CN101512014B

CN101512014B - 新的胎儿甲基化标记物

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Publication number: CN101512014B
Application number: CN2007800160259A
Authority: CN
Inventors: 卢煜明; 赵慧君; 詹兆冲; 丁春明; 陈君赐; 兴南·艾维·王; 袁嘉进
Original assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Current assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Priority date: 2006-05-03
Filing date: 2007-05-03
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2027-05-03
Also published as: US7754428B2; ES2658815T3; CA2982978A1; CA2651049C; EP3875604B1; US20130084566A1; CN101512014A; EP3299477A1; JP2009535049A; US20110143342A1; WO2007132166A3; EP3875604A1; AU2007251394A1; AU2007251394B2; EP3133173B1; DK2016190T3; WO2007132166A2; CA2651049A1; US8288100B2; MX2008013897A

Abstract

本申请描述了以下发现：在孕妇中，来自胎儿的某些基因(例如RASSF1A、APC、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB21P、PTPN6、THY1、TMEFF2和PYCARD)是高度甲基化的，而母体来源的相同基因是非甲基化的。该发现允许在来自孕妇的生物样品中方便地检测这些作为样品中胎儿DNA存在的通用指示剂的甲基化胎儿基因。这些胎儿甲基化标记物作为非侵入性分析方法的阳性对照尤其有用，在该方法中胎儿DNA的质量和数量被监测。还可以直接测量这些新鉴定的胎儿标记物以诊断某些妊娠相关病症。

Description

新的胎儿甲基化标记物

相关申请

本申请要求2006年5月3日提交的序列号为60/797,506的美国临时专利申请的优先权，为了所有目的将其整体通过引用并入本文。

发明背景

早期检测包括妊娠或者分娩期间的潜在并发症以及胎儿的遗传缺陷在内的妊娠相关病症非常重要，因为它使母体和胎儿安全所需的早期医疗介入成为可能。通常采用例如绒毛膜绒毛取样(CVS)或者羊膜穿刺术的方法利用从胎儿分离的细胞来进行产前诊断。尽管操作非常仔细，但这些常规方法均是侵入性的，并对母体和胎儿有一定的风险(Tabor et al.，Lancet 1：1287-1293，1986)。

在发现母体循环中存在一些类型的胎儿细胞(Johansen et al.，Prenat.Diagn.15：921-931，1995)之后，更重要的是在发现母体血浆和血清中能够检测到循环的无细胞的胎儿DNA(Lo et al.，Lancet 350：485-487，1997)之后，已经开发了替代这些侵入性方法的产前筛查方法，例如检测胎儿异常的方法。已证明，母体血液中的胎儿DNA的含量足够用于遗传学分析，与分离和富集胎儿细胞的必需步骤相比，并不需要对所述血浆或血清进行复杂的处理。利用基于聚合酶链式反应(PCR)的技术，通过检测母体血浆或者血清中的胎儿DNA来完成胎儿恒河猴D(rhesus D(RhD))基因型的检测(Lo et al.，N.Engl.J.Med.339：1734-1738，1998)、胎儿性别的确定(Lo et al.，Hum.Genet.90：483-488，1993)、以及一些胎儿病症的诊断(Amicucci et al.，Clin.Chem.46：301-302，2000；Saito et al.，Lancet 356：1170，2000；及Chiu et al.，Lancet360：998-1000，2002)。

此外，也有报道称在先兆子痫(Lo et al.，Clin.Chem.45：184-188，1999和Zhong et al.，Am.J.Obstet.Gynecol.184：414-419，2001)、胎儿21号染色体三体性(trisomy)(Lo et al.，Clin.Chem.45：1747-1751，1999和Zhong et al.Prenat.Diagn.20：795-798，2000)和妊娠剧吐症(hyperemesis gravidarum)(Sekizawa et al.，Clin.Chem.47：2164-2165，2001)的母体血浆/血清中胎儿DNA含量异常。美国专利第6,258,540号也公开了用于产前遗传分析的母体血液中胎儿核酸的检测。

因为胎儿DNA与母体DNA在孕妇血液的无细胞部分例如血清或者血浆中共存，所以需要区别胎儿来源和母体来源的DNA以保证基于胎儿DNA的诊断结果准确。公开号为20030044388的美国专利申请09/944,951首次公开了胎儿和母体DNA可以根据它们不同的甲基化模式被区分。Landes等在美国专利申请公开号20030211522中还提出了不同的甲基化标记物可以用于产前诊断。另一方面，为了确保基于胎儿DNA的检测法的效果并且消除检测结果的错误解读，还需要确定检测步骤使用的样品中胎儿DNA的存在和数量，所述错误解读是由于所述检测方法获得的胎儿DNA的不充分回收造成的。因此需要鉴定胎儿DNA标记物，该标记物可以有效地作为试样中胎儿DNA存在或者缺失的通用指示剂。重要的是，这类胎儿DNA标记物与其母体对应物一直且一致不同，而且该标记物的存在或者缺失可以在母体DNA背景中被容易地确定，并且通常与胎儿DNA的存在或者缺失有直接联系。本发明满足这类和其他相关的需要。

在本申请中，许多在胎儿组织(例如，来自胎盘)和母体组织中具有高度特异的甲基化模式的人类基因被第一次鉴定。源自胎儿的这些基因的甲基化高度一致，而母体来源的基因的非甲基化也相似的高度一致，所述母体来源的基因释放大量的无细胞DNA到母体血液中。这些特征使所述基因有效地作为产前诊断方法使用试样的内部阳性对照，以便确保所述过程从样品回收了足够量的胎儿DNA。因为这些基因的甲基化状态相对于它们来源的高度一致性，这些基因是特别可靠的对照，可以显示胎儿DNA的数量和质量。这些基因作为胎儿标记物的另一优点是，相对于它们的非甲基化母体对应物，只检测甲基化的胎儿形式相对容易。此外，本申请描述的胎儿基因还可以直接用作某些妊娠相关状态或者病症的诊断标记物。

发明简述

在本发明的第一个方面，提供一种检测孕妇生物样品中胎儿DNA的方法。该方法包括下列步骤：(a)用差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理样品；和(b)检测样品中RASSF1A、APC、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB2IP、PTPN6、THY1、TMEFF2(GenBank登录号NM_016192)或者PYCARD(GenBank登录号NM_013258)的DNA序列。DNA序列的存在表明样品中胎儿DNA存在，而DNA序列的缺乏表明样品中胎儿DNA的缺乏。

在一些实施方案中，取自孕妇的样品是全血。可选择地，样品可以是血浆、血清、尿液或者唾液。在一些实施方案中，能够差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂消化非甲基化DNA但不消化甲基化DNA。该试剂可以是甲基化敏感的酶，尤其是甲基化敏感的限制性内切酶，例如HpaII或者BstUI。在其他实施方案中，所述试剂可以包含亚硫酸氢盐。

在一些实施方式中，所述方法的步骤(b)包括扩增过程。在一个示例性的实施方式中，所述扩增过程是聚合酶链式反应((PCR))，例如实时PCR。在其他实施方式中，步骤(b)确定DNA序列的数量。

在一些实施方式中，当步骤(b)提示样品中胎儿DNA的存在时，所述方法可以进一步包括：(c)测定第二样品中第二胎儿DNA序列的数量。所述第二样品与步骤(a)中经差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理前的样品相同，所述第二序列不是RASSF1A、APC、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB2IP、PTPN6、THY1、TMEFF2或者PYCARD；和(d)将第二序列的数量与标准对照比较。当检测到第二序列的数量相对于对照增加时，它可以被解释为存在妊娠相关病症或者患这类病症风险增加的指示剂。在一些情况下，步骤(c)的第二样品不经任何差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理，而在其它情况下，在测定第二胎儿DNA序列的数量前步骤(c)的第二样品经所述试剂处理。例如，在测定第二胎儿DNA序列的数量前，步骤(c)的第二样品经差别修饰甲基化和非甲基化DNA的第二种不同试剂处理。该方法适合于检测妊娠期间各种妊娠相关病症的存在或者患妊娠相关病症风险的增加。这类病症的一些实例包括先兆子痫、早产和宫内发育迟缓(IUGR)。

