MX2008013897A - Nuevos marcadores de metilacion fetales. - Google Patents

Abstract

La presente solicitud describe el descubrimiento que, en una mujer embarazada, ciertos genes (tales como RASSF1A, APC, CASPB, RARB, SCGB3A1, DAB21P, PTPN6, THY1, TMEFF2 y PYCARD) originados de un feto están altamente metilados, mientras que los mismos genes de origen maternal están sin metilar. Este descubrimiento permite la detección fácil de uno o más de estos genes fetales metilados en una muestra biológica de una mujer embarazada, sirviendo como indicador universal de la presencia de ADN fetal en la muestra. Estos marcadores de metilación fetal son particularmente útiles como testigos positivos para un proceso analítico no invasivo durante el cual la calidad y cantidad de ADN fetal son monitoreadas. Estos marcadores fetales recién identificados pueden también ser medidos directamente para diagnosis de ciertas condiciones. relacionadas con el embarazo.

Description

NUEVOS MARCADORES DE METILACION FETALES Antecedentes de la Invención La detección prematura de condiciones relacionadas con el embarazo, en las que se incluyen complicaciones potenciales durante el embarazo o parto y defectos genéticos del feto es de crucial importancia, ya que permite la intervención médica prematura necesaria para la seguridad tanto de la madre como el feto. La diagnosis prenatal se ha llevado a cabo sistemáticamente utilizando células aisladas del feto por medio de procedimientos tales como toma de muestra de vilus coriónico (CVS) o amniocentesis . Estos métodos convencionales son sin embargo invasivos y presentan un riesgo apreciable tanto a la madre como al feto a pesar del manejo más cuidadoso (Tabor et al., Lancet 1: 1287-1293, 1986) . Alternativas a estos procedimientos invasivos han sido desarrolladas para la selección prenatal, por ejemplo, para detectar anormalidades fetales, siguiendo los descubrimientos de que varios tipos de células fetales pueden ser encontradas en la circulación materna (Johansen et al., Prenat. Diagn . 15. 921-931, 1995) y más importantemente, el ADN fetal libre de células circulantes puede ser detectado en el plasma y suero materno (Lo et al., Lancet 350: 485-487, 1997) . La cantidad de ADN fetal en la sangre materna ha mostrado ser suficiente para el análisis genético y tratamiento complejo del plasma o suero, en contraste con métodos alternativos que requieren etapas para aislar y enriquecer células fetales. El genotipo de rhesus D (RhD) (Lo et al., N. Engl. J. Med.339: 1734-1738, 1997), determinación de sexo fetal (Costa et al., N. Engl. J. Med.346: 1502, 2002) y diagnosis de varias alteraciones fetales (Amicucci et al., Clin. Chem . 46: 301-302, 2000; Saito et al., Lancet 356: 1170, 2000 y Chiu et al., Lancet 360: 998-1000, 2002) se han obtenido desde entonces al detectar el ADN fetal en el plasma o suero materno utilizando una técnica basada en reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Además, anormalidades cualitativas de ADN fetal en el plasma/suero materno han sido reportados en preeclampsia (Lo et al., Clin. Chem. 45: 184-188, 1999 y Zhong et al., Am . J. Obstet. Gynecol. 184: 414-419, 2001), trisomía 21 fetal (Lo et al., Clin. Chem. 45: 1747-17511, 1999 y Zhong et al., Prenat . Diagn. 20: 795-798, 2000) e hiperemesis gravidarum (Sekizawa et al., Clin. Chem. 47: 2164-2165, 2001). La detección de ácido nucleico fetal en la sangre materna para análisis genético prenatal descrita en la Patente Estadounidense No. 6,258,540. Debido a que el ADN fetal coexiste con el ADN materno en la porción acelular de la sangre de la mujer embarazada, por ejemplo, suero o plasma, hay necesidad de distinguir el ADN de origen fetal y origen materno para asegurar resultados exactos en la diagnosis basada en ADN fetal. Fue revelado por primera vez en la Solicitud de Patente Estadounidense No. 09/944,951, publicada como 20030044388, que el ADN fetal y materno puede ser distinguido por sus diferentes perfiles de metilación. Landes et al., en la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 20030211522 también propuso marcadores de metilación diferenciales que pueden ser usados para diagnosis prenatal. Por otra parte, para asegurar la eficacia de los métodos de prueba a base de ADN fetal y para eliminar la interpretación errónea de resultados de prueba debido a la recuperación insuficiente de ADN fetal obtenido de tales métodos, también existe la necesidad de determinar la presencia y cantidad de ADN fetal en una muestra usada para el procedimiento de prueba. Es por consiguiente deseable identificar el marcador de ADN fetal que pueda servir efectivamente como indicador universal de la presencia o ausencia de ADN. fetal en general en una muestra de prueba. Es importante que tal marcador de ADN fetal sea consistente y uniformemente distinto de su contraparte materna y que la presencia o ausencia del marcador pueda ser fácilmente determinada en el punto del ADN materno y correlacionado directamente con la presencia o ausencia de ADN fetal en general. La presente invención trata estas y otras necesidades relacionadas . En esta solicitud, un número de genes humanos han sido identificados por primera vez como aquellos que tienen patrones de metilación altamente distintos en tejidos fetales (por ejemplo, derivados de placenta) y en tejidos maternos.

Originados de un feto, estos genes son metilados a un alto nivel de uniformidad, mientras que los genes de una fuente materna que liberan cantidades significativas de ADN libre de células a la sangre materna están sin metilar a un nivel similarmente alto de uniformidad. Estos elementos permiten que los genes sirvan efectivamente como testigos o controles positivos internos de una muestra de prueba usada en un proceso de diagnóstico prenatal, por el propósito de asegurar que una cantidad suficiente de ADN fetal ha sido recuperada en la muestra durante el proceso. Debido al alto nivel de uniformidad en los estados de metilación de estos genes con respecto a su origen, estos genes son controles o testigos particularmente confiables, indicadores tanto de la calidad como cantidad del ADB fetal. Otra ventaja de estos genes como marcadores fetales es la facilidad general relativa para detectar solamente la versión fetal metilada en contraste con sus contrapartes maternas sin metilar. Además, los genes fetales descritos en esta solicitud pueden también ser usados directamente como marcadores de diagnóstico para ciertas condiciones o alteraciones relacionadas con el embarazo.

Breve descripción de la Invención En el primer aspecto de esta invención, se proporciona un método para detectar ADN fetal en una muestra biológica de una mujer embarazada. Este método comprende las siguientes etapas: (a) tratar las muestras con un agente que modifica diferencialmente el ADN metilado del ADN sin metilar y (b) detectar la secuencia de ADN de RASSF1A, APC, RARB , SCGB3A1, DAB21P, PTPN6, THY1 , TMEFF2 (GenBank No. de acceso NM_016192) o PYCARD (GenBank No. de acceso NM_013258) en la muestra. La presencia de la secuencia de ADN indica la presencia de ADN fetal en la muestra, mediante la ausencia de la secuencia de ADN que indica la ausencia de ADN fetal en la muestra. En algunas modalidades, la muestra de una mujer embarazada es sangre entera. En una alternativa, la muestra puede ser plasma, suero, orina o saliva. En algunas modalidades, el agente capaz de modificar diferencialmente ADN metilado y ADN sin metilar somete a digestión el ADN sin metilar pero no el ADN metilado. Este agente puede ser una enzima sensible a la metilación, particularmente una enzima de restricción sensible a la metilación, tal como Upa II o BstU I. En otras modalidades, el agente puede contener bisulfito. En algunas modalidades, la etapa (b) del método comprende un proceso de amplificación. En una modalidad ejemplar, el proceso de amplificación es una reacción en cadena de polimerasa (PCR), tal como PCR en tiempo real. En otras modalidades, la etapa (b) determina la cantidad de la secuencia de ADN. En algunas modalidades, cuando la etapa (b) indica la presencia de ADN fetal en la muestra, el método puede incluir además las etapas de: (c) determinar la cantidad de una segunda secuencia de ADN fetal en una segunda muestra. La segunda muestra es idéntica a la muestra en la etapa (a) antes de ser tratada con el agente que modifica diferencialmente el ADN metilado y el ADN sin metilar y la segunda secuencia no es RASSF1A, APC, RARB , SCGB3A1 , DAB21P, PTPN6, THY1, TMEFF2 o PYCARD y (b) comparar la cantidad de la segunda secuencia con un control o testigo estándar. Cuando se detecta un incremento en la cantidad de la segunda secuencia del testigo o control,-es interpretado como un indicador ya sea de la presencia de una condición asociada con embarazo o un riesgo incrementado de desarrollar tal condición. En algunos casos, la segunda muestra en la etapa (c) no es tratada con algún agente que modifica diferencialmente el ADN metilado y el ADN sin metilar, mientras que en otros casos, la segunda muestra en la etapa (c) es tratada con el agente antes de que la cantidad de la segunda secuencia de ADN fetal sea determinada. Por ejemplo, la segunda muestra en la etapa (c) es tratada con un segundo agente diferente que modifica diferencialmente el ADN metilado y el ADN sin metilar, antes de que se determine la cantidad de la segunda secuencia de ADN fetal. Este método es apropiado para detectar la presencia de varias condiciones asociadas al embarazo o un riesgo incrementado por desarrollar uno durante el embarazo. Algunos ejemplos de tal incluyen preeclampsia , labor de pretérmino y retardo de crecimiento intrauterino (IUGR) . En otras modalidades, cuando la etapa (b) indica la presencia de ADN fetal en la muestra, el método puede comprender la etapa adicional de: (c) detectar una segunda secuencia de ADN fetal en una segunda muestra. La segunda muestra es idéntica a la muestra en la etapa (a) antes de ser tratada con el agente y la segunda secuencia es un gen del tipo de sangre de RhD, un gen de un tipo de sangre de ABO, un gen de un tipo de sangre de RhC, un gen de un tipo de sangre de RhE, un gen de un tipo de HLA o un gen ubicado en el cromosoma Y o un gen que contiene una mutación predeterminada, en donde la presencia de la segunda secuencia indica la presencia del tipo de sangre de RhD particular, el tipo de sangre ABO particular, el tipo de sangre de RhC particular, el tipo de sangre de RhE particular, el tipo de HLA particular, el cromosoma Y o la mutación predeterminada dentro del gen en el genoma fetal. En algunos casos, la segunda muestra en la etapa (c) no es tratada con algún agente que modifica diferencialmente el ADN metilado y el ADN sin metilar. Opcionalmente, la etapa (c) comprende un proceso de amplificación. En una modalidad ejemplar, el proceso de amplificación es una reacción en cadena de polimerasa (PCR), tal como PCR en tiempo real. En el segundo aspecto de esta invención, se proporciona un método para detectar una condición asociada con el embarazo en una mujer embarazada. Este método comprende las siguientes etapas: (a) tratar una muestra biológica obtenida de la mujer con un agente que modifica diferencialmente el ADN metilado y el ADN sin metilar; (b) detectar la cantidad de secuencias de ADN de RASSF1A, APC, RARB, SCGB3A1 , DAB21P, PTPN6, THY1 , TMEFF2 o PYCARD en la muestra y (c) comparar la cantidad de la secuencia de ADN con un control estándar, en donde un incremento del control indica la presencia de o un riesgo incrementado por desarrollar la condición asociada con embarazo. En algunas modalidades, el agente capaz de modificar diferencialmente el ADN metilado o el ADN sin metilar somete a digestión el ADN sin metilar pero no el ADN metilado. una posibilidad es que el agente sea una enzima sensible a la metilación, tal como una enzima de restricción sensible a la metilación (por ejemplo, Hpa II o BstU I) . Otra posibilidad es que el agente comprende bisulfito. En algunas modalidades, la etapa (b) del método comprende un proceso de amplificación, que puede ser efectuado mediante varios medios, en los que se incluyen reacción en cadena de polimerasa (PCR), tal como PCR en tiempo real. Este método es apropiado para la diagnosis, monitoreo o determinación de riesgos de un número de condiciones asociadas con el embarazo, en los que se incluyen preeclampsia , labor de pretérmino y retardo de crecimiento intrauterino (IUGR) .

