医療を受けている、生きているヒトである。
本明細書で使用される場合、「ゲノム」という用語は、一般に、例えば、対象の遺伝情報の少なくとも一部または全体であり得る、対象由来のゲノム情報を指す。ゲノムは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかにコードされ得る。ゲノムは、コード領域（例えば、タンパク質をコードする）ならびに非コード領域を含み得る。ゲノムは、生物においてすべての染色体の配列を一緒に含むことができる。例えば、ヒトゲノムは、通常、合計４６本の染色体を有する。これらのすべての配列が一緒になってヒトゲノムを構成し得る。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、２つ以上のヌクレオチド、すなわちデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）もしくはリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）のいずれか、またはそれらの類似体の任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含むポリヌクレオチドを指す。核酸の非限定的な例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分枝核酸、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。核酸は、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、核酸の構築の前または後に行われ得る。核酸のヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断される場合がある。核酸は、重合後に、例えばレポーター因子とのコンジュゲーションまたは結合によってさらに修飾され得る。「変異体」核酸は、少なくとも１つのヌクレオチドがそれぞれ修飾、例えば欠失、挿入または置換されていることを除いて、その元の核酸と同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。変異体は、元の核酸のヌクレオチド配列に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性のヌクレオチド配列を有し得る。
セルフリーメチル化ＤＮＡは、血流を自由に循環するＤＮＡであり、ＤＮＡの様々な領域でメチル化されている。試料、例えば血漿試料を採取して、セルフリーメチル化ＤＮＡを分析し得る。諸研究が、血液の循環核酸の多くが壊死細胞またはアポトーシス細胞から生じ、アポトーシスからの核酸のレベルの大幅な上昇が、がんなどの疾患で観察されることを明らかにしている。特に、循環ＤＮＡががん遺伝子の変異を含む疾患の特徴となる証を有するがんの場合、マイクロサテライト変化、および特定のがんの場合、血漿のウイルスゲノム配列、ＤＮＡまたはＲＮＡは、疾患の潜在的なバイオマーカーとしていっそう研究されるようになっている。例えば、全循環ＤＮＡ中の低レベルの循環腫瘍ＤＮＡの定量的アッセイは、臨床的に使用される標準的なバイオマーカーであるがん胎児性抗原と比較して、結腸直腸がんの再発を検出するためのより良好なマーカーとして役立ち得る。循環ｃｆＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ライブラリ調製」は、リスト末端修復、Ａテーリング、アダプターライゲーション、またはＤＮＡのその後の配列決定を可能にするためにセルフリーＤＮＡに対して行われる任意の他の調製を含む。
本明細書で使用される場合、「フィラーＤＮＡ」は非コードＤＮＡであり得るか、またはアンプリコンからなり得る。
いくつかの実施形態では、断片の長さのメトリックは断片の長さである。いくつかの好ましい実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、＜１７０ｂｐ、＜１６５ｂｐ、＜１６０ｂｐ、＜１５５ｂｐ、＜１５０ｂｐ、＜１４５ｂｐ、＜１４０ｂｐ、＜１３５ｂｐ、＜１３０ｂｐ、＜１２５ｂｐ、＜１２０ｂｐ、＜１１５ｂｐ、＜１１０ｂｐ、＜１０５ｂｐ、または＜１００ｂｐの長さを有する断片に限定される。他の好ましい実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、約１００～約１５０ｂｐ、１１０～１４０ｂｐまたは１２０～１３０ｂｐの長さを有する断片に限定される。
いくつかの実施形態では、断片の長さのメトリックは、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡの断片の長さの分布である。いくつかの好ましい実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、長さに基づいて下位５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０パーセンタイル内の断片に限定される。
いくつかの実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、差次的メチル化領域（ＤＭＲ）の断片にさらに限定される。
いくつかの実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡの制限は、捕捉工程の間である。
いくつかの実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡの限定は、比較工程の間である。
いくつかの実施形態では、対象のセルフリーメチル化ＤＮＡの制限は、同定工程の間である。
いくつかの実施形態では、比較工程は、統計的分類器を使用した適合に基づく。ＤＮＡメチル化データを使用する統計的分類器は、試料をがんのタイプまたはサブタイプなどの特定の疾患状態に割り当てるために使用され得る。がんのタイプまたはサブタイプの分類という目的のために、分類器は、統計的モデル内の１つまたは複数のＤＮＡメチル化変数（すなわち、特徴）からなり、統計的モデルの出力は、異なる疾患状態を区別するための１つまたは複数の閾値を有する。統計的分類器で使用される特定の（１つまたは複数の）特徴および（１つまたは複数の）閾値は、がんのタイプまたはサブタイプの事前の知識から、最も情報がある可能性が高い特徴の事前の知識から、機械学習から、またはこれらのアプローチの２つ以上の組み合わせから導出され得る。
いくつかの実施形態では、分類器は機械学習によって導出される。好ましくは、分類器は、弾性ネット分類器、ラッソ、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、またはニューラルネットワークである。
分析されるゲノム空間は、ゲノムワイドであり得るか、または好ましくは調節領域（すなわち、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、およびＣｐＧ Ｓｈｅｌｆ）に限定され得る。
好ましくは、回収されたスパイクインメチル化ＤＮＡのパーセンテージは、プルダウン効率変動を制御するための共変量として含まれる。
複数のがんのタイプ（またはサブタイプ）を互いに区別することができる分類器の場合、分類器は、好ましくは、目的の各タイプ（またはサブタイプ）の対の比較に由来する差次的メチル化領域からなる。
いくつかの実施形態では、健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列は、健常な個体とがんの個体との間の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベースに含まれる。
いくつかの実施形態では、健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列は、血清、脳脊髄液、尿便、痰、胸水、腹水、涙、汗、パップスメア液、内視鏡ブラシリング液など、好ましくは血漿由来の体液から得たセルフリーＤＮＡに由来するＤＮＡにおいて、健常な個体とがんの個体との間として、差次的にメチル化される対照セルフリーメチル化ＤＮＡ配列に限定される。
試料
試料は、対象から単離された任意の生物学的試料であり得る。例えば、試料は、限定されないが、体液、全血、血小板、血清、血漿、便、赤血球、白血球、内皮細胞、組織生検物、滑液、リンパ液、腹水液、間質液または細胞外液、細胞間の空間の流体、例えば歯肉縁液、骨髄、脳脊髄液、唾液、粘液、痰、精液、汗、尿、鼻ブラッシングからの液、ペップスミアからの液、または任意の他の体液を含み得る。体液は、唾液、血液、または血清を含み得る。試料はまた、腫瘍試料であり得、これは、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引、洗浄、掻き取り、外科的切開、または介入もしくは他のアプローチを含むがこれらに限定されない様々なアプローチによって、対象から得ることができる。試料はセルフリー試料（例えば、細胞を実質的に含まない）であり得る。ＤＮＡ試料は、例えば、十分な熱を使用して変性させることができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の生物学的試料を含むかまたは使用するシステム、方法、またはキットを提供する。本明細書で使用される１つ以上の試料は、核酸を含有するかまたは含有すると推定される任意の物質を含み得る。試料は、対象から得られた生物学的試料を含み得る。いくつかの実施形態では、生物学的試料は液体試料である。
いくつかの実施形態では、試料は、約１００ｎｇ、９０ｎｇ、８０ｎｇ、７５ｎｇ、７０ｎｇ、６０ｎｇ、５０ｎｇ、４０ｎｇ、３０ｎｇ、２０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎｇ未満、またはセルフリー核酸分子の数の間の任意の量を含む。さらに、いくつかの実施形態では、試料は、約１ｐｇ未満、約５ｐｇ未満、約１０ｐｇ未満、約２０ｐｇ未満、約３０ｐｇ未満、約４０ｐｇ未満、約５０ｐｇ未満、約１００ｐｇ未満、約２００ｐｇ未満、約５００ｐｇ未満、約１ｎｇ未満、約５ｎｇ未満、約１０ｎｇ未満、約２０ｎｇ未満、約３０ｎｇ未満、約４０ｎｇ未満、約５０ｎｇ未満、約１００ｎｇ未満、約２００ｎｇ未満、約５００ｎｇ未満、約１０００ｎｇ未満、またはセルフリー核酸分子の数の間の任意の量を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、試料にある量のフィラーＤＮＡを充填して混合物試料を生成するための方法およびシステムを含み、混合物試料は、少なくとも約５０ｎｇ、５５ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、８５ｎｇ、９０ｎｇ、９５ｎｇ、１００ｎｇ、１２０ｎｇ、１４０ｎｇ、１６０ｎｇ、１８０ｎｇ、２００ｎｇ、または核酸混合物の総量の数の間にある任意の量を含む。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡは、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のメチル化フィラーＤＮＡを含み、残りは非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％～５０％、１０％～４０％、または１５％～３０％のメチル化フィラーＤＮＡである。いくつかの実施形態では、混合物試料は、２０ｎｇ～１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ～１００ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ～１００ｎｇの量のフィラーＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、試料から得たセルフリーＤＮＡおよび第１の量のフィラーＤＮＡは、合わせて少なくとも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡは、５０ｂｐ～８００ｂｐの長さ、好ましくは１００ｂｐ～６００ｂｐの長さ、より好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡは二本鎖である。フィラーＤＮＡは二本鎖である。例えば、フィラーＤＮＡはジャンクＤＮＡであり得る。また、フィラーＤＮＡは、内因性または外因性のＤＮＡであってもよい。例えば、フィラーＤＮＡは非ヒトＤＮＡであり、好ましい実施形態ではλＤＮＡである。本明細書で使用される場合、「λＤＮＡ」は、腸内細菌ファージλＤＮＡを指す。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡは、ヒトＤＮＡと整合していない。
いくつかの実施形態では、試料は、疾患または障害を有する対象の治療の前および／または後に採取され得る。試料は、治療または治療レジメンの最中に対象から得ることができる。治療の効果を経時的にモニターするために、対象から複数の試料を得ることができる。試料は、臨床試験によって確定的な陽性または陰性の診断が得られない疾患または障害を有することが知られているまたは疑われる対象から採取され得る。試料は、疾患または障害を有すると疑われる対象から採取され得る。試料は、疲労、吐き気、体重減少、痛みおよび疼痛、衰弱または出血などの説明できない症状を経験している対象から採取され得る。試料は、説明されている症状を有する対象から採取され得る。試料は、家族歴、年齢、高血圧または高血圧前症、糖尿病または糖尿病前症、過体重または肥満、環境への曝露、生活習慣リスク因子（例えば、喫煙、アルコール摂取、または薬物使用）、または他のリスク因子の存在などの因子によって疾患または障害を発症するリスクがある対象から採取され得る。
いくつかの実施形態では、試料は、第１の時点で採取され、配列決定され得、次いで、別の試料が、その後の時点で採取され、配列決定され得る。そのような方法は、例えば、疾患の発症または進行を追跡するため長期モニタリングする目的のために使用され得る。いくつかの実施形態では、治療の有効性を判定するために、治療前、治療後、または治療の経過中に疾患の進行を追跡することができる。例えば、本明細書に記載の方法は、医学的治療に応じて疾患の進行または退縮を測定するために、医学的治療の前および後に対象に対して実施され得る。
対象から試料を得た後、試料を処理して、対象の疾患または障害を示すデータセットを生成することができる。例えば、がん関連ゲノム遺伝子座または微生物関連遺伝子座のパネルでの試料のセルフリー核酸分子（例えば、ｃｔＤＮＡ分子）の有無または定量的評価は、対象のがんを示し得る。対象から得られた試料を処理することは、（ｉ）複数のセルフリー核酸分子を単離、濃縮または抽出するのに十分な条件に試料を供すること、および（ｉｉ）データセット（例えば、核酸配列）を生成するために複数のセルフリー核酸分子をアッセイすることを含み得る。いくつかの実施形態では、複数のセルフリー核酸分子が試料から抽出され、配列決定に供されて、複数の配列決定リードが生成される。
いくつかの実施形態では、セルフリー核酸分子は、セルフリーリボ核酸（ｃｆＲＮＡ）またはセルフリーデオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）を含み得る。セルフリー核酸分子（例えば、ｃｆＲＮＡまたはｃｆＤＮＡ）は、様々な方法によって試料から抽出され得る。セルフリー核酸分子は、がん関連ゲノム遺伝子座のパネルに対応する核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）分子を濃縮するように構成された複数のプローブによって濃縮され得る。プローブは、がん関連ゲノム遺伝子座のパネルの１つ以上からの核酸配列との配列相補性を有し得る。がん関連ゲノム遺伝子座のパネルは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、またはそれより多く、異なるがん関連ゲノム遺伝子座を含み得る。プローブは、１つまたは複数のゲノム遺伝子座（例えば、がん関連ゲノム遺伝子座）の核酸配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）と配列相補性を有する核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）であり得る。これらの核酸分子は、プライマーまたは濃縮配列であり得る。１つまたは複数のゲノム遺伝子座（例えば、がん関連ゲノム遺伝子座または微生物関連遺伝子座）に対して選択的なプローブを使用する試料のアッセイは、アレイハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸配列決定（例えば、ＲＮＡ配列決定またはＤＮＡ配列決定）の使用を含み得る。
核酸分子の配列決定
本開示は、１つまたは複数のポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基の配列を決定するための方法および技術を提供する。ポリヌクレオチドは、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸分子であり得、その変異体または誘導体（例えば、一本鎖ＤＮＡ）を含む。配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ（登録商標））、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（登録商標）またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標））による配列決定システムなどの現在利用可能な様々なシステムによって行うことができるが、これらに限定されない。さらに、対の末端の配列決定といった断片の長さを示す任意の配列決定方法を利用することができる。これに代えて、またはこれに加えて、配列決定は、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、デジタルＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、またはリアルタイムＰＣＲ）、または等温増幅を用いて行われ得る。そのようなシステムは、対象により与えられた試料からシステムによって生成されるように、対象の遺伝情報（例えば、ヒト）に対応する複数の生の遺伝データを提供することができる。いくつかの例において、そのようなシステムは、配列決定リード（本明細書では「リード」とも）を提供する。リードは、配列決定された核酸分子の配列に対応する一連の核酸塩基を含み得る。いくつかの状況では、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、プロテオームの情報と共に使用され得る。
いくつかの実施形態では、配列決定リードは、次世代配列決定法または次・次世代配列決定法によって得られる。いくつかの実施形態では、配列決定法は、がんの循環ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を定量化するために使用される次世代配列決定ベースの方法である、ＣＡｎｃｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）を含む。この方法は、再発性変異を有することが知られている任意のがんのタイプに対して一般化され得、１０，０００分子の健常なＤＮＡの変異体ＤＮＡの一分子を検出し得る。いくつかの実施形態では、配列決定法は、その全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｏｍｅｓ，（２０１８）Ｎａｔｕｒｅによって記載されているようなｃｆＭｅＤＩＰ配列決定を含む。いくつかの実施形態では、配列決定は亜硫酸水素塩配列決定を含む。
いくつかの実施形態では、配列決定は、例えばバーコード、固有の分子識別子（ＵＭＩ）、または別のタグを核酸分子またはその断片にライゲーションすることによる、核酸分子またはその断片の修飾を含む。核酸分子またはその断片の一端にバーコード、ＵＭＩまたはタグをライゲーションすることにより、配列決定後の核酸分子またはその断片の分析を容易にすることができる。いくつかの実施形態では、バーコードは固有のバーコード（例えば、ＵＭＩ）である。いくつかの実施形態では、バーコードは固有ではなく、バーコードの配列は、標的核酸の開始配列および停止配列などの内因性配列情報に関連して使用され得る（例えば、標的核酸はバーコードに隣接し、バーコードの配列は、標的核酸の開始部および終了部の配列に関連して、固有にタグ付けされた分子を生成する）。バーコード、ＵＭＩ、またはタグは、ポリヌクレオチドまたはその断片を入力または標的核酸分子またはその断片と関連付けるために使用される既知の配列であり得る。バーコード、ＵＭＩ、またはタグは、天然ヌクレオチドまたは非天然（例えば、修飾された）ヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるようなもの）を含み得る。バーコードの配列は、バーコードの配列が配列決定リード内に含まれ得るように、アダプター配列内に含まれ得る。バーコードの配列は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個、またはそれを超えるヌクレオチドの長さを含み得る。場合によっては、バーコードの配列は、十分な長さであってもよく、関連するバーコードの配列に基づいて試料の識別を可能にするために別のバーコードの配列と十分に異なっていてもよい。バーコードの配列、またはバーコードの配列の組み合わせを使用して、「元の」核酸分子またはその断片（例えば、対象から得た試料に存在する核酸分子またはその断片）をタグ付けし、続いて識別することができる。いくつかの場合、バーコードの配列またはバーコードの配列の組み合わせを内因性配列情報と併せて使用して、元の核酸分子またはその断片を同定する。例えば、バーコードの配列、またはバーコードの配列の組み合わせを、バーコード、ＵＭＩ、またはタグ（例えば、内因性配列の開始および終了）に隣接する内因性配列と共に使用することができる。
核酸分子またはその断片を処理することは、核酸の増幅を行うことを含み得る。例えば、任意のタイプの核酸増幅反応を使用して、標的核酸分子またはその断片を増幅し、増幅産物を生成することができる。核酸増幅方法の非限定的な例としては、逆転写、プライマー伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、非対称増幅、ローリングサークル増幅、および多置換増幅（ＭＤＡ）が挙げられる。ＰＣＲの例としては、限定されずに、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、およびアセンブリＰＣＲが挙げられる。核酸の増幅は、１つ以上のプライマー、プローブ、ポリメラーゼ、緩衝液、酵素、およびデオキシリボヌクレオチドなどの１つ以上の試薬を含み得る。核酸の増幅は等温であってもよく、または熱サイクルを含んでもよい。および／または内因性配列の長さを有する。
メチル化プロファイル
本開示は、疾患／状態を有するかまたはそのような疾患／状態を有すると疑われる対象のメチル化プロファイルを生成するための方法、システムおよびキットを提供し、メチル化プロファイルは、対象が疾患／状態を有するかまたは疾患／状態を有するリスクがあるかどうかを判定するために使用され得る。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを使用する前に、本明細書に開示される試料をライブラリ調製に供する。手短に言えば、末端修復およびＡテーリングの後、試料を核酸アダプターにライゲートし、酵素を用いて消化する。試料の項で上述したように、調製したライブラリをフィラー核酸（例えば、フィラーλＤＮＡ）と組み合わせて、調製したライブラリの低い存在量のｃｔＤＮＡの影響を最小限に抑え、混合試料を作製することができる。いくつかの実施形態では、疾患／状態が局所的な（非転移性）がんである場合、ｃｔＤＮＡの量は少なく、容易かつ正確に測定および定量化され得ない。混合試料を少なくとも約５０ｎｇ、８０ｎｇ、１００ｎｇ、１２０ｎｇ、１５０ｎｇまたは２００ｎｇにして、さらなる濃縮に供する。
本明細書に記載の方法、システム、およびキットは、それだけに限ることなく、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍を含む様々ながんに適用できる。実施形態では、がんは頭頸部扁平上皮癌である。
結合剤を使用して混合試料を濃縮することができる。いくつかの実施形態では、結合剤は、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である。そのような例示的なタンパク質の１つは、ＭＢＤ２タンパク質である。本明細書で使用される場合、「メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）」は、約７０残基の長さであり、１つまたは複数の対称的にメチル化されたＣｐＧを含むＤＮＡに結合するタンパク質および酵素の特定のドメインを指す。ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ４およびＢＡＺ２のＭＢＤは、ＤＮＡへの結合を媒介し、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１およびＭＢＤ２の場合、優先的にはメチル化ＣｐＧへの結合を媒介する。ヒトタンパク質ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、およびＭＢＤ４は、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）のそれぞれに存在することによって関連する核タンパク質のファミリーを含む。これらのタンパク質の各々は、ＭＢＤ３を除いて、メチル化ＤＮＡに特異的に結合することができる。
他の実施形態では、結合剤は抗体であり、セルフリーメチル化ＤＮＡを捕捉することは、抗体を使用してセルフリーメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む。本明細書で使用される場合、「免疫沈降」は、その特定の抗原に特異的に結合する抗体を使用して抗原（ポリペプチドおよびヌクレオチドなど）を溶液から沈殿させる技術を指す。このプロセスは、試料から特定のタンパク質またはＤＮＡを単離および濃縮するために使用され得、手順のある時点で抗体が固体の基材に結合されることを必要とする。固体の基材は、例えばビーズ、例えば磁気ビーズを含む。他の種類のビーズおよび固体の基材を使用してもよい。
１つの例示的抗体は５－ＭｅＣ抗体である。免疫沈降手順のために、いくつかの実施形態では、少なくとも０．０５μｇの抗体を試料に添加する。一方、より好ましい実施形態では、少なくとも０．１６μｇの抗体を試料に添加する。免疫沈降反応を確認するために、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、第２の量の対照ＤＮＡを試料に添加する工程をさらに含む。
濃縮された試料をさらに増幅し、精製し、配列決定して、複数の配列リードを生成する。複数の配列リードを分析して、複数の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定する。いくつかの実施形態では、複数のＤＭＲは、末梢血白血球（ＰＢＬ）に由来するセルフリー核酸分子に由来するＤＭＲを含む。いくつかの実施形態では、複数のＤＭＲは、少なくとも約７５万個の重複しない約３００ｂｐの核酸断片ウィンドウを含む。これらの断片は、８個以上のＣｐＧアイランドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＲは、疾患／状態を有する患者から得られた試料から生成された配列リードを、健常な対照から得られた試料から生成された配列リードと比較することによって、同定される。いくつかの実施形態では、健常な対照は、疾患／状態を発症するための同じリスク因子のセットを含む。いくつかの実施形態では、複数のＤＭＲは、少なくとも約９９７個のＤＭＲ、ＨＮＳＣＣにおける約９４１個の過剰メチル化およびＨＮＳＣＣにおける５６個の低メチル化を含む（表５）。本明細書において同じ開示のアプローチを使用して、過剰メチル化ＤＭＲを異なるがん（例えば、肺がん、膵臓がん、結腸直腸がん）について検出することができ、低メチル化ＤＭＲを異なるがんについて検出することができる。
