ES2608954T3 - Nuevo marcador fetal de metilación - Google Patents

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Abstract

Un metodo para detectar la presencia de ADN fetal en una muestra biologica de sangre entera, de plasma o de suero de una mujer embarazada, que comprende las etapas de: (a) tratar la muestra con un agente que modifica diferencialmente el ADN metilado y el no metilado; y (b) detectar la secuencia de ADN metilado de RASSF1A en la muestra, en donde la presencia de la secuencia de ADN metilado indica la presencia de ADN fetal en la muestra y la ausencia de la secuencia de ADN metilado indica la ausencia de ADN fetal en la muestra.

Description

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de una secuencia conocida. Ejemplos de tales métodos de hibridación incluyen transferencia Southern y transferencia Northern.
"Cebadores", tal como se usan en el presente documento, se refieren a oligonucleótidos que pueden usarse en un método de amplificación, tal como una reacción en cadena de polimerasa (PCR), para amplificar una secuencia de nucleótidos basada en la secuencia polinucleotídica correspondiente a un gen de interés, por ejemplo RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1, DAB2IP, PTPN6, THY1, TMEFF2, o PYCARD, metilados o no metilados. Al menos uno de los cebadores para PCR para la amplificación de una secuencia polinucleotídica es específico de secuencia para la secuencia.
"Valor de control estándar, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una cantidad predeterminada de una secuencia genómica que procedente de un feto y que está presente en una muestra establecida. El valor de control estándar es adecuado para el uso de un método de la presente invención, con el fin de comparar la cantidad de un gen de interés (o una secuencia no codificante) que está presente en una muestra de ensayo. Una muestra establecida que sirve como control estándar proporciona una cantidad promedio de un gen fetal de interés que es típico durante un tiempo definido (por ejemplo, el primer trimestre) durante el embarazo en la sangre de una mujer media embarazada normal, sana, portadora de un feto normal ninguno de los cuales presenta riesgo de desarrollar trastornos o complicaciones asociadas con el embarazo. Un valor de control estándar puede variar dependiendo de la secuencia genómica de interés y la naturaleza de la muestra.
El término "promedio", tal como se utiliza en el contexto de describir una mujer embarazada, se refiere al hecho de que la mujer está libre de al menos una afección de relevancia, tal como una afección asociada con el embarazo (por ejemplo, preeclampsia o parto prematuro). El término "promedio", cuando se usa en otro contexto, se refiere a ciertas características, tales como la cantidad o el estado de metilación de un gen particular tanto de origen materno como fetal que se encuentra en la sangre de la mujer, que son representativas de un grupo seleccionado de mujeres sanas que están embarazadas con fetos cromosómicamente normales y que no son susceptibles a ninguna enfermedad o afección relacionada con el embarazo. Este grupo seleccionado debe comprender un número suficiente de mujeres, de modo que la cantidad promedio o el perfil de metilación del gen de interés entre estas mujeres refleje, con una precisión razonable, el perfil correspondiente en la población general de mujeres embarazadas sanas con fetos sanos. Además, el grupo seleccionado de mujeres en general tiene una edad gestacional similar a la de una mujer cuya sangre se analiza para la indicación de un posible trastorno asociado al embarazo. La edad gestacional preferente para la práctica de la presente invención puede variar dependiendo del trastorno que se esté buscando. Por ejemplo, el cribado en una mujer embarazada para detectar el riesgo de preeclampsia se realiza, preferiblemente, durante el segundo trimestre del embarazo, mientras que el cribado de aneuploidía cromosómica fetal se realiza y se diagnostica lo antes posible. Además, la edad gestacional preferida para la prueba también puede depender del gen que interesa analizar.