在其他实施方式中，当步骤(b)提示样品中胎儿DNA的存在时，所述方法还可以包括：(c)检测第二样品中的第二胎儿DNA序列。所述第二样品与步骤(a)中用所述试剂处理前的样品相同，所述第二序列是RhD血型的基因，ABO血型的基因，RhC血型的基因，RhE血型的基因，HLA型的基因，或者位于Y染色体的基因，或者包含预定突变的基因，其中所述第二序列的存在指示胎儿基因组基因中特定RhD血型、特定ABO血型、特定RhC血型、特定RhE血型、特定HLA型、Y染色体或者预定突变的存在。在一些情况下，步骤(c)的第二样品不经任何差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂的处理。任选地，步骤(c)包括扩增过程。在一个示例性的实施方案中，所述扩增过程是聚合酶链式反应((PCR))，例如实时PCR。

在本发明的第二个方面，提供一种检测孕妇妊娠相关病症的方法。该方法包括下列步骤：(a)用差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理获自妇女的生物样品；(b)检测样品中RASSF1A、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB2IP、PTPN6、THY1，TMEFF2或者PYCARD DNA序列的数量；和(c)将所述DNA序列的数量与标准对照进行比较，其中相对于对照的增加提示妊娠相关病症的存在或者患妊娠相关病症风险的增加。

在一些实施方案中，能够差别修饰甲基化或者非甲基化DNA的试剂消化非甲基化DNA但不消化甲基化DNA。一种可能是所述试剂是甲基化敏感的酶，诸如甲基化敏感的限制性内切酶(例如HpaII或者BstU I)。另一种可能是所述试剂包括亚硫酸氢盐。

在一些实施方式中，所述方法的步骤(b)包括扩增过程，这可以通过各种方法包括聚合酶链式反应(PCR)实施，例如实时PCR。该方法适合于许多妊娠相关病症包括先兆子痫、早产和宫内发育迟缓(IUGR)的诊断、监测或者风险评估。

附图简述

图1.RASSF1A(SEQ ID NOS：1-8)、APC(SEQ ID NOS：9和10)和RARB(SEQ ID NOS：11-14)序列的引物、探针和标准校对序列以及PCR反应条件。

图2.(a)妊娠早期(first trimester)和(b)妊娠晚期(third trimester)胎盘组织以及相应的母体血细胞中RASSF1A CpG岛的甲基化状态。被分析的CpG位点根据RASSF1(智人，Homo sapiens)基因库(GenBank)登录号NM_007182进行顺序编码和命名，以其蛋白编码序列的起始密码子作为第+1位(括号表示)。第一个CpG位点(-113)对应于UCSC基因组浏览器(Genome Browser)(2004年5月汇编，hgl7)中人类基因组的chr3:50353354(反向链)。实心环和空心环分别代表甲基化和非甲基化的CpG位点。

图3.妊娠早期和妊娠晚期胎盘组织以及相应的母体血细胞中APC和RARB CpG岛的甲基化状态。对于APC，被分析的CpG位点根据基因库登录号NM_000038命名，以其蛋白编码序列的起始密码子作为第+1位。第一个CpG位点(-17371)对应于UCSC基因组浏览器(May2004汇编，hgl7)中人类基因组的chr5:112101115。对于RARB，被分析的CpG位点根据基因库登录号NM_016152命名，以其蛋白编码序列的起始密码子作为第+1位。第一个CpG位点(-73231)对应于UCSC基因组浏览器(2004年5月汇编，hgl7)中人类基因组的chr3:25444475(正向链)。实心环和空心环分别代表甲基化和非甲基化的CpG位点。

图4.CASP8(SEQ ID NOS：15-18)的引物、探针和标准校正序列以及PCR反应条件。

图5.妊娠早期和妊娠晚期胎盘组织以及相应的母体血细胞中CASP8CpG岛的甲基化状态。被分析的CpG位点根据CASP8(智人)基因库登录号NM_033355命名，以其蛋白编码序列的起始密码子作为第+1位。第一个CpG位点(-8167)对应于UCSC基因组浏览器(2004年5月汇编，hgl7)中人类基因组的chr2:201948550。实心环和空心环分别代表甲基化和非甲基化的CpG位点。

图6.SCGB3A1(SEQ ID NOS：19-22)的引物、探针和标准校正序列以及PCR反应条件。

图7.妊娠晚期胎盘组织以及相应的母体血细胞中SCGB3A1 CpG岛的甲基化状态。被分析的CpG位点根据SCGB3A1(智人)基因库登录号NM_052863命名，以其蛋白编码序列的起始密码子作为第+1位。第一个CpG位点(-390)对应于UCSC基因组浏览器(2004年5月汇编，hgl7)中人类基因组的chr5:179951435。

图8.甲基化DNA序列的选择性扩增。连接到基因序列上的环表示甲基化敏感的限制性内切酶的切割位点。空心和实心环分别代表这些甲基化敏感的限制性内切酶切割位点上的非甲基化和甲基化序列。甲基化敏感的限制性内切酶消化在酶切位点上切割非甲基化DNA序列。因此，在实时PCR扩增步骤中只检测到未被切割的甲基化DNA序列。

图9.(a)胎盘和母体血沉棕黄层(buffy coat)DNA样品中RASSF1A的实时PCR扩增曲线。在甲基化敏感的限制性内切酶消化后，在胎盘DNA样品中检测到RASSF1A序列，但在母体血沉棕黄层DNA样品中没有检测到。(b)胎盘和母体血沉棕黄层DNA样品中β肌动蛋白序列的实时PCR扩增。酶消化后，在胎盘或者母体血沉棕黄层DNA中没有检测到β肌动蛋白。(c)妊娠晚期胎盘组织以及相应的母体血细胞中β肌动蛋白CpG岛的甲基化状态。被分析的CpG位点根据人细胞质β肌动蛋白基因GenBank登录号M10277命名，以其蛋白编码序列的起始密码子作为第+1位。第一个CpG位点(-970)对应于UCSC Genome Browser(2004年5月汇编，hgl7)中人类基因组的chr7:5536879。

图10.(a)显示母体血浆DNA中胎儿来源的RASSF1A序列的选择性扩增原理的示意图。连接到基因序列上的环表示甲基化敏感的限制性内切酶的切割位点。空心和实心环分别代表这些甲基化敏感的限制性内切酶切割位点上的非甲基化和甲基化序列。甲基化敏感的限制性内切酶消化特异性消化在限制性酶切位点上的非甲基化DNA序列。因此，母体来源的RASSF1A(Rsf)和β肌动蛋白序列以及胎儿来源的β肌动蛋白序列会被消化，只留下可检测的胎儿来源的RASSF1A序列。实心和空心箭头分别代表针对RASSF1A和β肌动蛋白基因的PCR引物。因此，只有胎儿来源的RASSF1A序列可以通过实时PCR系统检测。(b)说明通过β肌动蛋白系统的内部对照检测不完全酶消化的示意图。当甲基化敏感酶的消化不完全时，一些母体来源的RASSF1A和β肌动蛋白序列以及一些胎儿来源的β肌动蛋白序列将仍残留在DNA样品中。在这种情况下，因为消化不完全，母体来源和胎儿来源序列的RASSF1A信号对胎儿DNA不是特异的。该内部对照系统被设计成将不完全酶消化造成的假阳性检测降到最低。

图11.妊娠晚期孕妇(a)和妊娠早期孕妇(b)的血浆DNA样品中的RASSF1A和β肌动蛋白的实时扩增曲线。酶消化后，这两种妇女母体血浆中的RASSF1A序列仍然是可检测的。扩增曲线的右移是因为RASSF1A序列在甲基化敏感的限制性内切酶消化母体来源的RASSF1A序列后数量降低。相反，β-肌动蛋白序列被酶消化，因此未被检出。分析了71例怀孕受试者的无细胞血浆DNA样品。她们中的28例处于妊娠早期，43例处于妊娠晚期。在甲基化敏感的酶消化后，所有血浆DNA样品均检测到RASSF1A序列。

图12.未怀孕妇女母体血浆DNA的RASSF1A和β肌动蛋白的实时扩增曲线。酶消化后，血浆DNA样品中没有检测到RASSF1A或者β肌动蛋白序列。在本研究招募的25例未怀孕妇女中，没有一例在甲基化敏感的限制性内切酶消化后的血浆中显示可检测的RASSF1A信号。

图13.在这种情况下，母体(母体血沉棕黄层DNA)和胎儿(胎盘DNA)的RASSF1A基因型分别是AC和CC。未经酶消化，母体血浆的RASSF1A基因型与母体是AC的基因型相同。酶消化后，母体血浆的RASSF1A基因型转变成与胎盘(胎儿)基因型相同的CC。

图14.对于24例妊娠晚期孕妇，经过或者未经酶消化的母体血浆中SRY序列与RASSF1A序列的浓度的相关性。全部受试者都怀有男性胎儿。经过酶消化的母体血浆中SRY和RASSF1A的浓度之间存在正相关(r＝0.717，p<0.0001，Spearman相关性)。但是，不经酶消化测量的SRY和总RASSF1A的浓度之间没有相关性(r＝0.228，p＝0.280，Spearman)。