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ゲノム変異プロファイル
本開示は、疾患／状態を有するかまたはそのような疾患／状態を有すると疑われる対象の変異プロファイルを生成するための方法、システムおよびキットを提供し、メチル化プロファイルは、対象が疾患／状態を有するかまたは疾患／状態を有するリスクがあるかどうかを判定するために使用され得る。本明細書に開示される試料は、ライブラリ調製および次世代ディープシーケンシング（例えば、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）に供される。複数の配列決定リードが生成され、分析される。いくつかの実施形態では、ディープシーケンシングは、疾患／状態に関連するゲノム変異の同定を最大化するように構成され得る。例えば、限定することを意図するものではないが、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）については、標準的なＨＮＳＣＣドライバ遺伝子のパネルをＣＡＰＰ－ｓｅｑのセレクタに含めることができる。さらに、肺がんの場合、肺がん駆動遺伝子のパネルがＣＡＰＰ－ｓｅｑのセレクタに含まれ得る。さらに、膵臓がんの場合、膵臓がん駆動遺伝子のパネルは、ＣＡＰＰ－ｓｅｑのためのセレクタに含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＰＰ－ｓｅｑのセレクタに特定のがんのタイプにおける既知のドライバ効果のない遺伝子を含めることにより、ｃｔＤＮＡ検出の感度を高めることができる。
いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡ存在量の相対的な尺度は、平均変異対立遺伝子画分（ＭＡＦ）から計算される。いくつかの実施形態では、変異の平均ＭＡＦは、対象を同定し、その変異プロファイルに含まれるのは、少なくとも約０．０１％～少なくとも約１０％の範囲である。本明細書に開示される試料のｃｔＤＮＡ画分は、少なくとも約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、またはその間の任意の割合である。
いくつかの実施形態では、対象の生成された変異プロファイルは、ＰＢＬに由来するセルフリー核酸分子に由来する変異の変異体を含まない。いくつかの実施形態では、変異プロファイルは、ミスセンス変異体、ナンセンス変異体、欠失変異体、挿入変異体、重複変異体、逆位変異体、フレームシフト変異体、または反復伸長変異体などの遺伝子多型を含む。いくつかの実施形態では、変異プロファイルは、特定のサイズ範囲のセルフリー核酸分子の画分に由来する変異の変異体を含み得る。
断片の長さプロファイル
いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡ断片の長さは、健常な対象に由来するセルフリー核酸分子よりも短い。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異を含むｃｔＤＮＡの長さは、対応する参照対立遺伝子を含むセルフリー核酸分子の長さよりも短い。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＭＲを含有するｃｔＤＮＡ断片の長さは、対応するゲノム領域を含有するセルフリー核酸分子の断片よりも短い。
いくつかの実施形態では、配列決定は、ｃｔＤＮＡ断片の分解を引き起こし、ｃｔＤＮＡの長さの分布の保存を妨げるので、亜硫酸水素塩配列を利用しない。いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡの断片の長さは、少なくとも６０～５００ｂｐ、８０～３００ｂｐ、９０～２５０ｂｐ、８０～１７０ｂｐ、または１００～１５０ｂｐである。いくつかの実施形態では、本開示は、特定のサイズのセルフリー分子の選択に基づいて、セルフリー核酸試料の濃縮をもたらす。いくつかの実施形態では、マルチモーダル解析は、複数の核酸分子をそれらの断片の長さに基づいて変異プロファイルに選択的に含めることによって、本明細書に記載の変異プロファイルおよび断片の長さプロファイルを利用することを含む。いくつかの実施形態では、マルチモーダル解析は、複数の核酸分子をそれらの断片の長さに基づいてメチル化プロファイルに選択的に含めることによって、本明細書に記載のメチル化プロファイルおよび断片の長さプロファイルを利用することを含む。いくつかの実施形態では、マルチモーダル解析は、複数の核酸分子をそれらの断片の長さに基づいて変異プロファイルに選択的に含めることによって、および複数の核酸分子をそれらの断片の長さにそれぞれ基づいてメチル化プロファイルに選択的に含めることによって、変異プロファイル、メチル化プロファイル、および断片の長さプロファイルを一緒に利用することを含む。
がんを検出し、腫瘍の起源の組織を決定し、予後を提供するための方法およびシステム
本開示は、対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するための方法およびシステムを提供し、この方法およびシステムは、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも１つのプロファイルを生成するために前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および前記対象が前記疾患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、処理する工程を含む。いくつかの実施形態では、感度は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージである。いくつかの実施形態では、特異度は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージである。
いくつかの実施形態では、方法およびシステムは、前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子を配列決定に供して、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイルおよび（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも２つのプロファイルを生成させる工程を含む。方法は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージの感度をもたらす。いくつかの実施形態では、２つのプロファイルを使用する場合の感度は、１つのプロファイルを使用する場合の感度と比較して、任意の数字の間で少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはパーセンテージだけ増加する。いくつかの実施形態では、３つのプロファイルを使用する場合の感度は、２つのプロファイルを使用する場合の感度と比較して、任意の数字の間で少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはパーセンテージだけ増加する。
さらに、方法は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージの特異度をもたらす。いくつかの実施形態では、２つのプロファイルを使用する場合の特異度は、１つのプロファイルを使用する場合の特異度と比較して、任意の数字の間で少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはパーセンテージだけ増加する。いくつかの実施形態では、３つのプロファイルを使用する場合の特異度は、２つのプロファイルを使用する場合の特異度と比較して、任意の数字の間で少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはパーセンテージだけ増加する。
本開示は、対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定する方法およびシステムであって、複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、および前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するために、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを使用する工程を含む、方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージの感度をもたらす。方法は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージの特異度をもたらす。
本開示は、複数の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定することを含む、腫瘍の組織の起源を決定するための方法およびシステムを提供し、複数のＤＭＲは、特定のがん（例えば、乳がん、結腸がん、前立腺がん、ＨＳＮＣＣ）に特異的であり、セルフリー核酸分子の画分に由来する。いくつかの実施形態では、セルフリー核酸分子の画分はｃｔＤＮＡに由来する。いくつかの実施形態では、方法は少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージの感度をもたらす。方法は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または数字の間の任意のパーセンテージの特異度をもたらす。
本開示は、疾患／状態の治療を受けた後に対象に対して予後を得るための方法およびシステムを記載する。例えば、治療は、腫瘍の外科的除去、特定の種類のがんのために設計された化学療法、放射線療法、または免疫療法（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲなど）を含む。いくつかの実施形態では、方法またはシステムは、前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子を配列決定に供して、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイルおよび（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも１つのプロファイルを生成させること、および少なくとも１つのプロファイルに少なくとも基づいて微小残存病変（ＭＲＤ）をモニタリングまたは検出することを含む。
本開示は、対象からの試料の少なくとも一部からのセルフリー核酸分子をアッセイすることによって、前記対象が疾患／状態を有するかどうかを判定するため、表５に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出するため、また少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記メチル化レベルを、前記表５に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較するための方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態では、表５に列挙される少なくとも約６個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、または１００個以上、２００個以上、３００個以上、４００個以上、５００個以上、６００個以上、または７００個以上のＤＭＲのメチル化レベルが測定され、本明細書で論じられる健常な対象の対応するＤＭＲのメチル化レベルと比較される。
対象が正確に診断され、外科的除去、化学療法、放射線療法などのがんを治療するための治療を受けるたら、治療の有効性をモニタリングし、患者の生存率を予測することが重要である。さらに、がん細胞の最小限の残存疾患を検出することが重要である。本開示は、前記対象が疾患の治療を受けた後に生存率が高いかどうかを判定するための方法およびシステムを提供し、この方法およびシステムは、前記対象からの試料の少なくとも一部からのセルフリー核酸分子をアッセイすること、表６に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出すること、また少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記メチル化レベルを、表６に列挙された前記ＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較することを含む。いくつかの実施形態では、表６に列挙されるＤＭＲは、遺伝子ＺＳＣＡＮ３１、ＬＩＮＣ０１３９１、ＧＡＴＡ２－ＡＳ１、ＳＴＫ３、およびＯＳＲ１に関連する領域を表す。
Figure 2023528533000029
いくつかの実施形態では、方法は、免疫沈降反応を確認するために第２の量の対照ＤＮＡを試料に添加する工程をさらに含む。
本明細書で使用される場合、「対照」は、陽性対照と陰性対照の両方、または少なくとも陽性対照を含み得る。
いくつかの実施形態では、方法は、セルフリーメチル化ＤＮＡの捕捉を確認するために、第２の量の対照ＤＮＡを試料に添加する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、がん細胞由来のＤＮＡが存在することを同定することは、がん細胞の起源の組織を同定することをさらに含む。
いくつかの例では、腫瘍組織サンプリングは困難であるか、または重大なリスクを伴う可能性があり、その場合、腫瘍組織サンプリングを必要とせずにがんを診断および／またはサブタイプに分けることが望ましい場合がある。例えば、肺腫瘍組織サンプリングは、縦隔鏡検査、開胸、または経皮的針生検などの侵襲的処置を必要とし得る。これらの処置は、入院、胸腔チューブ、機械での換気、抗生物質、または他の医学的介入の必要性をもたらし得る。一部の個体は、医学的併存症のために、または優先度のために、腫瘍組織サンプリングに必要な侵襲的処置を受けないことがある。いくつかの例では、腫瘍組織調達の実際の手順は、疑われているがんのサブタイプに依存し得る。他の例では、がんのサブタイプは、同じ個体の体内で経時的に進展し得、侵襲性腫瘍組織サンプリング処置による連続的な評価は、多くの場合非現実的であり、患者が十分に忍容できない。したがって、血液検査による非侵襲性がんのサブタイプ分類は、臨床腫瘍学の実施において多くの有利な用途を有し得る。
したがって、いくつかの実施形態では、がん細胞の起源の組織を同定することは、がんのサブタイプを同定することをさらに含む。好ましくは、がんのサブタイプは、ステージ（例えば、外科手術で治療された早期肺がん対化学療法で治療された後期肺がん）、組織学（例えば、肺がんにおける小細胞癌対腺癌対扁平上皮癌）、遺伝子発現パターンまたは転写因子活性（例えば、乳がんにおけるＥＲ状態）、コピー数の異常（例えば、乳がんにおけるＨＥＲ２の状態）、特異的再編成（例えば、ＡＭＬにおけるＦＬＴ３）、特異的遺伝子点変異状態（例えば、ＩＤＨ遺伝子点変異）、およびＤＮＡのメチル化パターン（例えば、脳がんにおけるＭＧＭＴ遺伝子プロモーターのメチル化）に基づいてがんを区別する。
いくつかの実施形態では、工程（ｆ）における比較は、ゲノムワイドで行われる。
他の実施形態では、工程（ｆ）における比較は、ゲノムワイドから、限定されないが、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、ＣｐＧ Ｓｈｅｌｆまたは前述の任意の組み合わせなどの特定の調節領域に制限される。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、がんの検出に使用するためのものである。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、がんの治療のモニタリングに使用するためのものである。
データ分析システムおよび方法
本明細書に開示される方法およびシステムは、アルゴリズムまたはその使用を含むことができる。１つまたは複数のアルゴリズムは、１つまたは複数の対象から１つまたは複数の試料を分類するために使用され得る。１つまたは複数のアルゴリズムは、１つまたは複数の試料からのデータに適用され得る。データはバイオマーカー発現データを含み得る。本明細書に開示される方法は、１人または複数の対象からの１つまたは複数の試料に分類を割り当てることを含み得る。分類を試料に割り当てることは、メチル化プロファイル、変異プロファイルおよび断片の長さプロファイルにアルゴリズムを適用することを含み得る。場合によっては、少なくとも１つのプロファイルは、対象から得られた試料を疾患または軽微な損傷を有すると分類するための訓練されたアルゴリズムを含むデータ分析システムに入力される。
データ分析システムは、訓練されたアルゴリズムであってもよい。アルゴリズムは、線形分類器を含み得る。場合によっては、線形分類器は、線形判別分析、フィッシャー線形判別、ナイーブベイズ分類器、ロジスティック回帰、パーセプトロン、サポートベクターマシン、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数を含む。線形分類器は、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）のアルゴリズムであってもよい。アルゴリズムは、双方向分類器を含み得る。双方向分類器は、１つまたは複数の決定木、ランダムフォレスト、ベイジアンネットワーク、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、またはロジスティック回帰アルゴリズムを含み得る。
アルゴリズムは、１つまたは複数の線形判別分析（ＬＤＡ）、基本パーセプトロン、弾性ネット、ロジスティック回帰、（カーネル）サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）、ゴルビン分類器、パーゼンベース、（カーネル）フィッシャー判別分類器、ｋ近傍法、反復ＲＥＬＩＥＦ、分類木、最尤分類器、ランダムフォレスト、最近接重心、マイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）、ｋ中間クラスタリング、ファジーＣ平均クラスタリング、ガウス混合モデル、勾配応答（ＧＲ）、勾配ブースティング法（ＧＢＭ）、楕円ネットロジスティック回帰、ロジスティック回帰、またはそれらの組み合わせを含み得る。アルゴリズムは、対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）のアルゴリズムを含み得る。アルゴリズムは、最近接重心のアルゴリズムを含み得る。アルゴリズムは、ランダムフォレストのアルゴリズムを含み得る。いくつかの実施形態では、子癇前症および非子癇前症を識別するために、ロジスティック回帰、ランダムフォレスト、および勾配ブースティング法（ＧＢＭ）のパフォーマンスは、線形判別分析（ＬＤＡ）、ニューラルネットワーク、およびサポートベクターマシン（ＳＶＭ）のパフォーマンスよりも優れている。
キット
本開示は、対象の疾患または障害（例えば、がん）を同定またはモニタリングするためのキットを提供する。キットは、対象の試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々における配列の定量的尺度（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）を同定するためのプローブを含み得る。試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々における配列の定量的尺度（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）は、対象の疾患または障害（例えば、がん）を示し得る。プローブは、試料のがん関連ゲノム遺伝子座（例えば、表３、５および６に列挙されるＤＭＲ）のパネルにおける配列に対して選択的であり得る。キットは、プローブを使用して試料を処理し、対象の試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルのそれぞれにおける配列の定量的尺度（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）を示すデータセットを生成するための説明書を含み得る。
キットにあるプローブは、試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルにおける配列に対して選択的であり得る。キットにあるプローブは、がん関連ゲノム遺伝子座のパネルに対応する核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）分子を選択的に濃縮するように構成され得る。キットにあるプローブは核酸プライマーであり得る。キットにあるプローブは、がん関連ゲノム遺伝子座またはゲノム領域のパネルの１つ以上からの核酸配列との配列相補性を有し得る。がん関連ゲノム遺伝子座または微生物関連ゲノム遺伝子座またはゲノム領域のパネルは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、またはそれより異なるがん関連ゲノム遺伝子座またはゲノム領域のパネルを含み得る。
キットの説明書は、セルフリー生物学的試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルにおける配列に対して選択的であるプローブを使用して、試料をアッセイするための説明書を含み得る。これらのプローブは、がん関連ゲノム遺伝子座の複数のパネルのうちの１つ以上由来の核酸配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）との配列相補性を有する核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）であり得る。これらの核酸分子は、プライマーまたは濃縮配列であり得る。セルフリー生物試料をアッセイするための説明書は、アレイハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または核酸の配列決定（例えば、ＤＮＡの配列決定またはＲＮＡの配列決定）を実施して試料を処理し、試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルのそれぞれにおける配列の定量的尺度を示す（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）データセットを生成するための導入を含み得る。試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々における配列の定量的尺度（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）は、疾患または障害（例えば、がん）を示し得る。
キットの説明書は、アッセイ読み出し値を測定および解釈するための説明書を含み得、それは、試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々における配列の定量的尺度を示す（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）データセットを生成するために、がん関連ゲノム遺伝子座のパネルの１つまたは複数において定量化され得る。例えば、がん関連ゲノム遺伝子座のパネルに対応するアレイハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の定量化は、試料のがん関連ゲノム遺伝子座のパネルの各々における配列の定量的尺度を示す（例えば、存在、非存在、または相対的な量を示す）データセットを生成し得る。アッセイ読み取り値は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）値、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）値、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）値、蛍光の値など、またはそれらの正規化された値を含み得る。
コンピュータシステム
いくつかの実施形態では、特定の工程は、コンピュータプロセッサによって実行される。本システムおよび方法は、様々な実施形態で実施することができる。適切に構成されたコンピュータデバイス、ならびに関連する通信ネットワーク、デバイス、ソフトウェアおよびファームウェアは、上述の１つまたは複数の実施形態を可能にするためのプラットフォームを提供することができる。例として、図８は、記憶ユニット１０４およびランダムアクセスメモリ１０６に接続された中央処理装置（「ＣＰＵ」）１０２を含むことができる汎用コンピュータデバイス１００を示す。ＣＰＵ１０２は、オペレーティングシステム１０１、アプリケーションプログラム１０３、およびデータ１２３を処理することができる。必要に応じて、オペレーティングシステム１０１、アプリケーションプログラム１０３、およびデータ１２３を記憶ユニット１０４に格納し、メモリ１０６にロードすることができる。コンピュータデバイス１００は、ＣＰＵ１０２およびメモリ１０６に動作可能に接続され、ＣＰＵ１０２からの集中的な画像処理計算をオフロードし、ＣＰＵ１０２と並列にこれらの計算を実行するグラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）１２２を、さらに含むことができる。オペレータ１０７は、ビデオインターフェース１０５によって接続されたビデオディスプレイ１０８、およびＩ／Ｏインターフェース１０９によって接続されたキーボード１１５、マウス１１２、およびディスクドライブまたはソリッドステートドライブ１１４などの様々な入出力デバイスを使用して、コンピュータデバイス１００と対話することができる。マウス１１２は、ビデオディスプレイ１０８のカーソルの移動を制御し、マウスのボタンでビデオディスプレイ１０８に表示される様々なグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）の制御を操作するように構成することができる。ディスクドライブまたはソリッドステートドライブ１１４は、コンピュータ可読媒体１１６を受け入れるように構成され得る。コンピュータデバイス１００は、ネットワークインターフェース１１１を介してネットワークの一部を形成することができ、コンピュータデバイス１００が他の適切に構成されたデータ処理システム（図示せず）と通信することを可能にする。様々なソースからの入力を受信するために、１つまたは複数の異なるタイプのセンサ１３５を使用することができる。
本システムおよび方法は、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、タブレットコンピュータ、またはワイヤレスハンドヘルドを含む実質的に任意の方式のコンピュータデバイスで実施することができる。本システムおよび方法はまた、１つまたは複数のコンピュータデバイスが本発明による方法における様々なプロセス工程の各々を実施することを可能にするためのコンピュータプログラムコードを含むコンピュータ可読／使用可能媒体として実施されてもよい。複数のコンピュータデバイスが動作全体を実行する場合、コンピュータデバイスはネットワーク接続されて動作の様々な工程を分配する。コンピュータ可読媒体またはコンピュータ使用可能媒体という用語は、プログラムコードの任意のタイプの物理的実施形態の１つまたは複数を含むことが理解される。特に、コンピュータ可読／使用可能媒体は、１つまたは複数の可搬型記憶製品（例えば、光ディスク、磁気ディスク、テープなど）、コンピュータおよび／または記憶システムに関連するメモリなどのコンピューティングデバイスの１つまたは複数のデータ記憶部に組み込まれたプログラムコードを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「プロセッサ」は、任意のタイプのプロセッサ、例えば、任意のタイプの汎用マイクロプロセッサまたはマイクロコントローラ（例えば、Ｉｎｔｅｌ（商標）ｘ８６、ＰｏｗｅｒＰＣ（商標）、ＡＲＭ（商標）プロセッサなど）、デジタル信号処理（ＤＳＰ）プロセッサ、集積回路、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