El término "preeclampsia", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una afección que se produce durante el embarazo, cuyo principal síntoma es varias formas de presión arterial alta que a menudo se acompaña de la presencia de proteínas en la orina y edema (hinchazón). La preeclampsia, a veces llamada toxemia del embarazo, está relacionada con un trastorno más grave llamado "eclampsia", que es preeclampsia junto con convulsiones. Estas afecciones generalmente se desarrollan durante la segunda mitad del embarazo (después de 20 semanas), aunque pueden desarrollarse poco después del nacimiento o antes de las 20 semanas de embarazo.
El término "parto prematuro", como se usa en el presente documento, se refiere a una afección en la que el parto comienza más de tres semanas antes del período completo de la gestación de aproximadamente 40 semanas, que conduce a menudo al nacimiento prematuro si no se trata.
La expresión "retraso del crecimiento intrauterino (RCIU)" se refiere a una afección en la cual el crecimiento del feto es anormalmente lento, su peso por debajo del percentil 10 para la edad gestacional. Cuando nace, el lactante parece demasiado pequeño y desnutrido para su edad. El RCIU, también denominado restricción del crecimiento intrauterino, se asocia con un mayor riesgo de enfermedad médica y muerte en el recién nacido.
Tal como se utiliza en la presente solicitud, "un gen de un tipo sanguíneo RhD, de un tipo sanguíneo ABO, de un tipo sanguíneo RhC, de un tipo de sangre RhE, de tipo HLA o en el cromosoma Y" se refiere a un gen que se reconoce como representativo de un tipo de sangre en particular de acuerdo con la tipificación de sangre RhD, ABO, RhC o RhE, o un tipo de HLA concreto, o un gen que se encuentra localizado en el cromosoma Y. La detección de tal gen en el ADN fetal es indicativa de que el feto tiene un tipo sanguíneo concreto, un tipo HLA o el sexo masculino.
Descripción detallada de la invención
I. Introducción
La presencia de ADN fetal en el plasma materno se notificó por primera vez en 1997, ofreciendo la posibilidad de un diagnóstico prenatal no invasivo simplemente mediante el análisis de una muestra de sangre materna (Lo et al.,
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dependiendo del trastorno investigado. La obtención de sangre de una mujer se realiza de acuerdo con el protocolo estándar que generalmente siguen los hospitales o clínicas. Se obtiene una cantidad apropiada de sangre periférica, por ejemplo, normalmente entre 5-50 ml, y se puede almacenar de acuerdo con el procedimiento estándar antes de la preparación adicional.
B. Preparación de muestras de sangre
El análisis del ADN fetal encontrado en la sangre materna de acuerdo con la presente invención se realiza usando, por ejemplo sangre entera, suero o plasma. Los métodos para preparar suero o plasma de sangre materna son bien conocidos entre los expertos en la técnica. Por ejemplo, la sangre de una mujer embarazada se puede introducir en un tubo que contiene EDTA o un producto comercial especializado, tal como Vacutainer SST ((Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) para prevenir la coagulación sanguínea y, a continuación, el plasma puede obtenerse a partir de sangre entera mediante centrifugación. Por otra parte, se puede obtener suero con o sin centrifugación después de la coagulación de la sangre. Si se utiliza centrifugación, entonces se realiza normalmente, aunque no exclusivamente, a una velocidad apropiada, por ejemplo, 1.500-3.000 x g. El plasma o el suero pueden someterse a etapas de centrifugación adicionales antes de ser transferidos a un tubo nuevo para la extracción de ADN.
Además de la porción acelular de la sangre entera, el ADN también puede recuperarse de la fracción celular, enriquecida en la porción de capa leucocitaria, que puede obtenerse tras la centrifugación de una muestra de sangre entera de la mujer y la extracción del plasma.
C. Extracción de ADN
Se conocen numerosos métodos para extraer ADN de una muestra biológica, incluyendo sangre. Se pueden seguir los métodos generales de preparación de ADN (por ejemplo, descritos por Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª ed., 2001); también se pueden usar varios reactivos o kits disponibles comercialmente, tales como QiaAmp DNA Mini Kit o QiaAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germana), GenomicPrep™ Blood DNA Isolation Kit (Promega, Madison, WI), y GFX™ Genomic Blood DNA Purification Kit (Amersham, Piscataway, NJ), para obtener ADN de una muestra de sangre de una mujer embarazada. También se pueden utilizar combinaciones de más de uno de estos métodos.