Breve descripción de las Figuras Figura 1. Secuencia de cebador, sonda y calibrador estándar para secuencias de RASSF1A (SEQ ID NOS: 1-8), APC (SEQ ID NOS: 9 y 10) y RARB (SEQ ID NOS: 11-14) y condiciones de reacción de PCR. Figura 2A - 2B . Estatus de metilación de isla de RASSF1A CpG en (a) primer y (b) tercer trimestres de tejidos placentaies y células de sangre materna correspondientes. Los sitios de CpG analizados son numerados serialmente y nombrados de acuerdo con RASSFI (Homo sapiens) GenBank Acceso NM_007182 con el codón de inicio de esta secuencia de codificación de proteina como posición +1 (en paréntesis). El primer sitio de CpG (-113) corresponde a chr3 : 50353354 (hebra inversa) del genoma humano en el UCSC Genome Browser (conjunto de mayo de 2004, hgl7). Los circuios llenos y circuios no llenos representan sitios de CpG metilados y sin metilar, respectivamente . Figura 3. Estado de metilación de islas CpG de APC y RARB en los tejidos placentaies del primer y tercer trimestres y células de sangre materna correspondientes. Para APC, los sitios de CpG analizados son nombrados de acuerdo con GenBank Acceso NM_000038 con el codón de inicio de su secuencia de codificación de proteina como posición +1. El primer sitio de CpG (-17371) corresponde a chr5 : 112101115 del genoma humano en el UCSC Genome Browser (conjunto de mayo de 2004, hgl7) . Para RARB, los sitios de CpG analizados fue nombrado de acuerdo con GenBank Acceso NM_016152 en el codón de inicio de su secuencia de codificación de proteina como posición +1. El primer sitio de CpG (-73231) corresponde a chr3 : 25444475 (hebra delantera) del genoma humano en el USCS Genome Browser (conjunto de mayo de 2004 , hgl7) . Los circuios llenos y no llenos representan sitios de CpG metilados y sin metilar respectivamente. Figura 4. Secuencia de cebador, sonda y de calibrado estándar para CASP8 (SEQ ID NOS: 15-18) y condiciones de reacción de PCR. Figura 5. Estado de metilación de las islas de CpG CASP8 en tejidos placentales del primer y tercer trimestres y células de sangre materna correspondientes. Los sitios de CpG analizados fueron nombrados de acuerdo con CASP8 (Homo sapiens) GenBank Acceso NM_033355 con el codón de inicio de su secuencia de codificación de proteina como posición +1. El primer sitio de CpG (-8167) corresponde a chr2 : 201948550 del genoma humano en el UCSC Genome Browser (conjunto de mayo de 2004, hgl7). Los circuios llenos y los circuios sin llenar representan sitios de CpG metilados y sin metilar, respectivamente. Figura 6. Secuencias de cebador, sonda y calibrador estándar para SCGB3A1 (SEQ ID NOS: 19-22) y condiciones de reacción de PCR. Figura 7. Estado de metilación de islas las de CPG SCGB3A1 en tejidos plácenteles en el tercer trimestre y células de sangre materna correspondientes. Los sitios de CpG analizados fueron nombrados de acuerdo con SCGB3A1 (Homo sapiens) GenBank Acceso NM_052863 con el codón de inicio de la secuencia de codificación de proteina como posición +1. El primer sitio CpG (-390) corresponde a chr5 : 179951435 del genoma humano en el UCSC Genome Browser (conjunto de mayo de 2004 , hgl7). Figura 8. Amplificación selectiva de la secuencia de ADN metilada. Los circuios conectados a la secuencia genética significan sitios de escisión de la enzima de restricción sensible a la metilación. Los circuios abiertos rellenos representan secuencias sin metilar y secuencias metiladas, respectivamente, en estos sitios de escisión de enzimas de restricción sensibles a la metilación. La digestión de enzimas de restricción sensibles a la metilación escinden la secuencia de ADN sin metilar en los sitios de restricción de enzima. Como resultado, solamente la secuencia de ADN metilada sin escindir podría ser detectada en la etapa de amplificación de PCR en tiempo real. Figura 9A - 9C Gráficas de amplificación de PCR en tiempo real para RASSF1A en muestras de ADN de rendimiento de pH regulado placental y materno. Después de la digestión de la enzima de restricción sensible a la metilación, la secuencia de RASSF1A en las muestras de ADN placental, pero no fue detectada en la muestra de ADN de cubierta amarilla materna. (b) La amplificación PCR en tiempo real para secuencias de ß-actina en muestras de ADN de cubierta amarilla placental y maternal. Después de la digestión de enzima, no se detectó ß-actina en el ADN de cubierta amarilla placental o materna. (c) Estado de metilación de islas de CpG ß-actina en tejidos placentales del tercer trimestre y células de sangre materna correspondientes. Los sitios CpG analizados son nombrados de acuerdo con el gen beta-actina citoplásmico humano GenBank Acceso M10277 con el codón de inicio de su secuencia de codificación de proteina en posición +1. El primer sitio CpG (-970) corresponde a chr7: 5336879 del genoma humano en el UCSC Genoma Crowser (conjunto de mayo de 2004, hgl7). Figura 10A - 10B Diagrama esquemático que muestra el principio de la amplificación selectiva de la secuencia RASSFIA derivada fetal en el ADN de plasma materno. Los circuios conectados a la secuencia génica significa sitios de escisión de los enzimas de restricción sensibles a la metilación. Los circuios abiertos y rellenos representan las secuencias metiladas y sin metilar, respectivamente, en los sitios de escisión de enzima de restricción sensibles a la metilación. La digestión de enzimas de restricción sensibles a la metilación somete a digestión el ADN sin metilar en los sitios de la enzima de restricción. Como resultado, las secuencias derivadas maternas RASSFIA (Rsf) y ß-actina , así como la secuencia derivada fetal de ß-actina pueden ser sometidas a digestión, permite la detección de secuencias fetales derivadas de RASSFIA. Las flechas abiertas y rellenas representan los cebadores PCR objetivo a los genes RASSFIA y ß-actina , respectivamente. Por consiguiente, solamente la secuencia derivada fetal RASSFIA puede ser detectada en el sistema PCR en tiempo real, (b) Diagrama esquemático que ilustra la detección de la digestión incompleta de enzima mediante el control interno del sistema de ß-actina. Cuando la digestión del enzima sensible a la metilación está incompleto, algunas secuencias maternas derivadas de RASSFIA y ß-actina , así como las secuencias fetales derivadas de ß-actina, pueden permanecer en la muestra de ADN . En este caso, la señal de RASSFIA que puede originarse tanto de secuencias derivadas maternas como de secuencias fetales maternas debido a la digestión incompleta, no son específicas para el ADN fetal. Este sistema de control interno está diseñado para minimizar la detección de falsos positivos debido a la digestión enzimática incompleta. Figura 11A -11B Gráficas de amplificación en tiempo real para RASSFIA y ß-actina para muestras de ADN en el plasma de una mujer en el tercer trimestre de embarazo (a) y una mujer en el primer trimestre de embarazo (b) . Después de la digestión enzimática, una secuencia de RASSFIA seguía siendo detectable en plasma maternal para ambas mujeres. El levantamiento hacia la derecha de la curva de amplificación es debido a la reducción en la cantidad de la secuencia de RASSFIA después de la digestión de las secuencias de RASSFIA maternal-derivadas por la enzima de restricción sensible a la metilación. En contraste, las secuencias de ß-actina fueron digeridas por la enzima y asi no fueron detectables. Las muestras de ADN en el plasma libres de células de 71 sujetas embarazadas fueron analizadas. Veintiocho de ellas estuvieron en el primer trimestre de su embarazo y 43 de ellas estuvieron en el tercer trimestre. Las secuencias de RASSFIA fueron detectables en TODAS las muestras de ADN en el plasma después de la detección de enzima sensible a la metilación. Figura 12. Gráficas de amplificación en tiempo real para RASSFIA y ß-actina para el ADN de plasma maternal de una mujer no embarazada. Después de la digestión enzimática, ninguna secuencia de RASSFIA o ß-actina fue detectada en la muestra de ADN en el plasma. En las 25 mujeres no embarazadas reclutadas para este estudio, ninguna mostró señal de RASSFIA en el plasma después de la digestión de enzima de restricción sensible a metilación. Figura 13. En este caso, los genotipos de RASSFIA de la madre (ADN de cubierta amarilla maternal) y el feto (ADN placental) fueron AC y CC, respectivamente. Sin la digestión de enzima, el genotipo RASSFIA del plasma materno es idéntico a aquel de la madre que fue AC . Después de la digestión de enzima, el genotipo de RASSF1A del plasma materno cambió a CC que fue idéntico al genotipo placental (fetal) . Figura 14. Correlaciones de las concentraciones de secuencia de SRY contra secuencia de RASSF1A en el plasma materno con o sin digestión de enzima para 24 mujeres embarazadas en el tercer trimestre. Todos los sujetos están portando un feto varón. Hubo una correlación positiva entre las concentraciones de SRY y RASSF1A en el plasma materno con digestión de enzima (r = 0.717, p < 0.0001, correlación de Spearman) . Sin embargo, no hay ninguna correlación entre las concentraciones de SRY y RASSF1A total medido sin digestión de enzima (r = 0.228, p = 0.280, Spearman) . Figura 15. Diagrama esquemático que muestra la estrategia de prueba de rhesus D fetal no invasiva en mujeres embarazadas . Figura 16. La concentración de secuencia RASSF1A después de digestión enzimática en plasma materno fue elevada en embarazos preeclámpsicos . Figura 17. Secuencias de cebador para la secuenciación de bisulfito de DAB21P (SEQ ID NOS: 23-26) y condiciones de reacción de PCR. Figura 18. Estado de metilación de las islas de CpG DAB21P en una muestra de tejido placental del tercer trimestre y células de sangre materna correspondientes. Los sitios de CpG analizados son nombrados de acuerdo al DAB21P (Homo sapiens) GenBank Acceso NM_032552 con el codón de inicio de su secuencia de codificación de proteina como posición +1. El primer sitio CpG (-59572) corresponde a chr9.1215 1221 del genoma humano en el UCSC Genome Browser (conjunto de mayo de 2004, hgl7) . Los circuios rellenos y no llenos representan sitios de CpG metilados y sin metilar, respectivamente.