本明細書で使用される場合、「メモリ」は、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤＲＯＭ）、電気光学メモリ、光磁気メモリ、消去可能プログラマブル読み出し専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、および電気的消去可能プログラマブル読み出し専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）など、内部または外部のいずれかに配置された任意のタイプのコンピュータメモリの適切な組み合わせを含むことができる。メモリ１０２の一部は、従来のファイルシステムを使用して編成され、デバイスの全体的な動作を管理するオペレーティングシステムによって制御および管理され得る。
本明細書で使用される場合、「コンピュータ可読記憶媒体」（機械可読媒体、プロセッサ可読媒体、またはコンピュータ可読プログラムコードが具現化されたコンピュータ使用可能媒体とも呼ばれる）は、コンピュータまたは機械によって読み取り可能なフォーマットで、データを記憶することができる媒体である。機械可読媒体は、ディスケット、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、メモリデバイス（揮発性または不揮発性）、または同様の記憶機構を含む磁気、光学、または電気記憶媒体を含む、任意の適切な有形の非一時的媒体であってもよい。コンピュータ可読記憶媒体は、実行されるとき、プロセッサに、本開示の実施形態による方法の工程を実行させる様々な命令セット、コードシーケンス、構成情報、または他のデータを含むことができる。当業者は、記載された実施態様を実施するために必要な他の命令および動作がまた、コンピュータ可読記憶媒体に記憶され得ることを理解するであろう。コンピュータ可読記憶媒体に記憶された命令は、プロセッサまたは他の適切な処理デバイスによって実行され得て、記載されたタスクを実行するための回路とインターフェースすることができる。
本明細書で使用される場合、「データ構造」は、コンピュータのデータを編成してそれが効率的に使用され得るようにする特定の方法である。データ構造は、１つまたは複数の特定の抽象データ型（ＡＤＴ）を実装することができ、それは、データ構造に対して実行され得る操作、およびそれらの操作の計算の複雑度を明示する。比較すると、データ構造は、ＡＤＴにより得られる仕様の具体的な実装である。
本発明の利点は、以下の実施例によってさらに説明される。本明細書に記載の実施例およびそれらの特定の細部は、例示のために提示されているにすぎず、本発明の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
［実施例］
材料および方法
ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーの末梢血白血球（ＰＢＬ）ならびに血漿の獲得
２０１４年～２０１６年の間にＨＮＳＣＣと診断された患者が、前向きなＡｎｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ（Ｗｏｎｇ Ｋ．ｅｔ ａｌ．２０１０）から同定された。すべての研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ ＮｅｔｗｏｒｋのＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄによって承認された。ＨＮＳＣＣ患者の試料は、以下の基準、１）診断時の限局性疾患の提示、２）診断時、および少なくとも１つの処置後の時点での血液の採取、３）診断後２年の最小フォローアップ時間に基づいて、Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｒｅのＨＮＣ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈプログラムから得た。すべての患者は、アジュバント放射線療法を伴うまたは伴わない手術からなる、治癒を意図した治療を受けた。年齢、性別および現在の喫煙状態が一致する健常なドナーを、前向き肺がんスクリーニングプログラムから同定した。５～１０ｍＬの血液をエチレン－ジアミン－四酢酸（ＥＤＴＡ）チューブに採取した。ＨＮＳＣＣ患者については、血液を、診断時（ベースライン、ＢＬ）ならびに一次手術の３ヶ月後（３Ｍ）に採取した。適用可能な場合、追加の血液を、補助放射線療法（ＰｒｅＲＴ）、中間補助放射線療法（ＭｉｄＲＴ）の前、および／または一次手術の１２ヶ月後（１２Ｍ）に採取した。血漿を採取の１時間以内に血液から単離し、さらなる処理まで－８０℃で保存した。診断時のＨＮＳＣＣ患者または健常なドナーに対する同じ採血から、末梢血白血球がまた単離された。
細胞培養
ＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣ細胞株ＦａＤｕは、Ｂｒａｄｌｙ Ｗｏｕｔｅｒｓ博士（Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）の厚意により提供され、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養された。ＦａＤｕ細胞培養物を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気において３７℃でインキュベートした。ＳＴＲプロファイリングにより、ＦａＤｕ細胞の同一性を確認した。使用前に細胞をマイコプラズマ試験ｅ－ＭｙｃｏＴＭＶＡＬｉＤ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏ）に供した。
セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）およびＰＢＬゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離
製造業者の指示に従ってＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、総血漿からｃｆＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡをＰＢＬから単離し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０集束超音波処理装置を用いて１５０～２００塩基対に剪断し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によってサイズ選択して、３００塩基対を超える断片を除去した。単離されたｃｆＤＮＡおよび剪断されたＰＢＬゲノムＤＮＡを、ライブラリ生成前にＱｕｂｉｔによって定量した（図９Ａおよび図９Ｂ）。
配列決定ライブラリの調製
それぞれ５～１０ｎｇまたは１０～２０ｎｇのＤＮＡをｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑまたはＣＡＰＰ－ｓｅｑのインプットとして使用した。いくつかの改変を加えたＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ライブラリ生成のためにインプットＤＮＡを調製した。ライゲーション時にインプットＤＮＡの両鎖に隣接するランダムな２ｂｐの配列とそれに続く一定の１ｂｐのＴ配列５’とを組み込むライブラリアダプターを利用した。ライゲーション中のアダプター二量体化を最小限に抑えるために、ライブラリアダプターを１００：１というアダプター：ＤＮＡのモル比（１０ｎｇのｃｆＤＮＡあたり約０．０７ｕＭ）で添加し、４℃で１７時間一晩インキュベートした。ライゲーション後の浄化後、ライブラリ生成の前に、インプットＤＮＡを４０μＬの溶出緩衝液（ＥＢ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０～８．５）で溶出した。
ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリの生成
ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリの作製を、いくつかの修正を加えてＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１４に記載されているように行った。ライブラリを１０サイクルでＰＣＲ増幅し、最大１２のインデックス付き増幅ライブラリを５００～１０００ｎｇで一緒にプールした。ＣＯＴ ＤＮＡおよびブロッキングオリゴを添加した後、プールしたライブラリをＳｐｅｅｄＶａｃ処理してすべての液体を蒸発させ、１３μＬの再懸濁混合物（８．５μＬの２Ｘハイブリダイゼーション緩衝液、３．４μＬのハイブリダイゼーション成分Ａ、１．１μＬのヌクレアーゼ非含有水）に再懸濁した。ハイブリダイゼーションの前に、４μＬのハイブリダイゼーションプローブ（すなわち、ＨＮＳＣＣセレクタ）を合計１７μＬにわたって再懸濁混合物に添加した。ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅／浄化の後、ライブラリを３０μＬのＩＤＴＥ、ｐＨ８．０（１×ＴＥ溶液）で溶出した。多重化ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ／ＮｏｖａＳｅｑ／ＨｉＳｅｑ４０００でそれぞれ２×７５／１００／１２５の対の試行で配列決定した。ＨＮＳＣＣセレクタの設計は、ＣＯＳＭＩＣデータベースからのＨＮＳＣＣならびにＨＰＶ－１６ゲノムのＥ６およびＥ７領域における頻繁に繰り返されるゲノム変化を組み込んだ（図１１）。
ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリのアライメントおよび質の管理
組み込まれたランダムの分子バーコードに対応する、アラインメントされていない対になったリードの各５’末端の最初の２塩基対を抽出し、照合して４ｂｐ分子識別子（ＵＭＩ）を生成した。第３のＴ塩基対スペーサーもアライメント前に除去した。対になったリードを、ＢＷＡ－ｍｅｍによってヒトゲノム（ゲノムアセンブリＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）にアラインメントし、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（ｖ １．３．１）によってソートおよびインデックス付けし、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＴｏｏｌＫｉｔ（ＧＡＴＫ）ＢａｓｅＲｅｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（ｖ ３．８）を使用して、最良の実践（参照）に従って、塩基の質のスコアについて再較正した。ＢＡＭファイルから得た重複配列をそれらのＵＭＩに基づいて折り畳み、ＣｏｎｓｅｎｓｕｓＣｒｕｎｃｈｅｒによってシングルトン、単一鎖コンセンサス配列（ＳＳＣＳ）または重複コンセンサス配列（ＤＣＳ）として標識した４４。各ライブラリの質の管理を、ＦａｓｔＱＣ（Ｂａｂｒａｈａｍ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）から得られた様々なメトリック、ならびに捕捉効率（ＣｏｌｌｅｃｔＨｓＭｅｔｒｉｃｓ、Ｐｉｃａｒｄ ２．１０．９）、カバレッジの深度（ＤｅｐｔｈＯｆＣｏｖｅｒａｇｅ、ＧＡＴＫ ３．８）および塩基対位置誤り率（ｉｄｅｓ－ｂｇｒｅｐｏｒｔ．ｐｌ、Ｎｅｗｍａｎら、２０１６）を得るための様々なスクリプトによって評価した。
体細胞ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）の検出およびｃｔＤＮＡの定量
Ｎｅｗｍａｎら２０１６に記載されているように、統合デジタルエラー抑制（ｉＤＥＳ）によって潜在的な配列決定エラーの除去を行った。バックグラウンド研磨を、２０名の健常なドナーのｃｆＤＮＡの試料を訓練コホートとして利用することによって、行った（図１２）。下流の分析に外れ値が影響を与えるのを防ぐために、ＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡまたはＰＢＬ ｇＤＮＡ試料にわたる配列決定の深度（１５００倍以下、５０００倍以上）の下位１５または上位８５パーセンタイルの候補ＳＮＶ、ならびに平均の配列決定の深度が５００倍以下の遺伝子を分析から除外した。クローン造血を説明するために、非生殖系列変異は、血漿に１０％未満の変異対立遺伝子画分を有すると定義された。ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ試料の候補ＳＮＶは、一致したＰＢＬのｇＤＮＡ試料の二重鎖のサポートおよび完全な非存在でリードをサポートする、３以上の基準に基づいて同定された。同定されたＳＮＶの変異対立遺伝子画分（ＭＡＦ）を、代替対立遺伝子に対応するリードの数を、代替対立遺伝子および参照対立遺伝子に対応するリードの合計で割ることによって計算した。同定可能なＳＮＶを有するＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡの試料各々について、ＳＮＶにわたる平均ＭＡＦを計算し、ｃｔＤＮＡの存在量の尺度として使用した。１つのみの同定可能なＳＮＶを有するｃｆＤＮＡ試料では、計算されたＭＡＦを使用した。検出可能ながん由来の変異の多くはホモ接合性でなくても、腫瘍の内部でクローン性でなくてもよく、これらの理由から、平均ＭＡＦはセルフリーＤＮＡ内の真のｃｔＤＮＡの存在量を過小評価したものであり得る。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリの生成
「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」に記載されているようにライブラリ調製工程を変更して、Ｓｈｅｎら２０１９に記載されているように、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロトコルを実施した。多重化ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ／ＮｏｖａＳｅｑ／ＨｉＳｅｑ４０００でそれぞれ２×７５／１００／１２５の対の試行で配列決定した。一般化の可能性のために、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリは、供給源（すなわち、ｃｆＤＮＡ、ｇＤＮＡ）にかかわりなく、５～１０ｎｇのインプットＤＮＡを利用する任意のＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ調製方法として記載されている。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリのアラインメントおよび質の管理
ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリのアラインメントおよび質の管理において、前に記載されたように、アラインメントされていない対のリードを処理し、アラインメントし、ソートし、インデックス付けした。ＢＡＭファイルからの重複配列をＳＡＭｔｏｏｌｓによって崩壊させた。各ライブラリの質の管理は、ＦａｓｔＱＣ（Ｂａｂｒａｈａｍ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）から得られた様々なメトリック、ならびにＣｐＧカバレッジ（ＭＥＤＩＰＳ．ｓｅｑＣｏｖｅｒａｇｅ）および濃縮（ＭＥＤＩＰＳ．ＣｐＧｅｎｒｉｃｈ）を含むＲパッケージＭＥＤＩＰＳ（参照）から得られた様々なメトリックによって評価した。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルにおける情報領域の選択
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリのペアリードから生成された断片を、ＭＥＤＩＰＳ（ＭＥＤＩＰＳ．ｃｒｅａｔｅＳｅｔ）によって重複しない３００塩基対ウィンドウ内でカウントし、Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＲＰＫＭ）によってスケーリングし、ＷＩＧフォーマット（ＭＥＤＩＰＳ．ｅｘｐｏｒｔＷＩＧ）としてエクスポートした。各試料から得たＷＩＧファイルをＲによってインポートし、マトリックスとして照合した。分析は、非疾患状況の中での適用を可能にするために、２０人の健常なドナーの試料から得たｃｆＤＮＡおよびＰＢＬの試料に限定された。情報領域は、ＣｐＧの密度、およびｃｆＤＮＡと一致したＰＢＬとの間でのＲＰＫＭ値の相関の基準に基づいた。ＣｐＧの密度（≧ｎのＣｐＧ）に基づくスライディングウィンドウを使用して、≧８個のＣｐＧの最小閾値を選択した。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリからの絶対的なメチル化の計算
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリの対にしたリードから得た断片を、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ Ｐｒｏｆｉｌｅｓに以前に記載されたようにカウントし、ＭｅＤＥＳｔｒａｎｄ Ｒパッケージによって絶対的なメチル化レベルにスケーリングした。カウントから絶対的なメチル化を計算するために、ロジスティック回帰モデルを使用して、ＣｐＧの密度（すなわち、ＣｐＧ密度バイアス）に基づいてＤＮＡプルダウンのバイアスを推定した（ＭｅＤＥＳｔｒａｎｄ．ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎＣｕｒｖｅ）。推定されたＣｐＧ密度バイアスに基づいて、各ウィンドウ内部のメチル化を、陽性および陰性のＤＮＡ鎖からの断片について補正した。補正された断片を有するウィンドウを対数変換し、絶対的なメチル化（ＭｅＤＥＳｔｒａｎｄ．ｂｉｎＭｅｔｈｙｌ）を表すために、０～１の値にスケーリングした。各ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ試料からの絶対的なメチル化レベルを、ＷＩＧ様ファイル（すなわち、トラックラインのないＷＩＧファイルフォーマット）としてエクスポートした。
インシリコのＰＢＬ枯渇の設計およびパフォーマンスの評価
疾患状況内のウィンドウを濃縮するために、ＰＢＬからのメチル化を「インシリコのＰＢＬ枯渇」と呼ばれるプロセスによって除去した。分析は、非がん特異的状況の中での適用を可能にするために、２０人の健常なドナーの試料のコホートから得たＰＢＬ試料に限定された。インシリコのＰＢＬ枯渇のための本発明者らの戦略を以下のように実行した：
１．ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルにおける情報領域の選択において記載される各情報ウィンドウについて、健常なドナーのＰＢＬ試料にわたる絶対的なメチル化の中央値を計算する。
２．絶対的なメチル化の中央値＜０．１の基準に基づいて、ＰＢＬ枯渇ウィンドウを定義する。
３．ＰＢＬ枯渇ウィンドウ内部のｃｆＤＮＡ試料の分析を制限する。
インシリコのＰＢＬ枯渇戦略のパフォーマンスを、訓練セットとして使用した健常なドナーのコホートから得た枯渇前後のＰＢＬ試料の絶対的なメチル化分布を検証セットとして使用したＨＮＳＣＣコホートと比較することによって、評価した。
差次的メチル化分析
ＨＮＳＣＣ関連の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）のロバストな検出を可能にするために、分析を、ＣＡＰＰ－ｓｅｑによる血漿の検出可能なＳＮＶを有するＨＮＳＣＣ患者に限定した（ｎ＝２０／３２）。差次的メチル化分析は、インシリコのＰＢＬ枯渇後の情報領域に限定された。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルにおける情報領域の選択において前に記載されたように作製された、ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーｃｆＤＮＡ試料からのビニングされた断片数の照合されたマトリックスを、ＤＥＳｅｑ２ ＲパッケージによるＤＭＲの同定のために利用した。すべてのｃｆＤＮＡ試料にわたって＜１０カウントの領域を除去することによってプレフィルタリングを行った。条件（ＨＮＳＣＣ対健常なドナー）として定義される単一因子を、差次的メチル化分析中のコントラストに使用した。簡潔には、サイズ因子および分散推定値に基づいて試料をスケーリングし、続いて負の二項一般線形モデルをフィッティングすることによって、差次的メチル化分析を行った。各ウィンドウについて、Ｗａｌｄ検定によってＨＮＳＣＣと健常なドナーの状態との間でＰ値を計算した。デフォルトのＣｏｏｋの距離カットオフを超える領域内のＰ値は、調整されたＰ値の計算から省かれた（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）。ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ試料の有意な過剰メチル化または低メチル化領域（過剰ＤＭＲ／低ＤＭＲ）は、調整されたＰ値＜０．１を有するウィンドウとして定義される。
ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域内のＣｐＧ特徴の濃縮
アイランド、ショア、ｓｈｅｌｆ、およびｏｐｅｎ ｓｅａ（ｉｎｔｅｒＣＧＩ）などのＣｐＧ特徴は、ＡｎｎｏｔａｔｉｏｎＨｕｂ Ｒパッケージ（参照）（ｈｇ１９＿ｃｐｇｓアノテーション）に定義されている。「ａｎｎｏｔａｔｒ」および「ＧｅｎｏｍｉｃＲａｎｇｅｓ」Ｒパッケージを利用する社内Ｒパッケージを使用して、ＰＢＬ枯渇領域内の各過剰メチル化ウィンドウ（すなわち、「ｃｈｒ．ｓｔａｒｔ．ｅｎｄ」）のＩＤ座標を、重複するＣｐＧ特徴でラベル付けした（図１３）。
観察された特徴の重なり対ヌル分布の濃縮確率を判定するために、１０００回のランダムサンプリングを行った。各サンプリングについて、ＣｐＧの同一の分布を維持しながら、過剰メチル化ウィンドウの数に基づいて、等しい数のビンを選択した。サンプリング全体の各ＣｐＧ特徴について、観察された重複数を使用して、それぞれのヌル分布を生成し、続いてｚスコアスケールに変換した。各ＣｐＧ特徴について観察された過剰メチル化領域の重複もｚスコア化変換し、ヌル分布から略式の統計を導出した。過剰メチル化ウィンドウから得た観察された重複の推定されるＰ値を、ヌル分布の観察された重複以上／以下の重複を有するランダムサンプリングの数として、計算した。
腫瘍がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）からのがん特異的過剰メチル化シトシンによるｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域のＨＮＳＣＣの濃縮
乳房（ＢＲＣＡ）、結腸直腸（ＣＯＡＤ）、頭頸部（ＨＮＳＣ）、前立腺（ＰＲＡＤ）、膵臓（ＰＡＡＤ）、肺アデノ（ＬＵＡＤ）、および肺扁平上皮（ＬＵＳＣ）からのすべての原発腫瘍の公的に利用可能なｈｍ４５０ｋのプロファイル由来のファイル情報をＴＣＧＡからダウンロードした。本発明者らのＨＮＳＣＣコホートの大部分が口腔の腫瘍を呈することに起因して、ＨＮＳＣ群からのファイルは、「口腔底部」に原発部位を有する患者に限定された（ｎ＝５５）。同数のｈｍ４５０ｋファイルを、残りのがんのタイプのそれぞれから、ならびに健常なＰＢＬの別個のデータベース（ＧＥＯシリーズＧＳＥ６７３９３）からランダムに選択した。ダウンロードされたファイルのマニフェストが、（図１４）に提供される。
「腫瘍特異的」過剰メチル化シトシンを生成するために、ｌｉｍｍａによる差次的メチル化分析を各々のがんのタイプについて行い、他のがんのタイプならびにＰＢＬ（すなわち、造影剤）と個々に比較した。所与のコントラストについて、残差分散および試料β値を組み込んだ各プローブ対象シトシンについて線形モデルをフィッティングし、次いで、コントラスト間の観察された差のＰ値を、経験的ベイズ平滑化によって計算する。個々の比較に対して所与のがんのタイプにおいてメチル化が上昇した過剰メチル化シトシンを、対数倍率変化０．２５以上および調整Ｐ値（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）０．０１未満によって定義した。個々のがんのタイプに固有の過剰メチル化シトシンを「腫瘍特異的」と命名した。ＬＵＳＣ、ＬＵＡＤおよびＰＡＡＤの場合については、腫瘍特異的な過剰メチル化シトシンが全くまたはほとんど同定されなかったので（０、１５、１８）、その後の分析から省いた。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリとの比較のために、腫瘍特異的過剰メチル化シトシンからの塩基対の位置を、Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ ＰＢＬ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅに記載されているように、インシリコのＰＢＬ枯渇後の情報ウィンドウと重ねた。
ＴＣＧＡ由来の腫瘍特異的領域とのＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域についての重複の濃縮を、ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域内のＣｐＧ特徴の濃縮に記載されているのと同じ方法を使用した１０，０００回のランダムサンプリングによって評価した。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡ検出の感度および特異度
３２個のＨＮＳＣＣおよび２０個の健常なドナーのｃｆＤＮＡ試料のコホートからのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリについて、ｃｔＤＮＡ検出を、健常なドナーのｃｆＤＮＡ試料にわたる最大ＲＰＫＭの平均値よりも大きい個々のＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ試料のＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域にわたるＲＰＫＭの平均値の観察に基づいて、定義した。この定義に基づくｃｔＤＮＡ検出の感度および特異度を、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析によって評価した。患者のサブセットにおけるｃｔＤＮＡ放出の潜在的な欠如に起因するいかなる交絡的な結果も最小限に抑えるために、ＲＯＣ曲線分析がまた、ＣＡＰＰ－ｓｅｑによる検出可能なｃｔＤＮＡを有する３２個のＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡ試料のうちの２０個のみにおいて行われた。ＤＭＲ分析によるｃｔＤＮＡ検出の精度を評価するための交差検証を行った。手短に言えば、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性患者および健常なドナーを、訓練セット（６０％、ｎ＝２４）および検証セット（４０％、ｎ＝１６）に無作為に割り当て、一方、両方のセットの間で同様のｃｔＤＮＡの存在量（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによって決定される）を維持した。訓練セットの中のＨＮＳＣＣと健常なドナーの試料との間の差次的メチル化分析によって、過剰ＤＭＲを同定した。これらの過剰ＤＭＲ内のｃｔＤＮＡ検出の感度を、ＡＵＲＯＣの値を得るために検証セット内で前述のように評価した（図２Ｃ）。ランダムサンプリングを合計５０回行った。