图15.显示孕妇中非侵入性胎儿恒河猴D检测策略的示意图。

图16.先兆子痫妊娠中，酶消化后母体血浆的RASSF1A序列浓度升高。

图17.用于DAB2IP(SEQ ID NOS.-23-26)亚硫酸氢盐测序的引物序列和PCR反应条件。

图18.妊娠晚期胎盘组织样品以及相应的母体血细胞中DAB2IPCpG岛的甲基化状态。被分析的CpG位点根据DAB2IP(智人)基因库登录号NM_032552命名，以其蛋白编码序列的起始密码子作为第+1位。第一个CpG位点(-59572)对应于UCSC基因组浏览器(2004年5月汇编，hgl7)中人类基因组的chr9:121541221。实心环和空心环分别代表甲基化和非甲基化的CpG位点。

定义

本申请使用的术语“妊娠相关病症”是指可能影响孕妇、该孕妇所怀的胎儿或者孕妇和胎儿的任何病症或者疾病。这种病症或者疾病可能在有限的时间段显示其症状，例如在妊娠或者分娩期间，或者可能在胎儿出生后持续其一生。妊娠相关病症的一些实例包括先兆子痫、早产和宫内发育迟缓(IUGR)。

在本申请中，术语“核酸”或者“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)以及其单链或者双链形式的聚合物。除非特别限定，该术语包括了包含天然核苷酸已知类似物的核酸，所述类似物与参照核酸具有类似的结合特性，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式进行代谢。除非另外指出，特定核酸序列无疑还包括其保守修饰的变异体(例如，简并密码子取代)，等位基因，同源体，包括点突变的突变体，单核苷酸多态性(SNPs)和互补序列，以及明确指定的序列。具体来说，简并密码子取代可以通过产生其选择的一个或者多个(或者全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer et al.，NucleicAcid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini et al.，Mol.Cell Probes 8：91-98(1994))。术语核酸可以与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。

术语“基因”表示参与产生多肽链的DNA片段；它包括编码区前后参与基因产物的转录/翻译以及转录/翻译调节的区域(前导和拖尾)，以及各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

在本申请中，当涉及氨基酸残基的聚合物时，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可以互换使用。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一种或者多种氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文使用的术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即，抗原)，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。

术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其功能类似于天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及之后被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。

本文中氨基酸可以用其公知的3字母符号或者1字母符号表示，这些符号是由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical NomenclatureCommission)推荐的。同样地，核苷酸可以用其公认的单字母代码表示。

本文使用的术语“亚硫酸氢盐”包括所有类型的亚硫酸氢盐，例如亚硫酸氢钠，即能够将胞嘧啶(C)化学转化成尿嘧啶(U)而不化学修饰甲基化胞嘧啶，因此可基于DNA的甲基化状态差异修饰DNA序列。

本文使用的“差异修饰”甲基化或者非甲基化DNA的试剂包括，在修饰甲基化和/或非甲基化DNA的过程中从甲基化和非甲基化DNA产生可区别的产物，从而允许鉴定DNA甲基化状态的任何试剂。这类过程可以包括，但不限于，化学反应(例如通过亚硫酸氢盐的C→U转化)和酶处理(例如甲基化依赖的核酸内切酶切割)。因此，优选切割或者消化甲基化DNA的酶是一种当DNA是甲基化的时候以更高的效率切割或者消化DNA分子的酶，而当DNA不是甲基化的时候，优选切割或者消化非甲基化DNA的酶显示明显增加的效率。

在本申请中，词语“存在”或者“缺乏”用于描述特定DNA序列水平的相对含义。换言之，当给定DNA序列或者基因被描述为“存在”于试样中时，这表示该DNA序列或者基因水平高于预定的阈值；而当DNA序列或者基因“缺乏”时，它在试样中的水平低于该阈值。

“增加”或者“减少”用于本申请时是指数量相对于建立的标准对照可检测的阳性或者阴性变化。增加是阳性变化，优选是对照值的至少10％，更优选50％，仍然更优选2倍，甚至更优选至少5倍，以及最优选至少10倍。类似地，减少是阴性变化，优选是对照值的至少10％，更优选50％，仍然更优选2倍，甚至更优选是对照值的至少90％。例如“更多(more)”或者“更少(less)”的表示数量相对于比较基准的变化或者差异的其他术语在本申请中以如上所述的相同方式使用。

本文使用的“多聚核苷酸杂交方法”指基于其形成沃森-克里(Watson-Crick)碱基配对的能力，在适合的杂交条件下，利用已知序列的多聚核苷酸探针来检测多聚核苷酸存在和/或数量的方法。这种杂交方法的本文使用的“引物”是指可用于扩增方法例如聚合酶链式反应(PCR)的寡核苷酸，以对应于目的基因的多核苷酸序列为基础扩增核苷酸序列，所述目的基因例如，甲基化或非甲基化的RASSF1A、APC、CASP、RARB、SCGB3A1、DAB2IP、PTPN6、THY1、TMEFF2或者PYCARD。用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个是针对所述序列序列特异性的。

本文使用的“标准对照值”是指基因组序列的预定量，所述基因组序列来源于胎儿并且存在于建立的样品中。标准对照值适合用于本发明的方法，以便比较试样中存在的目的基因(或者非编码序列)的数量。作为标准对照的建立样品提供目的胎儿基因的平均量，所述平均量对于妊娠指定时间(例如，妊娠早期)怀有正常胎儿的健康孕妇的血液平均值来说是典型的，所述孕妇和胎儿均没有患任何妊娠相关病症或者并发症的风险。标准对照值可以根据目的基因组序列和样品的性质而变化。

在描述孕妇的情况下，术语“平均”是指所述妇女没有至少一种相关病症，例如妊娠相关病症(例如，先兆子痫或者早产)。当用于其他情况时，术语“平均”是指某些特征，例如在所述妇女血液中发现的母体和胎儿来源的特定基因的数量或者甲基化状态，其代表怀有染色体正常胎儿并且对任何妊娠相关疾病或者病症不易感的健康妇女的随机选择组。该选择组应该包括足够数量的妇女，以使这些妇女中目的基因的平均量或者甲基化模式以合理的准确度反映怀有健康胎儿的健康孕妇总群体的相应模式。此外，选择组的妇女通常与其血液被检测以诊断潜在妊娠相关病症的妇女具有类似的孕龄。实施本发明的优选孕龄可以根据被筛查的病症而改变。例如，筛查先兆子痫风险的孕妇优选处于妊娠中期(secondtrimester)，而胎儿的染色体非整倍性优选被尽早筛查和诊断。此外，检测优选的孕龄还取决于被测的目的基因。

本文使用的术语“先兆子痫”指在妊娠过程中发生的病症，其主要症状为多种形式的高血压并常伴有尿蛋白和水肿(浮肿)。先兆子痫有时称为妊娠毒血症，与更严重的被称为“惊厥”的病症有关，所述惊厥为先兆子痫结合癫痫发作。尽管其在出生后可立即发生或在妊娠20周之前发生，这些疾病状态通常在妊娠的后半程(20周后)发病。

本文使用的术语“早产”或“提前分娩”指在约40周的完全妊娠期届满前3周以上发生分娩的病症，该病症如果不治疗常导致早产。

术语“宫内发育迟缓(IUGR)”是指一种病症，其中胎儿生长异常缓慢，其体重不到孕龄的10％。出生时，婴儿相对其年龄显得太小和营养不良。也被称为子宫内生长受限的IUGR与新生儿医疗疾病和死亡风险的增加有关。

本申请使用的“RhD血型、ABO血型、RhC血型、RhE血型、HLA型或者位于Y染色体的基因”是指被认为代表与RhD、ABO、RhC或者RhE血液分型一致的特定血型或者特定HLA型的基因，或者位于Y染色体上的基因。检测胎儿DNA中的这类基因提示胎儿是特定的血型、HLA型或者性别。

发明详述

I.引言

1997年首次报道了胎儿DNA在母体血浆中的存在，这提供了简单通过母体血液样品的分析进行非侵入性产前诊断的可能(Lo et al.，Lancet350：485-487，1997)。但是，胎儿DNA与背景母体DNA在母体血浆中的共存需要区别胎儿和母体来源DNA的可靠方法。先前已经报道了若干基因在其胎儿和母体形式的甲基化之间存在差别，参见，例如，Chim et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 102：14753-14758，2005。