Definiciones El término "alteración asociada con embarazo", como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier condición o enfermedad que puede afectar a una mujer embarazada, el feto que la mujer está portando o tanto a la mujer o como el feto. Tal condición o enfermedad puede manifestar sus síntomas durante un período de tiempo limitado, por ejemplo, durante el embarazo o parto o puede durar toda la extensión de vida del feto seguida de su nacimiento. Algunos ejemplos de la alteración asociada con embarazo incluye preeclampsia , labor pretérmino y retardo de crecimiento intrauterino (IUGR) . En esta solicitud, el término "ácido nucleico" o "polionucleótido" se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y polímeros de los mismos ya sea en forma de una sola hebra o en forma de doble hebra. A no ser que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de enlace similares como el ácido nucleico de referencia y son metaboli zados de manera similar a los nucleótidos que se presentan de manera estable en la naturaleza. A no ser que se indique de otra manera, una secuencia de ácidos nucleicos en particular también abarca implícitamente variantes modificadas conservadoras de las mismas (por ejemplo, sustituciones de codón degeneradas), alelos, ortólogos, mutaciones en las que se incluyen mutaciones puntuales, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y secuencias complementarias también como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, sustituciones de codón degeneradas pueden ser obtenidas al generar secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones (o todos los codones) seleccionados están sustituidas con residuos de base mezclada y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol . Chem . 260: 2605-2608 (1985) y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). El término ácido nucleico es usado intercambiablemente con gen, cADN y mARN codificados por un gen. El término "gen" significa el segmento de ADN involucrado en producid una cadena de polipéptido; incluye regiones precedentes y siguientes a la región de codificación (líder y posterior) involucradas en la transcripción/traducción del producto genético y la regulación de la transcripción/traducción, también como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos de codificación individuales ( exones ) . En esta solicitud, los términos "polipéptido" , "péptido" y "proteína" son usados intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza correspondiente, también como a polímeros de aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza y polímeros de aminoácidos que no se presentan de manera estable en la naturaleza. Como se usa en la presente, el término abarca cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, en las que se incluyen cadenas de plena longitud (esto es, antígenos) , en donde los residuos de aminoácidos están enlazados por enlaces de péptidos covalentes. El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza y aminoácidos sintéticos, también como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza. Los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que son modificados más tarde, por ejemplo, hidroxiprolina , ?-carboxiglutamato y O-fosfoserina .

Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente ya sea por símbolos de tres letras conocidos comúnmente o por símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Asimismo, se puede hacer referencia a los nucleótidos con sus códigos de una sola letra aceptados comúnmente. El término "bisulfito" · como se usa en la presente abarca todos los tipos de bisulfitos, tales como bisulfito de sodio, que son capaces de convertir químicamente una citosina (C) a un uracilo (U) sin modificar químicamente una citosina metilada y por consiguiente puede ser usado para modificar diferencialmente una secuencia de ADN en base al estatus de metilación del ADN. Como se usa en la presente, un reactivo que "modifica diferencialmente" ADN metilado o ADN sin metilar abarca cualquier reactivo que modifica el ADN metilado y/o ADN sin metilar en un proceso por medio del cual productos distinguibles resultan del ADN metilado y del ADN sin metilar permitiendo mediante esto la identificación del estatus de metilación del ADN. Tales procesos pueden incluir, pero no están limitados a, reacciones químicas (tales como una conversión de C ? U mediante bisulfito) y tratamiento enzimático (tal como escisión mediante una endonucleasa metilación-dependiente) . Así, una enzima que escinde preferiblemente o somete a digestión ADN metilado es una capaz de escindir o someter a digestión moléculas de ADN a una eficiencia mucho más alta cuando el ADN está metilado, mientras que una enzima que escinde preferiblemente o somete a digestión el ADN sin metilar exhibe una eficiencia significativamente más alta cuando el ADN no está metilado. En esta solicitud, la palabra "presencia" o "ausencia" es usada en un sentido relativo para describir el nivel de una secuencia de ADN particular. En otras palabras, cuando se dice que una secuencia de ADN dada o un gen está "presente" en la muestra de prueba, significa que el nivel de esta secuencia de ADN o gen está por encima de un umbral predeterminado; mientras que, cuando una secuencia de ADN o gen está "ausente" cuando su nivel en una muestra de prueba está por debajo de tal umbral. Como se usa en esta solicitud, un "incremento" o "disminución" se refiere a un cambio positivo o negativo detectable en cantidad de un control estándar establecido. Un incremento es un cambio positivo preferiblemente por lo menos 10%, más preferiblemente 50%, todavía más preferiblemente dos veces, aún más preferiblemente por lo menos cinco veces y más preferiblemente por lo menos diez veces el valor de control. Similarmente , una disminución es un cambio negativo preferiblemente por lo menos 10%, más preferiblemente 50%, todavía más preferiblemente por lo menos 805 y más preferiblemente por lo menos 90% del control. Otros términos 1 que indican cambios cuantitativos o diferencias desde una base comparativa, tales como "más" o "menos" son usados en esta solicitud de la misma manera como se describe anteriormente. Un "método de hibridización de polinucleótido" como se usa en la presente se refiere a un método para detectar la presencia y/o cantidad de un polinucleótido basado en su habilidad para formar un apareamiento de bases de Wat son-Crick, bajo condiciones de hibridización apropiadas, con una sonda de polinucleótido de una secuencia conocida. Ejemplos de tales métodos de hibridización incluyen Southern blotting y Northern blotting . "Cebadores" como se usa en la presente se refieren a oligonucleot idos que pueden ser usados en un método de amplificación, tal como una reacción en cadena de polimerasa (PCR), para amplificar una secuencia de nucleótidos en base a la secuencia de polinucleótidos correspondiente a un gen de interés, por ejemplo, RASSF1A, APC, CASP8 , RARB, SCGB3A1 , DAB21P, PTPN6, THY1 , TMEFF2 o PYCARD, ya sea metilado o sin metilar. Por lo menos uno de los cebadores de PCR para amplificación de una secuencia de polinucleótidos es especifico de secuencias para la secuencia. "Valor de control estándar" como se usa en la presente se refiere a una cantidad predeterminada de una secuencia genómica que es originada de un feto y está presente en una muestra establecida. El valor de control estándar es apropiado para el uso de un método de la presente invención, con el fin de comparar ka cantidad de un gen de interés (o una secuencia sin codificación) que está presente en una muestra de prueba. Una muestra establecida que sirve como control estándar proporciona una cantidad promedio de un gen fetal de interés que es típico para un tiempo definido (por ejemplo, primer trimestre) durante el embarazo en la sangre de una mujer embarazada saludable promedio que porta un feto normal, tanto de quien no está en riesgo de desarrollar alguna alteración o complicación asociada con el embarazo. Un valor de control estándar puede variar dependiendo de la secuencia genómica de interés y la naturaleza de la muestra. El término "promedio", como es usado en el contexto de describir una mujer embarazada, se refiere al hecho de que la mujer está libre de por lo menos una condición de relevancia, tal como una condición asociada con el embarazo, (por ejemplo, preeclampsia o labor de pretérmino) . El término "promedio" cuando es usado en otro contexto, se refiere a ciertas características, tales como la cantidad o estatus de metilación de un gen particular de origen maternos o fetales encontrados en la sangre de la mujer, que son representativas de un grupo seleccionado aleatoriamente de mujeres saludables que están embarazadas con un feto cromosomalmente normales y no susceptible a cualesquier enfermedades o condiciones relacionadas con el embarazo. Este grupo seleccionado debe comprender un número suficiente de mujeres, de tal manera que la cantidad promedio o perfil de metilacion del gen de interés entre estas mujeres refleje, con exactitud razonable, el perfil correspondiente en la población general de mujeres embarazadas saludables con fetos saludables. Además, el grupo seleccionado de mujeres tienen en general una edad de gestación similar a aquella de una mujer cuya sangre es probada para indicación de una alteración asociada con el embarazo potencial. La edad gestacional preferida para llevar a la práctica la presente invención puede variar dependiendo de la alteración que es seleccionada. Por ejemplo, una mujer embarazada es seleccionada por el riesgo de preeclampsia preferiblemente durante el segundo trimestre del embarazo, mientras que aneuploidia cromosómica fetal es preferiblemente seleccionada por y diagnosticado tan tempranamente como sea posible. Más aún, la edad gestacional preferida para prueba puede también depender del gen de interés en las pruebas. El termino "preeclampsia" como se usa en la presente se refiere a una condición que ocurre durante el embarazo, el síntoma principal del cual son varias formas de alta presión sanguínea frecuentemente acompañadas por la presencia de proteínas en la orina y edema (hinchamiento) . La preeclampsia, algunas veces llamada toxemia del embarazo, está relacionada con una alteración más sería llamada "eclampsia", que es la preeclampsia junto con ataques. Estas condiciones se desarrollan usualmente durante la segunda mitad del embarazo (después de 20 semanas) , aunque se pueden desarrollar brevemente después del nacimiento o antes de las 20 semanas de embarazo . El término "labor de pretérmino" o "labor prematura" como se usa en la presente se refiere a la condición en donde la labor que comienza más de tres semanas antes del periodo total de gestación de aproximadamente 40 semanas, que frecuentemente conduce al nacimiento prematuro no es tratado. El término "retardo de crecimiento intrauterino (IUGR)" se refiere a una condición en la cual el crecimiento del feto es anormalmente lento, su peso es menor del décimo percentil para la edad gestacional . Cuando nace, el infante aparece demasiado pequeño y desnutrido para su edad. IUGR también se refiere como restricción de crecimiento intrauterino, está asociado con el riesgo incrementado de enfermedad médica y muerte en el neonato. Como se usa en esta solicitud, "un gen de un tipo de sangre RhD, un gen de un tipo de sangre de ABO, un gen de un tipo de sangre RhC, un gen de un tipo de sangre RhE, de un tipo de HLA o del cromosoma Y" se refiere a un gen que es reconocido como representativo de un tipo de sangre particular de acuerdo con la tipificación de sangre de RhD, ABO, RhC o RhE o un tipo de HLA particular o un gen que está ubicado en el cromosoma Y. La detección de tal gen en el ADN fetal es indicador del feto que es de un tipo de sangre particular, tipo de HLA o del género masculino.