ＣＡＰＰ－ｓｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって検出されたｃｔＤＮＡの断片の長さの分析
各ＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡ ＣＡＰＰ－ｓｅｑライブラリについて、明示されたＳＮＶ（すなわち、シングルトン、ＳＣＳ、ＤＣＳ）のすべてのサポート対リードおよび参照対立遺伝子を含む対のリードからの断片の長さの中央値を測定した。断片の長さの中央値が、１を超えるＳＮＶの患者について報告された場合、各ＳＮＶからの断片の長さの中央値にわたる中央値を計算した。各ＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリについて、以前に決定されたＨＮＳＣＣのｃｆＤＮＡ過剰メチル化領域にマッピングするすべての断片からの断片の長さの中央値を計算した。２０人の健常なドナーのコホートの中にメチル化が相対的に存在しないため、各健常なドナーのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリの断片の長さを、いずれかの計算の前に照合した。両方のタイプのライブラリにおいて、断片の長さの分析は、１番目のピーク内のｃｆＤＮＡに限定された（すなわち、＜２２０塩基対）。
過剰ＤＭＲ内の断片（１００～１５０ｂｐまたは１００～２２０ｂｐ）の濃縮を以下のように計算した。以前に設計したＰＢＬ枯渇ウィンドウ内のランダムな３００ｂｐビンから、合計３０回のサンプリングから、同一の数およびＣｐＧ密度分布で、予想されるカウントのヌル分布を生成した。各試料について観察されたカウントを、過剰ＤＭＲにわたるリードカウントに基づいて決定した。各試料について、平均観察数を平均予想数で割ることに基づいて、濃縮度を計算した。
教師付き階層クラスタリング
クラスタリングの前に、ｌｏｇ２変換を可能にするために、０．１の擬似カウントをｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリのすべてのＲＰＫＭ値に追加した。値をユークリッド変換によってスケーリングし、ウォードの方法によってクラスタリングした。３つの別個のクラスターの任意の数を選択し（ｋ＝３）、メチル化クラスター１～３と命名し、その後の分析に使用した。
ＨＮＳＣＣ患者の臨床転帰に対するｃｔＤＮＡ検出および定量化のメトリック
ｃｔＤＮＡ検出の潜在的な臨床的有用性を、３つのメトリックによって評価した。１）ＣＡＰＰ－ｓｅｑによるＳＮＶの検出、２）ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる過剰メチル化領域における増加した平均ＲＰＫＭの検出。比較分析のために、患者を以下の基準に基づいて層別化した。１）ＳＮＶの有無、２）メチル化クラスター１対メチル化クラスター２＋３。患者の特徴を表１に記載する。
Figure 2023528533000030
Figure 2023528533000031
Figure 2023528533000032
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ分析によるｃｔＤＮＡ由来メチル化の交差検証
ｃｔＤＮＡ由来メチル化を同定するためのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑのロバスト性を評価するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を行った。ｃｔＤＮＡ低／欠如に起因した交絡する結果を最小限に抑えるために、分析を、ＣＡＰＰ－ｓｅｑによる検出可能なｃｔＤＮＡを有するＨＮＳＣＣ患者に限定した。患者および健常対照のｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを訓練セット（ＨＮＳＣＣ：ｎ＝１２／２０；健常対照：ｎ＝１２／２０）および試験セット（ＨＮＳＣＣ：ｎ＝８／２０；健常対照：ｎ＝８／２０）に分割した。訓練セットおよび試験セットは、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ分析によって判定されるｃｔＤＮＡの存在量についてバランスを取るようにした。各反復で実行されたＲＯＣ曲線分析を用いて、合計５０回の分割を実行した。
ＴＣＧＡ分析によるＨＮＳＣＣの予後領域の同定
一致したレガシーｈｍ４５０ｋおよびＲＮＡ発現データを有するＴＣＧＡからのすべての利用可能なＨＮＳＣＣの症例を選択した（ｎ＝５２０）。生存データをＪｉａｎｆａｎｇらから得た。ｈｍ４５０ｋのデータに関して、特定の領域のプローブＩＤ間で平均β値を計算することによって、前述のようにメチル化を３００ｂｐ領域にまとめた。隣接する正常組織と比較してＨＮＳＣＣ原発腫瘍において過剰メチル化された領域を同定するために、独立したウィルコクソン検定を各領域について行った。隣接する正常組織と比較して、原発腫瘍において、調整されたｐ値＜０．０５（Ｈｏｌｍｓ法）ならびにｌｏｇ倍数変化１以上である領域を、その後の分析のために選択した。予後と関連する過剰メチル化領域を同定するために、年齢、性別および臨床病期を考慮して、ｐ値＜０．０５の領域を選択して、多変量Ｃｏｘ回帰を行った。生存分析は、ＨＮＳＣＣ ｃｆＤＮＡコホート内で観察されたことを反映して、診断後５年の最大追跡期間に限定された。遺伝子発現の変化に関連する予後の領域をさらに同定するために、スピアマンの相関を、各領域のｈｍ４５０ｋ原発性腫瘍プロファイルについて、２Ｋｂウィンドウ内の転写物の一致したＲＮＡ発現プロファイルに対して計算した。絶対的なＲｈｏ値＞０．３および偽発見率＜０．０５を有する領域を選択し、ＺＮＦ３２３／ＺＳＣＡＮ３１、ＬＩＮＣ０１３９５、ＧＡＴＡ２－ＡＳ１、ＯＳＲ１、およびＳＴＫ３／ＭＳＴ２の発現に関連する５つの予後領域の最終的な同定をもたらした。ＴＣＧＡ患者プロファイルについては、複合メチル化スコア（ＣＭＳ）を、５つすべての予後領域にわたるβ値の合計を計算することによって得た。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルの場合、９４３個すべての過剰ＤＭＲにわたるＲＰＫＭ値を合計１にスケーリングし、ＣＭＳを、５つすべての予後領域にわたるこれらのスケーリングされたＲＰＫＭ値の合計を計算することによって得た。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる治療後の血漿試料の長期モニタリング
３０／３２の患者についてｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリの生成に成功した（図１７Ａ～図１７Ｄ）。残りの２人の患者については、不十分な材料が血漿から単離され、および／または質のメトリックを満たさなかった。治療後のｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリのｃｔＤＮＡ定量化を前述のように行い、差次的メチル化分析によって同定された過剰メチル化領域にわたるＲＰＫＭの平均値を計算した。解釈を容易にするために、処理前および処理後の両方のｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリを、一致したＣＡＰＰ－Ｓｅｑプロファイルによって計算された平均ＭＡＦに対する線形回帰に基づいて、パーセントのＤＮＡの値に変換した。残留疾患の高い信頼性の検出を達成するために、０．２％の最小ｃｔＤＮＡ画分が、治療後の試料で必要であり、これはすべての健常対照にわたって観察されたＲＰＫＭの平均値の最大値に対応した。
結果および考察
局在化したＨＮＳＣＣにおけるセルフリーＤＮＡのマルチモーダルプロファイリング
限局性がんの状況においてｃｔＤＮＡを特性評価するためのマルチモーダルプロファイリングの能力を調べるために、本発明者らは、末梢血試料を連続した時点で収集した前向き観察試験に、３２人のＨＮＳＣＣ患者を募集した（図９Ａ、表１）。すべての患者は手術で治療され、サブセットはアジュバント放射線療法（ｎ＝１４）または化学放射線療法（ｎ＝１１）を受けた。追跡調査の中央値が４３．２ヶ月で、９／３２の患者（２８％）が再発をした（保険統計２年の無再発生存率：８８％）。
大部分の患者は、体細胞組織のゲノム／エピゲノムランドスケープを変化させ、前がん病変に寄与することが十分に記載されている重度の喫煙歴を示したので、本発明者らはまた、以前に肺がんスクリーニングプログラムに登録された２０人のリスクが適合する健常なドナーからの血液試料を分析した３４～３７。血漿由来のセルフリーＤＮＡおよびＰＢＬ由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を血液から共単離し、定量および分析に供した（補足図１Ａ）。健常対照と比較して、転移性疾患における総血漿のセルフリーＤＮＡの有意に上昇したレベルを実証した他の研究とは対照的に、ＨＮＳＣＣコホートと健常なドナーとの間に有意差は認められなかった３８～４１（補足図１Ｂ）。
患者および健常対照からのセルフリーＤＮＡおよびＰＢＬのｇＤＮＡのマルチモーダルプロファイリングを行った（図１）。同じ試料を変異およびメチロームプロファイリングの両方に供することによって、本発明者らは、ｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出および特性評価へのそれらの寄与を評価することができた。変異およびメチル化を、それぞれＣＡｎｃｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）およびｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎおよびハイスループットシーケンシング（ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）を使用して独立してプロファイリングした。さらに、配列決定されたセルフリーＤＮＡ断片の長さを得るために、ペアードエンドシーケンシングを両方の方法論に利用した。
治療前の血漿からの変異ベースのｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出
本発明者らは、最初に、一致した腫瘍試料内での確認なしでの変異ベースのｃｔＤＮＡ検出の信頼性を改善するためのアプローチを評価した。最近の研究は、ＴＰ５３などのｃｔＤＮＡ検出のために頻繁に標的化される遺伝子が、クローンで拡大されたＰＢＬに由来する変異を有し得ることを示している。さらに、ｃｔＤＮＡは腫瘍の遺伝的特徴およびエピジェネティックの特徴の両方を含むので、本発明者らは、患者のセルフリーＤＮＡにおける両方の特徴の直交解析がｃｔＤＮＡ検出の信頼性を高め得ると推論した。したがって、低い存在量のｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出を高い信頼性で達成するために、ｃｆＤＮＡおよび一致したＰＢＬの両方について、ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによってそれぞれ変異およびメチル化を独立してプロファイリングした。
腫瘍から得る事前の知識なしにＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣにおけるｃｔＤＮＡ検出の感度を評価するために、本発明者らはまず、ベースライン血漿試料における変異の存在量を測定した（図２Ａ）。ＣＡＰＰ－Ｓｅｑを、ＨＮＳＣＣ関連変異の数を最大化するように設計された配列決定パネルを用いて行った（表３および図１０）。本発明者らはまた、バックグラウンド塩基置換エラーを除去するために、確立されたエラー抑制方法論を採用した。
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１０～３０ｎｇのインプットＤＮＡを利用する、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによる診断時のＨＮＳＣＣ患者および健常なドナーからの血漿およびＰＢＬ試料をプロファイリングした。低い存在量でのｃｔＤＮＡの高感度検出を達成するために、本発明者らは、ＨＮＳＣＣにおける検出された変異の数を最大化するように最適化されたＣＡＰＰ－Ｓｅｑセレクタを適用した（表２および図１０）。本発明者らは、統合デジタルエラー抑制（ｉＤＥＳ）によって分析感度をさらに改善し、カスタム分子バーコードを組み込み、健常なドナー血漿試料（方法）内で同定されたバックグラウンド塩基置換エラーを除去した。
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血漿プロファイリングおよび可能性のある生殖系列変異の除去に基づいて候補の体細胞一塩基変異体（ＳＮＶ）を選択した後、本発明者らは、適合したＰＢＬプロファイルとの比較によってクローン造血（ＣＨ）による潜在的偽陽性を特性評価した。同定可能な候補のＳＮＶを有する２４人の患者のうち、１０人が、高度に相関する変異対立遺伝子画分（ＭＡＦ）を有する一致したＰＢＬプロファイル内で同一のＳＮＶを示した（Ｒ＝０．９４、ｐ＝１．３９２ｅ－０７、図２Ｂ）。ＰＩＫ３ＣＡを除いて、これらのＳＮＶを有する遺伝子は各患者に固有であった（図２Ｃ）。ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、およびＡＳＸＬ１などのＣＨによって一般に影響を受ける遺伝子はＣＡＰＰ－Ｓｅｑセレクタ内に含まれなかったので、一致したｃｆＤＮＡおよびＰＢＬ試料内の患者固有のＳＮＶの本発明者らの知見は、遺伝子レベルフィルタリングよりもこのアプローチの利点をさらに強調する。４人の患者から得た血漿試料は、ＣＨに由来するＳＮＶについて厳密に陽性であり（図２Ｄ）、一致したＰＢＬプロファイリングが、低い存在量のｃｔＤＮＡの偽陽性検出を大幅に最小化し得ることを示唆している。
ＣＨを潜在的に反映する候補のＳＮＶを除去した後、ｃｔＤＮＡを２０人の患者の血漿内で検出した（中央値［範囲］：患者１人あたり３［１～１０］のＳＮＶ）。これらのＳＮＶの妥当性を評価するために、本発明者らは、結果を、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）によって公表された２７９個のＨＮＳＣＣ腫瘍からの全エクソーム解析データと比較して４５、ＴＰ５３（６５％対７２％）、ＰＩＫ３ＣＡ（２０％対２１％）、ＦＡＴ１（１５％対２３％）およびＮＯＴＣＨ１（１０％対１９％）を含む高頻度変異遺伝子における類似性を観察した（図２Ｅ）。興味深いことに、２人の患者は、これらの遺伝子の中で見られない単一のＳＮＶを示し（ＧＲＩＮ３ＡおよびＭＹＣ、図１１）、ｃｔＤＮＡの検出感度を高めるための未知／非ドライバ効果の遺伝子プロファイリングの付加的な有用性を実証した。
ＳＮＶの平均ＭＡＦに基づいてｃｔＤＮＡ存在量を計算すると、ｃｔＤＮＡレベルは０．１４％～４．８３％の範囲であった（図２Ｆ）。この検出下限は、約０．１４％と推定される、腫瘍ナイーブＣＡＰＰ－Ｓｅｑ分析を利用する他の者によって以前に記載されたものと類似している。検出不能なｃｔＤＮＡを有する患者を含めて、本発明者らのＨＮＳＣＣコホートにわたるｃｔＤＮＡ存在量の中央値は０．４９％であり、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによって限局性ＮＳＣＬＣにおいて観察されたものと類似していた。
ベースライン血漿からのメチル化ベースのｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出
次に、本発明者らは、ＨＮＳＣＣおよび健常対照試料におけるｃｔＤＮＡ関連メチル化パターンを定義しようとした。ＣＡＰＰ－Ｓｅｑの結果は、ＰＢＬから生じる偽陽性変異の影響を示したので、本発明者らは、偽陽性ｃｔＤＮＡ関連メチル化の減少が、ＰＢＬ由来のＤＮＡメチル化シグナルの除去によって達成され得ると推論した。したがって、本発明者らは、セルフリーＤＮＡメチル化シグナルへの寄与を抑制するために、ＨＮＳＣＣおよび健常対照試料からの一致したＰＢＬ ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを使用し（図３Ａ）、一致したＰＢＬの分析がまた、メチル化ベースのｃｔＤＮＡ検出も可能にし得るかどうかを評価した（図３Ａ）。治療前のＨＮＳＣＣおよび健常なドナーの血漿ならびにＰＢＬを、５～１０ｎｇのインプットＤＮＡを利用し、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって、プロファイリングした。前に記載されたように、メチル化の存在量を、１００万あたりのキロベース（ＲＰＫＭ）（方法）のリードに対して正規化されたリードカウントで、染色体１～２２にわたる重複しない３００ｂｐウィンドウ（ｎ＝９，６０３，４５４ウィンドウ）で定義した。
メチル化プルダウンのために利用される抗５ｍＣ抗体は、ＣｐＧアイランドを含む増加するＣｐＧ密度でＤＮＡ断片に優先的に結合するので、本発明者らは、この相互作用を最初に特性評価して、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑデータ内で高度に表される可能性が高い領域を同定した。本発明者らはまた、ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑをＨＮＳＣＣ細胞株ＦａＤｕに適用して、がん由来メチル化ＤＮＡ断片の優先的な結合を評価した。様々な数のＣｐＧを有するウィンドウにわたってＤＮＡ断片プルダウン存在量（ＲＰＫＭの中央値）を比較すると、本発明者らは、ＰＢＬおよびＦａＤｕの両方について最大８ＣｐＧ以上の濃縮の増加を観察した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。ＦａＤｕは、３００ｂｐウィンドウあたり８ＣｐＧ以上で、ＰＢＬと比較してより大きな濃縮を示した。この結果は、ＦａＤｕを含むがん細胞におけるＣｐＧアイランドの過剰メチル化の確立された現象と一致している。これらの観察に基づいて、本発明者らは、８以上のＣｐＧ（ｎ＝７０２，４８８）を有するウィンドウがｃｔＤＮＡ検出に最も情報があり得、そのためその後のすべての分析に利用されたと判定した。
限局性がんを有する患者の場合、血漿のセルフリーＤＮＡの大部分はＰＢＬに由来する。したがって、本発明者らは、セルフリーＤＮＡシグナルへのこの寄与を生物情報学的に抑制するためにＰＢＬ ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを利用しようとした。本発明者らは、ＨＮＳＣＣおよび健常なドナーｃｆＤＮＡから作製されたｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内の各ウィンドウについてのＲＰＫＭの値を、ＦａＤｕ（１×１の比較）、対になっていないＰＢＬ（１×５１の比較）または対になったＰＢＬ（１×１の比較）から作製されたＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルと比較した。血漿のセルフリーＤＮＡの主な寄与因子であるＰＢＬによれば、ゲノムワイドのメチル化プロファイルは、血漿のセルフリーＤＮＡと、対になったまたは対になっていないＰＢＬとの間で高度に相関していた（それぞれ最頻値Ｒ＝０．９２およびＲ＝０．９１）。これらの相関の強さは、血漿のｃｆＤＮＡに対するＰＢＬの既知のサイズ外の寄与を反映している可能性が高い。対照的に、血漿のセルフリーＤＮＡとＦａＤｕとの間の相関はより弱かった（最頻値Ｒ＝０．７８）（図３Ｂ）。
優先的プルダウンを考慮しながら、ＰＢＬにわたるメチル化の減少の閾値を選択するために、本発明者らは、ＭｅＤＥＳｔｒａｎｄ Ｒパッケージ（方法）によるロジスティック回帰モデリングに基づいて、ＰＢＬ ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルを絶対的なメチル化レベル（０～１）にスケーリングおよび正規化した。本発明者らは、健常なドナーのＰＢＬにわたって０．１未満の絶対的なメチル化の中央値を示す９９，９９７個のウィンドウを選択した。これらのウィンドウを、除外されたＨＮＳＣＣ ＰＢＬに適用したとき、本発明者らは、利用された健常なドナーのＰＢＬの絶対的なメチル化分布と同様の絶対的なメチル化分布を観察し（図３Ｂ）、このアプローチの一般化の可能性を実証した。同様に、これらのウィンドウのいずれも個々には、健常なドナーのＰＢＬと比較してＨＮＳＣＣのＰＢＬにわたって有意に高いメチル化を示さず（図３Ｃおよび図１２Ｂ）、ｃｔＤＮＡ検出を混乱させ得るＨＮＳＣＣ特異的ＰＢＬメチル化のあらゆる供給源を制限した。換言すれば、これらの結果は、対照および局所的に限定されたＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣ血漿の両方におけるｃｆＤＮＡメチル化の主な源がＰＢＬに由来し、ＰＢＬ由来のメチル化の生物情報学的除去がｃｔＤＮＡの定量化を混乱させたシグナルを制限し得ることを確認する。
治療前のメチル化ベースのｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出
ＨＮＳＣＣコホート内の一般的なｃｔＤＮＡ由来の過剰メチル化領域を同定するために、本発明者らは、ＨＮＳＣＣ患者と、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによる検出可能なｃｔＤＮＡ（ｎ＝２０）とを、健常なドナーと比較する、差次的メチル化分析を行った。ＰＢＬにおけるメチル化のために枯渇される９９，９９４個の３００ｂｐウィンドウを利用して、本発明者らは、２０人のＨＮＳＣＣ患者をＣＡＰＰ－Ｓｅｑ－検出可能なｃｔＤＮＡと２０人の健常対照と比較することによって、ｃｔＤＮＡ由来の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を同定した。総じて、本発明者らは、ＨＮＳＣＣ試料全体で９９７個の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）（過剰メチル化：９４１、低メチル化：５６）を同定した（図３Ｃ）。過剰メチル化領域（過剰ＤＭＲ）の半分程度が互いに直接隣接していることが見出され、過剰メチル化のブロックは最大１８００塩基対の長さに及んだ（図１３Ａ）。これらのデータは、同定された過剰ＤＭＲ内のＣｐＧアイランドが存在することを示唆している。逆に、隣接する低メチル化領域（低ＤＭＲ）は観察されなかった。３００ｂｐの過剰ＤＭＲのうち、４７．５％は、長さが１８００ｂｐにまで及ぶ過剰メチル化シグナルの連続したブロックに存在し（図１３Ａ）、典型的には長さが３００～３０００ｂｐに及ぶＣｐＧアイランドを示した。実際、ＣｐＧアイランドは、過剰ＤＭＲについて有意に濃縮されていた（図３Ｅ）。対照的に、低ＤＭＲについてはＣｐＧアイランドが有意に枯渇した（図１３Ｂ）。
これらの過剰ＤＭＲが実際にＣｐＧアイランドについて濃縮されているかどうかを判定するために、本発明者らは次に、置換分析（方法）によってＣｐＧアイランド、ショア、ｓｈｅｌｆ、およびｏｐｅｎ ｓｅａについて、過剰ＤＭＲの濃縮を評価した。予想されるように、ＣｐＧアイランドの有意な濃縮、ならびにショアおよびｏｐｅｎ ｓｅａの有意な枯渇が、過剰ＤＭＲ内で観察された（図３Ｅ）。対照的に、低ＤＭＲは、がん全体で頻繁に観察されるＣｐＧ－スパース領域の低メチル化に従って、ｏｐｅｎ ｓｅａが有意に濃縮され、ＣｐＧアイランドが枯渇していた（補足図５Ｂ）。
最後に、特定の領域のメチル化は、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを使用して以前に記載されたように起源の組織を区別し得るので、本発明者らはまた、過剰ＤＭＲがＨＮＳＣＣまたは他のがんに特異的な領域を含むかどうかを調べた。腫瘍特異的メチル化領域を同定するために、本発明者らは、ＴＣＧＡ（方法）によってもたらされる原発腫瘍から生成されたＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋ（ｈｍ４５０ｋ）のデータを利用した。浸潤性乳癌（ＢＲＣＡ）、結腸腺癌（ＣＯＡＤ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、前立腺腺癌（ＰＲＡＤ）、ＨＮＳＣＣ、膵臓腺癌（ＰＡＡＤ）、およびＰＢＬ由来の原発腫瘍を比較して、本発明者らは、ＢＲＣＡ、ＣＯＡＤ、ＰＲＡＤ、およびＨＮＳＣＣ（方法）に特異的な十分な過剰メチル化ＣｐＧ（≧５０）を同定した（図１４）。予想通り、本発明者らは、ＨＮＳＣ特異的過剰メチル化ＣｐＧと重複する血漿由来ＤＭＲの有意な濃縮、ならびにＢＲＣＡ、ＣＯＡＤおよびＰＲＡＤ特異的過剰メチル化ＣｐＧにわたる重複の有意な枯渇を観察し（図３Ｆ）、このことは、過剰ＤＭＲが、様々な他のがんのタイプと比較した場合にＨＮＳＣＣ起源に特異的な領域を含むことを示唆している。
変異ベースとメチル化ベースのｃｔＤＮＡ検出は特に一致している
いっそう多くの研究が、血漿のセルフリーＤＮＡの健常な源と比較して、減少した断片の長さに関連するｃｔＤＮＡを記載しており、ロバストな腫瘍ナイーブ検出のためのさらなるメトリックが得られている。標的化された配列決定が、低下した断片の長さでｃｔＤＮＡを検出することが以前に示されているので、本発明者らはまず、本発明者らのＣＡＰＰ－Ｓｅｑプロファイルを利用して、本発明者らがＨＮＳＣＣ患者において同様の傾向を観察し得るかどうかを判定した。患者ごとに同定された各ＳＮＶ（図２Ｅ）について、ＳＮＶ対立遺伝子ならびに重複する参照対立遺伝子を含む断片の長さの中央値を測定した。患者の試料の中で複数のＳＮＶが同定された場合については、すべてのＳＮＶおよびそれらの参照対立遺伝子にわたる中央値を使用した。以前の知見によれば、本発明者らは、患者全体で健常なセルフリーＤＮＡと比較してｃｔＤＮＡ断片のサイズの一貫した減少を観察した（中央値［範囲］Δ＝－１７．５［１～５８］ｂｐ）（図４Ａ）。これらの変異の平均ＭＡＦと断片の長さとの間に有意な関連はなかった（図１５Ａ）。
亜硫酸水素塩ベースのＤＮＡメチル化アプローチとは異なり、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑはＤＮＡの分解を引き起こさず、したがって元の断片サイズ分布を維持する。これは、ＤＮＡメチル化および断片の長さを同時にマッピングする新規な機会を提供する。各患者について以前に同定された血漿由来過剰ＤＭＲ内の断片の長さの分布を評価した。これらの領域が本発明者らの健常なドナーにわたる低いメチル化を有するという性質のために、ドナーにわたるＤＮＡ断片を、比較のために組み合わせた。変異に基づく分析と同様に、本発明者らは、グループ化された健常対照と比較して、１９／２０のＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性患者からの断片の長さの減少を観察した（中央値［範囲］Δ＝－７［１～２１］ｂｐ）（図４Ｂ）。これは、おそらく過剰ＤＭＲ内のセルフリーＤＮＡ断片の健常な組織による部分的な寄与のために、変異ベースの分析と比較して断片の長さの減少が小さいことを示した。この考えを裏付けて、最も短い過剰ＤＭＲ断片を有する試料は、より高いメチル化ｃｔＤＮＡ存在量（ピアソンｒ＝－０．６４、ｐ＝０．００２）を示した（図１５Ｂ）。小さい断片（１００ｂｐ～１５０ｂｐ）対大きい断片（１５１ｂｐ～２２０ｂｐ）の比を本発明者らの過剰ＤＭＲ、ｃｔＤＮＡを濃縮するための以前に記載されたアプローチ、のために使用したとき、本発明者らは、大部分のＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性ＨＮＳＣＣ試料にわたってｃｔＤＮＡの濃縮の同様の傾向を観察した（中央値［範囲］＝２８［－８～６３］％）（図４Ｃ）。
本発明者らのＨＮＳＣＣコホートにおいて同定された血漿のセルフリーＤＮＡ過剰ＤＭＲがこれらの小さな断片（１００～１５０ｂｐ）内の個体にわたりどのように異なり得るかを評価するために、本発明者らは最初に階層的クラスタリングを行った。４つの主要なクラスターがＣｏｎｓｅｎｓｕｓＣｌｕｓｔｅｒＰｌｕｓ Ｒパッケージを利用して出現し、それぞれが過剰ＤＭＲにわたって異なるレベルのメチル化を有した（図４Ｅおよび図１６Ｃ）。同様に、３つのクラスターは、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ（図１６Ｄ）によって判定されるような別個のｃｔＤＮＡ存在量によって定義され、これは、過剰ＤＭＲメチル化の平均と変異に基づくｃｔＤＮＡの存在量との間の潜在的な関係を示唆している。