IV. Modificación química del ADN específica de metilación
El ADN presente en una muestra de una mujer embarazada, extraída o no de la muestra, se trata después con un agente capaz de modificar preferentemente el ADN dependiendo de si la secuencia de ADN está metilada o no. Por ejemplo, este agente puede ser una enzima que digiere el ADN de una manera sensible a la metilación, es decir, sólo el ADN no metilado será digerido mientras que el ADN metilado permanece sin cambios. Otra posibilidad es que el agente convierte selectivamente una secuencia polinucleotídica dependiendo del estado de metilación. Normalmente, dicho agente reacciona con el resto o restos C no metilados en una molécula de ADN y convierte cada resto C no metilado en un resto uracilo (U), mientras que los restos C metilados permanecen sin cambios. Esta conversión C → U permite la detección y comparación del estado de metilación sobre la base de cambios en la secuencia primaria del ácido nucleico. Un reactivo de ejemplo adecuado para este fin es bisulfito, tal como bisulfito sódico. Los métodos para usar bisulfito para la modificación química del ADN son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Hennan et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996) y no se discutirán con detalle en el presente documento.
Como reconocerá un experto en la técnica, cualquier otro reactivo que no se cite en el presente documento pero que tenga la misma propiedad de modificar químicamente (o mediante cualquier otro mecanismo) el ADN metilado y no metilado de forma diferencial se puede usar para practicar la presente invención. Por ejemplo, la modificación específica del ADN de la metilación puede realizarse también mediante enzimas de restricción sensibles a la metilación, algunas de las cuales normalmente escinden un fragmento de ADN no metilado, pero no un fragmento de ADN metilado, mientras que otras (por ejemplo, la endonucleasa dependiente de metilación McrBC) escinden el ADN que contienen citosinas metiladas pero no ADN no metilado. Además, se puede usar una combinación de modificación química y tratamiento con enzimas de restricción, por ejemplo, análisis combinado de restricción con bisulfito (COBRA) para la práctica de la presente invención.
V. Amplificación y determinación de la secuencia polinucleotídica
Después de la modificación diferencial dependiente de la metilación del ADN, tal como la modificación química del ADN de una manera específica de metilación o digestión enzimática sensible a la metilación, el ADN tratado se somete a continuación a un análisis basado en secuencias, de manera que RASSF1A, de la fuente fetal puede distinguirse de su homólogo de la fuente materna y que la presencia y la cantidad del gen o genes fetales pueden determinarse y compararse con un control estándar. Adicionalmente, una vez que se determina que RASSF1A de origen fetal está, de hecho, presente en la muestra, en particular cuando la cantidad del gen o genes es mayor que un umbral predeterminado, se considera que la muestra y sus equivalentes contienen suficiente cantidad de ADN fetal para análisis adicionales. Por otra parte, se puede detectar y medir la cantidad de estos genes particulares
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MATERIALES Y MÉTODOS
Reclutamiento sujetos y recolección de muestras
Se reclutaron sujetos que se estaban realizando en el primer trimestre el cribado de detección de síndrome de Down del King's College Hospital de Londres, Reino Unido. El estudio y la recolección de muestras clínicas humanas fueron aprobados por la junta de revisión institucional. Se solicitó el consentimiento informado de cada sujeto. Los tejidos de las vellosidades coriónicas se recogieron a través de un procedimiento de muestreo de vellosidades coriónicas. Se recogieron muestras de sangre periférica materna justo antes de la realización de procedimientos obstétricos.
