CN111206094B - 用于结肠、直肠癌无创早期诊断的piRNA生物标志物及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于结肠、直肠癌无创早期诊断的piRNA生物标志物及检测试剂盒，所述piRNA标志物包括piRNA020619和piRNA020450。这两种piRNA在结肠、直肠癌患者血清中的表达量显著高于在健康人血清中的表达量，用于诊断结肠、直肠癌时，具有很高的灵敏度和特异性。本发明所提供的试剂盒可以快速准确的区分结肠、直肠癌患者血清样本和健康人血清样本。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及用于人结肠、直肠癌诊断的piRNA生物标志物及基于该生物标志物构建的检测试剂盒。
背景技术
结肠、直肠癌是临床最为常见的恶性肿瘤之一。全球每年新发病例超过140万，死亡病例超过70万。在我国，结肠、直肠癌的发病率和死亡率逐年攀升，每年新增病例超过25万，死亡病例超过14万，严重威胁着人民的健康和生命，已成为一项亟待解决的公共卫生问题。
结肠、直肠癌患者的预后与肿瘤分期关系密切。早期患者的5年生存率超过80％，而晚期患者的5年生存率不足20％。不幸的是，结肠、直肠癌往往起病隐匿，早期无明显症状，不易被发现，绝大多数患者都是在出现便血、腹痛等症状三个月到半年后才到医院就诊。此时疾病已处于中、晚期，癌细胞已向周围侵袭甚至向远处转移，失去了最佳的手术治疗时机。目前，结肠、直肠癌患者的整体预后和生存质量均堪忧。对早期结肠、直肠癌患者及时发现、确诊，并予以积极治疗，是延长患者生存期、提高患者生存质量的关键所在。
目前，对结肠、直肠癌患者进行早期筛查的主要途径是粪便隐血试验结合肠镜检查。然而，粪便潜血试验灵敏度低、特异性差，在消化性溃疡、上消化道出血、较大的肠息肉和腺瘤等良性疾病中，其结果也会呈现阳性，从而将一些非肿瘤患者误认为肿瘤患者，给病人带来较大的心理压力和后续繁琐的检查，消耗患者大量精力财力。另外，只有当出血达到一定量时，才能在粪便中检测到潜血，因此粪便潜血试验检出的多为晚期结肠、直肠癌患者。结肠镜检查是结肠、直肠癌诊断的金标准。但其检查程序复杂、价格昂贵、给患者带来较大痛苦，且有心脏病及凝血功能障碍等疾病的患者不能进行结肠镜检查。因此，结肠镜检查不是首选的筛查手段，不适合用于无症状人群的大规模筛查。
血清肿瘤标志物检查具有简便、无创、经济的优点，是对无症状人群进行大规模筛查的理想手段。但临床上常用的结肠、直肠癌血清肿瘤标志物，如CEA、CA-199等，其含量在很多早期患者血清中并不升高，无法满足早期筛查的需要，目前主要用于疗效观察和复发监测。因此，寻找新的、可诊断早期结肠、直肠癌患者的血清标志物具有重要临床意义。
piRNA是新发现的一类单链非编码小RNA，长度24-33nt，至今在人类已鉴定出近3万个成员，不同成员表达于不同组织中，形成该组织特异的“piRNA签名”，它们在抑制转座因子活动、维持基因组印记、调节基因组DNA甲基化模式和组蛋白修饰模式中发挥重要作用，是保持细胞内部稳态的关键因子。piRNA调控的异常可引起转座因子激活、基因组印记丢失、DNA甲基化和组蛋白修饰模式紊乱，进而诱发一系列癌基因、抑癌基因的表达失调和序列改变，导致肿瘤的发生和发展。目前已在胃癌、结肠癌、乳腺癌等一些肿瘤组织中发现piRNA的表达发生了显著的异常改变。特别值得注意的是，在肿瘤发生的早期阶段，肿瘤组织中一些piRNA的表达较之正常组织就有了明显的异常改变。由于肿瘤组织的坏死和肿瘤细胞的主动分泌，肿瘤组织中piRNA表达的异常也可以反映到患者血液当中，指示着肿瘤的发生和发展。
最近的研究证明，人血清当中存在的piRNA比较稳定，经过体外长期保存和反复冻融基本不发生降解。这一特点使得piRNA很适合作为一种血清标志物分子。寻找到早期结肠、直肠癌患者血清中表达异常的piRNA，建立起稳定高效的检测方法，就可以为结肠、直肠癌的大规模普查，为结肠、直肠癌患者的无创早期诊断提供新的有力武器，将极大的延长结肠、直肠癌患者的生存期、提高他们的生存质量。
发明内容
本发明的第一个内容是提供一种用于结肠、直肠癌无创早期诊断的血清肿瘤标志物。
本发明所述的标志物由两种piRNA分子组成：piRNA020619和piRNA020450。所述piRNA020619的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO.1，所述piRNA020450的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO.2。所述piRNA生物标志物在早期结肠、直肠癌患者血清中的表达显著高于在健康人血清中的表达。
本发明的第二个方面是提供一种用于诊断早期结肠、直肠癌和区分早期结肠、直肠癌患者血清与健康人血清的试剂盒。
所述试剂盒包含上述两种piRNA生物标志物、对两种piRNA生物标志物进行荧光定量PCR检测的特异性扩增引物以及一个回归模型。
本发明的优势在于：
(1)本发明首次发现了血清中的piRNA020619和piRNA020450分子可作为结肠、直肠癌的早期诊断标志物，确定了新的结肠、直肠癌无创早期诊断指标。