本发明人第一次发现，来自胎儿的许多基因(例如，RASSF1A、APC、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB21P、PTPN6、THY1、TMEFF2和PYCARD)是高度甲基化的，而来自怀有所述胎儿的孕妇的相同基因不是甲基化的。尽管当比较基因的胎儿形式和母体形式时已经报道了具有不同甲基化模式的其他基因，但本发明人的发现是独一无二的，不仅因为先前不知道这些特定基因甲基化状态的这种区别，而且之前也不知道所述胎儿基因甲基化的高度一致性和所述母体基因甲基化的缺乏。因此本发现提供一种新的、更准确和更有效的区别胎儿和母体基因组DNA的方法。尤其是，在非侵入性产前诊断的分析方法中检测样品中本文鉴定的任意一种胎儿基因可以确认所述过程(包括采样和处理)是像设计的那样成功操作的，因为样品中常规胎儿DNA(不限于本文指定的基因)在质量和数量上都得到了正确保障。此外，这些新鉴定的基因还可以直接用作指示某些妊娠相关病症和并发症的存在或者患病风险增加的胎儿DNA标记物，因为相对其母体对应物，这些基因是一致甲基化的，可以容易地区别在所述基因的母体拷贝和胎儿拷贝。

II.常规方法

利用分子生物学领域的常规技术实施本发明。公开本发明所用常规方法的基础性文本包括Sambrook和Russell，Molecular Cloning，ALaboratory Manual(分子克隆，实验室手册)(第三版.2001)；Kriegler，GeneTransfer and Expression：A Laboratory Manual(基因转移和表达：实验室手册)(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(通用分子生物学技术)(Ausubel et al.，eds.，1994))。

对于核酸，大小单位是千碱基(kb)或者碱基对(bp)。这根据琼脂糖或者丙烯酰胺凝胶电泳、被测序的核酸或者公开的DNA序列来估算。对于蛋白，大小单位是千道尔顿(kDa)或者氨基酸残基编号。蛋白大小根据凝胶电泳、被测序的蛋白、导出的氨基酸序列或者公开的蛋白序列来估算。

没有商品化供应的寡核苷酸可以通过化学合成，例如，根据Beaucage& Carathers，Tetrahedron Lett.22：1859-1862(1981)首次描述的固相亚磷酰胺三酯方法，如在Van Devanter et.al.，Nucleic Acids Res.12：6159-6168(1984)中所述的那样利用自动合成仪合成。利用本领域已知的任何策略进行寡核苷酸的纯化，例如，如在Pearson & Reanier，J.Chrom.255：137-149(1983)中描述的非变性丙烯酰胺凝胶电泳或者阴离子交换高效液相色谱法(HPLC)。

本发明鉴定的RASSF1A、APC、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB2IP、PTPN6、THY1、TMEFF2和PYCARD这些基因中的任何一种，以及合成寡核苷酸的多核苷酸序列，可以利用例如Wallace et al.，Gene 16：21-26(1981)描述的测序双链模板的链终止方法进行验证。

III.血液样品的获取和DNA的萃取

本发明涉及基于不同的甲基化状态测定母体血液中发现的某些胎儿基因的存在和/或数量，以检测常规胎儿DNA的存在和/或数量，例如所述胎儿DNA可以用作指示非侵入性分析方法正确操作的内部对照，所述分析方法利用胎儿DNA评估妊娠相关病症或者不适的存在或者风险。因此，实施本发明的第一步是从孕妇获取生物样品，并利用基于甲基化状态差异修饰DNA的试剂处理DNA，其中所述孕妇的生物样品中预期存在胎儿DNA。这类试剂的一个实例是只消化非甲基化DNA但不消化甲基化DNA的试剂。任选地，首先从样品中提取DNA。

A.血液样品的获得

从处于适合检测的孕龄的孕妇获得血液样品，所述检测利用基于胎儿DNA的非侵入性诊断方法。根据所检测的病症，所述合适的孕龄可以不同。根据医院或者诊所通常采用的标准步骤进行妇女血液的采集。采集适量的外周血，例如5-50ml，并可以在进一步制备前根据标准步骤进行保存。

B.血液样品的制备

根据本发明对母体血液中发现的胎儿DNA的分析可以使用，例如，全血、血清或者血浆。从母体血液制备血清或者血浆的方法是本领域技术人员公知的。例如，可以将孕妇的血液置于包含EDTA或者专门商品化的产品例如Vacutainer SST(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)的管中防止血液凝固，然后可以通过离心从全血获取血浆。另一方面，血液凝固后经过或者不经过离心就可以获取血清。如果使用离心，则通常但不是唯一的，在合适的速度进行，例如，1,500-3,000×g。血浆或者血清在被转移到新管进行DNA提取前可以经过另外的离心步骤。

除了全血的无细胞部分外，也可以从血沉棕黄层部分富集的细胞部分回收DNA，所述血沉棕黄层部分是在离心妇女的全血样品并去除血浆后获取的。

C.DNA的提取

存在许多已知的从包括血液的生物样品提取DNA的方法。可以遵循DNA制备的常规方法(例如，由Sambrook和Russell描述的方法，MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆:实验室手册)第三版，2001)；各种商品化供应的试剂或者试剂盒，例如QiaAmp DNA小提试剂盒(QiaAmpDNA Mini Kit)或QiaAmp血液DNA小提试剂盒(QiaAmp DNA BloodMini Kit)(Qiagen，Hilden，Germany)，GenomicPrep^TM血液DNA分离试剂盒(Promega，Madison，WI)和GFX^TM Genomic血液DNA纯化试剂盒(Amersham，Piscataway，NJ)，也可用于从孕妇的血液样品中获取DNA。也可以使用这些方法中不止一种的组合。

IV.DNA的甲基化特异性化学修饰

无论是否从样品中被提取，孕妇样品中存在的DNA都将用试剂进行处理，所述试剂根据DNA序列是否被甲基化能够优先修饰DNA。例如，该试剂可以是以甲基化敏感方式消化DNA的酶，即，只有非甲基化DNA被消化而甲基化DNA仍然不变。另一种可能是所述试剂根据甲基化状态选择性转化多核苷酸序列。通常，这种试剂与DNA分子中非甲基化C残基反应并将每个非甲基化C残基转化为尿嘧啶(U)残基，而甲基化C残基保持不变。这种C→U转化允许根据核酸原始序列的改变来检测和比较甲基化状态。适合于该目的的示例性试剂是亚硫酸氢盐，例如亚硫酸氢钠。使用亚硫酸氢盐化学修饰DNA的方法是本领域公知的(参见，例如，Herman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：9821-9826，1996)，在此不做赘述。

本领域技术人员应认识到，未在本文中指定但具有相同的化学差异(或者通过任何其他机制)修饰甲基化和非甲基化DNA特性的任何其他试剂均可用于实施本发明。例如，DNA的甲基化特异性修饰可以通过甲基化敏感的限制性内切酶来实现，其中一些限制性内切酶通常切割非甲基化DNA片段而不切割甲基化DNA片段，而其他限制性内切酶(例如，甲基化依赖的核酸内切酶McrBC)切割包含甲基化胞嘧啶的DNA而不切割非甲基化DNA。此外，化学修饰和限制性内切酶处理的组合，例如，组合的亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)，可用于实施本发明。

V.多核苷酸序列扩增和测定

在DNA的甲基化依赖性差异修饰后，诸如以甲基化特异性方式的DNA化学修饰或者甲基化敏感的酶消化，然后对被处理的DNA进行序列分析，以使胎儿来源的本发明一种或者多种相关基因(例如，RASSF1A、APC、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB2IP、PTPN6、THY1、TMEFF2或者PYCARD)可以与其母体来源的对应物区别，从而可以测定所述胎儿基因的存在和数量并与标准对照进行比较。此外，一旦确定这些胎儿来源基因中的一种或者多种确实在样品中存在时，尤其当所述基因的数量大于预定阈值时，则所述样品和其等同物被认为包含用于进一步分析的足够数量的胎儿DNA。另一方面，技术人员可以检测和测量这些特定基因的数量作为提示某些妊娠相关状态或者病症的胎儿标记物，这利用了所述基因与其母体来源的对应物的非甲基化状态相对的高度甲基化状态。对于这种用途，可以将试样中选自RASSF1A、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB2IP、PTPN6、THY1、TMEFF2和PYCARD的一种或者多种胎儿基因的数量与标准值进行比较，其中相对于标准值的增加提示这类妊娠相关疾病的存在或者风险增加。