Procesamiento de muestras y detección en PCR en tiempo real para secuencias RHD
Se extrajo ADN de muestras de plasma materno, capa leucocitaria y CVS como se ha descrito en las secciones anteriores. El estado RhD de la madre y del feto se determinó mediante amplificación en tiempo real de una secuencia en el exón 7 y en el exón 10 del gen RHD como se ha descrito en anteriormente (Lo et al., N Engl J Med 1998, 339: 1734-1738; Rijnders et al., Obstet Gynecol 2004, 103:157-164) utilizando ADN de la capa leucocitaria materna y ADN de las CVS como moldes, respectivamente. En nuestra cohorte, los ensayos con el exón 7 y el exón 10 dieron resultados idénticos para todos los sujetos estudiados. La detectabilidad de la secuencia de RHD en el plasma materno se determinó por los mismos sistemas de PCR en tiempo real usando 5 µl de ADN plasmático como moldes. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Una muestra se calificaría como positiva si cualquiera de los duplicados fuera positivo. La presencia de ADN fetal en el plasma materno se confirmó mediante la amplificación de la secuencia de SRY (para fetos masculinos) y la secuencia de RASSF1A después de la digestión enzimática del ADN de plasma materno. La PCR en tiempo real dirigida al gen SRY se llevó a cabo utilizando ADN de plasma sin digestión enzimática como los moldes. Las PCR en tiempo real para las secuencias de RASSF1A y βactina se llevaron a cabo utilizando el ADN de plasma materno después de la digestión enzimática como los moldes.
RESULTADOS
Se examinó el estado RhD de 355 mujeres embarazadas. Cincuenta y cuatro de ellas eran RHD negativo. Como este grupo de sujetos estaban en riesgo de aloinmunización por un feto RhD positivo, se realizó su plasma y CVS a una investigación adicional para el estado fetal de RhD. Las secuencias de RHD se detectaron en el ADN materno de 35 sujetos y fueron negativos en el plasma materno de 19 sujetos. En 15 de los 19 sujetos con resultado RHD negativo en plasma materno se detectaron secuencias de RASSF1A en el ADN plasmático tras digestión enzimática. Los otros 4 casos fueron negativos para RASSF1A después de la digestión enzimática. La señal de Beta-actina fue negativa en todos los casos, lo que indica que la digestión con la enzima BstU I fue completa en los 19 casos. Según el análisis de las muestras de CVS, los 15 sujetos con detección positiva de RASSF1A después de la digestión enzimática llevaban un feto RhD-negativo. En los 4 sujetos que mostraron una detección negativa de RHD y RASSF1A en su plasma, CVS fue RHD positivo en 2 de ellos. Por lo tanto, para estos dos casos, el genotipado de RHD en plasma materna había producido resultados falsos negativos, que se escogieron según el fallo en la detección del marcador analítico positivo RASSF1A después de la digestión enzimática. Para ilustrar la importancia de este marcador fetal independiente del sexo, estos resultados se compararon con un marcador de ADN fetal existente SRY. El ensayo de SRY sería positivo solo cuando el feto es masculino. Para los 19 sujetos con detección negativa de la secuencia de RHD en su plasma, 6 de ellos fueron positivos para SRY, indicando la presencia de ADN fetal amplificable en la muestra de plasma materno analizado y confirmando así la naturaleza genuina del estado RhD negativo del feto. En los 13 casos restantes, si la detección negativa de las secuencias de RHD y SRY en el ADN plasmático es el resultado de un feto RhD negativo femenino o el ADN fetal inadecuado en el plasma materno no puede determinarse sin utilizar el protocolo RASSF1A como control positivo para ADN fetal.
