CN109825597A - 食管癌前病变miRNAs标志物组、应用与诊断系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食管癌前病变miRNAs标志物组、应用与诊断系统。本发明所述标志物组包括以下miRNAs：hsa‑miR‑17‑5p、hsa‑miR‑21‑5p、hsa‑miR‑93‑5p、hsa‑miR‑25‑3p、hsa‑miR‑103a‑3p、hsa‑miR‑106b‑5p、hsa‑miR‑151‑3p和hsa‑miR‑181a‑5p。本发明所述miRNAs组合在检测食管癌前病变方面具有特异性和灵敏度高，无创、检测便捷、周期短和费用低等优点。

Description

食管癌前病变miRNAs标志物组、应用与诊断系统

技术领域

本发明涉及医学检验和医学诊断领域，具体而言，涉及食管癌前病变miRNAs标志物组、应用与诊断系统。

背景技术

食管癌(esophageal carcinoma,EC)是全世界高发的消化道恶性肿瘤之一,全世界每年约有40万人死于本病，严重危害民众健康；我国亦属于食管癌高发地区，据悉，我国每10万人中有22.14人发病，16.77人死亡，位居恶性肿瘤死亡率的第4位。食管癌具有抵抗放化疗、局灶复发或远端转移的特性，五年生存率约为15-25％。鉴于食管癌的高发性以及高死亡率，优化食管癌前病变的诊断方法，对患者的治疗和预后具有重要意义。

食管癌前病变患者的症状不明显，通常表现为进行性吞咽困难。内窥镜结合活性检测是目前最为主要的临床诊断手段，辅以CT检查和血清学检查。但内窥镜+活性检测的成本比较高，且受试者在接受内窥镜检查之前，需要检测血型，凝血功能和病毒等各项指标，检测的成本表较高，周期相对比较长；而食管癌血清学检测没有特异的标志物，灵敏度和特异性都比较差。总而言之，目前的食管癌前病变在检测成本、对患者的友好度、以及检测结果的准确性方面仍存在诸多不尽如人意的地方。

miRNA(microRNA)是一类非编码小RNA，其一般由19-24个核苷酸组成，平均长度为22bp，广泛存在于真核生物，其作为内源性调节因子，在转录后水平抑制靶mRNA表达。目前研究表明，miRNA与疾病密切相关，例如，miRNA参与多种肿瘤的发生和转移。同时，miRNA广泛存在于组织细胞和血清、血浆等体液中，其种类和数量可随生理状况或疾病而不同；生化分析显示miRNA在血清/血浆等体液中稳定性好；另外，与蛋白质相比，miRNA的检测不需要制备抗体，且便于精确定量。因此，miRNA有望成为优质的疾病诊断标志物，尤其有望成为优质的非侵入式疾病诊断标志物。鉴于受试者在食管癌前病变确诊中的受益，以及现有诊断方法的不足之处，获得能够指示食管癌前病变的miRNA具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供miRNAs标志物的检测试剂在制备食管癌前病变的诊断试剂和/或试剂盒中的应用，根据所述应用可获取能够准确且灵敏地检测食管癌前病变的诊断试剂和/或试剂盒。

本发明的第二目的在于提供根据前述应用制备而成的食管癌前病变的诊断试剂和/或试剂盒。

本发明的第三目的在于提供一种食管癌前病变诊断系统，所述诊断系统可准确、灵敏地检测受试者是否患有食管癌前病变。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

miRNAs标志物组的检测试剂在制备食管癌前病变的诊断试剂和/或试剂盒中的应用，所述miRNAs标志物组包括8个miRNAs：hsa-miR-17-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-151-3p和hsa-miR-181a-5p。

在一些具体的实施方式中，所述食管癌前病变为高级别瘤变或低级别瘤变，优选为高级别瘤变；或者，所述食管癌前病变为无明显症状的食管癌前病变。

在一些具体的实施方式中，所述8个miRNAs为体液miRNA，优选地，所述体液为血清或血浆。

在一些具体的实施方式中，所述食管癌前病变的诊断样本为无症状受试者或者疑似食管癌前病变患者的样本。

在一些具体的实施方式中，所述hsa-miR-17-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-151-3p和hsa-miR-181a-5p的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～8所示。

在一些具体的实施方式中，所述检测试剂包括所述miRNAs标志物的Ct值检测试剂；优选地，所述Ct值检测试剂包括PCR引物对和检测探针，可选地，所述检测探针为Taqman探针。