A.核苷酸序列的扩增

通过甲基化依赖的差异修饰过程处理后，在基于序列分析本发明胎儿标记物前，可任选地进行扩增反应。在本发明的一些实施方案中，进行所述扩增以优先扩增本发明具有特定甲基化模式的胎儿标记物，以便只检测和分析特定来源的基因组序列，例如来自胎儿胎盘或者其他组织的基因组序列。

多种多核苷酸扩增方法是成熟的，并且在研究中经常被使用。例如，用于多核苷酸序列扩增的聚合酶链式反应(PCR)常规方法是本领域公知的，因此在本文中不做赘述。关于PCR方法、实验技术和设计引物的原则的综述参见，例如，Innis，et al.，PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(PCR实验技术：方法和应用指导)，Academic Press，Inc.N.Y.，1990。从例如Roche分子系统(Roche Molecular Systems)的商品供应商处也可获得PCR试剂和实验技术。

PCR通常利用耐热酶以自动化过程来完成。在此过程中，反应混合物的温度自动循环通过变性区、引物退火区和延伸反应区。特别适合该目的的设备可以商购。

尽管通常使用靶多核苷酸序列的PCR扩增(例如，RASSF1A、APC、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB2IP、PTPN6、THY1、TMEFF2或者PYCARD的PCR扩增)实施本发明，本领域技术人员会认识到，也可以通过任何已知的方法扩增母体血液样品中发现的基因组序列，所述已知的方法例如连接酶链式反应(LCR)，转录介导的扩增以及自我持续序列复制或者基于核酸序列的扩增(NASBA)，这些方法中的每一种都提供了充分的扩增。最近开发的分枝DNA技术(branched-DNA technology)也可用于定性显示代表特定的甲基化模式的本发明特定基因组序列的存在，或者定量测定母体血液中该特定基因组序列的数量。用于临床样品中核酸序列直接定量的分枝DNA信号扩增的综述参见Nolte，Adv.Clin.Chem.33：201-235，1998。

B.多核苷酸序列的测定

多核苷酸序列测定的技术也是成熟的，并且在相关研究领域被广泛实施。例如，多核苷酸测序的基本原则和常规技术在各种研究报告以及分子生物学和重组遗传学相关论文中均有描述，例如Wallace et al.，见上述；Sambrook和Russell，见上述，以及Ausubel et al.，见上述。不论是手动还是自动化的，研究实验室常规实施的DNA测序方法均可用于实施本发明。为了实施本发明的方法，适于检测多核苷酸序列变化(例如，C→U)的其他方法包括但不限于质谱分析、引物延伸、多核苷酸杂交、实时PCR和电泳。

VI.建立标准对照值

为了建立标准对照值以实施本发明的方法，首先选择怀有健康胎儿的一组健康孕妇。这些妇女具有相似的孕龄，并处于适合使用本发明方法筛查诸如先兆子痫和早产的病症的妊娠时间段。

通过成熟的、常规使用的方法来确认所选孕妇及其所怀胎儿的健康状况，所述方法包括但不限于监测所述妇女的血压、记录产程开始和利用CVS和羊水穿刺术进行胎儿遗传分析。

此外，所选择的这组怀有健康胎儿的健康孕妇必须有合理的规模，以使存在于从该组获得的母体血液中的本发明鉴定的特定胎儿基因的平均量能够被可信地视为代表怀有健康胎儿的健康妇女总群体的正常或者平均量或者甲基化模式。优选地，所选择的组包括至少10名妇女。

一旦依据所选健康对照组中每位妇女的个体值，建立母体血液中特定胎儿基因的平均水平，则该平均值或者中值或者代表值被认为是标准对照值。因此任何包含相似量胎儿基因的生物样品(例如，血液样品)可用于提供相同种类样品(例如，血液样品)的标准对照值。此外，也可以人工组合包含平均量或者中间量或者代表性的量的基因组DNA序列的溶液，以提供标准对照值。基因和基因的标准对照值可以不同，这取决于生物样品的性质，即，血浆样品和唾液标本的RASSF1A标准对照值可以是不同的。

实施例

以下仅以示例方式而非限定性的方式提供了下列实施例。本领域技术人员应容易的认识到，通过改变或者修改各种非关键参数也能产生基本相同或者相似的结果。

实施例1：相对于母体血液，在胎儿中被高甲基化(hypermethylated)的肿瘤抑制基因

我们的目的在于鉴定母体血液中胎儿特异性的后生(epigenetic)标记物。先前的数据表明母体血浆中的胎儿DNA分子主要来自胎盘(Chim etal.，Proc Natl Acad Sci USA.，102，14753-14758；Masuzaki et al.，J MedGenet 41，289-292，2004；Flori et al.，Hum Reprod 19，723-724，2004)，而母体血浆中的背景DNA可以来自母体血细胞(Lui et al.，Clin Chem 48，421-427，2002)。因此，为了鉴定胎儿后生标记物，评估了胎盘组织和母体血细胞中基因组基因座的甲基化模式，其目的在于鉴定两种组织类型中显示差异甲基化的基因座。这类标记物可以用于妊娠相关病症的产前诊断和监测。

受试者招募和采样

从香港威尔士亲王医院妇产科(Obstetrics and Gynaecology，Prince ofWales Hospital，Hong Kong)招募受试者。本研究和人类临床样品的采集得到机构审查委员会(institutional review board)的批准。并获得每位受试者的知情同意书。在选择性妊娠终止后立即采集妊娠早期的胎盘组织。在单纯性妊娠的选择性剖腹产后立即采集妊娠晚期的胎盘组织。在即将进行产科手术前采集母体外周血样品(12mL EDTA)。

样品处理和亚硫酸氢盐测序

于4℃以1,600g离心血液样品10分钟。除去上清后，将外周血细胞部分再以2,500g离心。进一步去除任何残留的血浆。按照制造商的说明书，利用Nucleon Blood DNA提取试剂盒(GE Healthcare-Biosciences，LittleChalfont，United Kingdom)从外周血细胞提取DNA，利用QIAamp组织试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)从胎盘组织提取DNA。亚硫酸氢盐将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而保持甲基化的胞嘧啶不变。按照制造商的说明书，利用CpGenome通用DNA修饰试剂盒(Chemicon，Temecula，CA)将提取的DNA样品进行亚硫酸氢盐转化。对于每个转化反应，在添加试剂I后，于50℃孵育1μg DNA 16小时。利用GeneAmp PCR核心试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems))，通过不区别甲基化和非甲基化序列的引物对各种亚硫酸氢盐转化的DNA样品进行PCR。按照制造商的说明书，每个后续PCR产物被TA克隆入pGEM-Teasy载体(Promega)以转化入大肠杆菌(E.coli)JM109株。随机挑取克隆，然后利用载体引物T7和SP6进行菌落PCR以扩增克隆的插入物。利用1.1版BigDye(应用生物系统公司)和自动化毛细管DNA序列测序仪遗传分析仪3100(应用生物系统公司)进行循环测序。利用SeqScape软件(应用生物系统公司)比对和比较所得序列。在记录前首先证实完全的亚硫酸氢盐转化。测序的胞嘧啶或者胸腺嘧啶残基的CpG位点分别被记为甲基化或者非甲基化的。通过除以所有克隆CpG位点中甲基化位点的总数，计算每个样品的甲基化位点频率。

数据比较和统计分析

在亚硫酸氢盐转化后，如果序列是胞嘧啶则CpG位点被记为甲基化的；如果所述序列被胸腺嘧啶残基占据，则被记为非甲基化的(尿嘧啶的脱氧对应物)。通过除以所有克隆CpG位点中甲基化位点的总数，计算每个样品的甲基化位点频率。

RASSF1A、APC和RARB

图1列出了亚硫酸氢盐测序的PCR引物和PCR循环条件。图2和3列出了亚硫酸氢盐测序结果。这些结果表明RASSF1A、APC和RARB序列在胎盘中是高甲基化的，而在母体血细胞中不是甲基化的。

CASP8

图4列出了亚硫酸氢盐测序的PCR引物和PCR循环条件。图5列出了亚硫酸氢盐测序结果。这些结果表明CASP8序列在胎盘中是高甲基化的，而在母体血细胞中不是甲基化的。

SCGB3A1

图6列出了亚硫酸氢盐测序的PCR引物和PCR循环条件。图7列出了亚硫酸氢盐测序结果。这些结果表明SCGB3Al序列在胎盘中是高甲基化的，而在母体血细胞中大部分不是甲基化的。

DAB2相互作用蛋白(DAB2IP)