Descripción detallada de la Invención I. Introducción La presencia de ADN fetal en el plasma materno fue reportada por primera vez en 1997, ofreciendo la posibilidad para la diagnosis prenatal no invasiva simplemente por medio del análisis de una muestra de sangre materna (Lo et al., Lancet 350: 485-487, 1997) . La coexistencia de ADN fetal con ADN materno de fondo en el plasma materno, sin embargo, demanda medios confiables para distinguir el ADN de orígenes fetales y maternos, varios genes han sido indicados previamente como metilados diferencialmente entre sus versiones fetales y maternos, véase por ejemplo, Chim et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 102: 14753-14758, 2005. Los presentes inventores descubrieron por primera vez que un número de genes (por ejemplo, RASSF1A, APC, RARB, SCGB3A1, DAB21P, PTPN6, THY1 , TMEFF2 y PYCARD) derivados de un feto están altamente metilados, mientras que los mismos genes derivados de la mujer embarazada con el feto no están metilados. Aunque otros genes han sido reportados previamente al tener distintos perfiles de metilación cuando la versión fetal de los genes y las versión materna son comparados, el descubrimiento de los presentes inventores es único en que no 2 solamente fue tal distinción de estatus de metilación previamente desconocido con respecto a estos genes particulares, el alto nivel de uniformidad en la metilación de los genes fetales y la carencia de metilación de los genes maternos fue tampoco previamente observado. Este descubrimiento proporciona asi un nuevo procedimiento más exacto y más objetivo para distinguir el ADN genómico fetal y materno. En particular, la detección de cualquiera de los genes fetales identificados en la presente en una muestra durante un proceso analítico para diagnosis prenatal no invasiva permite la confirmación que el proceso, en los que se incluyen recolección y manipulación de muestra, está operando exitosamente tal como se designó en el ADN en general (no limitado a los genes nombrados en la presente) en la muestra está apropiadamente conservada tanto en calidad como en cantidad. Además, estos genes recién identificados pueden también ser usados directamente como marcadores de ADN que están para indicar la presencia de o un riesgo aumentado por ciertas condiciones y complicaciones relacionadas con el embarazo, por lo que estos genes están metilados uniformemente en comparación con sus contrapartes maternas, permitiendo la fácil distinción entre la copia materna y la copia fetal de los genes.

II . Metodología General La práctica de esta invención utiliza las técnicas de rutina en el campo de la biología molecular. Textos básicos que revelan los métodos generales para el uso en esta invención incluyen Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a edición, 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990) y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., editores, 1994)). Para ácidos nucleicos, los tamaños son dados ya sea en kilobases (kb) o pares de bases (bp) . Estos son valores estimativos derivados de electroforesis de gel de agarosa o acrilamida, a partir de ácidos nucleicos secuenciados o de secuencias de ADN publicadas. Para proteínas, los tamaños son dados en kilodaltons (kDa) o números de residuos de aminoácidos. Los tamaños de proteínas son estimados a partir de electroforesis de gel, de proteínas secuenciadas , de secuencias de aminoácidos derivadas o de secuencias de proteínas publicadas . Los oligonucleótidos que no están disponibles comercialmente pueden ser sintetizados químicamente, por ejemplo, de acuerdo con el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981), utilizando un sintetizador automático, como se describe en Van Devanter et al., Nucleic Acid Res.il: 6159-6168 (1984). La purificación de oligonucleótidos se lleva a cabo utilizando cualquier estrategia reconocida en el arte, por ejemplo, electroforesis de gel de acrilamida natural o cromatografía líquida de alto desempeño de intercambio aniónico (HPLC) como se describe en Pearson y Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983) . Cualquiera de los genes identificados en la presente invención, RASSF1A, APC, RARB , SCGB3A1 , DAB21P, PTPN6, THY1 , TMEFF2 y PYCARD y la secuencia de polinucleót idos de oligonucleót idos sintéticos pueden ser verificados utilizando por ejemplo, el método de terminación de cadena para secuenciación de plantillas de doble hebra de allace et al., Gene 16: 21-26 (1981) .

III . Adquisición de muestras de sangre y extracción de ADN La presente invención es concerniente con la determinación de la presencia y/o cantidad de ciertos genes fetales encontrados en sangre materna en base a su distinto estatus de metilación para detectar la presencia y/o cantidad de ADN fetal general, que puede ser usado, por ejemplo, como control interno para el indicar la operación apropiada de un proceso analítico no invasivo que utiliza ADN fetal para determinar la presencia o riesgo de una condición o alteración asociada con el embarazo. Así, las primeras etapas para llevar a la práctica esta invención son obtener una muestra biológica de una mujer embarazada en donde se espera que el ADN fetal esté presente y tratar el ADN con un agente que modifica sustancialmente el ADN n base al estado de metilación. Un ejemplo de tal agente es uno que somete a digestión el ADN sin metilar pero no el ADN metilado. Opcionalmente , el ADN es extraído primero de las muestras.

A . Adquisición de muestras de sangre Una muestra de sangre es obtenida de una mujer embarazada en una edad gestacional apropiada para prueba utilizando un método de diagnóstico no invasivo a base de ADN fetal. La edad gestacional apropiada puede variar dependiendo de la alteración probada. La recolección de sangre de una mujer se efectúa de acuerdo con el protocolo estándar de hospitales o clínicas que se sigue en general, una cantidad apropiada de sangre periférica, por ejemplo, comúnmente entre 5-50 mi, es recolectada y puede ser almacenada de acuerdo con el procedimiento estándar antes de la preparación adicional.

B . Preparación de muestras de sangre El análisis de ADN fetal encontrado en sangre materna de acuerdo con la presente invención puede ser efectuado utilizando por ejemplo, la sangre entera, suero o plasma. Los métodos para preparar el suero o plasma a partir de sangre materna son bien conocidos por aquellos de habilidad en el arte. Por ejemplo, la sangre de una mujer embarazada puede ser colocada en un tubo que contiene EDTA o un producto comercial especializado tal como Vacutainer SST (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) para impedir la coagulación de sangre y el plasma puede luego ser obtenido de la sangre entera por medio de centrifugación. Por otra parte, el suero puede ser obtenido con o sin centrifugación seguida de la coagulación de sangre. Si se usa centrifugación entonces se lleva a cabo comúnmente, aunque no de manera exclusiva, a una velocidad apropiada, por ejemplo, 1,500-3,000 x g. El plasma o suero pueden ser sometidos a etapas de centrifugación adicionales antes de ser trasferidos a un tubo nuevo para la extracción de ADN . Además de la porción acelular de la sangre entera, el ADN puede también ser generado de la fracción celular, enriquecido en la porción de cubierta amarilla, que puede ser obtenida en seguida de la centrifugación de una muestra de sangre entera de la mujer y remoción del plasma.

C . Extracción del ADN Hay numerosos métodos conocidos para extraer ADN de una muestra biológica incluyendo sangre. Los métodos generales de preparación de ADN (por ejemplo, descritos en Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a edición, 2001) pueden ser seguidos; varios reactivos o kits comercialmente disponibles tales como QiaAmp DNA Mini Kit o QiaAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) , GenomicPrep™ Blood DNA Isolation Kit (Promega, Madison, WI) y GFX™ Genomic Blood DNA Purification Kit (Amersham, Piscataway, NJ) , pueden también ser usados para obtener ADN de una muestra de sangre de una mujer embarazada. Combinaciones de más de uno de estos métodos puede también ser usado.

IV. Modificación química metilación-específica de ADN El ADN presente en una muestra de una mujer embarazada ya sea extraído o no de la muestra es luego tratado con un agente capaz de modificar preferiblemente el ADN dependiendo de si la secuencia de ADN está metilada. Por ejemplo, este agente puede ser una enzima que somete a digestión el ADN de manera sensible a la metilación, esto es, solamente el ADN sin metilar será sometido a digestión, en tanto que el ADN metilado permanece sin cambios. Otra posibilidad es que el agente convierta selectivamente la secuencia de polinucleótidos dependiendo del estatus de metilación. Comúnmente, tal agente reacciona con el (los) residuo (s) C sin metilar en una molécula de ADN y convierte cada residuo de C a un residuo de uracilo (U) , mientras que los residuos de C metilados permanecen sin cambio. Esta conversión de C —> U permite la detección y comparación del estatus de metilación en base a cambios en la secuencia primaria del ácido nucleico. Un reactivo ejemplar apropiado para este propósito es bisulfito, tal como bisulfito de sodio. Métodos para usar bisulfito para modificación química de ADN son bien conocidos en el arte (véase por ejemplo, Hermán et al., Proc. Nati. ñcad.

SCI. EUA 93: 9821-9826, 1996) y no serán discutidos en detalle en la presente. Como el técnico experimentado reconocerá, cualesquier otros reactivos que no son nombrados pero tienen la misma propiedad de modificar químicamente (o por medio de cualquier otro mecanismo) el ADN metilado y el ADN sin metilar diferencialmente pueden ser usados para llevar a la práctica la presente invención. Por ejemplo, la modificación de la metilación específica del ADN también se puede llevar a cabo mediante enzimas de restricción sensibles a metilación, algunas de las cuales escinden comúnmente un fragmento de ADN sin metilar pero no un fragmento de ADN metilado, mientras que otras (por ejemplo, endonucleasa metilación-dependiente McrBC) escinden el ADN que contiene citosinas metiladas pero no el ADN sin metilar. Además, se puede usar una combinación de modificación química y tratamiento de enzimas de restricción, por ejemplo, análisis de restricción de bisulfito combinado (COBRA) para llevar a la práctica la presente invención.

V. Amplificación y determinación de secuencia de polinucleótidos Enseguida de la modificación diferencial dependiente de metilación del ADN, tal como modificación química del ADN de manera específica de la metilación o digestión enzimática sensible a la metilación, el ADN tratado es luego sometido a un análisis a base de secuencia, de tal manera que el uno o más de los genes revelantes de la presente invención (por ejemplo RASSF1A, APCr CASP8 , RARB , SCGB3A1 , DAB2IP, PTPN6, THY1, TMEFF2 o PYCARD) o de la fuente pueden ser distinguidos de sus contrapartes de la fuente materna y que la presencia y cantidad del (los) gen (es) fetal (es) pueden ser determinadas y comparadas con un control estándar. Además, una vez que se determina que uno o más de estos genes de origen fetal está por supuesto preferente en la muestra, particularmente cuando la cantidad del (los) gen (es) es mayor que un umbral predeterminado, la muestra y sus equivalentes son considerados contener suficientes cantidades de ADN fetal para análisis adicionales. Por otra parte, se puede detectar y medir la cantidad de estos genes particulares como marcadores fetales imitadores de ciertas condiciones o alteraciones concernientes con el embarazo, tomando ventaja del estatus altamente metilado de los genes en contrasto con extracto sin metilar de sus contrapartes de origen materno. Para este uso, la cantidad del uno o más del (los) gen (es) fetal (es) seleccionados de RASSF1A, CASP8, RARB, SCGB3A1 , DAB2IP, PTPN6, THY1, TMEFF2 y PYCARD en una muestra de prueba pueden ser comparados con un valor estándar, en donde un incremento del valor estándar indica la presencia o riesgo aumentado de tal alteración asociada con el embarazo.