本发明还涉及根据前述应用制备而成的食管癌前病变的诊断试剂和/或试剂盒。

本发明还涉及一种食管癌前病变诊断系统，所述系统包括信息获取模块、计算模块和诊断模块，其中：

所述信息获取模块用于执行获取受试者检测信息的操作，所述检测信息包括前述标志物组的Ct值，所述Ct值经内参miRNA标准化；

所述计算模块用于执行将所述标志物组的Ct值代入基于标志物组的Ct值建立的诊断模型，获取模型值的操作；

所述诊断模块用于执行根据所述模型值判断所述受试者是否为食管癌前病变患者的操作，如果所述受试者的模型值大于截断值，则判断所述受试者为食管癌前病变患者，优选地，所述食管癌前病变患者为高级别瘤变患者，否则，则判断所述受试者为正常受试者。

在一些具体的实施方式中，所述受试者为无诊断受试者或无明显症状受试者。

在一些具体的实施方式中，所述诊断模型的计算公式如下所示：

logit(P)＝k1×Ct_{(hsa-miR-17-5p)}－k2×Ct_{(hsa-miR-21-5p)}－k3×Ct_{(hsa-miR-25-3p)}+k4×Ct_{(hsa-miR-93-5p)}－k5×Ct_{(hsa-miR-103a-3p)}－k6×Ct_{(hsa-miR-106b-5p)}－k7×Ct_{(hsa-miR-151-3p)}+k8×Ct_{(hsa-miR-181a-5p)}－k9；

其中，k1取0.008～0.009，k2取0.18～0.19，k3取0.97～0.98，k4取0.97～0.98，k5取0.34～0.35，k6取0.29～0.3，k7取0.19～0.2，k8取0.22～0.03，k9取3.1～3.2；

所述截断值取-0.09～-0.07。

在一些具体的实施方式中，k1取0.0081，k2取0.183，k3取0.974，k4取0.973，k5取0.347，k6取0.298，k7取0.194，k8取0.226，k9取3.196；

所述截断值取-0.08。

在一些具体的实施方式中，所述诊断系统还包括检测模块，所述检测模块用于执行检测前述标志物组的Ct值的步骤。

在一些具体的实施方式中，所述诊断系统还可用于食管癌诊断。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所述miRNAs标志物组合填补了目前国际、国内缺少利用miRNAs组合检测食管癌前病变的空白，根据本发明所述miRNAs检测试剂制备的食管癌前病变诊断试剂或试剂盒能准确、灵敏地检测食管癌前病变；

(2)本发明所述食管癌前病变miRNAs标志物组合在检测时只需要100-200μl血清，对患者损伤小、检测便捷、实验周期短，且miRNAs表达相对比较稳定，检测结果不会产生较大的波动，检测结果准确。

(3)本发明所述食管癌前病变miRNAs标志物组合与食管癌传统诊断手段内窥镜检查相比，具有无创、非侵入性的特点，同时，本发明所述miRNAs标志物组合的检测费用约为300元/人，显著低于内窥镜检查总费用(600元/人)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2所述miRNAs组合对食管癌的诊断结果；

图2为实施例2所述miRNAs的风险评分对健康受试者与食管癌前病变(低级别瘤变+高级别瘤变)、食管癌各阶段的区分情况，其中healthy表示健康受试者，Pre表示食管癌前病变患者(低级别瘤变+高级别瘤变)，Ⅰ表示食管癌Ⅰ期患者，Ⅱ表示食管癌Ⅱ期患者，Ⅲ表示食管癌Ⅲ期患者，Ⅳ表示食管癌Ⅳ期患者；

图3为实施例2所述miRNAs的风险评分对健康受试者与食管癌前病变(高级别瘤变)、食管癌各阶段的区分情况，其中healthy表示健康受试者，HGIN表示食管癌前病变患者(高级别瘤变)，Ⅰ表示食管癌Ⅰ期患者，Ⅱ表示食管癌Ⅱ期患者，Ⅲ表示食管癌Ⅲ期患者，Ⅳ表示食管癌Ⅳ期患者。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例建立一种检测受试者血清中hsa-miR-17-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-151-3p和hsa-miR-181a-5p的表达量的方法，其中，前述miRNAs的成熟体序列如表1所示。