图17列出了亚硫酸氢盐测序的PCR引物和PCR循环条件。图18列出了胎盘组织样品和相应母体血细胞的亚硫酸氢盐测序结果。这些结果表明DAB2IP序列在胎盘中是高甲基化的，而在母体血细胞中不是甲基化的。

实施例2：甲基化敏感酶消化，随后进行实时PCR

甲基化敏感酶是只有当其识别位点没有被甲基化的时候才切割DNA的酶。更详细的说明参见，例如，美国专利申请公开号US2005/0158739(Jeddeloh et al.)。例如，BstUI识别CGCG位点，并且当CpG没有被甲基化的时候切割DNA。如图8所示，不止一种甲基化敏感酶可以用于消化非甲基化DNA，但保持甲基化序列的完整。随后可以使用诸如实时PCR的方法检测酶性消化后仍然可以扩增的DNA序列。

材料和方法

受试者招募和采样

从香港威尔士亲王医院妇产科(Obstetrics and Gynaecology，Prince ofWales Hospital，Hong Kong)招募受试者。本研究和人类临床样品的采集得到机构审查委员会的批准。并获得每位受试者的知情同意书。在单纯性妊娠的选择性剖腹产后采集妊娠晚期的胎盘组织。在即将进行产科手术前采集母体外周血样品。

样品处理和甲基化敏感酶对DNA的消化

母体血液样品在4℃以1,600g离心10分钟，并在4℃以16,000g离心10分钟。按照制造商的推荐，利用QIAamp血液DNA小提试剂盒和QIAamp DNA小提试剂盒从200μl血沉棕黄层和0.2g胎盘组织中提取DNA。利用100U BstU I(甲基化敏感的酶)在60℃于1×消化缓冲液中消化100纳克胎盘和母体血沉棕黄层DNA16小时。

RASSF1A序列的实时PCR检测

利用引物RSF-b151F，5′-AGCCTGAGCTCATTGAGCTG-3′(SEQ IDNO：27)和RSF-dsgnR，5′-ACC AGCTGCCGTGTGG-3′(SEQ ID NO：28)，以及小沟结合(minor grove binding，MGB)荧光探针RSF-dsgnT，5′-FAM-CCAACGCGCTGCGCAT-MGB-3′(SEQ ID NO：29)，通过实时PCR扩增RASSF1A序列。出现可检测荧光信号需要的PCR循环时间或者次数与输入DNA样品中RASSF1A序列的数量负相关。换言之，存在于DNA样品中的RASSF1A序列的数量越多，荧光信号出现的越早，就会导致产生更少的阈值循环次数。

图9a显示BstU I消化后，对来自胎盘和母体血细胞的RASSF1A分子进行实时PCR定量的实例。未经酶消化的情况下，检测到了来自胎盘和母体血沉棕黄层的RASSF1A分子。经过酶消化后，只检测到来自胎盘的RASSF1A分子。对于β肌动蛋白分子来说，不管其来源，它只在未经酶消化的情况下是可检测的(图9b)。这是预料之中的，因为β肌动蛋白序列不是甲基化的。图9c显示胎盘和母体血沉棕黄层的β肌动蛋白基因的亚硫酸氢盐测序结果。胎盘组织和母体血沉棕黄层是完全非甲基化的。

实施例3：酶消化后母体血浆中RASSF1A的检测

在实施例1中，通过亚硫酸氢盐测序，我们证明了母体血细胞的RASSF1A基因是完全非甲基化的，而胎盘(胎儿来源的)的RASSF1A基因是高度甲基化的。在实施例2中，我们证明了母体血细胞的RASSF1A序列被甲基化敏感的限制性内切酶完全消化，而胎盘的RASSF1A序列只被相同的酶部分消化。血浆DNA包括母体来源的DNA(主要来自母体血细胞，因此是非甲基化的)和胎儿来源的DNA(胎盘是主要的来源，因此本专利申请描述的标记物是甲基化的)。因此可以使用甲基化敏感的酶消化血浆DNA以去除母体DNA背景，并增加母体血浆中胎儿来源的RASSF1A分子的部分浓度。

图10a是示意图，母体来源的RASSF1A是非甲基化的，因此被甲基化敏感的酶消化，而一些胎儿来源的RASSF1A是甲基化的，因此没有被消化。如果酶消化是完全的，那只有胎儿来源的甲基化DNA保存完整，可以作为PCR扩增的模板。就β肌动蛋白而言，因为母体和胎儿来源的DNA序列都是非甲基化的，所以完全的酶消化会破坏所有序列，随后利用该β肌动蛋白序列无法实现PCR扩增。人为失误和试剂质量有时可能造成不完全的酶消化。因此β肌动蛋白可以用作提示不完全消化的内部对照(图10b)。如果酶消化后可以成功进行β肌动蛋白的PCR扩增，则很可能酶消化是不完全的。在这种情况下，需要重复进行全面分析直到实现β肌动蛋白分析的阴性结果。

材料和方法

样品处理和甲基化敏感酶对DNA的消化

母体血液样品在4℃以1,600g离心10分钟，并4℃以16,000g离心10分钟。使用QIAamp小提试剂盒(QIAamp mini kit)(Qiagen)从1.6ml血浆中提取DNA，并用50μl H₂O洗脱。利用100U BstU I酶在60℃于1×消化缓冲液中消化35微升血浆DNA16小时。

RASSF1A和β肌动蛋白序列的实时PCR检测

按照上文的描述通过实时PCR扩增和定量RASSF1A序列。利用引物肌动蛋白-163F，5′-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3′(SEQ ID NO：30)和肌动蛋白-298R，5′-CGGCGGATCGGCAAA-3′(SEQ ID NO：31)，以及MGB荧光探针肌动蛋白-243T，5′-VIC-ACCGCCGAGACCGCGTC-MGB-3′(SEQ ID NO：32)，通过实时PCR扩增和定量β肌动蛋白序列。利用引物SRY-109F，5′-TGGCGATTAAGTCAAATTCGC-3′(SEQ ID NO：33)和SRY-245R，5′-CCCCCTAGTACCCTGACAATGTATT-3′(SEQ ID NO：34)，以及荧光探针SRY-HZT，5′-FAM-AGCAGTAGAGCAGTCAGGGAGGCAGA-TAMRA-3′(SEQ IDNO：35)，扩增和定量SRY序列。包含RASSF1A、SRY和β肌动蛋白扩增子各一个拷贝的DNA构建体被用作这三种分析的定量标准。通过连续稀释已知量的DNA构建体作出校准曲线，并将其用于每轮实时PCR以定量血浆RASSF1A、β肌动蛋白和SRY。

图11显示对经过和没有经过BstU I消化的来自妊娠早期和妊娠晚期母体血浆的RASSF1A分子进行实时PCR定量的实例。对于妊娠早期样品，由于酶的消化，RASSF1A浓度从688拷贝/mL血浆降低到49拷贝/mL血浆。这种显著的降低是预料之中的，因为所测DNA分子的大部分(平均96.6％，Lo et al.，Am J Hum Genet 1998，62：768-775)来自母体，因此是非甲基化的，从而被消化。对于妊娠晚期样品，由于酶的消化，RASSF1A浓度从1275拷贝/mL血浆降低到74拷贝/mL血浆。利用RASSF1A分子的这种分析，我们分析了71例孕妇(28例处于妊娠早期，43例处于妊娠晚期)。在甲基化敏感酶消化后，所有血浆DNA样品均检测到RASSF1A序列。分析了所有样品的β肌动蛋白消化对照。对于每例受试者，只有未经酶消化时才检测到β肌动蛋白序列。

实施例4：酶消化后母体血浆中RASSF1A序列胎儿特异性的证实

酶消化后DNA序列的胎儿特异性对于产前诊断和妊娠监测是非常重要的。在本实施例中，我们将通过4个实验证实酶消化后母体血浆中RASSF1A序列的胎儿特异性。

在第一个实验中，证明酶消化后在非孕妇中检测不到RASSF1A序列。这点是非常重要的，因为如果酶消化后RASSF1A分子是胎儿特异性的，它们将不会在非孕妇中被检测到。图12显示了非孕妇的情况。只有在未经酶消化的情况下才检测到RASSF1A序列。经过酶消化，没有发现可检测的RASSF1A序列。与预期一致，只有在未经酶消化的情况下才检测到β肌动蛋白消化对照。在本研究招募的25例未怀孕志愿者中，甲基化敏感的限制性内切酶消化后没有人的血浆显示可检测的RASSF1A信号。