A . Amplificación de secuencias de nucleótidos Una reacción de amplificación es opcional antes de un análisis a base de secuencia para un marcador fetal de esta invención después de tratamiento mediante el proceso de modificación diferencial dependiente de metilación. En algunas modalidades de esta invención, la amplificación es efectuada para amplificar preferiblemente un marcador fetal de esta invención que tiene un patrón de metilación particular, de tal manera que solo la secuencia genómica de una fuente particular, por ejemplo de la placenta u otros tejidos del feto, es detectada y analizada. Una variedad de métodos de amplificación de polinucleót idos están bien establecidos y son frecuentemente usados en investigación. Por ejemplo, los métodos generales de reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificación de secuencias de polinucleótidos son bien conocidos en el arte y asi no son descritos en detalle en la presente. Para una revisión de los métodos de PCR, protocolos y principios para diseñar cebadores, véase, por ejemplo, Innis, et al., PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990. Reactivos y protocolos de PCR también están disponibles de proveedores comerciales, tales como Roche Molecular Systems. PCR es llevada a cabo más usualmente como un proceso automático con una enzima termoestable . En este proceso, la temperatura de la mezcla de reacción es sometida a ciclos a través de una región de desnaturalización, una región de recocido de cebador y una región de reacción de extensión automáticamente. Máquinas específicamente adaptadas para este propósito están disponibles comercialmente . Aunque la amplificación de PCR de una secuencia de polinucleótido objetivo {por ejemplo, aquella de RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1 , DAB2IP, PTPN6, THY1 , TMEFF2 ó PYCARD) es usada comúnmente para llevar a la práctica la presente invención, aquel de habilidad en el arte reconocerán que la amplificación de una secuencia genómica encontrada en una muestra de sangre materna se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido, tal como reacción en cadena de ligasa (LCR) , amplificación moderada por transcripción y replicación de secuencia auto-sostenida o amplifica a base de secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) , cada una de las cuales proporciona amplificación suficiente. Tecnología de ADN ramificada más recientemente desarrollada puede también ser usada para demostrar cualitativamente la presencia de una secuencia genómica particular de esta invención, que representa un patrón de metilación particular o para determinar cualitativamente la cantidad de esta secuencia genómica particular en la sangre materna. Para una revisión de una amplificación de señal de ADN ramificada para cuantificación directa de secuencias de ácido nucleico en muestras clínicas, véase Nolte, Adv. Clin. Chem. 33:201-235, 1998.

B . Determinación de secuencia de polinucleótidos Técnicas para determinación de secuencia de polinucleótidos están también bien establecidas y son ampliamente practicadas en el campo de la investigación relevante. Por ejemplo, los principios básicos y técnicas generales para secuenciación de polinucleótidos son descritos en varios reportes de investigación y tratados en cuanto a biología molecular y genética recombinante, tal como Wallace et a, supra; Sambrook y Russell, supra y Ausubel et al., supra . Métodos de secuenciación de ADN llevados a la práctica sistemáticamente en laboratorios de investigación, ya sea manuales o automatizados, pueden ser usados para llevar a la práctica la presente invención. Medios adicionales apropiados para detectar cambios (por ejemplo C ? U) en una secuencia de polinucleótidos para llevar a la práctica los métodos de la presente invención incluyen pero no están limitados a espectrometría de masas, extensión de cebador, hibridización de polinucleótidos, PCR en tiempo real y electroforesis .

VI . Establecimiento de un valor de control estándar Con el fin de establecer un valor de control estándar control para llevar a la práctica el método de esta invención, se selecciona primero un grupo de mujeres embarazadas que portan fetos saludables. Estas mujeres son de edad gestacional similar, que es dentro del periodo de tiempo apropiado de embarazo para selección de las condiciones tales como preeclampsia y labor de pre-término utilizando los métodos de la presente invención. El estado saludable de las mujeres embarazadas seleccionadas y los fetos que portan son confirmados mediante métodos usados sistemáticamente bien establecidos en los que se incluyen pero no limitados a monitoreo de la presión sanguínea de la mujer, registro del inicio de labor y llevar a cabo análisis genético fetal utilizando CVS y amniocentesis . Además, el grupo seleccionado de mujeres embarazadas saludables que portan fetos saludables deben ser de una talla razonable, de tal manera que la cantidad promedio de un gen fetal particular identificado en esta invención presente en la sangre materna obtenida del grupo pueda ser considerado razonablemente como representativo de la cantidad normal o promedio o perfil de metilación entre la población general de mujeres saludables que portan fetos saludables. Preferiblemente, el grupo seleccionado comprende por lo menos 10 mujeres. Una vez un nivel promedio es establecido para un gen fetal particular presente en la sangre materna en base a los valores individuales encontrados en cada mujer del grupo de control saludable seleccionado, este valor medio o promedio o representativo es considerado un valor de control estándar. Cualquier muestra biológica (por ejemplo, una muestra de sangre) que contiene una cantidad similar del gen fetal puede asi ser usada para proporcionar un valor de control estándar para muestras de la misma clase (por ejemplo, muestras de sangre) . Además, una solución que contiene una secuencia de ADN genómica en la cantidad promedio o media o representativa puede también ser ensamblada artificialmente y proporcionar un valor de control estándar. El valor de control estándar puede diferir de un gen a otro y dependiendo de la naturaleza de las muestras biológicas, esto es, el valor de control estándar para RASSF1A puede ser diferente para una muestra de plasma de aquella de una muestra de saliva.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son provistos a manera de ilustración solamente y no a manera de limitación. Aquellos de habilidad en el arte reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían ser cambiados o modificados para producir esencialmente los mismos resultados o resultados similares .

Ejemplo 1 : Genes supresores de tumor que están hipermetilados en el feto en comparación con la sangre materna Se tenía como objetivo identificar marcadores epigenéticos que son fetal-especí fieos en la sangre materna. Datos previos sugieren que las moléculas de ADN fetal en el plasma materno son derivados predominantemente de la placenta (Chim et al., Proc Nati Acad Sci USA., 102, 14753-14758; Masuzaki et al., J Med Genet 41, 289-292, 2004; Flori et al., Hum Reprod 19, 723-724, 2004), en tanto que el ADN de fondo en el plasma materno se puede originar de las células de sangre materna (Lui et al., Clin Chem 48, 421-427, 2002) . De aquí, para identificar marcadores epigenéticos fetales, los perfiles de metilación de los sitios genómicos fueron determinados tanto en tejos placentales como células de sangre materna con el objetivo de identificar sitios que demuestran metilación diferencial entre los tipos de tejidos. Tales marcadores pueden ser usados para diagnosis prenatal y monitoreo de condiciones relacionadas con el embarazo.

.Reclutamiento subsecuente y recolección de muestras Los sujetos fueron reclutados del Departamento de Obstetricia y Ginecología, Hospital Príncipe de Gales, Hong Kong. El estudio y la recolección de muestras clínicas humanas fueron aprobados por la Oficina de revisión institucional. Se buscó el consentimiento por escrito de cada sujeto. Los primeros tejidos placentales del trimestre fueron recolectados inmediatamente después de terminaciones de embarazo electivo. Terceros tejidos placentales de trimestre fueron recolectados después del parto por cesárea electivo de embarazos no complicados. Muestras de sangre periférica materna (12 mL de EDTA) fueron recolectados justo antes de la ejecución de los procedimientos de obstetricia .

Procesamiento de muestras y secuenciación por bisulfito Las muestras de sangre fueron centrifugadas a 1,600 g durante 10 minutos a 4°C. Después de la remoción del sobrenadante, la porción de célula de sangre periférica fue re-centrifugada a 2,500 g. Cualquier plasma residual fue removido adicionalmente . El ADN fue extraído de células de sangre periférica utilizando el kit de extracción de ADN Nucleón Blood (GE Healthcare-Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido) y de los tejidos placentales utilizando el kit QIAamp Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania) , cada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El bisulfito convierte la citocina sin metilar a uracilo, en tanto que la citocina metilada saliente permanecía sin cambio. Muestras de ADN extraídas fueron convertidas por bisulfito utilizando el kit de modificación de ADN universal CpGenome de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cada reacción de conversión, 1 ig de ADN fue incubado a 50°C durante 16 horas después de la adición del Reactivo I . Cada muestra de ADN convertida por bisulfito fue sometida a PCR mediante cebadores que no discriminan entre las secuencias metiladas y las secuencias sin metilar, utilizando un kit de reactivo de núcleo de PCR GeneAmp (Applied Biosystems) . Cada producto de PCR subsecuente fue TA-clonado a un vector de pGEM-Teasy (Promega) para transformación a la cepa JM109 de E. coli, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los clones fueron seleccionados aleatoriamente y la PCR de colonia fue luego efectuada utilizando los cebadores de vector T7 y SP6 para amplificar los injertos clonados. La secuenciación de ciclo se llevó a cabo utilizando BigDye versión 1.1 (Applied Biosystems) y un secuenciador de ADN capilar automatizado Genetic Analyzer 3100 (Applied Biosystems). Las secuencias obtenidas fueron alineadas y comparadas utilizando software de SeqScape (Applied Biosystems) . La terminación de la conversión de bisulfito fue confirmada primero antes de la escorificación . Los sitios de CpG secuenciados como residuos de citocina o timina fueron puntuados como metilados o sin metilar, respectivamente. La frecuencia de sitio metilado fue calculado para cada muestra al dividir el número total de sitios metilado sobre todos los sitios de CpG clonados.

Comparación de datos y análisis estadístico Enseguida de la conversión por bisulfito, un sitio de CpG fue puntuado como metilado si la secuencia era de citocina; puntuado como sin metilar si estaba ocupado por un residuo de timina (contraparte desoxi de uracilo) . La frecuencia de sitio metilado fue calculada para cada muestra al dividir el número total de sitios metilados sobre todos los sitios de CpG clonados .

RASSF1A, APC y RABB Los cebadores de PCR para la secuenciación por bisulfito y las condiciones de ciclo de PCR son enlistados en la Figura 1. Los resultados de secuenciación por bisulfito son enlistados en las Figuras 2 y 3. Estos resultados indican que las secuencias de RASSF1A, APC y RARB fueron hipermetiladas en la placenta, pero no metilados en las células de sangre materna .

CASP8 Los cebadores de PCR para la secuenciación por bisulfito y condiciones de ciclo de PCR son enlistados en la Figura 4. Los resultados de secuenciación de bisulfito son enlistados en la Figura 5. Estos resultados indican que la secuencia de CASP8 fueron hipermetiladas en la placenta, pero no metilados en las células de sangre materna.

SCGB3A1 Los cebadores de PCR para la secuenciación de bisulfito y condiciones de ciclo de PCR son enlistados en la figura 6. Los resultados de secuenciación por bisulfito son enlistados en la Figura 7. Estos resultados indican que la secuencia de SCGB3A1 fueron hipermet iladas en la placenta, pero no metiladas extensamente en las células de sangre materna.

Proteína de interacción de DAB2 (DAB2IP) Los cebadores de PCR para la secuenciación por bisulfito y condiciones de ciclo de PCR son enlistados en la Figura 17. Los resultados de secuenciación por bisulfito para una muestra de tejido placental y las células de sangre materna correspondientes son enlistados en la Figura 18. Estos resultados indican que las secuencias de DAB2IP fueron hipermetiladas en la placenta, pero no metiladas en las células de sangre materna.