(2)piRNA020619和piRNA020450联合作为诊断标志物，具有灵敏度高、特异性强的优点，优于CEA、CA19-9等传统的结肠、直肠癌血清标志物。
(3)对早期结肠、直肠癌具有很高的检出率，可用于无症状人群的大规模筛查，实现结肠、直肠癌的早发现、早诊断、早治疗。
(4)一些血液中的microRNA分子也被报道可用于结肠、直肠癌的无创诊断，但它们一般需要四种或五种分子的联合才有诊断参考价值，临床应用起来较为繁琐，检测成本较高。本发明提供的生物标志物，只需要检测两种piRNA分子，可以极大的节省检验人员的操作时间、减轻患者的经济负担。
(5)本发明提供了可用于结肠、直肠癌早期诊断的试剂盒，该试剂盒可以快速、低成本、高灵敏地获得检测结果，并且不会对患者造成创伤，利于临床上的广泛应用。
附图说明
图1和图2分别显示piRNA020619和piRNA020450在早期结肠、直肠癌患者血清和健康人血清中的表达水平；
图3和图4分别显示piRNA020619和piRNA020450单独用于区分早期结肠、直肠癌患者血清和健康人血清的ROC曲线。
图5显示piRNA020619和piRNA020450联合用于区分早期结肠、直肠癌患者血清和健康人血清的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。
实施例1：结肠、直肠癌患者血清中表达异常的piRNA的初步筛选
1、血清样本的收集
选择内蒙古医科大学附属医院2015年7月至2018年5月间确诊的早期结肠、直肠癌患者(0-II期)86例为患者组，选择经体检确认为健康的66人为对照组。所有结肠、直肠癌患者均为初次确诊患者，取血之前未进行手术、放疗及化疗。对照组个体未患有恶性肿瘤及其它疾病，同时年龄、性别与患者组个体匹配。
清晨空腹状态下，抽取外周血5ml至促凝采血管中，静置30min，于4℃、3900rmp/min离心10min，吸取上部淡黄色的血清至1.5ml无酶无菌的离心管中，于4℃、12000rmp/min离心10min,吸取上清至新的1.5ml无酶无菌离心管中。-80℃冰箱保存。
2、高通量测序
取6名患者和6名年龄、性别匹配的健康人的血清样本，提取总RNA，进行浓度、纯度和完整性检测，合格后送深圳华大基因进行测序。使用的测序方法为BGISEQ-500深度测序，该测序方法可以在短时间内获得大量的小RNA信息。将测得的序列与已知piRNA数据库进行比对，获得结肠、直肠癌患者和健康人血清中的piRNA表达谱，将两者进行比较，得到一系列表达有显著差异的piRNA分子，其中包括piRNA020619和piRNA020450。
实施例2：差异表达的血清piRNA的验证及其作为结肠、直肠癌诊断生物标志物价值的评估
1、RNA提取
取80名患者和60名年龄、性别匹配的健康人的血清样本，用TRIzol法提取血清总RNA：每200μL血清，加入1mL TRIzol，震荡混匀，室温放置5min；加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，静置3min；4℃、10000rmp/min离心10min，把上层水相转移到新的管中；加入等体积异丙醇，混匀，静置20min；4℃、10000rmp/min离心10min，去上清；用1mL 75％乙醇洗涤沉淀；4℃、5000r/mim离心5min，弃去液体；室温晾干后，加入20μL无酶水，溶解RNA，取2μL RNA在微量核酸分析仪上测定RNA浓度及A260/280比值。比值在1.7到2.0之间的样本视为达到质量要求，用于反转录实验。
2、反转录
以100ng总RNA为模板，按照TransScript miRNA First-Strand cDNASynthesisSuperMix说明书配制20μL反转录反应体系：2×TS miRNA Reaction Mix 10.0μL，RTEnzyme Mix 2.0μL，RNA模板加无酶水8.0μL。配置过程在冰上进行。37℃，60min；95℃,10min,合成cDNA。cDNA于-20℃保存备用。
3、荧光定量PCR检测piRNA表达量
使用天根FP411-02扩增试剂建立20μL荧光定量PCR扩增反应体系：2×miRcutePlusmiRNA PreMix(SYBR&ROX)10μL，PCR正向引物0.4μL，PCR反向通用引物0.4μL，上述cDNA2.0μL，无酶水7.2μL。
反应条件为：95℃15min，(94℃20s，60℃34s)×40个循环，采用ABI7500荧光定量PCR仪进行荧光定量检测，反应结束由计算机自动计算各反应管内的Ct值。
4、piRNA表达水平的计算
以U6作为内参，采用2-△Ct法分析计算piRNA的相对表达量：ΔCt患者＝Ct患者piRNA-Ct患者内参，ΔCt健康＝Ct健康piRNA-Ct健康内参，患者血清中piRNA的相对表达量＝2-△Ct患者，健康人血清中piRNA的相对表达量＝2-△Ct健康。ΔCt值越高表示该piRNA表达水平越低。。