在第二个实验中，证明酶消化后的RASSF1A序列在婴儿分娩后是检测不到的。如果酶消化后RASSF1A分子是胎儿特异性的，则预期它们会从母体血浆消失，因为释放这类分子的来源(主要是胎盘)在分娩后被去除。其他的胎儿特异性标记物例如SRY已经被证明在分娩后显示相似的清除(Lo et al.，Am J Hum Genet 1998，62：768-775)。采集5对分娩前和分娩后的母体血浆。对于所有情况，在酶消化后，RASSF1A分子在分娩前能检测到，但在分娩后是检测不到的(表1)。类似地，胎儿特异性SRY标记物也只在分娩前能检测到。

在第三个实验中，使用单核苷酸多态性(SNP)标记物区别母体来源和胎儿来源的RASSF1A序列。如果酶消化后RASSF1A序列的确是胎儿特异性的，则这种序列的基因型应该是胎儿的基因型，而不是母体的基因型。例如，如果SNP标记物在胎儿中是CC，在母体中是AC，则酶消化后DNA的基因型应该是CC，而不是AC。类似地，对于AC/CC(胎儿/母体)对，酶消化后的DNA基因型应该是AC，而不是CC。对于未经消化的血浆DNA，其基因型可能与母体的基因型相同，因为大部分血浆DNA来自母体。

材料和方法

RASSF1A基因分型

按照上文的描述，从母体血浆、母体血沉棕黄层和胎盘提取DNA。如上所述将35微升的每一份母体血浆DNA样品用BstU I酶消化16小时。利用未经酶消化的母体血沉棕黄层DNA、胎盘DNA、母体血浆DNA和酶消化后的母体血浆DNA作为模板，通过引物RSF-b151F，5′-AGCCTGAGCTC ATTGAGCTG-3′(SEQ ID NO：27)和RSF-dsgnR，5′-ACCAGCTGCCGTGTGG-3′(SEQ ID NO：28)进行RASSF1A序列的PCR扩增。因为该RASSF1A扩增子中存在单核苷酸多态性(SNP id：rs4688725)，所以可以确定不同组织的RASSF1A基因型。进行引物延伸反应以对RASSF1ADNA进行基因分型。每14μl反应物包含10μl PCR产物，0.77μM延伸引物Rsf-R17 5′-CAGCCGGGTGGGCCCT-3′(SEQ IDNO：36)，1.15U热测序酶(thermosequenase)以及双脱氧核苷酸(ddATP、ddCTP和ddTTP)和脱氧核苷酸dGTP的混合物(各64μM)。对于基因型A的RASSF1A序列，所述引物将被延伸以产生5′-CAGCCGGGTGGGCCCTddT-3′(SEQ ID NO：37)，其分子量为5476.6Da。对于基因型C的RASSF1A序列，所述引物将被延伸以产生5′-CAGCCGGGTGGGCCCTGddC-3′(SEQ ID NO：38)，其分子量为5790.8Da。利用MassARRAY基质辅助激光解吸附电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析法(SEQUENOM)分析最终的碱基延伸产物。利用TyperAnalyzer软件(SEQUENOM)确定RASSF1A的基因型。

图13显示母体血浆DNA(经过或者未经酶消化)、母体血沉棕黄层DNA和胎盘DNA基因分型实验结果的实例。与预期一致，酶消化后母体血浆DNA的基因型与胎盘的基因型(胎儿基因型)相同，但与母体血沉棕黄层的基因型不同。表2显示43例受试者的基因分型结果，其中母体血浆DNA(经过或者未经酶消化)、母体血沉棕黄层DNA和胎盘DNA均被分析。在全部43例受试者中，酶消化后母体血浆DNA的基因型都与胎盘(胎儿)基因型相同。

在第四个实验中，我们证实了两种标记物即酶消化后的RASSF1A序列以及SRY序列在母体血浆中的浓度彼此相关。提取24例怀有单个男性胎儿的妊娠晚期孕妇的血浆DNA。如图14所示，在酶消化后的RASSF1A序列与SRY序列之间观察到正相关(r＝0.717，p<0.0001，施佩尔曼氏(Spearman)相关性)。此外，主要来自母体的未经酶消化的总RASSF1A浓度与SRY的浓度无关。

这4个实验确定地证实，酶消化后的RASSF1A序列是专一来自胎儿的(就我们使用的技术程度来说)。因此RASSF1A可用于产前诊断和妊娠监测。

实施例5：RASSF1A作为产前诊断RhD血型的阳性分析标记物的证实

恒河猴D(RhD)血型不合是胎儿和新生儿溶血病的一个重要原因。该病症的发病机理涉及RhD抗原对RhD阴性孕妇的异源免疫，所述RhD抗原由父系等位基因编码并在胎儿红细胞表面显示。母体的异源免疫通常在RhD阳性胎儿的组织接触到母体血液时的分娩期间发生。这将在后来怀有RhD阳性胎儿的妊娠中产生抗RhD抗体，所述抗体可以穿过胎盘并且破坏胎儿红细胞。在分娩第一个RhD阳性婴儿前后，通过施用预防性的抗RhD免疫球蛋白，可以防止母体异源免疫或者将其降到最低。因此，在分娩前知道胎儿的RhD状况是有益的。但是，通过羊水穿刺术获取用于RhD基因分型/表型的胎儿细胞会有经胎盘出血的风险，如果胎儿是RhD阳性的，这可能敏化母体抗RhD的产生。非侵入性产前RhD基因分型的发展为获取胎儿细胞进行RhD基因分型提供了一种安全的替代方法(Lo et al.，N Engl J Med 1998；339：1734-1738)。该技术涉及检测母体血浆中的胎儿RhD序列。RhD阴性孕妇血浆中RhD序列的存在将提示是RhD阳性胎儿。但是，母体血浆中这种序列的缺失可以有两种方式解释：1)胎儿是RhD阴性的；或者2)母体血浆中的胎儿DNA不足以进行准确的胎儿RhD分型。母体血浆DNA中作为阳性对照的通用胎儿DNA标记物可用于排除第二种可能性。母体血浆DNA中阳性对照胎儿DNA标记物的检测会支持RhD阴性胎儿的存在，而所述胎儿DNA标记物的缺失会提示母体血浆中的胎儿DNA不足。迄今为止，可用作阳性对照的现有胎儿DNA标记物包括Y染色体DNA和DNA多态性。这两种类型的标记物只适用于妊娠的亚群。Y染色体DNA只适用于怀有男性胎儿的妊娠。DNA多态性只适用于特定的基因型组合，其中某些基因型只在胎儿中存在，而在孕妇中不存在。关于这个方面，上面章节说明的甲基化RASSF1A序列可以用作通用的胎儿DNA标记物，其适用于全部妊娠，与胎儿的性别或者多态性无关。本领域技术人员还会认识到，除了所述甲基化的RASSF1A标记物外，本文描述的其他标记物也可以按照这种方式使用。

图15显示对胎儿进行非侵入性RhD分型策略的示意图。高甲基化的胎儿DNA标记物作为产前诊断RhD血型的阳性分析标记物决不是唯一的用途。本领域技术人员还能够理解，诸如RASSF1A的高甲基化的胎儿DNA标记物可以用作产前诊断其他病症的阳性分析标记物，所述病症例如β地中海贫血、囊性纤维化、先天性肾上腺增生和染色体非整倍性。也可以在诸如RhD血型的状态的产前实际评估之前或者同时，对该阳性分析标记物进行分析。

材料和方法

受试者招募和采样

从英国伦敦国王学院医院(King′s College Hospital London，UnitedKingdom)招募正在进行妊娠早期唐氏综合征(Down syndrome)筛查的受试者。本研究和人类临床样品的采集得到机构审查委员会的批准。并获得每位受试者的知情同意书。通过绒毛膜绒毛采样步骤采集绒毛膜绒毛组织。在即将进行产科手术前采集母体外周血样品。

样品处理和RHD序列的实时PCR检测

按照先前章节的描述从母体血浆、血沉棕黄层和CVS样品中提取DNA。按照先前的描述(Lo et al.，N Engl J Med 1998，339：1734-1738；Rijnders et al.，Obstet Gynecol 2004，103：157-164)，分别利用母体血沉棕黄层DNA和CVS DNA作为模板，通过实时扩增RHD基因外显子7和外显子10上的序列，确定母体和胎儿的RhD状况。在我们的群组中，对于所有被研究受试者的外显子7和外显子10分析均得到相同的结果。使用5μl血浆DNA作为模板，通过相同的实时PCR系统确定母体血浆中RHD序列的可检测性。全部实验都重复两次。两次中如果任何一次是阳性的，则样品被记为阳性。通过酶消化后从母体血浆DNA扩增SRY序列(对于男性胎儿)和RASSF1A序列确认母体血浆中胎儿DNA的存在。利用未经酶消化的血浆DNA作为模板，进行针对SRY基因的实时PCR。利用酶消化后的母体血浆DNA作为模板，进行RASSF1A和β肌动蛋白序列的实时PCRs。