次に、本発明者らは、断片の長さがＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑの両方によって同定されたｃｔＤＮＡ分子間で一致するかどうかを調査し、本発明者らのマルチモーダルアプローチに対する検証のさらなる層を潜在的にもたらす。バックグラウンドＤＮＡ断片がｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内のｃｔＤＮＡの計算された断片の長さを混同させる可能性を最小限に抑えるために、本発明者らは、過剰ＤＭＲ全体でメチル化レベルの中央値を超える患者（ｎ＝１０人のＨＮＳＣＣ患者）に分析を限定した。驚くべきことに、完全に異なるゲノム領域がこれらの２つのプロファイリング手法を用いて表されているにもかかわらず、ｃｔＤＮＡ断片の長さは、各患者についての対となったＣＡＰＰ－ＳｅｑプロファイルとｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルとの間で非常に一致していた（図４Ｃ）（ピアソンｒ＝０．８６、ｐ＝０．００１６）（ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ：４３個の異なる変異、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ：９４１個の過剰ＤＭＲ）。
過剰ＤＭＲメチル化レベルと変異ベースのｃｔＤＮＡ存在量との間の関係をさらに特性評価するために、本発明者らは、９４１の過剰ＤＭＲにわたるＲＰＫＭの平均値を、各患者についてＣＡＰＰ－Ｓｅｑによって判定されたＭＡＦの平均値と比較した。メチル化クラスター間で観察された傾向と同様に、本発明者らは有意な正の相関（ピアソン相関、Ｒ＝０．８５、ｐ＝５ｅ－１０）を観察した（図４Ｆ）。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるこれらの過剰ＤＭＲ内のｃｔＤＮＡ検出の感度を評価するために、本発明者らは、本発明者らのＨＮＳＣＣコホートと健常なドナーとの間のＲＰＫＭの平均値を比較した。ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性患者（ｎ＝２０）については、ｃｔＤＮＡ検出は特に一致しており（ＡＵＣ＝０．９９８）、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陰性患者（ｎ＝１２）の組み込み時にパフォーマンスがわずかに低下した（ＡＵＣ＝０．９４４）（図４Ｇ）。ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性患者および健常なドナーにわたる交差検証（ｎ＝５０サンプリング）の結果、０．９８４のＡＵＣ中央値がもたらされ（図１６Ａ）、本明細書に開示されるアプローチのロバスト性が実証された。
これらの観察に基づいて、本発明者らは、短縮された長さのセルフリーＤＮＡ断片に分析を限定することによって、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内でｃｔＤＮＡを濃縮し得るかどうかを評価した。本発明者らは、非メチル化ベースのアプローチを使用してｃｔＤＮＡを濃縮する同様の方法が記載されているので、小さい（１００～１５０ｂｐ）断片からなる過剰ＤＭＲ内のセルフリーＤＮＡ断片の割合を評価した。実際、これにより、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性ＨＮＳＣＣ試料の大部分（中央値［範囲］＝２８［－８～６３］％）にわたってｃｔＤＮＡ濃縮がもたらされたが、健常対照のいずれについてももたらされなかった（図４Ｄ）。したがって、セルフリーＤＮＡ断片のインシリコのサイズ選択は、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリ内のｃｔＤＮＡを濃縮し、腫瘍ナイーブマルチモーダルｃｔＤＮＡ分析に寄与し得る。
限局性非転移性がんを有する患者において、診断時のＣＡＰＰ－ＳｅｑによるｃｔＤＮＡの検出は、予後不良に関連することが以前に記載されている。同様に、ＳＨＯＸ２およびＳＥＰＴ９のメチル化によって評価されるｃｔＤＮＡのレベルは、ＨＮＳＣＣにおける予後不良と関連している。したがって、本発明者らは、診断時のＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡの検出または定量化が本発明者らのＨＮＳＣＣコホート内の臨床転帰と関連するかどうかを尋ねた。実際、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ（すなわち、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性対ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陰性）によるｃｔＤＮＡの検出（ハザード比［ＨＲ］＝７．６、ログランクｐ＝０．０２６；補足図８Ｄ）、ならびに本発明者らが以前に同定した過剰ＤＭＲ内のメチル化の増加（すなわち、メチル化クラスター１＋２＋３対メチル化クラスター４）（ＨＲ＝４．５１、ｐ＝０．０３８；図４Ｇ）は、生存期間の短縮と相関していた。この知見と一致して、過剰ＤＭＲにわたる平均ＲＰＫＭは、がんのステージと相関した（補足図８Ｅ）。
次に、本発明者らは、変異またはメチル化に基づくプロファイリングのいずれかによって同定されたｃｔＤＮＡの断片の長さの中央値を比較した。バックグラウンドＤＮＡ断片がｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内のｃｔＤＮＡの計算された断片の長さを混同させる可能性を最小限に抑えるために、本発明者らは、階層的クラスタリングによって定義されるように高いｃｔＤＮＡ存在量を有する患者を選択した（すなわち、メチル化クラスター１および２、図４Ｄ、補足図８Ａ～Ｂ）。このアプローチでは、完全に異なるゲノム領域がこれらの２つのプロファイリング手法を用いて表されているにもかかわらず、ｃｔＤＮＡ断片の長さは、各患者について対となったＣＡＰＰ－ＳｅｑプロファイルとｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルとの間で特に一致していた（Ｒ＝０．８３、ｐ＝０．００１６）（図４Ｈ）。さらに、すべての長さの断片を用いた本発明者らの分析と同様に、本発明者らは、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ（Ｒ＝－０．７９、ｐ＝０．００３８）による小さい断片比とｃｔＤＮＡ断片の長さとの間で同じ関係を観察した（図４Ｉ）。
これらの結果は、ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって検出されるｃｔＤＮＡから観察される断片の長さの同様の減少が、ゲノム領域によるのではなく、腫瘍の固有の特性の結果であり得ること、およびより短い断片の長さを利用することがｃｔＤＮＡのより特異的な同定に寄与し得ることを示唆している。
予後の判定のためのマルチモーダルｃｔＤＮＡ検出の適用
腫瘍ナイーブマルチモーダルｃｔＤＮＡ分析の潜在的な臨床応用を評価するために、本発明者らは、ＨＮＳＣＣコホートにおいてｃｔＤＮＡを臨床転帰と比較した。断片の長さの情報に基づくｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイルは、一致したＣＡＰＰ－ＳｅｑプロファイルにおいてＭＡＦと強く関連し（ピアソンｒ＝０．８５、ｐ＝３×１０－９）、９４１個の過剰ＤＭＲ内のメチル化強度が実際にｃｔＤＮＡの存在量を反映していることを示唆した（図５Ｃ）。重要なことに、交差検証分析により、ｃｔＤＮＡを検出するためのこれらの過剰ＤＭＲのロバスト性が確認された（図１６Ｃ）。変異およびメチル化に基づく方法の両方によってベースラインの血漿において検出されたｃｔＤＮＡを有する患者（ｎ＝１９）は、検出可能なｃｔＤＮＡを有していない患者（ｎ＝８／１３）と比較した場合、進行した疾患（すなわち、ステージＩＩＩ－ＩＶＡ）を有する可能性が有意に高く（ｎ＝１８／１９）（フィッシャーの正確検定ｐ＝０．０２８）、劇的に不良な全生存率を示した（ハザード比［ＨＲ］＝７．５５、９５％信頼区間［ＣＩ］＝［０．９５～５９．９４］、ログランクｐ＝０．０２５）（図５Ｇ）。比較すると、ステージのみでは、より不良な全生存（ＨＲ＝２．５９、９５％ＣＩ＝［０．３２～２０．４６］、ログランクｐ＝０．３５）の患者を予測することができず（図１６Ｄ）、マルチモーダルｃｔＤＮＡプロファイリングの潜在的な臨床的有用性がさらに実証された。
がんドライバの遺伝子発現および結果として生じる機能活性に対するＤＮＡメチル化の既知の効果のために、本発明者らは、特定の遺伝子座におけるｃｔＤＮＡメチル化パターンがｃｔＤＮＡ存在量とは無関係に予後の有意性を有し得ると推論した。本発明者らの以前に同定された過剰ＤＭＲが、ｃｔＤＮＡ存在量とは無関係に予後と関連する特定の領域を含むかどうかを評価するために、本発明者らは、入手可能なすべてのＨＮＳＣＣ患者（ｎ＝５２０）についてＴＣＧＡによって得られるＤＮＡメチル化、ＲＮＡ発現および臨床転帰データを調べた（図５Ｃ）。最初に、本発明者らは、ＴＣＧＡ ｈｍ４５０ｋメチル化アレイデータから異なる３００ｂｐウィンドウ内に含まれるすべてのＣｐＧにわたるβの平均値を計算した。分析を、血漿由来過剰ＤＭＲと重複するプローブｈｍ４５０ｋ領域（ｎ＝７６４／９４１）に限定して、本発明者らが隣接する正常組織（ｎ＝５０）と比較して原発腫瘍（ｎ＝５２０）の４８３個の過剰メチル化領域を同定した（ウィルコクソン検定、ＦＤＲ＜０．０５、ｌｏｇ２ＦＣ＞１）。本発明者らは、ＨＮＳＣＣならびにＴＷＩＳＴ１およびＯＮＥＣＵＴ２で以前に評価されたＳＥＰＴ９およびＳＨＯＸ２を含む、市販のメチル化ベースのｃｔＤＮＡ診断試験によってプロファイリングされた遺伝子内のＣｐＧの近くに、これらの過剰メチル化領域のいくつかが重複しているかまたは位置していることを観察した（図１７Ａ）。これらの結果から、本発明者らの血漿由来過剰ＤＭＲの潜在的な臨床的関連性を支持するさらなる証拠が得られる。
本発明者らのＨＮＳＣＣコホートおよびＴＣＧＡのＨＮＳＣ ｈｍ４５０ｋのプロファイルによって共通して保持されるこれらの過剰メチル化領域の潜在的な臨床的有用性をさらに調べるために、本発明者らは、利用可能なｈｍ４５０ｋのプロファイルおよび疾患特異的生存（ＤＳＳ）転帰であるすべてのＴＣＧＡのＨＮＳＣＣ患者にわたって単変量コックス比例ハザード回帰を行った（ｎ＝４９３／５２０）。本発明者らは、ＤＳＳと有意に関連する３３の領域を同定した（ｐ＜０．０５）。腫瘍形成において機能的役割を有する可能性が高い予後領域をさらに選択するために、本発明者らは、各領域（ｎ＝３３）のメチル化レベルを２ｋｂ内の周囲の遺伝子転写物の発現と比較した。次に、本発明者らは、ＴＣＧＡのＨＮＳＣＣコホートを使用して、（１）多変量Ｃｏｘ回帰における予後および（２）隣接遺伝子転写物の発現に関連する４８３個のＤＭＲのサブセットを同定した。５つの領域が両方の基準を満たすように同定され、各領域のメチル化が増加すると、ＺＮＦ３２３／ＺＳＣＡＮ３１、ＬＩＮＣ０１３９１、およびＧＡＴＡ２－ＡＳ１のより高い発現がもたらされ（図５Ｇ、図１７Ａ～図１７Ｃ、またＳＴＫ３／ＭＳＴ２およびＯＳＲ１のそれぞれのより低い発現がもたらされた（図５Ｈ）（図５Ｄ）。メチル化の結果としての発現の減少および増加に関連する領域は、それぞれプロモーターまたは第１のエクソン／イントロンおよび遺伝子本体内に存在することが見出された。本発明者らは、これらの５つの領域から複合メチル化スコア（ＣＭＳ）を構築し（表６）、このスコアに従ってＴＣＧＡのＨＮＳＣＣコホートを層別化した（図５Ｅ）。より高いＣＭＳは、劣った生存転帰と有意に関連していた（ＨＲ＝１．６７、９５％ＣＩ＝［１．２５，２．２１］、ログランクｐ＝３．４×１０－４）。
最後に、本発明者らは、ｃｔＤＮＡに適用した場合にＣＭＳかた同様の予後情報が得られるかどうかも評価した。ｃｔＤＮＡを濃縮するために、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑライブラリの分析を、上記のように１００～１５０ｂｐの長さの断片に限定した（図４Ｅ）。５つの推定予後マーカーによって得られるｃｔＤＮＡメチル化レベルの相対的な寄与を説明するために、本発明者らは、これらの領域からのｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑのＲＰＫＭの値を９４１個の過剰ＤＭＲ全体に正規化した。これは、より高いＣＭＳがより不良な生存とわずかに関連するという同様の傾向をもたらし（ログランクｐ＝０．１；ＨＲ＝３．０６）（図５Ｆ）、このことは、ＴＣＧＡから同定されたこれらの推定予後領域のメチル化の増加がまた、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内で情報があり得ることを示唆している。さらに、これらの結果は、バイオマーカー発見のために、血漿のセルフリーＤＮＡメチロームプロファイリングを既存のマルチオミックのがんデータベースと組み合わせてどのように活用できるかを強調している。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる最終治療後の疾患の監視
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑがＨＮＳＣＣ患者において高感度かつ定量的なｃｔＤＮＡ検出を達成したので、本発明者らは、ＣＡＰＰ－ｓｅｑと同様に、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑもｃｔＤＮＡ存在量の治療関連変化をモニタリングすることができる可能性があると推論した。治療後のｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑプロファイル内のｃｔＤＮＡのパーセントを定量するために、本発明者らは、以前に同定された血漿由来の過剰ＤＭＲ（ｎ＝９４１）にわたって平均ＲＰＫＭの線形変換を適用し、ｃｔＤＮＡをさらに濃縮するために１００～１５０ｂｐの間の断片のサイズを制限した。すべての健常対照にわたって観察されたＲＰＫＭの平均値の最大値に基づいて、０．２％のｃｔＤＮＡの検出閾値を計算した。１つまたは複数の利用可能な治療後試料のＣＡＰＰ－Ｓｅｑ陽性のＨＮＳＣＣ患者（ｎ＝２０）については、１０ｎｇのインプットｃｆＤＮＡを利用してｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを行った。
治療全体にわたるｃｔＤＮＡ存在量の変化を測定すると、本発明者らは、完全クリアランス（ＣＣ）、部分クリアランス（ＰＣ；９０％を超える低下）またはクリアランスなし（ＮＣ）を示す様々な動態を観察した（図６Ａ 補足図１０）。１８人の適格患者のうち、５人（２８％）がクリアランスなしを示した（図６Ｂ）。クリアランスなしの患者は、完全または部分的クリアランスの患者と比較して、疾患の再発を経験する可能性が高かった（ＨＲ＝８．７３、９５％ＣＩ＝［１．５、５０．９２］、ログランクｐ＝０．００４６）（図６Ｃ）。興味深いことに、診断時と比較して、最後の試料採取時にｃｔＤＮＡ存在量がより多いすべての患者が、疾患の再発を示した。さらに、この群内で疾患の再発が実証されなかった唯一の患者が、追跡不能になったが、原因不明で治療後１年以内に死亡した。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる検出不能な処置後ｃｔＤＮＡを有する１３名の患者については、９名が無病のままであり、追跡調査の中央値は４４．４ヶ月であった（最低値＝１２．２、最大値＝５８．７）。他の４人の患者のうち、一人は所属リンパ節内に持続性疾患を有し、他の人は最後の採取後３．５～７．７ヶ月（中央値７．４ヶ月）で再発を経験した。注目すべきことに、検出不能な治療後ｃｔＤＮＡを有する患者間のこれらの再発は、最後の収集後に検出可能な治療後ｃｔＤＮＡ（中央値［範囲］：３．０［１．７～５．２］ヶ月）を有する患者間の４つの再発と比較してかなり遅延した。まとめると、これらの結果は、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる血漿のセルフリーＤＮＡメチロームプロファイリングを使用して、根治的治療に対する応答を評価し、急速な再発のリスクが高い患者を同定することができることを実証している。
考察
臨床現場におけるｃｔＤＮＡの広範な実施は、患者全体におよび腫瘍物質の非存在下で適用することができる方法によって加速され得る。記載される研究において、本発明者らは、低ｃｔＤＮＡのＨＮＳＣＣ患者の探索コホート内でのｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出のためのマルチモーダルゲノムワイドセルフリーＤＮＡプロファイリング技術の能力を評価した。本発明者らは、一致したＰＢＬの取り込みが、両方の変異（すなわち、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑ）ならびにＤＮＡメチル化（すなわち、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）を使用してｃｔＤＮＡ検出を改善することを示す。さらに、検出可能および検出不可能なｃｔＤＮＡを有する患者を層別化するために、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑを利用することによって、本発明者らは、ｃｔＤＮＡ由来のメチル化パターンのロバストな同定を達成した。本発明者らは、腫瘍起源（すなわち、断片の長さの短縮）を反映する血漿のセルフリーＤＮＡの生物物理学的特性が分子異常および検出プラットフォームにわたって保存されていることを初めて示した。腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡ検出および定量化は複数の臨床用途を見出し、ｃｔＤＮＡの存在量およびメチル化パターンの予後関連を調査する。
腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡ検出は、現在、低いｃｔＤＮＡ存在量のためにいくつかの制限に遭遇する。最近の研究では、ｃｔＤＮＡの偽陽性検出の主な原因であるクローン造血に由来する変異を同定するために、対になったＰＢＬおよび／または健常対照血漿がプロファイリングされている。しかし、直交メトリックの組み込みは、精度および臨床適用性をさらに改善することができる。ここで、本発明者らは、低いｃｔＤＮＡ存在量を有するＨＮＳＣＣ患者のコホート内での腫瘍ナイーブｃｔＤＮＡ検出のためのマルチモーダルゲノムワイドセルフリーＤＮＡプロファイリング技術の能力を評価した。本発明者らは、変異ベースおよびメチル化ベースのプロファイリング方法によって検出されたｃｔＤＮＡメトリック（存在量および断片の長さ）間の高度な一致を実証した。さらに、本発明者らは、腫瘍ナイーブマルチモーダルｃｔＤＮＡプロファイリングが、ｃｔＤＮＡ存在量とは無関係の推定予後バイオマーカーを同定することによって、ならびに連続試料中のｃｔＤＮＡ存在量をモニタリングすることによって値を提示し得ることを示した。
ｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出は、研究および臨床の両方の状況において多くの実用的な利点を有する。最近の研究では、感度を改善するために、初期疾患における低い存在量で同定されたｃｔＤＮＡ由来領域の検証のために一致した腫瘍プロファイリングが利用されている。しかし、これらのアプローチの１つの制限は、腫瘍のサンプリング不均一性に起因して失われる情報領域の数であり、これは、以前にサンプリングされていないサブクローンに由来する処置後ｃｔＤＮＡに適用された場合にさらに悪化し得る。さらに、これらの腫瘍の情報に基づく検出方法の臨床的利点は、非侵襲性液体生検の主な強度の１つを回避して、生検によって容易に入手可能ながんに限定される。腫瘍ナイーブマルチモーダルプロファイリング戦略を利用することによって、本発明者らは、腫瘍の情報に基づく方法の欠点なしに早期がんにおいて同様の結果を達成した。
これは、限局性がん患者のコホートからのｃｔＤＮＡの包括的検出のために変異およびメチル化プロファイリングを利用する最初の研究である。このマルチモーダルプロファイリングアプローチを他のがんのタイプおよび疾患状況に拡張することは、液体生検の継続的な開発にとって重要である。さらに、ＨＮＳＣＣにおける多数のｃｔＤＮＡ研究が、変異、メチル化またはＨＰＶプロファイリングに基づく検出方法を利用して記載されているが、本発明者らは、これまでに知られている標的（すなわち、ＴＰ５３変異またはＳＥＰＴ９／ＳＨＯＸ２メチル化）を同定するゲノムワイド変異／メチル化プロファイリング法の最初の適用を、より少ない／未調査の標的に加えて記載した。
ｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブ検出は、研究および臨床の両方の状況において多くの実用的な利点を有している。腫瘍変異プロファイリングは、低い存在量でｃｔＤＮＡ検出のための患者特異的マーカーを同定することができるが、そのような個別化アプローチは、十分な変異の負荷を有するがんのタイプから得る高純度腫瘍試料に依存する。個別化アッセイ設計のための変異プロファイリングは、費用および時間がかかる可能性があり、また、原発腫瘍内または転移性クローンにわたるゲノム不均一性の説明をとなることがまれである。さらに、腫瘍組織へのアクセスに依存するｃｔＤＮＡ検出方法は、非侵襲性液体生検の重要な利点を減少させる。独立したセルフリーＤＮＡ特性を統合することにより、本発明者らは、腫瘍の情報に基づく方法の欠点なしに、初期段階のがんにおける高感度のｃｔＤＮＡの検出を達成した。
本発明者らの分析では、本発明者らは、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを使用してｃｔＤＮＡ由来のメチル化パターンを同定するために、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによって、検出可能なｃｔＤＮＡを有する患者を選択した。このアプローチにより、本発明者らのコホートにおける血漿のセルフリーＤＮＡの腫瘍由来の性質のさらなる検証がなされた。ｃｔＤＮＡメチル化パターンは、ｃｔＤＮＡ変異と同様の方法でｃｔＤＮＡの存在量を定量することができた。さらに、メチル化パターンは、腫瘍起源を明らかにし、推定予後および動的バイオマーカーを同定した。ＣＡＰＰ－ＳｅｑとｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑとの組み合わせは、低い存在量ｃｔＤＮＡの詳細な分子的な特性評価を可能にした。変異に基づくｃｔＤＮＡ定量化は、血漿中のＨＮＳＣＣ特異的過剰ＤＭＲの発見に寄与し、その一部はｃｔＤＮＡ存在量を調整した後でも予後であることが確認された。したがって、変異およびメチル化の同時プロファイリングは、定量的、組織特異的、および予後のｃｔＤＮＡバイオマーカーを明らかにすることによって、互いに補完することができる。さらに、メチロームプロファイリングは、再発性またはクローン性変異がほとんどないがんのタイプにおいて特に有用であることを判明し得る。
以前の研究と同様に、本発明者らはまた、変異およびメチル化ベースのアプローチの両方を使用して、健常なドナーのセルフリーＤＮＡと比較しながら、ｃｔＤＮＡ断片の長さの減少を観察した。一貫して平均的な約１６６～１６７ｂｐである健常なセルフリーＤＮＡとは異なり、患者間のｃｔＤＮＡの長さは非常に可変であり得る。ｃｔＤＮＡ断片の長さに影響を及ぼす因子としては、位置依存的断片化４９、転移性疾患対非転移性疾患７３、ならびに健常なセルフリーＤＮＡ断片化に関与する様々な細胞内／細胞外ＤＮａｓｅの調節不全動態７４が挙げられ得る。興味深いことに、本発明者らは、両方の技術が異なる領域および腫瘍由来の異常を探査しているにもかかわらず、ＣＡＰＰ－ＳｅｑおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによって同定されたｃｔＤＮＡの断片の長さ間の高い一致を、適格な患者について観察した。これらの説得力のあるデータで、がん患者における血漿のセルフリーＤＮＡ断片化の関連性および再現性に関するさらなる証拠が得られる。
本発明者らは、ＣＡＰＰ－Ｓｅｑによる検出可能なｃｔＤＮＡまたはｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによる上昇したｃｔＤＮＡ存在量が、本発明者らのＨＮＳＣＣコホート内の予後不良と関連することを観察した。これらの結果は、メチル化によるｃｔＤＮＡの検出５６、ならびにコピー数収差による存在量の増加７５またはＨＰＶ検出７６が高いリスクの患者を同定した以前のＨＮＳＣＣ ｃｔＤＮＡ研究に従っている。腫瘍病期との不完全な関連があり、腫瘍生物学の他の測定されていない特徴がｃｔＤＮＡ存在量に寄与し得ることを示唆している。
本発明者らの知る限りでは、ｃｔＤＮＡ検出／存在量とは無関係に、おそらく部分的には一般的に使用されるｃｔＤＮＡ検出方法の制限のために、ＨＮＳＣＣのセルフリーＤＮＡにおける予後領域を以前に同定した研究はない。本発明者らは、セルフリーＤＮＡメチロームプロファイルが、ＴＣＧＡデータと併せて、ＨＮＳＣＣにおける新規予後メチル化バイオマーカーを同定する発見ツールとして役立ち得ることを実証した。５つのＤＭＲから構成される複合体メチル化スコアは、メチル化検出プラットフォーム（ｈｍ４５０ｋおよびｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）およびバイオスペシメンタイプ（腫瘍組織および血漿のセルフリーＤＮＡ）にわたって一貫した予後関連性を実証した。本発明者らの知見を検証するためには将来より大きなコホートが必要であるが、この研究は、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるメチル化領域のゲノムワイドな同定が、新規の予後バイオマーカーの発見を可能にし得ることを示している。
ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑのパフォーマンスを、疾患の予後と関連して評価した。治療後約０．２％超のｃｔＤＮＡのストリンジェントな閾値を検出可能な疾患として適用することにより、本発明者らは９人の患者のうち４人について疾患の再発を予測することができた。検出可能なｃｔＤＮＡを治療後に有することができなかった再発した（ｎ＝４）または持続性疾患を有した（ｎ＝１）残りの５人の患者について、本発明者らは典型的には再発までの時間がより長いことを観察し、これらの時点でのｃｔＤＮＡの画分がｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑの検出の下限を下回っていた可能性があることを示唆した。腫瘍ナイーブ疾患の監視のためにｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑを利用するその後の研究では、治療後のより頻繁な血漿の収集が、これらの限界に対処するのに役立ち得る。
本発明者らは、限局性疾患およびＨＮＳＣＣにおけるマルチモーダルプロファイリングの潜在的な臨床的有用性を実証しているので、これらの方法は、様々ながんのタイプを有する患者のための将来のバイオマーカー発見および最終的には臨床的有用性に寄与する。この研究は、複数の顕著な貢献をしている。第１に、セルフリーＤＮＡ変異、メチル化および断片の長さの分析を組み合わせていることである。さらに、本発明者らは、ＨＮＳＣＣ患者およびリスクが一致する健常対照の両方からの血漿試料および対にされたＰＢＬを、体系的にプロファイリングした。これらの分析は、ｃｔＤＮＡの検出および特性評価のためのマルチモーダルプロファイリングの最適な取り扱いに関する重要な洞察を明らかにした。例えば、寄与するメチル化シグナルを白血球から除去し、断片の長さの特性を使用して腫瘍由来のメチル化を濃縮する本発明者らの独自のアプローチは、将来の研究にとって有用なものであることが判明するであろう。