Ejemplo 2: Digestión de enzima sensible a metilación seguida por PCR en tiempo real Las enzimas sensibles a metilación son enzimas que cortan el ADN solamente cuando su sitio de reconocimiento no está metilado. Para más descripción, véase, por ejemplo, publicación de solicitud de patente estado No. US 2005/0158739 (Jeddeloh et al) . Por ejemplo, BstU I reconoce el sitio de CGCG y corta el ADN en donde el CpG no está metilado. Como se muestra en la Figura 8, más de una enzima sensible a la metilación puede ser usada para someter a digestión el ADN sin metilar, dejando solamente las secuencias metiladas intactas. Métodos tales como PCR en tiempo real pueden ser usados subsecuentemente para detectar la secuencia de ADN que son todavía amplificables después de digestión enzimática.

MATERIALES Y MÉTODOS .Reclutamiento de sujetos y recolección de muestras Los sujetos fueron reclutados del Departamento de Obstetricia y Ginecología, Hospital Príncipe de Gales, Hong Kong. El estudio y la recolección de muestras clínicas humanas fueron aprobados por la Oficina de revisión institucional. Se buscó el consentimiento por escrito de cada sujeto. Tejidos placentales del tercer trimestre fueron recolectados después de parto por cesárea electivo de embarazos no complicados. Muestras de sangre periférica materna fueron recolectadas justo antes de la ejecución de los procedimientos de obstetricia.

Procesamiento de muestras y digestión de ADN mediante enzima sensible a metilación Las muestras de sangre materna fueron centrifugadas a 1,600 g durante 10 minutos y a 16,000 g por 10 minutos a 4°C. El ADN fue extraído del 200 µ? de cubierta amarilla y 0.2 g de tejido placental utilizando el mim-kit de sangre de ADN QIAamp y el mini-kit de ADN QIAamp, respectivamente, siguiendo la recomendación del fabricante. 10 pg de ADN de cubierta amarilla placental y materna fueron sometidos a digestión con 100 U de BstU I, una enzima sensible a metilación, en solución reguladora del pH de digestión IX 60°C por 16 horas.

Detección de PCR e tiempo real para la secuencia de RASSF1A La secuencia de RASSF1A fue amplificada mediante PCR en tiempo real utilizando los cebadores RSF-bl51F, 5'-AGCCTGAGCTCATTGAGCTG-3 ' ( SEQ ID NO: 27) y RSF-dsgnR, 5'-ACCAGCTGCCGTGTGG-3 ' (SEQ ID NO. 28) y la sonda fluorescente de enlace menor (MGB) RSF-dsgnT, 5 ' -FAM-CCAACGCGCTGCGCAT-MGB-3 ' (SEQ ID NO: 29) . La sincronización de o el número de ciclos de PCR requeridos para la apariencia de la señal fluorescente detectables es inversamente correlacionada con la cantidad de secuencia de RASSF1A en la muestra de ADN de entrada. En otras palabras, mientras más alta es la cantidad de secuencia de RASSF1A presente en una muestra de ADN, más pronto la señal fluorescente aparecerá, dando como resultado un número de ciclo de umbral más bajo. La Figura 9a muestra un ejemplo de cuantificación de PCR en tiempo real de moléculas de RASSF1A las células de sangre de placenta y maternal después de digestión por BstU I. Sin digestión de enzima, las moléculas de RASSF1A tanto de la placenta como de la cubierta amarilla maternal fueron detectadas. Con digestión de enzima, solamente las moléculas de RASSFlñ de la placenta fueron detectadas. Para moléculas de ß-actina, fueron detectables solamente sin digestión de enzima, sin consideración de su origen (Figura 9b). Es esperado puesto que la secuencia de ß-actina no está metilada. La Figura 9c muestra los resultados de secuenciación por bisulfito del gen de ß-actina para la placenta y cubierta amarilla materna. Tanto los tejidos de placenta como la cubierta amarilla maternal estuvieron completamente sin metilar.

Ejemplo 3: Detección de RASSF1A en plasma materno después de digestión enzimática En el Ejemplo 1, mediante secuenciación por bisulfito, se ha demostrado que el gen de RASSF1A de células de sangre materna está completamente sin metilar, en tanto que aquel de la placenta (de origen fetal) está fuertemente metilado. En el Ejemplo 2, se han demostrado que la secuencia de RASSF1A de las células de sangre materna fueron completamente sometidas a digestión mediante una enzima de restricción sensible a metilación, mientras que las secuencias de RASSF1A de la placenta fueron solamente sometidas a digestión parcialmente por la misma enzima. El ADN del plasma está compuesto de ADN de origen maternal (extensamente de células de sangre materna y asi está sin metilar) y ADN de origen fetal (la placenta es un contribuyente principal y asi está metilado para los marcadores descritos en la presente solicitud) . Es asi factible utilizar la digestión de enzima sensible a metilación del ADN de plasma para remover el fondo de ADN maternal y para incrementar la concentración fraccional de las moléculas de RASSF1A fetal-derivadas en el plasma materno. Un diagrama esquemático es mostrado en la Figura 10a, el RASSF1A maternal-derivado está sin metilar y asi es sometido a digestión por la enzima sensible a metilación en tanto que algo del RASSF1A feta-derivado está metilado y asi no es sometido a digestión. Si la digestión de enzima es completa, solamente el ADN metilado, fetal-derivado es dejado intacto y puede servir como la plantilla para la amplificación de PCR. En el caso de ß-actina, puesto que ambos de las secuencias de ADN maternal como fetal-derivadas están sin metilar, la digestión por enzima completa destruirá todas las secuencias y subsecuentemente no se puede obtener ninguna amplificación de PCR utilizando esta secuencia de ß-actina. Los errores humanos y calidad de reactivo algunas veces puede provocar digestión de enzima incompleta. La beta-actina puede asi ser usada como control interno para indicar la digestión incompleta (Figura 10b) . Si la amplificación de PCR es exitosa para ß-actina después de digestión de enzima, es probable que la digestión de enzima sea incompleta. En este caso, todo el análisis puede necesitar ser repetido hasta que se obtiene un resultado negativo para el análisis de ß-actina.

MATERIALES Y MÉTODOS Procesamiento de muestras y digestión por ADN mediante enzima sensible a metilación Muestras de sangre materna fueron centrifugadas a 1,600 g por 10 minutos y a 16,000 g por 10 minutos a 4°C. El ADN fue extraído de 1.6 mi de plasma utilizando el mini-kit de QIAamp (Qiagen) y eluidos con 50 µ? de H20. Treinta y cinco microlitros de ADN de plasma fueron sometidos a digeridos con 100 U de enzima BstU I, en solución reguladora del pH de digestión IX a 60°C durante 16 horas.

Detección por PCR en tiempo real para secuencias de RASSF1A y heta-actina La secuencia de RASSF1A fue amplificada y cuantificada mediante PCR en tiempo real como se describe anteriormente. La secuencia de beta-actina fue amplificada y cuantificada mediante PCR en tiempo real utilizando los cebadores actina-163F, 5 ' -GCGCCGTTCCGAAAGTT-3 ' (SEQ ID NO: 30) y actin-298R, 5 ' -CGGCGGATCGGCAAA-3 ' (SEQ ID NO: 31) y la sonda fluorescente MGB actin-243T, 5 ' -VIC-ACCGCCGAGACCGCGTC-MGB-3 ' (SEQ ID NO: 32) . La secuencia de SRY fue amplificada y cuantificada utilizando los cebadores SRY-109F, 5'-TGGCGATTAAGTCAAATTCGC-3 ' (SEQ ID NO: 33) y SRY-245R, 5'-CCCCCTAGTACCCTGACAATGTATT-3 ' . (SEQ ID NO: 34) y la sonda fluorescente SRY-142T, 5 ' -FAM-AGCAGTAGAGCAGTCAGGGAGGCAGA-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 35). Un constructo de ADN que contiene una copia cada uno de los amplicones RASSF1A, SRY y ß-actina fue establecido como el estándar cuantitativo de los tres análisis. Una curva de calibración fue creada mediante diluciones seriales de una cantidad conocida del constructo de ADN y fue incluida en cada ronda de PCR en tiempo real para la cuantificación de RASSF1A, ß-actina y SRY en el plasma. La Figura 11 muestra un ejemplo de cuantificación por PCR en tiempo real de moléculas de RASSF1A de plasma maternal de primero y tercer semestre con y sin digestión de BstO I. Para la muestra del primer trimestre, la concentración de RASSF1A fue reducido de 688 copias/mL de plasma a 49 copias/mL de plasma debido a la digestión de enzima. Esta reducción espectacular es esperada puesto que la mayoría (en promedio 96.6%, Lo et al., Am J Hum Genet 1998, 62: 768-775) de las moléculas de ADN son de origen maternal, y así están sin metilar y digeridas. Para la muestra del tercer trimestre, la concentración de RASSF1A fue reducida de 1275 copias/mL de plasma a 74 copias/mL de plasma debido a la digestión de enzima. Se han analizado 71 mujeres embarazadas (28 en el primer trimestre y 43 en el tercer trimestre) utilizando este análisis en moléculas de RASSFIA. Las secuencias de RASSFIA fueron detectables en todas las muestras de ADN de plasma después de la digestión de enzima sensible a la metilación. El control de digestión de beta-actina fue analizado para todas las muestras. Para cada caso, la secuencia de ß-actina fue detectada solamente sin digestión de enzima.

Ejemplo : Demostración de especificidad fetal de secuencia de RASSFIA en plasma materno después de digestión enzimática La especificidad fetal de las secuencias de ADN después digestión enzimática es importante para la aplicación a diagnosis prenatal y monitoreo. En este ejemplo, se demostrará la especificidad fetal de la secuencia de RASSFIA después de digestión enzimática en plasma materno mediante cuatro líneas de experimentos. En el primer experimento, se demuestra que la secuencia de RASSFIA no fue detectable después de digestión enzimática en mujeres no embarazadas. Esto es importante puesto que si las moléculas de RASSFIA después de digestión enzimática son fetal-específicas , no deben ser detectadas en mujeres no embarazadas. En la Figura 12, se muestra un caso de mujer no embarazada. La secuencia de RASSFIA fue solamente detectada sin digestión de enzima. Con la digestión de enzima, no se encontró ninguna secuencia de RASSFIA detectable. Como se esperaba, el control de digestión de ß-actina fue solamente detectado sin digestión de enzima. En las 25 voluntarias no embarazadas que se han reclutado para este estudio, ninguna de ellas mostró señal de RASSF1A detectable en plasma después de la digestión enzimática de restricción sensible a metilación. En el segundo experimento, se demuestra que la secuencia de RASSF1A después de la digestión enzimática no fue detectable después del nacimiento del bebé. Si las moléculas de RASSF1A después de la digestión enzimática son fetal-especificas, se espera que desaparecerán del plasma materno puesto que las fuentes (la placenta es la principal) que liberan tales moléculas son removidas después del parto. Otros marcadores fetal-especificos tales como SRY han demostrado despeje similar después del parto (Lo et al., Am J Hum Genet 1998, 62: 768-775) . Cinco pares de muestras de plasma materno pre- y post-parto fueron recolectados. Para todos los casos, después de digestión enzimática, las moléculas de RASSF1A fueron detectables antes del parto, pero no detectables después del parto (Tabla 1) . Similarmente , el marcador de SRY fetal-especifico fue solamente detectable antes de parto. En el tercer experimento, un marcador de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) fue usado para distinguir las secuencias de RASSF1A maternal-derivadas y fetal-derivadas . Si las secuencias de RASSF1A después de digestión enzimática son por supuesto fetal-especificas , entonces el genotipo de tales secuencias debe ser aquel del feto, en lugar de aquel de la madre. Por ejemplo, si un marcador de SNP es CC en el feto y AC en la madre, el genotipo del ADN después de digestión enzimática debe ser CC, en lugar de AC . Similarmente , para un par de AC/CC (fetal/materno), el genotipo del ADN después de digestión enzimática debe ser AC, en lugar de CC . Para el ADN de plasma sin digestión, el genotipo puede ser el mismo como aquel de la madre, puesto que la mayoría del ADN del plasma es de origen materno.