结果

筛查了355例孕妇的RhD状态。其中54例是RHD阴性的。因为这组受试者有被RhD阳性胎儿异源免疫的风险，她们的血浆和CVS被用于胎儿RhD状态的进一步研究。在35例受试者的母体血浆DNA中检测到RHD序列，19例受试者的母体血浆中RHD序列是阴性的。在母体血浆RHD结果阴性的19例受试者中，其中有15例在酶消化后的血浆DNA中检测到RASSF1A序列。其余4例在酶消化后是RASSF1A阴性的。所有受试者中β肌动蛋白信号都是阴性的，表明在全部19例受试者中BstUI酶消化是完全的。根据CVS样品的分析，在酶消化后具有RASSF1A阳性检测结果的全部15例受试者均怀有RhD阴性胎儿。其血浆显示RHD和RASSF1A阴性检测结果的4例受试者中，其中2例CVS是RHD阳性的。因此，对于这2例受试者，母体血浆RHD基因分型产生假阴性结果，将其挑出，因为其不能检测酶消化后的阳性分析标记物RASSF1A。为了说明这种与性别无关的胎儿标记物的重要性，将这些结果与现有的胎儿DNA标记物SRY进行比较。只有当胎儿是男性时SRY分析才是阳性的。对于血浆显示RHD序列阴性检测结果的19例受试者，其中6例是SRY阳性的，提示被分析的母体血浆样品中存在可扩增的胎儿DNA，因此进一步证实了胎儿RhD阴性状态的真实性。在剩余的13例受试者中，如果不使用RASSF1A实验步骤作为胎儿DNA的阳性对照，就不能确定血浆DNA中RHD和SRY序列的阴性检测结果是由于女性RhD阴性胎儿还是由于母体血浆中胎儿DNA的不足造成的。

实施例6：RASSF1A作为与性别无关的监测先兆子痫的标记物的证实

高甲基化的胎儿DNA标记物的临床应用不只限于作为阳性分析标记物。酶消化后检测和/或定量RASSF1A本身可以用于产前诊断和妊娠监测。换言之，母体血浆中的这些高甲基化的胎儿DNA序列本身可用作生物标记物。先前，已经证明了在诸如先兆子痫和胎儿非整倍性的某些病症中，母体血浆的胎儿DNA浓度增加。但是，因为缺乏与性别无关的胎儿DNA标记物，先前的研究仅限于怀有男性胎儿的孕妇(Levine et al.，AmJ Obstet Gynecol 190：707-713；Leung et at，Clin Chem 47：147-139)。在本实施例中，针对酶消化后的RASSF1A序列，我们比较了来自5名患有先兆子痫的妇女以及5名孕龄匹配但没有任何妊娠相关并发症的孕妇的血浆中胎儿DNA的浓度。酶消化后两组母体血浆DNA样品测定的RASSF1A浓度显示于图16。患有和没有患先兆子痫的孕妇的中值浓度分别是9400拷贝/ml和2200拷贝/ml血浆。两组之间的差异在统计上是显著的(p＝0.016，曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test))。

为了所有目的，将本申请引用的全部专利、专利申请和其他公开出版物，包括公开的氨基酸或者多核苷酸序列，通过引用以其整体并入本文。

表1.分娩后RASSF1A和SRY序列从母体血浆的清除。在即将分娩前和分娩后24小时，采集怀有男性胎儿的5例孕妇的血液。在母体血浆DNA样品用甲基化敏感酶处理后，RASSF1A和SRY序列在所有受试者分娩前的血浆中均可以检测到，但在分娩后24小时的任何血浆样品中均没有被检测到。

表2.43例孕妇的母体血沉棕黄层DNA、胎盘DNA以及经过或者未经酶消化的母体血浆DNA的RASSF1A基因型。在全部43例中，经过酶消化的母体血浆DNA基因型与胎盘(胎儿)基因型相同，表明母体血浆DNA样品的酶消化后只有胎儿特异性的DNA分子是可扩增的。

Claims

1.检测来自孕妇的生物样品中胎儿DNA存在的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)差异修饰所述样品中的甲基化和非甲基化DNA的试剂；和

(b)检测所述样品中甲基化的RASSF1A的DNA序列的试剂，其中所述DNA序列的存在指示样品中胎儿DNA的存在，所述DNA序列的缺乏指示样品中胎儿DNA的缺乏。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述样品是全血。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述样品是血浆。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述样品是血清。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述样品是尿液。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述样品是唾液。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂(a)消化非甲基化的DNA但不消化甲基化的DNA。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述试剂(a)是甲基化敏感酶。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述甲基化敏感酶是甲基化敏感的限制性内切酶。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述甲基化敏感的限制性内切酶是Hpa II或者BstU I。

11.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂(a)包括亚硫酸氢盐。

12.如权利要求1所述的试剂盒，其中试剂(b)包括扩增试剂。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述扩增试剂是聚合酶链式反应(PCR)试剂。

14.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述PCR是实时PCR。

15.如权利要求1所述的试剂盒，其中试剂(b)用于测定DNA序列的数量。

16.如权利要求1所述的试剂盒，其中试剂(b)用于指示样品中胎儿DNA的存在，所述试剂盒还包括以下试剂：

(c)测定第二样品中第二胎儿DNA序列的数量的试剂，其中所述第二样品与用所述试剂(a)处理前的样品相同，并且所述第二胎儿DNA序列不是RASSF1A；和

(d)标准对照，其中第二胎儿DNA序列的数量相对于对照的增加指示妊娠相关病症的存在或者患妊娠相关病症风险的增加。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述的第二样品不经任何差异修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂的处理。

18.如权利要求16所述的试剂盒，其中将所述的第二样品在测定第二胎儿DNA序列的数量前用所述试剂(a)处理。

19.如权利要求16所述的试剂盒，其中将所述的第二样品在测定第二胎儿DNA序列的数量前用差异修饰甲基化和非甲基化DNA的不同于试剂(a)的第二种试剂处理。

20.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述妊娠相关病症是先兆子痫、早产或者宫内发育迟缓(IUGR)。

21.如权利要求1所述的试剂盒，其中试剂(b)用于指示样品中胎儿DNA的存在，所述试剂盒还包括以下试剂：

(c)检测第二样品中的第二胎儿DNA序列的试剂，其中所述第二样品与用所述试剂(a)处理前的样品相同，所述第二胎儿DNA序列是RhD血型的基因、ABO血型的基因、RhC血型的基因、RhE血型的基因、HLA型的基因、或者位于Y染色体的基因、或者包含预定突变的基因，其中所述第二胎儿DNA序列的存在指示胎儿基因组中所述RhD血型、所述ABO血型、所述RhC血型、所述RhE血型、所述HLA型、所述Y染色体或者所述突变的存在。

22.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述第二样品不经任何差异修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂的处理。

23.如权利要求21所述的试剂盒，其中试剂(c)包括扩增试剂。

24.如权利要求23所述的试剂盒，其中所述扩增试剂是聚合酶链式反应(PCR)试剂。

25.如权利要求24所述的试剂盒，其中所述PCR是实时PCR。

26.检测孕妇中妊娠相关病症的试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：

(a)差异修饰从所述孕妇获得的生物样品中甲基化和非甲基化DNA的试剂；

(b)检测样品中甲基化的RASSF1A的DNA序列的数量的试剂；和

(c)标准对照，其中样品中甲基化的RASSF1A的DNA序列的数量相对于对照的增加指示妊娠相关病症的存在或者患妊娠相关病症风险的增加。

27.如权利要求26所述的试剂盒，其中所述试剂(a)消化非甲基化的DNA但不消化甲基化的DNA。

28.如权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂(a)是甲基化敏感酶。

29.如权利要求28所述的试剂盒，其中所述甲基化敏感酶是甲基化敏感的限制性内切酶。

30.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述甲基化敏感的限制性内切酶是Hpa II或者BstU I。

31.如权利要求26所述的试剂盒，其中所述试剂(a)包括亚硫酸氢盐。

32.如权利要求26所述的试剂盒，其中试剂(b)包括扩增试剂。

33.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述扩增试剂是聚合酶链式反应(PCR)试剂。

34.如权利要求33所述的试剂盒，其中所述PCR是实时PCR。

35.如权利要求26所述的试剂盒，其中所述妊娠相关病症是先兆子痫、早产或者宫内发育迟缓(IUGR)。