結論として、本発明者らは、ｃｔＤＮＡの腫瘍ナイーブＣＡＰＰ－Ｓｅｑプロファイリングが、ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡ由来のメチル化の高い信頼性の同定を可能にすることを実証する。ｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるエピジェネティックプロファイリングの強度を利用して、本発明者らはさらに、これらのｃｔＤＮＡ由来メチル化領域が腫瘍の起源、予後、および治療の反応のマーカーとしての可能性を実証することを示す。本発明者らがＨＮＳＣＣにおけるｃｆＭｅＤＩＰ－ｓｅｑによるｃｔＤＮＡ検出の改善された感度について記載したいくつかのアプローチ、例えばＰＢＬ枯渇ウィンドウおよび短い断片への分析の制限を組み込むことがまた、臨床的利益のために、様々な他の限局性がんに適用され得る。開示されたフレームワークは、腫瘍組織の利用可能性が制限される他の臨床状況に広く適用可能である。
本発明の好ましい実施形態を本明細書で説明したが、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明に変更を加えることができることは当業者には理解されよう。以下の参考文献にあるものを含む、本明細書に開示されるすべての文書は、参照により組み込まれる。
本発明の好ましい実施形態を本明細書で説明したが、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明に変更を加えることができることは当業者には理解されよう。以下の参考文献にあるものを含む、本明細書に開示されるすべての文書は、参照により組み込まれる。
本発明は一態様において、下記を提供する。
[項目１]
対象のがん細胞から循環腫瘍デオキシリボ核酸（ｃｔＤＮＡ）が存在することを検出する方法であって、
（ａ）前記対象からセルフリーデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の試料を得る工程、
（ｂ）前記試料をライブラリ調製に供して、前記セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の配列決定を可能にする工程、
（ｃ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡを捕捉する工程、
（ｄ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
（ｅ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用いて、前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの前記配列をコンピュータ処理する工程、および
（ｆ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来のＤＮＡの前記存在を同定する工程を含み、
（ｄ）、（ｆ）および（ｇ）の少なくとも１つにおいて、前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定される、方法。
[項目２]
第１の量のフィラーＤＮＡを前記試料に添加することをさらに含み、前記フィラーＤＮＡの少なくとも一部がメチル化され、次いでさらに前記試料を変性させていてもよい、項目１に記載の方法。
[項目３]
前記断片の長さのメトリックが断片の長さである、項目１に記載の方法。
[項目４]
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、＜１７０塩基対（ｂｐ）、＜１６５ｂｐ、＜１６０ｂｐ、＜１５５ｂｐ、＜１５０ｂｐ、＜１４５ｂｐ、＜１４０ｂｐ、＜１３５ｂｐ、＜１３０ｂｐ、＜１２５ｂｐ、＜１２０ｂｐ、＜１１５ｂｐ、＜１１０ｂｐ、＜１０５ｂｐ、または＜１００ｂｐの長さを有する断片に限定される、項目２に記載の方法。
[項目５]
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、約１００～約１５０ｂｐ、１１０～１４０ｂｐまたは１２０～１３０ｂｐの長さを有する断片に限定される、項目２に記載の方法。
[項目６]
前記断片の長さのメトリックが、前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡの前記断片の長さの分布である、項目１に記載の方法。
[項目７]
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、長さに基づいて下位５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０パーセンタイル内の断片に限定される、項目５に記載の方法。
[項目８]
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、差次的メチル化領域（ＤＭＲ）内の断片にさらに限定される、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
[項目９]
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡがさらに制限される、前記捕捉する工程の間である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
[項目１０]
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡがさらに制限される、前記比較する工程の間である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
[項目１１]
前記限定することが、前記同定することの間である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
[項目１２]
前記試料が前記対象の血液または血漿に由来する、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
[項目１３]
（ｆ）が統計的分類器を使用することを含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
[項目１４]
前記分類器が機械学習によって導出される、項目１２に記載の方法。
[項目１５]
健常な個体およびがんの個体由来の前記対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列は、健常な個体とがんの個体との間の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベースに含まれる、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
[項目１６]
健常な個体およびがんの個体由来の前記対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列が、セルフリーＤＮＡに由来するＤＮＡにおいて健常な個体とがんの個体との間として差次的にメチル化されているその対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列に限定される、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
[項目１７]
前記対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列が、血漿に由来するＤＮＡにおいて健常な個体とがんの個体との間として差次的にメチル化される、項目１６に記載の方法。
[項目１８]
前記試料が、１００ｎｇ、７５ｎｇまたは５０ｎｇ未満のセルフリーＤＮＡを有する、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
[項目１９]
前記フィラーＤＮＡの第１の量は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のメチル化フィラーＤＮＡを含み、残りは非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％～５０％、１０％～４０％、または１５％～３０％のメチル化フィラーＤＮＡである、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
[項目２０]
前記フィラーＤＮＡの第１の量が、２０ｎｇ～１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ～１００ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ～１００ｎｇである、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
[項目２１]
前記試料から得た前記セルフリーＤＮＡおよび前記第１の量のフィラーＤＮＡは、合わせて少なくとも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む、項目１～２０のいずれか一項に記載の方法。
[項目２２]
前記フィラーＤＮＡが、５０ｂｐ～８００ｂｐの長さ、好ましくは１００ｂｐ～６００ｂｐの長さ、より好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐの長さである、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
[項目２３]
前記フィラーＤＮＡが二本鎖である、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
[項目２４]
前記フィラーＤＮＡがジャンクＤＮＡである、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
[項目２５]
前記フィラーＤＮＡが内因性または外因性ＤＮＡである、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
[項目２６]
前記フィラーＤＮＡが非ヒトＤＮＡ、好ましくはλＤＮＡである、項目２５に記載の方法。
[項目２７]
前記フィラーＤＮＡがヒトＤＮＡとアライメントしていない、項目１～２６のいずれか一項に記載の方法。
[項目２８]
前記結合剤が、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である、項目１～２７のいずれか一項に記載の方法。
[項目２９]
前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である、項目１～２８のいずれか一項に記載の方法。
[項目３０]
（ｄ）が、抗体を使用して前記セルフリーメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む、項目１～２９のいずれか一項に記載の方法。
[項目３１]
免疫沈降のために少なくとも０．０５μｇ、好ましくは少なくとも０．１６μｇの前記抗体を前記試料に添加することを含む、項目３０に記載の方法。
[項目３２]
前記抗体が５－ＭｅＣ抗体である、項目３０に記載の方法。
[項目３３]
前記免疫沈降反応を確認するために、（ｃ）の後に第２の量の対照ＤＮＡを前記試料に添加することをさらに含む、項目３０に記載の方法。
[項目３４]
セルフリーメチル化ＤＮＡの前記捕捉を確認するために、（ｃ）の後に第２の量の対照ＤＮＡを前記試料に添加することをさらに含む、項目１～３２のいずれか一項に記載の方法。
[項目３５]
がん細胞由来のＤＮＡが前記存在することを同定することは、がん細胞の起源の組織を同定することをさらに含む、項目１～３４のいずれか一項に記載の方法。
[項目３６]
前記がん細胞の起源の組織を同定することは、がんのサブタイプを同定することをさらに含む、項目３５に記載の方法。
[項目３７]
前記がんのサブタイプが、ステージ、組織学、遺伝子発現パターン、コピー数異常、再編成、または点変異状態に基づいて前記がんを区別する、項目３６に記載の方法。
[項目３８]
（ｆ）がゲノムワイドに行われる、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
[項目３９]
（ｆ）がゲノムワイドから特定の調節領域に制限される、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
[項目４０]
前記調節領域が、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、ＣｐＧ Ｓｈｅｌｆ、または前述物の任意の組み合わせである、項目３９に記載の方法。
[項目４１]
工程（ｆ）および（ｇ）がコンピュータプロセッサによって実行される、項目１～４０のいずれか一項に記載の方法。
[項目４２]
前記がんが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍からなる群から選択される、項目１～４１のいずれか一項に記載の方法。
[項目４３]
前記がんが頭頸部扁平上皮癌である、項目１～４１のいずれか一項に記載の方法。
[項目４４]
前記がんの前記検出に使用するための、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
[項目４５]
前記がんの治療のモニタリングに使用するための、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
[項目４６]
対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、
（ａ）（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルからなる群から選択される少なくとも１つのプロファイルを生成するために前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および
（ｂ）前記対象が前記疾患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ナノグラム（ｎｇ）／ミリリットル（ｍｌ）未満の前記複数の核酸分子を含む、処理する工程を含む、方法。
[項目４７]
前記セルフリー核酸試料が１０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、項目４６に記載の方法。
[項目４８]
前記セルフリー核酸試料が５ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、項目４６に記載の方法。
[項目４９]
前記セルフリー核酸試料が１ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、項目４６に記載の方法。
[項目５０]
（ａ）に前記供する工程が、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からなる群から選択される少なくとも２つのプロファイルを生成する、項目４６に記載の方法。
[項目５１]
前記少なくとも２つのプロファイルが、前記メチル化プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを含む、項目５０に記載の方法。
[項目５２]
前記少なくとも２つのプロファイルが、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを含む、項目５０に記載の方法。
[項目５３]
前記少なくとも２つのプロファイルが、前記メチル化プロファイルおよび前記変異プロファイルを含む、項目５０に記載の方法。
[項目５４]
（ａ）を前記供する工程が、前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを生成する、項目４６に記載の方法。
[項目５５]
対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定する方法であって、
（ａ）複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、
（ｂ）前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、
（ｃ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、および
（ｄ）前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するために、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを使用する工程を含む、方法。
[項目５６]
前記疾患ががんを含む、項目４６～５５のいずれか一項に記載の方法。
[項目５７]
前記がんが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、扁平上皮癌、および頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択される前記がんからなる群から選択される、項目５６に記載の方法。
[項目５８]
前記がんが扁平上皮癌である、項目５７に記載の方法。
[項目５９]
前記がんが頭頸部扁平上皮癌である、項目５８に記載の方法。
[項目６０]
前記複数のセルフリー核酸分子が循環腫瘍核酸分子を含む、項目４６～５６のいずれか一項に記載の方法。
[項目６１]
前記循環腫瘍核酸が循環腫瘍ＤＮＡを含む、項目６０に記載の方法。
[項目６２]
前記循環腫瘍核酸が循環腫瘍ＲＮＡを含む、項目６０に記載の方法。
[項目６３]
前記メチル化プロファイルが、複数の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を含む、項目４６～６２のいずれかに記載の方法。
[項目６４]
前記複数のＤＭＲがｃｔＤＮＡ由来である、項目６３に記載の方法。
[項目６５]
末梢血白血球に由来する複数のＤＭＲが前記メチル化プロファイルから除去される、項目６３に記載の方法。
[項目６６]
前記複数のＤＭＲが、正常で健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して低メチル化レベルを有する少なくとも約５６のゲノム領域を含む、項目６３に記載の方法。
[項目６７]
前記複数のＤＭＲが、正常で健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して、過剰メチル化レベルを有する少なくとも約９４１のゲノム領域を含む、項目５４に記載の方法。
[項目６８]
ＤＭＲが少なくとも約３００ｂｐのサイズを含む、項目６３に記載の方法。
[項目６９]
ＤＭＲが、少なくとも約１００ｂｐ～少なくとも約２００ｂｐのサイズを含む、項目６８に記載の方法。
[項目７０]
ＤＭＲが、少なくとも約１００ｂｐ～少なくとも約１５０ｂｐのサイズを含む、項目６８に記載の方法。
[項目７１]
ＤＭＲが少なくとも８のＣｐＧゲノムアイランドを含む、項目６３に記載の方法。
[項目７２]
前記正常で健常な対象が、前記対象と同じリスク因子のセットを含む、項目６６または６７のいずれかに記載の方法。
[項目７３]
前記変異プロファイルが、ミスセンス変異体、ナンセンス変異体、欠失変異体、挿入変異体、重複変異体、逆位変異体、フレームシフト変異体、または反復伸長変異体を含む、項目４５～７２のいずれかに記載の方法。
[項目７４]
複数の末梢血白血球から得られたゲノムＤＮＡ試料に存在する任意の変異体であって、前記複数の末梢血白血球が前記対象から得られ、前記変異プロファイルから除去される、項目４５～７２のいずれかに記載の方法。
[項目７５]
クローン造血に由来するいずれかの変異体が前記変異プロファイルから除去される、項目４５～７２のいずれかに記載の方法。
[項目７６]
前記変異プロファイルが、遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、またはＡＳＸＬ１の変異体を含まない、項目７５に記載の方法。
[項目７７]
前記変異プロファイルが標準的がんドライバ遺伝子を含まない、項目７５に記載の方法。
[項目７８]
前記変異プロファイルが非標準的がんドライバ遺伝子を含み、前記非標準的遺伝子がＧＲＩＮ３ＡまたはＭＹＣである、項目７５に記載の方法。
[項目７９]
前記断片の長さプロファイルが、少なくとも約８０ｂｐ～１７０ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む、項目４６～７８のいずれかに記載の方法。
[項目８０]
前記断片の長さプロファイルが、少なくとも約１００ｂｐ～１５０ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む、項目４６～７８のいずれかに記載の方法。
[項目８１]
前記循環腫瘍核酸分子が濃縮されている、項目７９または８０のいずれかに記載の方法。
[項目８２]
前記セルフリー核酸試料をフィラーＤＮＡ分子と混合してＤＮＡ混合物を生じることをさらに含む、項目４６～８１のいずれかに記載の方法。
[項目８３]
前記フィラーＤＮＡ分子が約５０ｂｐ～８００ｂｐの長さを含む、項目８２に記載の方法。
[項目８４]
前記フィラーＤＮＡ分子が約１００ｂｐ～６００ｂｐの長さを含む、項目８２に記載の方法。
[項目８５]
前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約５％のメチル化フィラーＤＮＡ分子を含む、項目８２に記載の方法。
[項目８６]
前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約２０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む、項目８２に記載の方法。
[項目８７]
前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約３０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む、項目８２に記載の方法。
[項目８８]
前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約５０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む、項目８２に記載の方法。
[項目８９]
前記ＤＮＡ混合物を、メチル化ヌクレオチドに結合するように構成された結合剤とインキュベートして濃縮試料を生成することをさらに含む、項目４６～８８のいずれかに記載の方法。
[項目９０]
前記結合剤が、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質を含む、項目８９に記載の方法。
[項目９１]
前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である、項目８９に記載の方法。
[項目９２]
前記結合剤が抗体を含む、項目８９に記載の方法。
[項目９３]
前記抗体が５－ＭｅＣ抗体である、項目８９に記載の方法。
[項目９４]
前記抗体が５－ヒドロキシメチルシトシン抗体である、項目８９に記載の方法。
[項目９５]
前記配列決定が亜硫酸水素塩配列決定を含まない、項目４６～９４のいずれかに記載の方法。
[項目９６]
前記セルフリー核酸試料が血液試料を含む、項目４６～９４のいずれかに記載の方法。
[項目９７]
前記血液試料が血漿試料を含む、項目９６に記載の方法。
[項目９８]
がん組織の起源を検出することをさらに含む、項目４６～９７のいずれかに記載の方法。
[項目９９]
前記対象の生存率の予後を含む報告を生成することをさらに含む、項目４６～９７のいずれかに記載の方法。
[項目１００]
前記対象に治療を与えることをさらに含む、項目４６～９７のいずれかに記載の方法。
[項目１０１]
前記疾患の治療に続いて、前記治療が有効であるかどうかを示す第２の報告を与えることをさらに含む、項目４６～９７のいずれかに記載の方法。
[項目１０２]
対象が状態を有するか、または状態を有するリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、
（ａ）前記対象からの試料の少なくとも一部から得たセルフリー核酸分子をアッセイする工程、
（ｂ）表５に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および
（ｃ）少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記メチル化レベルを、前記表５に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較する工程を含む、方法。
[項目１０３]
前記セルフリー核酸分子がｃｔＤＮＡを含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１０４]
前記配列決定分析を実施することを含み、前記配列決定分析がｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ｃｆＭｅＤＩＰ）配列決定を含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１０５]
前記検出する工程が、表５に列挙される６つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上のＤＭＲに含まれる前記核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを測定することを含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１０６]
対象が疾患の治療を受けた後により高い生存率を有するかどうかを判定する方法であって、
（ａ）前記対象からの試料の少なくとも一部から得たセルフリー核酸分子をアッセイする工程、
（ｂ）表６に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および
（ｃ）少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記メチル化レベルを、前記表６に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと処理する工程を含む、方法。
[項目１０７]
前記セルフリー核酸分子がｃｔＤＮＡを含む、項目１０６に記載の方法。
[項目１０８]
前記検出する工程が、複合体メチル化スコア（ＣＭＳ）を提示することを含む、項目１０６に記載の方法。
[項目１０９]
前記ＣＭＳが、表６に列挙されたＤＭＲのβ値の合計を含む、項目１０７に記載の方法。
[項目１１０]
ＣＭＳがより高いことが、前記対象の生存率がより低いことを示す、項目１０７に記載の方法。
[項目１１１]
前記ＣＭＳがｃｔＤＮＡの存在量に依存しない、項目１０７に記載の方法。
[項目１１２]
前記疾患が扁平上皮癌である、項目１０２～１１１のいずれかに記載の方法。
[項目１１３]
前記がんが頭頸部扁平上皮癌である、項目１１２に記載の方法。
[項目１１４]
少なくとも約８０ｂｐ～１７０ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することをさらに含む、項目１０２～１１３のいずれか一項に記載の方法。
[項目１１５]
対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するためのシステムであって、
（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも１つのプロファイルを生成するために前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および
前記対象が前記疾患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、処理する工程
を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含む、システム。
[項目１１６]
対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するシステムであって、