MATERIALES Y MÉTODOS Genotipo de RASSFIA El ADN fue extraído del plasma materno, cubierta amarilla maternal y placenta como se describe anteriormente. Treinta y cinco' microlitros de cada muestra de ADN de plasma materno fueron sometido a digestión de enzima de BstO I por 16 horas como se describe anteriormente. La amplificación de PCR de la secuencia de RASSFIA fue efectuada con los cebadores RSF-bl51F, 5 ' -AGCCTGAGCTCATTGAGCTG-3 ' (SEQ ID NO: 27) y RSF-dsgnR, 5 ' -ACCAGCTGCCGTGTGG-3 ' (SEQ ID NO.28) utilizando ADN de cubierta amarilla materna, ADN placental, ADN de plasma materno sin digestión enzimática y ADN de plasma materno después de digestión enzimática como plantillas. Ya que hay un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP id: rs4688725) dentro de este amplicon de RASSFIA, los genotipos de RASSFIA de diferentes tejidos pueden ser determinados. Una reacción de extensión de cebador fue establecida para el genotipo del ADN de RASSF1A. Cada 14 µ? de reacción contenían 10 µ? de productos de PCR, 0.77 µ? de cebador de extensión Rsf-R17 5'-CAGCCGGGTGGGCCCT-3 ' (SEQ ID NO: 36), una termosecuencia de 1.15 U y una mezcla de didesoxinucleót idos (ddATP, ddCTP y ddTTP) y el desoxinucleótido dGTP (64 µ? cada uno) . Para la secuencia de RÁSSF1A con un genotipo A, el cebador sería extendido para producir 5 ' -CAGCCGGGTGGGCCCTddT-3 ' (SEQ ID NO: 37) con un peso molecular de 5476.6 Da. Para la secuencia de RASSF1A con un genotipo C, el cebador sería extendido para producir 5'-CAGCCGGGTGGGCCCTGddC-3 ' (SEQ ID NO: 38) con un peso molecular de 5790.8 Da. Los productos de extensión de base finales fueron analizados mediante la espectrometría de masas massARRAY MALDI-TOF (SEQUENOM) . El genotipo de RASSF1A fue determinado mediante el software de typerAnalyzer (SEQUENOM) . La Figura 13 muestra un ejemplo del resultado de experimento de genotipo para el ADN de plasma materno con o sin digestión de enzima, ADN de cubierta amarilla maternal y ADN placental. Como se esperaba, el genotipo del ADN de plasma materno después de digestión enzimática fue el mismo como aquel de la placenta (genotipo fetal), pero no aquel de la cubierta amarilla materna. La Tabla 2 muestra los resultados de genotipo para 43 casos en donde el ADN de plasma materno con o sin digestión de enzima, ADN de cubierta amarilla materno y ADN placental fueron todos analizado. En cada de los 43 casos, el genotipo del ADN de plasma materno después de digestión enzimática fue idéntico a aquel del genotipo de placenta (fetal) . En el cuarto experimento, se demostró que dos marcadores, es decir la secuencia de RASSFIA después de digestión enzimática y secuencia de SRY, tenían concentraciones en el plasma materno que se correlacionan entre sí. El ADN de plasma fue extraído de 24 mujeres embarazadas de tercer trimestre que portan un solo feto varón. Como se muestra en la Figura 14, se observó una .correlación positiva entre la secuencia de RASSFIA después de digestión enzimática y la secuencia de SRY (r = 0.717, p < 0.0001, correlación de Spearman) . Adicionalmente , la concentración de RASSFIA total sin digestión enzimática, que fue derivada predominantemente de la madre, no se correlacionó con aquella para SRY. Estos cuatro experimentos demostraron conclusivamente que la secuencia de RASSFIA después de digestión enzimática fue exclusivamente (a la extensión de las técnicas que se utilizaron) de origen fetal. RASSFIA es así útil para diagnosis prenatal y monitoreo de embarazo.

Ejemplo 5 : Demostración de RASSF1A como marcador analítico positivo para diagnosis prenatal del tipo de sangre de RhD La incompatibilidad de grupo sanguíneo Rhesus D (RhD) es una causa importante de enfermedad hemolítica del feto y neonato. La patogénesis de esta alteración involucra la aloinmunización de una mujer embarazada RhD negativa por el antígeno RhD codificado por el alelo paterno y mostrado sobre la superficie de células rojas fetales. La aloinmunización materna usualmente ocurre durante el parto cuando el tejido de un feto RhD positivo se pone en contacto con sangre materna. Esto generaría anticuerpos anti-RhD que pueden cruzar la placenta y destruir las células rojas fetales en los embarazos subsecuentes con un feto RhD positivo. La aloinmunización materna puede ser impedida o minimizada al dar inmunoglobulina anti-RhD profiláctica antes y después del parto del primer bebé RhD positivo. Por consiguiente, es benéfico saber el estatus de RhD de un feto antes del parto. Sin embargo, la obtención de células fetales para genotipo/fenotipo de RhD mediante amniocentesis porta un riesgo de hemorragia transplacental , que, si el feto es RhD positivo, podría sensibilizar la producción materna de anti-RhD. El desarrollo del genotipo de RhD prenatal no invastivo ofrece una alternativa segura para obtener células fetales para el genotipo de RhD (Lo et al., N Engl J Med 1998; 339: 1734-1738) . Esta técnica involucra la detección de secuencia de RhD fetal en el plasma .materno. La presencia de secuencia de RhD en el plasma de una mujer embarazada RhD negativa indicaría un feto RhD positivo. Sin embargo, la ausencia de tal secuencia en el plasma materno puede ser interpretada de dos maneras: 1) el feto es RhD negativo; o 2) hay un ADN fetal inapropiado en el plasma materno para permitir la tipificación de RhD fetal exacto. Un marcador de ADN fetal universal como control positivo en el ADN de plasma materno sería útil para excluir la segunda posibilidad. La detección del marcador de ADN fetal de control positivo en el ADN de plasma materno apoyaría la presencia de un feto RhD negativo, en tanto que la ausencia del marcador de ADN fetal sugeriría ADN fetal inapropiado en el plasma materno. A la fecha, marcadores de ADN fetales disponibles que pueden ser usados como control positivos incluyen ADN cromosomal Y y polimorfismos de ADN. Ambos de estos dos tipos de marcadores son solamente aplicables a un subconjunto de embarazos. Un ADN cromosomal Y es solamente aplicable a embarazos con un feto varón. El polimorfismo de ADN es solamente aplicable a combinaciones de genotipo particulares en donde cierto genotipo está presente solamente en el feto, pero no en la mujer embarazada. A este respecto, la secuencia de RASSF1A metilada ilustrada en las secciones anteriores podrían ser usada como marcador de ADN fetal universal que es aplicable a todos los embarazos sin consideración del género o polimorfismo del feto. Aquellos de habilidad en el arte también reconocerán que, además del marcador de RASSFlñ metilado, los otros marcadores descritos en la presente podrían también ser usados de tal manera . La Figura 15 muestra un diagrama esquemático que bosqueja una estrategia para la tipificación de RhD no invasiva del feto. Esto es por ningún medio la única manera que un marcador de ADN fetal hipermetilado puede ser usado como marcador analítico positivo para diagnosis prenatal del tipo de sangre de RhD. Aquellos de habilidad en el arte pueden también apreciar que un marcador de ADN fetal hipermetilado, tal como RASSF1A puede ser usado como marcador analítico positivo para diagnosis prenatal de otras condiciones, tales como ß-talasemia, fibrosis cística, hiperplasia adrenal congenital y aneuploides cromosomal. Este marcador analítico positivo puede también ser determinado antes o simultáneamente con la determinación prenatal real de una condición tal como un tipo de sangre de RhD.

MATERIALES Y MÉTODOS Reclutamiento de sujetos y recolección de muestras Sujetos que sufren de selección de síndrome de Down de primer semestre fueron reclutados del Hospital King's College Londres, Reino Unido de la Gran Bretaña. El estudio y la recolección de muestras clínicas humanas fueron aprobada por la oficina de revisión institucional. Se buscó el consentimiento por escrito de cada sujeto. Tejidos de villus coriónicos fueron recolectados vía el procedimiento de toma de muestra de villus coriónico. Las muestras de sangre periférica materna fueron recolectadas justo antes de la ejecución de los procedimientos de obstetricia.

Procesamiento de muestras y detección de PCR en tiempo real para secuencias de RHD El ADN fue extraído del plasma materno, muestras de cubierta amarilla y muestras de CVS como se describe en las secciones previas. El estatus de RhD de la madre y el feto fueron determinados mediante amplificación en tiempo real de una secuencia sobre el exón 7 y exón 10 del gen de RHD como se describe previamente (Lo et al., N Engl J Med 1998, 339: 1734-1738; Rijnders et al., Obstet Gynecol 2004, 103:157-164) utilizando ADN de cubierta amarilla materna y ADN de CVS como plantillas, respectivamente. En nuestro cohorte, los análisis de exón 7 y exón 10 dieron resultados idénticos para todos los sujetos estudiados. La detectabilidad de la secuencia de RHD en el plasma materno fue determinada por los mismos sistemas de PCR en tiempo real utilizando 5 µ? de ADN de plasma como plantillas. Todos los experimentos se llevaron a cabo por duplicado. Una muestra sería puntuada como positiva si cualquiera de los duplicados era positivo. La presencia de ADN fetal en el plasma materno fue confirmada mediante la amplificación de la secuencia de SRY (para fetos varones) y la secuencia de RASSFIA después de digestión enzimática del ADN de plasma materno. El apuntamiento por PCR en tiempo real del gen SRY se llevó a cabo utilizando ADN de plasma sin digestión enzimática como las plantillas. Las PCR en tiempo real para las secuencias de RASSFIA y ß-áctina se llevaron a cabo utilizando ADN de plasma materno después de digestión enzimática como plantillas .