表1 miRNAs成熟体的核苷酸序列

名称	序列	SEQ ID NO：
			hsa-miR-17-5p	CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG	1
hsa-miR-21-5p	UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA	2
			hsa-miR-93-5p	AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG	3
hsa-miR-25-3p	CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA	4
			hsa-miR-103a-3p	AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA	5
hsa-miR-106b-5p	UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU	6
			hsa-miR-151-3p	CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG	7
hsa-miR-181a-5p	AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU	8

前述miRNA采用qRT-PCR的方式进行检测，具体检测方法包括以下步骤：

(1)使用凯杰公司的试剂盒(miRNeasy Serum/Plasma kit)提取血清样本中提取RNA：取250μl血清样本，以10000RPM离心5分钟，将血清样本分离为上清液和沉积在离心管底部的细胞碎片。从离心管中取200μl上清液转移至RNA酶-free的离心管中，将1000μlQIAzol裂解液加入至前述转移有上清液的离心管中，依照miRNeasy Serum/Plasma kit的说明书书进行操作，最后用30μl RNA酶-free水溶解提取产物，并于-80℃冻存备用。

(2)反转录miRNA：利用茎环引物和TaqMan MicroRNA反转录试剂对步骤(1)获取的RNA样本进行miRNAs的反转录。反转录的反应体系如下所示：总体系为6μl，由0.6μl 10×反转录缓冲液、1.2μl 5×反转录引物、0.42μlMulti Scribe TM Reverse Transcriptase、0.06μl 100mM dNTPs、0.06μl RNA酶抑制剂、1.2μl RNA样本和2.46μl RNA-free水组成。反转录的反应条件如下所示：第一步，16℃下反应30分钟；第二步，42℃下反应30分钟；第三步，85℃下反应5min。反应结束后，将产物在-20℃下保存。

(3)通过qRT-PCR(定量PCR)检测miRNAs的表达丰度

定量PCR仪：QuantStudio DX仪器(ABI公司)。样本重复次数：2次/每个样本。具体的定量PCR反应体系如下所示：总体系为10μl，由0.5μl 20×TaqMan small RNA assay、3μlproduction RT reaction、5μl TaqMan Universal Master Mix II(不含尿嘧啶糖苷酶)和1.5μl RNase-free水组成。

所述qRT-PCR的反应程序如下所示：第一步，50℃反应2分钟；第二步，95℃反应10分钟；第三步，95℃反应15s，60℃反应60s(共40个循环)。

根据qRT-PCR的结果计算miRNA表达量，具体公式如下所示：miRNAs表达量(-deltaCT)＝CT_目标miRNA－CT_内参。所述目标miRNA为miR-423-5p。

实施例2

本实施例检测实施例1所述miRNAs在健康受试者与食管癌患者血清样本中的表达水平，建立并验证逻辑回归模型。具体内容如下所示：

1.受试者

健康受试者(族群：中国人群)：健康状态良好、未患肿瘤的受试者，共200名，在随机分组中，按性别和年龄随机分组。

食管癌受试者(族群：中国人群)：未经过放化疗及手术治疗的食管癌患者，共200名，按性别，年龄和临床分期匹配随机分组。

2.训练集和验证集

训练集和验证集为性别和临床分期匹配的随机分组。

3.miRNAs具体检测方法

参照实施例1所述方法检测受试者血清miRNAs表达水平。

4.建立和验证诊断模型

基于训练集的前述8种miRNAs检测结果，建立逻辑回归模型：logit(P)＝0.00810×Ct_{(hsa-miR-17-5p)}-0.183×Ct_{(hsa-miR-21-5p)}-0.974×Ct_{(hsa-miR-25-3p)}+0.973×Ct_{(hsa-miR93-5p)}-0.347×Ct_{(hsa-miR103-3p)}-0.298×Ct_{(hsa-miR-106b-5p)}-0.194×Ct_{(hsa-miR-151-3p)}+0.226×Ct_{(hsa-miR-181a-5p)}-3.196，截断值为-0.08。并在验证集中进行验证。

本实施例还对受试者其他血清学标志物SCC-Ag和CEA进行检测，比较本发明所述miRNAs标志物组合与前述血清学标志物对食管癌的诊断效果。具体结果参见图1。根据图1所示信息可知，本发明所述miRNA组合对食管癌诊断的特异度为0.9，灵敏度为0.92，准确性为0.9，明显优于SCC-Ag和CEA的诊断效果。