（ａ）複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、
（ｂ）前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、
（ｃ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、および
（ｄ）前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するために、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを使用する工程を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含む、システム。
本発明の好ましい実施形態を本明細書で説明したが、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明に変更を加えることができることは当業者には理解されよう。以下の参考文献にあるものを含む、本明細書に開示されるすべての文書は、参照により組み込まれる。
本発明は一態様において、下記を提供する。
[項目１]
対象のがん細胞から循環腫瘍デオキシリボ核酸（ｃｔＤＮＡ）が存在することを検出する方法であって、
（ａ）前記対象からセルフリーデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の試料を得る工程、
（ｂ）前記試料をライブラリ調製に供して、前記セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の配列決定を可能にする工程、
（ｃ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡを捕捉する工程、
（ｄ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
（ｅ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用いて、前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの前記配列をコンピュータ処理する工程、および
（ｆ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来のＤＮＡの前記存在を同定する工程を含み、
（ｄ）、（ｆ）および（ｇ）の少なくとも１つにおいて、前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定される、方法。
[項目２]
第１の量のフィラーＤＮＡを前記試料に添加することをさらに含み、前記フィラーＤＮＡの少なくとも一部がメチル化され、次いでさらに前記試料を変性させていてもよい、項目１に記載の方法。
[項目３]
前記断片の長さのメトリックが断片の長さである、項目１に記載の方法。
[項目４]
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、＜１７０塩基対（ｂｐ）、＜１６５ｂｐ、＜１６０ｂｐ、＜１５５ｂｐ、＜１５０ｂｐ、＜１４５ｂｐ、＜１４０ｂｐ、＜１３５ｂｐ、＜１３０ｂｐ、＜１２５ｂｐ、＜１２０ｂｐ、＜１１５ｂｐ、＜１１０ｂｐ、＜１０５ｂｐ、または＜１００ｂｐの長さを有する断片に限定される、項目２に記載の方法。
[項目５]
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、約１００～約１５０ｂｐ、１１０～１４０ｂｐまたは１２０～１３０ｂｐの長さを有する断片に限定される、項目２に記載の方法。
[項目６]
前記断片の長さのメトリックが、前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡの前記断片の長さの分布である、項目１に記載の方法。
[項目７]
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、長さに基づいて下位５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０パーセンタイル内の断片に限定される、項目５に記載の方法。
[項目８]
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、差次的メチル化領域（ＤＭＲ）内の断片にさらに限定される、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
[項目９]
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡがさらに制限される、前記捕捉する工程の間である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
[項目１０]
前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡがさらに制限される、前記比較する工程の間である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
[項目１１]
前記限定することが、前記同定することの間である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
[項目１２]
前記試料が前記対象の血液または血漿に由来する、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
[項目１３]
（ｆ）が統計的分類器を使用することを含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
[項目１４]
前記分類器が機械学習によって導出される、項目１２に記載の方法。
[項目１５]
健常な個体およびがんの個体由来の前記対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列は、健常な個体とがんの個体との間の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベースに含まれる、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
[項目１６]
健常な個体およびがんの個体由来の前記対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列が、セルフリーＤＮＡに由来するＤＮＡにおいて健常な個体とがんの個体との間として差次的にメチル化されているその対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列に限定される、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
[項目１７]
前記対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列が、血漿に由来するＤＮＡにおいて健常な個体とがんの個体との間として差次的にメチル化される、項目１６に記載の方法。
[項目１８]
前記試料が、１００ｎｇ、７５ｎｇまたは５０ｎｇ未満のセルフリーＤＮＡを有する、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
[項目１９]
前記フィラーＤＮＡの第１の量は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のメチル化フィラーＤＮＡを含み、残りは非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％～５０％、１０％～４０％、または１５％～３０％のメチル化フィラーＤＮＡである、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
[項目２０]
前記フィラーＤＮＡの第１の量が、２０ｎｇ～１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ～１００ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ～１００ｎｇである、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
[項目２１]
前記試料から得た前記セルフリーＤＮＡおよび前記第１の量のフィラーＤＮＡは、合わせて少なくとも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む、項目１～２０のいずれか一項に記載の方法。
[項目２２]
前記フィラーＤＮＡが、５０ｂｐ～８００ｂｐの長さ、好ましくは１００ｂｐ～６００ｂｐの長さ、より好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐの長さである、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
[項目２３]
前記フィラーＤＮＡが二本鎖である、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
[項目２４]
前記フィラーＤＮＡがジャンクＤＮＡである、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
[項目２５]
前記フィラーＤＮＡが内因性または外因性ＤＮＡである、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
[項目２６]
前記フィラーＤＮＡが非ヒトＤＮＡ、好ましくはλＤＮＡである、項目２５に記載の方法。
[項目２７]
前記フィラーＤＮＡがヒトＤＮＡとアライメントしていない、項目１～２６のいずれか一項に記載の方法。
[項目２８]
前記結合剤が、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である、項目１～２７のいずれか一項に記載の方法。
[項目２９]
前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である、項目１～２８のいずれか一項に記載の方法。
[項目３０]
（ｄ）が、抗体を使用して前記セルフリーメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む、項目１～２９のいずれか一項に記載の方法。
[項目３１]
免疫沈降のために少なくとも０．０５μｇ、好ましくは少なくとも０．１６μｇの前記抗体を前記試料に添加することを含む、項目３０に記載の方法。
[項目３２]
前記抗体が５－ＭｅＣ抗体である、項目３０に記載の方法。
[項目３３]
前記免疫沈降反応を確認するために、（ｃ）の後に第２の量の対照ＤＮＡを前記試料に添加することをさらに含む、項目３０に記載の方法。
[項目３４]
セルフリーメチル化ＤＮＡの前記捕捉を確認するために、（ｃ）の後に第２の量の対照ＤＮＡを前記試料に添加することをさらに含む、項目１～３２のいずれか一項に記載の方法。
[項目３５]
がん細胞由来のＤＮＡが前記存在することを同定することは、がん細胞の起源の組織を同定することをさらに含む、項目１～３４のいずれか一項に記載の方法。
[項目３６]
前記がん細胞の起源の組織を同定することは、がんのサブタイプを同定することをさらに含む、項目３５に記載の方法。
[項目３７]
前記がんのサブタイプが、ステージ、組織学、遺伝子発現パターン、コピー数異常、再編成、または点変異状態に基づいて前記がんを区別する、項目３６に記載の方法。
[項目３８]
（ｆ）がゲノムワイドに行われる、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
[項目３９]
（ｆ）がゲノムワイドから特定の調節領域に制限される、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
[項目４０]
前記調節領域が、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、ＣｐＧ Ｓｈｅｌｆ、または前述物の任意の組み合わせである、項目３９に記載の方法。
[項目４１]
工程（ｆ）および（ｇ）がコンピュータプロセッサによって実行される、項目１～４０のいずれか一項に記載の方法。
[項目４２]
前記がんが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍からなる群から選択される、項目１～４１のいずれか一項に記載の方法。
[項目４３]
前記がんが頭頸部扁平上皮癌である、項目１～４１のいずれか一項に記載の方法。
[項目４４]
前記がんの前記検出に使用するための、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
[項目４５]
前記がんの治療のモニタリングに使用するための、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
[項目４６]
対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、
（ａ）（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルからなる群から選択される少なくとも１つのプロファイルを生成するために前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および
（ｂ）前記対象が前記疾患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ナノグラム（ｎｇ）／ミリリットル（ｍｌ）未満の前記複数の核酸分子を含む、処理する工程を含む、方法。
[項目４７]
前記セルフリー核酸試料が１０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、項目４６に記載の方法。
[項目４８]
前記セルフリー核酸試料が５ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、項目４６に記載の方法。
[項目４９]
前記セルフリー核酸試料が１ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、項目４６に記載の方法。
[項目５０]
（ａ）に前記供する工程が、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からなる群から選択される少なくとも２つのプロファイルを生成する、項目４６に記載の方法。
[項目５１]
前記少なくとも２つのプロファイルが、前記メチル化プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを含む、項目５０に記載の方法。
[項目５２]
前記少なくとも２つのプロファイルが、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを含む、項目５０に記載の方法。
[項目５３]
前記少なくとも２つのプロファイルが、前記メチル化プロファイルおよび前記変異プロファイルを含む、項目５０に記載の方法。
[項目５４]
（ａ）を前記供する工程が、前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを生成する、項目４６に記載の方法。
[項目５５]
対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定する方法であって、
（ａ）複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、
（ｂ）前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、
（ｃ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、および
（ｄ）前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するために、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを使用する工程を含む、方法。
[項目５６]
前記疾患ががんを含む、項目４６～５５のいずれか一項に記載の方法。
[項目５７]
前記がんが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、扁平上皮癌、および頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択される前記がんからなる群から選択される、項目５６に記載の方法。
[項目５８]
前記がんが扁平上皮癌である、項目５７に記載の方法。
[項目５９]
前記がんが頭頸部扁平上皮癌である、項目５８に記載の方法。
[項目６０]
前記複数のセルフリー核酸分子が循環腫瘍核酸分子を含む、項目４６～５６のいずれか一項に記載の方法。
[項目６１]
前記循環腫瘍核酸が循環腫瘍ＤＮＡを含む、項目６０に記載の方法。
[項目６２]
前記循環腫瘍核酸が循環腫瘍ＲＮＡを含む、項目６０に記載の方法。
[項目６３]
前記メチル化プロファイルが、複数の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を含む、項目４６～６２のいずれかに記載の方法。
[項目６４]
前記複数のＤＭＲがｃｔＤＮＡ由来である、項目６３に記載の方法。
[項目６５]
末梢血白血球に由来する複数のＤＭＲが前記メチル化プロファイルから除去される、項目６３に記載の方法。
[項目６６]
前記複数のＤＭＲが、正常で健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して低メチル化レベルを有する少なくとも約５６のゲノム領域を含む、項目６３に記載の方法。
[項目６７]
前記複数のＤＭＲが、正常で健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して、過剰メチル化レベルを有する少なくとも約９４１のゲノム領域を含む、項目５４に記載の方法。
[項目６８]
ＤＭＲが少なくとも約３００ｂｐのサイズを含む、項目６３に記載の方法。
[項目６９]
ＤＭＲが、少なくとも約１００ｂｐ～少なくとも約２００ｂｐのサイズを含む、項目６８に記載の方法。
[項目７０]
ＤＭＲが、少なくとも約１００ｂｐ～少なくとも約１５０ｂｐのサイズを含む、項目６８に記載の方法。
[項目７１]
ＤＭＲが少なくとも８のＣｐＧゲノムアイランドを含む、項目６３に記載の方法。
[項目７２]
前記正常で健常な対象が、前記対象と同じリスク因子のセットを含む、項目６６または６７のいずれかに記載の方法。
[項目７３]
前記変異プロファイルが、ミスセンス変異体、ナンセンス変異体、欠失変異体、挿入変異体、重複変異体、逆位変異体、フレームシフト変異体、または反復伸長変異体を含む、項目４５～７２のいずれかに記載の方法。
[項目７４]
複数の末梢血白血球から得られたゲノムＤＮＡ試料に存在する任意の変異体であって、前記複数の末梢血白血球が前記対象から得られ、前記変異プロファイルから除去される、項目４５～７２のいずれかに記載の方法。
[項目７５]
クローン造血に由来するいずれかの変異体が前記変異プロファイルから除去される、項目４５～７２のいずれかに記載の方法。
[項目７６]
前記変異プロファイルが、遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、またはＡＳＸＬ１の変異体を含まない、項目７５に記載の方法。
[項目７７]
前記変異プロファイルが標準的がんドライバ遺伝子を含まない、項目７５に記載の方法。
[項目７８]
前記変異プロファイルが非標準的がんドライバ遺伝子を含み、前記非標準的遺伝子がＧＲＩＮ３ＡまたはＭＹＣである、項目７５に記載の方法。
[項目７９]
前記断片の長さプロファイルが、少なくとも約８０ｂｐ～１７０ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む、項目４６～７８のいずれかに記載の方法。
[項目８０]
前記断片の長さプロファイルが、少なくとも約１００ｂｐ～１５０ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む、項目４６～７８のいずれかに記載の方法。
[項目８１]
前記循環腫瘍核酸分子が濃縮されている、項目７９または８０のいずれかに記載の方法。
[項目８２]
前記セルフリー核酸試料をフィラーＤＮＡ分子と混合してＤＮＡ混合物を生じることをさらに含む、項目４６～８１のいずれかに記載の方法。
[項目８３]
前記フィラーＤＮＡ分子が約５０ｂｐ～８００ｂｐの長さを含む、項目８２に記載の方法。
[項目８４]
前記フィラーＤＮＡ分子が約１００ｂｐ～６００ｂｐの長さを含む、項目８２に記載の方法。
[項目８５]
前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約５％のメチル化フィラーＤＮＡ分子を含む、項目８２に記載の方法。
[項目８６]
前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約２０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む、項目８２に記載の方法。
[項目８７]
前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約３０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む、項目８２に記載の方法。
[項目８８]
前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約５０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む、項目８２に記載の方法。
[項目８９]
前記ＤＮＡ混合物を、メチル化ヌクレオチドに結合するように構成された結合剤とインキュベートして濃縮試料を生成することをさらに含む、項目４６～８８のいずれかに記載の方法。
[項目９０]
前記結合剤が、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質を含む、項目８９に記載の方法。
[項目９１]
前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である、項目８９に記載の方法。
[項目９２]
前記結合剤が抗体を含む、項目８９に記載の方法。
[項目９３]
前記抗体が５－ＭｅＣ抗体である、項目８９に記載の方法。
[項目９４]
前記抗体が５－ヒドロキシメチルシトシン抗体である、項目８９に記載の方法。
[項目９５]
前記配列決定が亜硫酸水素塩配列決定を含まない、項目４６～９４のいずれかに記載の方法。
[項目９６]
前記セルフリー核酸試料が血液試料を含む、項目４６～９４のいずれかに記載の方法。
[項目９７]
前記血液試料が血漿試料を含む、項目９６に記載の方法。
[項目９８]
がん組織の起源を検出することをさらに含む、項目４６～９７のいずれかに記載の方法。
[項目９９]
前記対象の生存率の予後を含む報告を生成することをさらに含む、項目４６～９７のいずれかに記載の方法。
[項目１００]
前記対象に治療を与えることをさらに含む、項目４６～９７のいずれかに記載の方法。
[項目１０１]
前記疾患の治療に続いて、前記治療が有効であるかどうかを示す第２の報告を与えることをさらに含む、項目４６～９７のいずれかに記載の方法。
[項目１０２]
対象が状態を有するか、または状態を有するリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、
（ａ）前記対象からの試料の少なくとも一部から得たセルフリー核酸分子をアッセイする工程、
（ｂ）表５に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および
（ｃ）少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記メチル化レベルを、前記表５に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較する工程を含む、方法。
[項目１０３]
前記セルフリー核酸分子がｃｔＤＮＡを含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１０４]
前記配列決定分析を実施することを含み、前記配列決定分析がｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ｃｆＭｅＤＩＰ）配列決定を含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１０５]
前記検出する工程が、表５に列挙される６つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上のＤＭＲに含まれる前記核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを測定することを含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１０６]
対象が疾患の治療を受けた後により高い生存率を有するかどうかを判定する方法であって、
（ａ）前記対象からの試料の少なくとも一部から得たセルフリー核酸分子をアッセイする工程、
（ｂ）表６に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および
（ｃ）少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記メチル化レベルを、前記表６に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと処理する工程を含む、方法。
[項目１０７]
前記セルフリー核酸分子がｃｔＤＮＡを含む、項目１０６に記載の方法。
[項目１０８]
前記検出する工程が、複合体メチル化スコア（ＣＭＳ）を提示することを含む、項目１０６に記載の方法。
[項目１０９]
前記ＣＭＳが、表６に列挙されたＤＭＲのβ値の合計を含む、項目１０７に記載の方法。
[項目１１０]
ＣＭＳがより高いことが、前記対象の生存率がより低いことを示す、項目１０７に記載の方法。
[項目１１１]
前記ＣＭＳがｃｔＤＮＡの存在量に依存しない、項目１０７に記載の方法。
[項目１１２]
前記疾患が扁平上皮癌である、項目１０２～１１１のいずれかに記載の方法。
[項目１１３]
前記がんが頭頸部扁平上皮癌である、項目１１２に記載の方法。
[項目１１４]
少なくとも約８０ｂｐ～１７０ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することをさらに含む、項目１０２～１１３のいずれか一項に記載の方法。
[項目１１５]
対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するためのシステムであって、
（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも１つのプロファイルを生成するために前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および
前記対象が前記疾患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、処理する工程
を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含む、システム。
[項目１１６]
対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するシステムであって、
（ａ）複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、
（ｂ）前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、
（ｃ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、および