RESULTADOS El estatus de RhD de 355 mujeres embarazadas fue seleccionado. Cincuenta y cuatro de ellas fueron RHD negativas. Ya que este grupo de sujetos estaban en riesgo de aloinmunización por un feto RhD positivo, su plasma y CVS fueron sometidos a investigación adicional en cuanto a estatus de RhD fetal. Las secuencias de RHD fueron detectadas en el ADN de plasma materno de 35 sujetos y fueron negativos en el plasma materno de 19 sujetos. En 15 de los 19 sujetos con resultado de RHD de plasma materno negativo, las secuencias de RASSFIA fueron detectadas en el ADN del plasma después de digestión enzimática. Los otros 4 casos fueron negativo en cuanto a RASSFIA después de digestión enzimática. La señal beta-actina fue negativa en todos los casos indicando que la digestión por enzima de BstO I fue complete en todos los 19 casos. En base al análisis de las muestras de CVS, todos los 15 sujetos con detección positiva de RASSF1A después de digestión enzimática estaban portando un feto RhD-negativo . En los 4 sujetos que muestran detección negativa de RHD y RASSF1A en su plasma, el CVS fueron RHD positivos en 2 de ellas. Asi, para estos dos casos, el genotipo de RHD de plasma materno había producido resultados negativos falsos, que fueron captados por la falla en detectar el marcador analítico positivo RASSF1A después de digestión enzimática. Para ilustrar la importancia de este marcador fetal independiente de género, estos resultados fueron comparados con un marcador de ADN fetal existente SRY. El análisis de SRY sería positivo solamente cuando el feto es varón. Para los 19 sujetos con detección negativa de secuencia de RHD en su plasma, 6 de ellos fueron positivo para SRY, indicando la presencia de ADN fetal amplificable en la muestra de plasma materno analizado y así confirmó adicionalmente la naturaleza genuina del estatus RhD-negativo del feto. En los 13 casos restantes, si la detección negativa de secuencias de RhD y SRY en el ADN del plasma, es el resultado de un feto RhD-negativo hembra o el ADN fetal inapropiado en el plasma materno no puede ser determinado sin utilizar el protocolo de RASSF1A como control positivo para ADN fetal.

Ejemplo 6: Demostración de RASSF1A como marcador independiente de género para el monitoreo de preeclampsia La utilidad clínica de los marcadores de ADN fetales hipermetilados va más allá de servir como marcador analítico positivo. La detección y/o cuant ificación del RASSF1A por sí mismo después de digestión enzimática puede ser útil en diagnosis prenatal y monitoreo de embarazo. En otras palabras, estas secuencias de ADN fetales hipermetiladas en plasma materno pueden servir como biomarcadores por su propio derecho. Previamente, se han demostrado que la concentración de ADN fetal en el plasma materno es incrementada en ciertas condiciones tales como preeclampsia y aneuploides fetales. Sin embargo, debido a la carencia de un marcador de ADN fetal independiente de género, los estudios previos estaban limitados a mujeres embarazadas que portan un feto varón (Levine et al., Am J Obstet Gynecol 190:707-713; Leung et a, Clin Chem 47:147-139) . En este ejemplo, se ha comparado la concentración de ADN fetal en el plasma, al apuntar la secuencia de RASSF1A después de digestión enzimática, de 5 mujeres que sufren de preeclampsia con 5 mujeres embarazadas que coinciden en edad gestacional sin ninguna complicación asociada con el embarazo. Las concentraciones de RASSF1A medidas en las muestras de ADN de plasma materno después de digestión enzimática de los dos grupos son mostradas en la Figura 16. Las concentraciones medias de las mujeres embarazadas con y sin preeclampsia fueron 9400 copias/ml y 2200 copias/ml de plasma, respectivamente. La diferencia entre los dos grupos fue estadísticamente significativa (p=0.016, prueba de Mann-Whitney) . Todas las patentes, solicitudes de patente y otras publicaciones citadas en esta solicitud, incluyendo secuencias de aminoácidos o polinucleótidos publicadas, son incorporadas por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Tabla 1 Despeje de secuencias de RASSF1A y SRY del plasma materno después del parto. La sangre fue tomada de 5 mujeres embarazadas que portan un feto varón justo antes del parto y 24 horas después del parto. Después que las muestras de ADN de plasma materno fueron tratadas por la enzima sensible a metilación, las secuencias de RASSF1A y SRY fueron detectadas en el plasma de todos los fetos antes del parto, pero no fueron detectables en ninguna de las muestras de plasma a 24 horas después del parto.

Genotipo RASSFIA caso ADN de ADN de ADN ADN de cubierta plasma placental plasma amarilla materno sin materno con materna digestión digestión 616 * CA CC CC CC 677 AC AC AC AC 688 AC AC CC CC 695 AC CC CC CC 832 CC AC CC CC 849 AC AC CC CC 873 AC AC AC AC 920 AC AC AC AC 928 AC AA AC AC 1082 AA CC CC CC 1088 CC AC CC CC 1089 AC AA AC AC 1112 AA CC CC CC 1114 CC AA AA AA 1145 AA AA AA AA 1148 AA AC AC AC 1149 CC CC CC CC 1155 AA AA AA AA 1157 CC CC CC CC 1158 AC AC AA AA 1170 CC CC CC CC 1171 AC AC CC CC 1172 AC AC AC AC 1182 CC CC CC CC 1185 AC AC AC AC 1186 AC AC AA AA caso ADN de ADN de ADN ADN de cubierta plasma placental plasma amarilla materno sin materno con materna digestión digestión 1192 AC AC AA AA 1194 AC AC AC AC 1195 CC CC CC CC 1197 CC CC AC AC 1200 AC AC AC AC 1203 AA AA AA AA 1204 AA AA AC AC 1210 AC AC AC AC 1211 CC CC AC AC 1212 AC AC AC AC 1213 AC AC CC CC 1214 AC AC CC CC 1222 CC CC CC CC 1234 CC CC CC CC 1235 CC CC CC CC 1266 AC AC AC AC 1276 AA AA AA AA Tabla 2. Los genotipos de RASSF1A del ADN de cubierta amarilla materno, ADN placental y ADN de plasma materno con o sin digestión de enzima de 43 mujeres embarazadas. En cada uno de los 43 casos, el genotipo del ADN de plasma materno con digestión de enzima fue idéntico al genotipo placental (fetal) , sugiriendo que solamente las moléculas de ADN fetal-especificas fueron amplificables después de la digestión de enzima de las muestras de ADN de plasma materno.

Claims (35)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para detectar ADN fetal en una muestra biológica de una mujer embarazada, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) tratar la muestra con un agente que modifica diferencialmente el ADN metilado y el ADN sin metilar; y (b) detectar la secuencia de ADN de RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1 , DAB2IP, PTPN6, THY1 , TMEFF2 ó PYCARD en la muestra, en donde la presencia de la secuencia de ADN indica la presencia de ADN fetal en la muestra y la ausencia de la secuencia de ADN indica la ausencia de ADN fetal en la muestra.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es sangre entera.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es de plasma.
4. 4.. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es de suero.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es de orina.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es de saliva.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente somete a digestión el ADN sin metilar pero no el ADN metilado.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el agente es un enzima sensible a la metilación .
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la enzima sensible a la metilación es una enzima de restricción sensible a la metilación.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la enzima de restricción sensible la metilación es Hpa II o BstU I.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente comprende bisulfito.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (b) comprende un proceso de amplificación proceso.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el proceso de amplificación es una reacción en cadena de polimerasa (PCR).
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la PCR es PCR en tiempo real.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (b) determina la cantidad de la secuencia de ADN.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (b) indica la presencia de ADN fetal en la muestra, el método comprende además las etapas de: (c) determinar la cantidad de una segunda secuencia de ADN fetal en una segunda muestra, en donde la segunda muestra es idéntica a la muestra en la etapa (a) antes de ser tratada con el agente y la segunda secuencia no es RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1 , DAB2IP, PTPN6, THY1, TMEFF2 ó PYCARD; y (d) comparar la cantidad de la segunda secuencia con un control estándar, en donde un incremento en la cantidad de la segunda secuencia del control indica la presencia o un riesgo incrementado por desarrollar una condición asociada con el embarazo.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la segunda muestra en la etapa (c) no es tratada con algún agente que modifica diferencialmente el ADN metilado y el ADN sin metilar.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la segunda muestra en la etapa (c) es tratada con el agente antes de que se determine la cantidad de la segunda secuencia de ADN fetal.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la segunda muestra en la etapa (c) es tratada con un segundo agente diferente que modifica diferencialmente el ADN metilado y el ADN sin metilar antes de que se determine la cantidad de la segunda secuencia de ADN fetal.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la condición asociada con el embarazo es preeclampsia , labor de pretérmino o retardo de crecimiento intrauterino (IUGR) .
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa (b) indica la presencia de ADN fetal en la muestra, el método comprende además la etapa de: (c) detectar una segunda secuencia de ADN fetal en una segunda muestra, en donde la segunda muestra es idéntica a la muestra en la etapa (a) antes de ser tratada con el agente y la segunda secuencia es un gen de un tipo de sangre de RhD, de un tipo de sangre de ABO, de un tipo de sangre de RhC, de un tipo de sangre de RhE, de un tipo de HLA, en el cromosoma Y o que contiene una mutación predeterminada, en donde la presencia de la segunda secuencia indica la presencia del tipo de sangre de RhD, el tipo de sangre de ABO, el tipo de sangre de RhC, el tipo de sangre de RhE, el tipo HLA, el cromosoma Y o la mutación en el genoma fetal.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la segunda muestra en la etapa (c) no es tratada con algún agente que modifica diferencialmente el ADN metilado y el ADN sin metilar.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la etapa (c) comprende un proceso de amplificación.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el proceso de amplificación es una reacción en cadena de polimerasa (PCR) .
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la PCR es PCR es tiempo real.
26. 26. Un método para detectar una condición asociada con embarazo en una mujer embarazada, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) tratar una muestra biológica obtenida de la mujer con un agente que modifica diferencialmente el ADN metilado y el ADN sin metilar; (b) detectar la cantidad de secuencia de ADN de RASSF1A, CASP8, RARB, SCGB3A1, DAB2IP, PTPN6, THY1, T EFF2 ó PYCARD en la muestra; y (c) comparar la cantidad de la secuencia de ADN con un control estándar, en donde un incremento del control indica la presencia o un riesgo incrementado por desarrollar la condición asociada con el embarazo.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el agente somete a digestión el ADN sin metilar pero no el ADN metilado.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el agente es una enzima sensible a la met ilación .
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la enzima sensible a la metilación es una enzima de restricción sensible a la metilación.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado la enzima de restricción sensible a la metilación es Hpa II o BstU I.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el agente comprende bisulfito.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la etapa (b) comprende un proceso de amplificación .
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el proceso de amplificación es una reacción en cadena de polimerasa (PCR) .
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la PCR es PCR en tiempo real.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la condición asociada con el embarazo es preeclampsia , labor de pretérmino o retardo de crecimiento intrauterino (IUGR) .