本实施例还利用前述逻辑回归模型计算健康受试者食管癌前病变患者、食管癌各期患者的风险评分(Risk score)，具体检测结果参见图2-3。

1.受试者

健康受试者(族群：中国人群)：健康状态良好、未患肿瘤的受试者，共200名，在随机分组中，按性别和年龄随机分组。

食管癌前病变患者(族群：中国人群)：临床内窥镜+组织病理检测确定，其中8例低级别瘤变和13例低级别瘤变。

食管癌受试者(族群：中国人群)：未经过放化疗及手术治疗的食管癌患者，共200名，按性别，年龄和临床分期匹配随机分组。

根据图2-3显示：健康受试者平均Risk Score为-2.02，标准差2.35；食管癌前病变包括低级别瘤变和高级别瘤变(LGIN+HGIN)平均Risk Score为-0.81，标准差1.69(图2)；食管癌前病变的高级别瘤变(HGIN)平均Risk Score为-0.63，标准差2.38(图3)。根据图2-3所示结果可知，miRNAs标志物组合可以很好的区分健康受试者与食管癌前病变的患者(P<0.05)或者区分健康受试者与高级别瘤变(P＜0.05)，在统计学上具有显著差异，本发明所述miRNAs标志物组能够作为食管癌前病变标志物。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.miRNAs标志物组的检测试剂在制备食管癌前病变的诊断试剂和/或试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNAs标志物组包括8个miRNAs：hsa-miR-17-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-151-3p和hsa-miR-181a-5p。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述食管癌前病变为高级别瘤变或低级别瘤变，优选为高级别瘤变；或者，所述食管癌前病变为无明显症状的食管癌前病变。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述8个miRNAs为体液miRNA，优选地，所述体液为血清或血浆。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述食管癌前病变的诊断样本为无症状受试者或者疑似食管癌前病变患者的样本。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述hsa-miR-17-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-151-3p和hsa-miR-181a-5p的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～8所示。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括所述miRNAs标志物的Ct值检测试剂；优选地，所述Ct值检测试剂包括PCR引物对和检测探针，可选地，所述检测探针为Taqman探针。

7.根据权利要求1～6任一项所述应用制备而成的食管癌前病变的诊断试剂和/或试剂盒。

8.一种食管癌前病变诊断系统，其特征在于，所述系统包括信息获取模块、计算模块和诊断模块，其中：

所述信息获取模块用于执行获取受试者检测信息的操作，所述检测信息包括权利要求1所述标志物组的Ct值，所述Ct值经内参miRNA标准化；

所述计算模块用于执行将所述miRNAs标志物组的Ct值代入基于miRNAs标志物组的Ct值建立的诊断模型，获取模型值的操作；

所述诊断模块用于执行根据所述模型值判断所述受试者是否为食管癌前病变患者的操作，如果所述受试者的模型值大于截断值，则判断所述受试者为食管癌前病变患者，优选地，所述食管癌前病变患者为高级别瘤变患者，否则，则判断所述受试者为正常受试者。

9.根据权利要求8所述的诊断系统，其特征在于，所述受试者为无症状受试者或无明显诊断受试者。

10.根据权利要求8或9所述的诊断系统，其特征在于，所述诊断模型的计算公式如下所示：

logit(P)＝k1×Ct_{(hsa-miR-17-5p)}－k2×Ct_{(hsa-miR-21-5p)}－k3×Ct_{(hsa-miR-25-3p)}+k4×Ct_{(hsa-miR-93-5p)}－k5×Ct_{(hsa-miR-103a-3p)}－k6×Ct_{(hsa-miR-106b-5p)}－k7×Ct_{(hsa-miR-151-3p)}+k8×Ct_{(hsa-miR-181a-5p)}－k9；

其中，k1取0.008～0.009，k2取0.18～0.19，k3取0.97～0.98，k4取0.97～0.98，k5取0.34～0.35，k6取0.29～0.3，k7取0.19～0.2，k8取0.22～0.03，k9取3.1～3.2；

所述截断值取-0.09～-0.07；

优选地，k1取0.0081，k2取0.183，k3取0.974，k4取0.973，k5取0.347，k6取0.298，k7取0.194，k8取0.226，k9取3.196；所述截断值取-0.08；

优选地，所述诊断系统还包括检测模块，所述检测模块用于执行检测权利要求1所述miRNAs标志物的Ct值的步骤。