经分析计算，piRNA020619在健康人血清中的平均相对表达量为1.85(0.25,4.93)，在早期结肠、直肠癌患者血清中的平均相对表达量为9.51(1.04，63.71)；piRNA020450在健康人血清中的平均相对表达量为2.48(0.02,5.92)，在早期结肠、直肠癌患者血清中的平均相对表达量为10.16(0.40,60.05)。
实施例3：受试者工作特征曲线(ROC)分析
构建ROC曲线来分析两个血清piRNA区分早期结肠、直肠癌患者和健康人的诊断能力。piRNA020619的曲线下面积为0.883(95％置信区间：0.822-0.944)，在最佳的cutoff值下，其灵敏度和特异性分别为80.6％和82.4％。piRNA020450的曲线下面积为0.774(95％置信区间：0.694-0.855)；在最佳的cutoff值下，其灵敏度和特异性分别为71.2％和74.0％。
进一步，将这两个piRNA在血清中的相对表达量引入logistic回归方程，建立logit(P)判别公式：logit(P)＝-3.332+0.703×piRNA020619+0.327×piRNA020450。基于该判别公式的验证，发现piRNA020619和piRNA020450联合使用，对早期结肠、直肠癌具有很高的诊断灵敏度和特异性：ROC曲线下面积可以达到0.924(95％置信区间：0.881-0.968)，灵敏度和特异性分别为86.0％和82.2％。该结果显著优于传统肿瘤标志物CEA、CA19-9(参见”Nishiumi,Shin,et al.A novel serummetabolomics-based diagnosticapproach forcolorectal cancer.PloS one 7.7(2012):e40459.”)，该文献报道，用于早期结肠、直肠癌的诊断时，CEA和CA19-9的灵敏度分别只有30.6％和5.6％。
实施例4：人结肠、直肠癌诊断用试剂盒
上述实施例表明，血清piRNA020619和piRNA020450联合起来对结肠、直肠癌检测具有非常高的灵敏度和特异性。因此，可基于piRNA020619和piRNA020450制作用于人结肠、直肠癌无创早期诊断的试剂盒。该试剂盒包括piRNA020619和piRNA020450特异性的扩增引物、Taq DNA聚合酶、反转录酶、缓冲液、无酶水、以及一个回归模型
logit(P)＝-3.332+0.703×piRNA020619+0.327×piRNA020450。下面为扩增引物的一种设计：
piRNA020619:5’-GTATATGGCATGTGGGCTAGTTTCAGACAG-3’
piRNA020450:5’-GGGAGATGAAGAGGACAGTGACTGAG-3’
引物的设计是本领域常规技术手段，可以设计成其他序列。
序列表
<110> 内蒙古医科大学附属人民医院
<120> 用于结肠、直肠癌无创早期诊断的piRNA生物标志物及检测试剂盒
<141> 2018-11-20
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
guauauggca ugugggcuag uuucagacag gu 32
<210> 2
<211> 30
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
gggagaugaa gaggacagug acugagagac 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
gtatatggca tgtgggctag tttcagacag 30
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
gggagatgaa gaggacagtg actgag 26
Claims (4)
1.一种用于人结肠、直肠癌早期诊断的piRNA生物标志物，所述piRNA生物标志物由piRNA020619和piRNA020450两种短链RNA分子组成，它们的核苷酸序列分别见序列表SEQID NO.1和SEQ ID NO.2。
2.两条用于人结肠、直肠癌早期诊断的piRNA特异性扩增引物，一条为piRNA020619的特异性扩增引物，序列见序列表SEQ ID NO.3，另一条为piRNA020450的特异性扩增引物，序列见序列表SEQ ID NO.4。
3.权利要求1中所述的piRNA生物标志物和权利要求2中所述的特异性扩增引物在制备人结肠、直肠癌诊断试剂中的用途。
4.一种人结肠、直肠癌早期诊断试剂盒，该试剂盒包含有权利要求2中所述的piRNA特异性扩增引物。
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-
2018
- 2018-11-21 CN CN201811391946.XA patent/CN111206094B/zh active Active
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Also Published As
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