（ｄ）前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するために、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを使用する工程を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含む、システム。

Claims (116)

  1. 対象のがん細胞から循環腫瘍デオキシリボ核酸（ｃｔＤＮＡ）が存在することを検出する方法であって、
    （ａ）前記対象からセルフリーデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の試料を得る工程、
    （ｂ）前記試料をライブラリ調製に供して、前記セルフリーメチル化ＤＮＡのその後の配列決定を可能にする工程、
    （ｃ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いたセルフリーメチル化ＤＮＡを捕捉する工程、
    （ｄ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡを配列決定する工程、
    （ｅ）健常な個体およびがんの個体由来の対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列を用いて、前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの前記配列をコンピュータ処理する工程、および
    （ｆ）前記捕捉されたセルフリーメチル化ＤＮＡの１つ以上の配列とがんの個体由来のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合、がん細胞由来のＤＮＡの前記存在を同定する工程を含み、
    （ｄ）、（ｆ）および（ｇ）の少なくとも１つにおいて、前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡは、断片の長さのメトリックに従って亜集団に限定される、方法。
  2. 第１の量のフィラーＤＮＡを前記試料に添加することをさらに含み、前記フィラーＤＮＡの少なくとも一部がメチル化され、次いでさらに前記試料を変性させていてもよい、請求項１に記載の方法。
  3. 前記断片の長さのメトリックが断片の長さである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、＜１７０塩基対（ｂｐ）、＜１６５ｂｐ、＜１６０ｂｐ、＜１５５ｂｐ、＜１５０ｂｐ、＜１４５ｂｐ、＜１４０ｂｐ、＜１３５ｂｐ、＜１３０ｂｐ、＜１２５ｂｐ、＜１２０ｂｐ、＜１１５ｂｐ、＜１１０ｂｐ、＜１０５ｂｐ、または＜１００ｂｐの長さを有する断片に限定される、請求項２に記載の方法。
  5. 前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、約１００～約１５０ｂｐ、１１０～１４０ｂｐまたは１２０～１３０ｂｐの長さを有する断片に限定される、請求項２に記載の方法。
  6. 前記断片の長さのメトリックが、前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡの前記断片の長さの分布である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、長さに基づいて下位５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０パーセンタイル内の断片に限定される、請求項５に記載の方法。
  8. 前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡが、差次的メチル化領域（ＤＭＲ）内の断片にさらに限定される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡがさらに制限される、前記捕捉する工程の間である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記対象のセルフリーメチル化ＤＮＡがさらに制限される、前記比較する工程の間である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記限定することが、前記同定することの間である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記試料が前記対象の血液または血漿に由来する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  13. （ｆ）が統計的分類器を使用することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記分類器が機械学習によって導出される、請求項１２に記載の方法。
  15. 健常な個体およびがんの個体由来の前記対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列は、健常な個体とがんの個体との間の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベースに含まれる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 健常な個体およびがんの個体由来の前記対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列が、セルフリーＤＮＡに由来するＤＮＡにおいて健常な個体とがんの個体との間として差次的にメチル化されているその対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列に限定される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記対照のセルフリーメチル化ＤＮＡ配列が、血漿に由来するＤＮＡにおいて健常な個体とがんの個体との間として差次的にメチル化される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記試料が、１００ｎｇ、７５ｎｇまたは５０ｎｇ未満のセルフリーＤＮＡを有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記フィラーＤＮＡの第１の量は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のメチル化フィラーＤＮＡを含み、残りは非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％～５０％、１０％～４０％、または１５％～３０％のメチル化フィラーＤＮＡである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記フィラーＤＮＡの第１の量が、２０ｎｇ～１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ～１００ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ～１００ｎｇである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記試料から得た前記セルフリーＤＮＡおよび前記第１の量のフィラーＤＮＡは、合わせて少なくとも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記フィラーＤＮＡが、５０ｂｐ～８００ｂｐの長さ、好ましくは１００ｂｐ～６００ｂｐの長さ、より好ましくは２００ｂｐ～６００ｂｐの長さである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記フィラーＤＮＡが二本鎖である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記フィラーＤＮＡがジャンクＤＮＡである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記フィラーＤＮＡが内因性または外因性ＤＮＡである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記フィラーＤＮＡが非ヒトＤＮＡ、好ましくはλＤＮＡである、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記フィラーＤＮＡがヒトＤＮＡとアライメントしていない、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記結合剤が、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. （ｄ）が、抗体を使用して前記セルフリーメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 免疫沈降のために少なくとも０．０５μｇ、好ましくは少なくとも０．１６μｇの前記抗体を前記試料に添加することを含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記抗体が５－ＭｅＣ抗体である、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記免疫沈降反応を確認するために、（ｃ）の後に第２の量の対照ＤＮＡを前記試料に添加することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  34. セルフリーメチル化ＤＮＡの前記捕捉を確認するために、（ｃ）の後に第２の量の対照ＤＮＡを前記試料に添加することをさらに含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  35. がん細胞由来のＤＮＡが前記存在することを同定することは、がん細胞の起源の組織を同定することをさらに含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記がん細胞の起源の組織を同定することは、がんのサブタイプを同定することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記がんのサブタイプが、ステージ、組織学、遺伝子発現パターン、コピー数異常、再編成、または点変異状態に基づいて前記がんを区別する、請求項３６に記載の方法。
  38. （ｆ）がゲノムワイドに行われる、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. （ｆ）がゲノムワイドから特定の調節領域に制限される、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記調節領域が、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、ＣｐＧ Ｓｈｅｌｆ、または前述物の任意の組み合わせである、請求項３９に記載の方法。
  41. 工程（ｆ）および（ｇ）がコンピュータプロセッサによって実行される、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記がんが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍からなる群から選択される、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記がんが頭頸部扁平上皮癌である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記がんの前記検出に使用するための、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記がんの治療のモニタリングに使用するための、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  46. 対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、
    （ａ）（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルからなる群から選択される少なくとも１つのプロファイルを生成するために前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および
    （ｂ）前記対象が前記疾患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ナノグラム（ｎｇ）／ミリリットル（ｍｌ）未満の前記複数の核酸分子を含む、処理する工程を含む、方法。
  47. 前記セルフリー核酸試料が１０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記セルフリー核酸試料が５ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記セルフリー核酸試料が１ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、請求項４６に記載の方法。
  50. （ａ）に前記供する工程が、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からなる群から選択される少なくとも２つのプロファイルを生成する、請求項４６に記載の方法。
  51. 前記少なくとも２つのプロファイルが、前記メチル化プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記少なくとも２つのプロファイルが、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを含む、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記少なくとも２つのプロファイルが、前記メチル化プロファイルおよび前記変異プロファイルを含む、請求項５０に記載の方法。
  54. （ａ）を前記供する工程が、前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを生成する、請求項４６に記載の方法。
  55. 対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定する方法であって、
    （ａ）複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、
    （ｂ）前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、
    （ｃ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、および
    （ｄ）前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するために、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを使用する工程を含む、方法。
  56. 前記疾患ががんを含む、請求項４６～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記がんが、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫－成人軟部組織がん、皮膚がん（基底細胞および扁平上皮細胞、黒色腫、メルケル細胞）、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、扁平上皮癌、および頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択される前記がんからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記がんが扁平上皮癌である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記がんが頭頸部扁平上皮癌である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記複数のセルフリー核酸分子が循環腫瘍核酸分子を含む、請求項４６～５６のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記循環腫瘍核酸が循環腫瘍ＤＮＡを含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記循環腫瘍核酸が循環腫瘍ＲＮＡを含む、請求項６０に記載の方法。
  63. 前記メチル化プロファイルが、複数の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を含む、請求項４６～６２のいずれかに記載の方法。
  64. 前記複数のＤＭＲがｃｔＤＮＡ由来である、請求項６３に記載の方法。
  65. 末梢血白血球に由来する複数のＤＭＲが前記メチル化プロファイルから除去される、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記複数のＤＭＲが、正常で健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して低メチル化レベルを有する少なくとも約５６のゲノム領域を含む、請求項６３に記載の方法。
  67. 前記複数のＤＭＲが、正常で健常な対象からの対応するゲノム領域と比較して、過剰メチル化レベルを有する少なくとも約９４１のゲノム領域を含む、請求項５４に記載の方法。
  68. ＤＭＲが少なくとも約３００ｂｐのサイズを含む、請求項６３に記載の方法。
  69. ＤＭＲが、少なくとも約１００ｂｐ～少なくとも約２００ｂｐのサイズを含む、請求項６８に記載の方法。
  70. ＤＭＲが、少なくとも約１００ｂｐ～少なくとも約１５０ｂｐのサイズを含む、請求項６８に記載の方法。
  71. ＤＭＲが少なくとも８のＣｐＧゲノムアイランドを含む、請求項６３に記載の方法。
  72. 前記正常で健常な対象が、前記対象と同じリスク因子のセットを含む、請求項６６または６７のいずれかに記載の方法。
  73. 前記変異プロファイルが、ミスセンス変異体、ナンセンス変異体、欠失変異体、挿入変異体、重複変異体、逆位変異体、フレームシフト変異体、または反復伸長変異体を含む、請求項４５～７２のいずれかに記載の方法。
  74. 複数の末梢血白血球から得られたゲノムＤＮＡ試料に存在する任意の変異体であって、前記複数の末梢血白血球が前記対象から得られ、前記変異プロファイルから除去される、請求項４５～７２のいずれかに記載の方法。
  75. クローン造血に由来するいずれかの変異体が前記変異プロファイルから除去される、請求項４５～７２のいずれかに記載の方法。
  76. 前記変異プロファイルが、遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、またはＡＳＸＬ１の変異体を含まない、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記変異プロファイルが標準的がんドライバ遺伝子を含まない、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記変異プロファイルが非標準的がんドライバ遺伝子を含み、前記非標準的遺伝子がＧＲＩＮ３ＡまたはＭＹＣである、請求項７５に記載の方法。
  79. 前記断片の長さプロファイルが、少なくとも約８０ｂｐ～１７０ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む、請求項４６～７８のいずれかに記載の方法。
  80. 前記断片の長さプロファイルが、少なくとも約１００ｂｐ～１５０ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することを含む、請求項４６～７８のいずれかに記載の方法。
  81. 前記循環腫瘍核酸分子が濃縮されている、請求項７９または８０のいずれかに記載の方法。
  82. 前記セルフリー核酸試料をフィラーＤＮＡ分子と混合してＤＮＡ混合物を生じることをさらに含む、請求項４６～８１のいずれかに記載の方法。
  83. 前記フィラーＤＮＡ分子が約５０ｂｐ～８００ｂｐの長さを含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記フィラーＤＮＡ分子が約１００ｂｐ～６００ｂｐの長さを含む、請求項８２に記載の方法。
  85. 前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約５％のメチル化フィラーＤＮＡ分子を含む、請求項８２に記載の方法。
  86. 前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約２０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む、請求項８２に記載の方法。
  87. 前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約３０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む、請求項８２に記載の方法。
  88. 前記フィラーＤＮＡ分子が、少なくとも約５０％のメチル化フィラーＤＮＡを含む、請求項８２に記載の方法。
  89. 前記ＤＮＡ混合物を、メチル化ヌクレオチドに結合するように構成された結合剤とインキュベートして濃縮試料を生成することをさらに含む、請求項４６～８８のいずれかに記載の方法。
  90. 前記結合剤が、メチル－ＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質を含む、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である、請求項８９に記載の方法。
  92. 前記結合剤が抗体を含む、請求項８９に記載の方法。
  93. 前記抗体が５－ＭｅＣ抗体である、請求項８９に記載の方法。
  94. 前記抗体が５－ヒドロキシメチルシトシン抗体である、請求項８９に記載の方法。
  95. 前記配列決定が亜硫酸水素塩配列決定を含まない、請求項４６～９４のいずれかに記載の方法。
  96. 前記セルフリー核酸試料が血液試料を含む、請求項４６～９４のいずれかに記載の方法。
  97. 前記血液試料が血漿試料を含む、請求項９６に記載の方法。
  98. がん組織の起源を検出することをさらに含む、請求項４６～９７のいずれかに記載の方法。
  99. 前記対象の生存率の予後を含む報告を生成することをさらに含む、請求項４６～９７のいずれかに記載の方法。
  100. 前記対象に治療を与えることをさらに含む、請求項４６～９７のいずれかに記載の方法。
  101. 前記疾患の治療に続いて、前記治療が有効であるかどうかを示す第２の報告を与えることをさらに含む、請求項４６～９７のいずれかに記載の方法。
  102. 対象が状態を有するか、または状態を有するリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、
    （ａ）前記対象からの試料の少なくとも一部から得たセルフリー核酸分子をアッセイする工程、
    （ｂ）表５に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および
    （ｃ）少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記メチル化レベルを、前記表５に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと比較する工程を含む、方法。
  103. 前記セルフリー核酸分子がｃｔＤＮＡを含む、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記配列決定分析を実施することを含み、前記配列決定分析がｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ｃｆＭｅＤＩＰ）配列決定を含む、請求項１０２に記載の方法。
  105. 前記検出する工程が、表５に列挙される６つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上のＤＭＲに含まれる前記核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを測定することを含む、請求項１０２に記載の方法。
  106. 対象が疾患の治療を受けた後により高い生存率を有するかどうかを判定する方法であって、
    （ａ）前記対象からの試料の少なくとも一部から得たセルフリー核酸分子をアッセイする工程、
    （ｂ）表６に列挙される差次的メチル化領域（ＤＭＲ）に含まれる前記セルフリー核酸分子の少なくとも一部のメチル化レベルを検出する工程、および
    （ｃ）少なくとも１つのコンピュータプロセッサを使用して、（ｂ）で検出された前記メチル化レベルを、前記表６に列挙されたＤＭＲに含まれる前記セルフリー核酸分子の対応する（１つまたは複数の）部分のメチル化レベルと処理する工程を含む、方法。
  107. 前記セルフリー核酸分子がｃｔＤＮＡを含む、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記検出する工程が、複合体メチル化スコア（ＣＭＳ）を提示することを含む、請求項１０６に記載の方法。
  109. 前記ＣＭＳが、表６に列挙されたＤＭＲのβ値の合計を含む、請求項１０７に記載の方法。
  110. ＣＭＳがより高いことが、前記対象の生存率がより低いことを示す、請求項１０７に記載の方法。
  111. 前記ＣＭＳがｃｔＤＮＡの存在量に依存しない、請求項１０７に記載の方法。
  112. 前記疾患が扁平上皮癌である、請求項１０２～１１１のいずれかに記載の方法。
  113. 前記がんが頭頸部扁平上皮癌である、請求項１１２に記載の方法。
  114. 少なくとも約８０ｂｐ～１７０ｂｐの断片の長さの範囲に基づいてセルフリー核酸分子を選択することをさらに含む、請求項１０２～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 対象が疾患を有するか、または疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するためのシステムであって、
    （ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルのうちの少なくとも１つのプロファイルを生成するために前記対象から得られたセルフリー核酸試料に由来する複数の核酸分子をシーケンシングに供する工程、および
    前記対象が前記疾患を有するかまたは前記疾患のリスクがあるかどうかを少なくとも８０％の感度または少なくとも約９０％の特異度で判定するために前記少なくとも１つのプロファイルを処理する工程であって、前記セルフリー核酸試料が３０ｎｇ／ｍｌ未満の前記複数の核酸分子を含む、処理する工程
    を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含む、システム。
  116. 対象のセルフリー核酸試料を処理して、前記対象が疾患を有するかまたは疾患を有するリスクがあるかどうかを判定するシステムであって、
    （ａ）複数の核酸分子を含む前記セルフリー核酸試料を得る工程、
    （ｂ）前記複数の核酸分子またはその誘導体を配列決定に供して、複数の配列決定リードを生成する工程、
    （ｃ）前記複数の配列決定リードをコンピュータ処理して、前記複数の核酸分子について、（ｉ）メチル化プロファイル、（ｉｉ）変異プロファイル、および（ｉｉｉ）断片の長さプロファイルを同定する工程、および
    （ｄ）前記対象が前記疾患を有するかまたは有するリスクがあるかどうかを判定するために、少なくとも前記メチル化プロファイル、前記変異プロファイルおよび前記断片の長さプロファイルを使用する工程を含むプロセスを実施するように個別にまたは集合的にプログラムされた１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含む、システム。
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