Ejemplo 6: Demostración de RASSF1A como un marcador independiente del sexo para el control de la preeclampsia
La utilidad clínica de los marcadores de ADN fetal hipermetilados va más allá de servir como un marcador analítico positivo. La detección y/o cuantificación del RASSF1A por sí misma después de la digestión enzimática puede ser útil en el diagnóstico prenatal y la monitorización del embarazo. En otras palabras, estas secuencias de ADN fetal hipermetiladas en el plasma materno pueden servir como biomarcadores por su propio derecho. Anteriormente, se ha demostrado que la concentración de ADN fetal en el plasma materno se incrementa en ciertas afecciones, como la preeclampsia y las aneuploidías fetales. Sin embargo, debido a la falta de un marcador de ADN fetal independiente del sexo, los estudios previos estaban limitados a mujeres embarazadas que llevaban un feto masculino (Levine et al., Am J Obstet Gynecol 190:707-713; Leung et al., Clin Chem 47:147-139). En este ejemplo, se compararon las concentraciones de ADN fetal en el plasma, dirigiéndose a la secuencia de RASSF1A después de la digestión enzimática, de 5 mujeres con preeclampsia con 5 embarazadas de edad gestacional equivalente sin ninguna complicación asociada con el embarazo. Las concentraciones de RASSF1A medidas en las muestras de ADN del plasma materno después de la digestión enzimática de los dos grupos se muestran en la Figura 16. La mediana de las concentraciones de las mujeres embarazadas con y sin preeclampsia fueron 9.400 copias/ml y 2.200 copias/ml de plasma, respectivamente. La diferencia entre los dos grupos fue estadísticamente significativa (p =
16
0,016, prueba de Mann-Whitney).
Tabla 1 Aclaramiento de las secuencias de RASSF1A y SRY del plasma materno después del parto. Se tomó sangre de 5 mujeres embarazadas que llevaban un feto masculino justo antes del parto y 24 horas después del parto. Después de que las muestras de ADN de plasma materno se trataran con enzima sensible a la metilación, se detectaron secuencias de RASSF1A y SRY en el plasma de todos los sujetos antes del parto, pero no se detectaron en ninguna de las muestras de plasma 24 horas después del parto.
Después de la digestión enzimática, concentraciones plasmáticas de (copias/ml)
RASSF1A
SRY
Sujetos
Antes del parto 24 horas después del parto Antes del parto 24 horas después del parto
A
84 0 27 0
B
49 0 13 0
C
42 0 15 0
D
23 0 11 0
E
19 0 9 0
Tabla 2 Los genotipos RASSF1A del ADN de la capa leucocitaria materna, ADN placentario y ADN del plasma materno con o sin digestión enzimática de 43 mujeres embarazadas. En cada uno de los 43 casos, el genotipo del ADN del plasma materno con digestión enzimática fue idéntico al genotipo de la placenta (fetal), lo que sugiere que solo las moléculas de ADN fetales específicas fueron amplificables después de la digestión enzimática de las muestras de ADN del plasma materno.
Genotipo de RASSF1A
Caso
ADN de capa leucocitaria materna ADN de plasma materno sin digestión ADN de la placenta ADN de plasma materno con digestión
616
CC CC CC CC
677
AC AC AC AC
688
AC AC CC CC
695
CC CC CC CC
832
AC AC CC CC
849
AC AC CC CC
873
AC AC AC AC
920
AC AC AC AC
928
AA AA AC AC
1082
CC CC CC CC
1088
AC AC CC CC
1089
AA AA AC AC
1112
CC CC CC CC
1114
AA AA AA AA
1145
AA AA AA AA
1148
AC AC AC AC
1149
CC CC CC CC
1155
AA AA AA AA
1157
CC CC CC CC
1158
AC AC AA AA
1170
CC CC CC CC
1171
AC AC CC CC
1172
AC AC AC AC
1182
CC CC CC CC
1185
AC AC AC AC
1186
AC AC AA AA
1192
AC AC AA AA
1194
AC AC AC AC
1195
CC CC CC CC
1197
CC CC AC AC
1200
AC AC AC AC
1203
AA AA AA AA
1204
AA AA AC AC
1210
AC AC AC AC
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CC CC AC AC
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AC AC AC AC
1213
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