CN103387989B - 上皮细胞粘附分子的核酸适体EpCAM D及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
上皮细胞粘附分子的核酸适体EpCAM？D及其制备方法，涉及一种核酸。提供具有高特异性和高亲和力的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体及其制备方法与应用。所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体具有G四聚体结构或者茎环结构，制备方法包括：设计并合成单链DNA随机寡核苷酸库，筛选目的寡核苷酸序列，并通过流式分析法鉴定其与靶蛋白结合的特异性和亲和力。筛选获得的核酸适体无毒性，分子量小，渗透性好，易于合成与标记，只特异性识别EpCAM蛋白，并且特异性识别表达EpCAM蛋白的细胞系，对不表达此蛋白的细胞系不具有识别功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸，特别涉及EpCAM(Epithelialcelladhesionmolecule)上皮细胞粘附分子的核酸适体制备方法及其在肿瘤早期检测、治疗和预后中的应用。
背景技术
EpCAM(Epithelialcelladhesionmolecule)上皮细胞粘附分子属于黏附分子家族，也称为17-A，ESA，EGP40，Trop-1，KSA,CD326，TACSTD1，CO17-1A，GA733-2等。EpCAM是一种由肿瘤相关钙信号转导1(tumor-associatedcalciumsignaltransducer1,TACSTD1)基因编码的一个分子量30-40kDa的单次跨膜蛋白，参与调节细胞粘附、介导信号转导、细胞迁移、增殖和分化等功能（1、KurtzJE，DufourP.Adecatumumab:ananti-EpCAMmonoclonalantibody，fromthebenchtothebedside［J］.ExpertOpinBiolTher，2010，10(6):951-958；2、TrzpisM，McLaughlinPM,deLeijLM，etal.Epithelialcelladhesionmolecule.Morethanacarcinomamarkerandadhesionmolecule［J］.AmJPathol,2007，171(2):386-395）。
EpCAM表达在人部分正常上皮细胞和大多数恶性上皮细胞表面，目前普遍认为它对肿瘤的生物学特性起重要作用。病理情况下，EpCAM几乎表达于所有的腺癌中，包括结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝细胞癌和视网膜母细胞瘤（1、KurtzJE，DufourP.Adecatumumab:ananti-EpCAMmonoclonalantibody，fromthebenchtothebedside［J］.ExpertOpinBiolTher，2010，10(6):951-958）。研究发现EpCAM也是一些肿瘤干细胞的标记物，Kimura等的研究发现EpCAM阳性的肝癌干细胞能够诱导免疫缺陷的小鼠发生肿瘤（3、KimuraO，TakahashiT，IshiiN，etal.Characterizationoftheepithelialcelladhesionmolecule(EpCAM)+cellpopulationinhepatocellularcarcinomacelllines［J］.CancerSci，2010，101(10):2145-2155.）。将肝细胞癌EpCAM阳性及阴性亚群细胞分别注射到免疫缺陷的小鼠体内，结果显示形成肿瘤所需的癌细胞数EpCAM阳性者远少于EpCAM阴性者，且注射EpCAM阳性癌细胞的小鼠所产生的肿瘤比注射EpCAM阴性者更大，说明EpCAM阳性的癌细胞致瘤性比EpCAM阴性的癌细胞大。肝细胞癌细胞系中EpCAM阳性的亚群克隆速率远远大于EpCAM阴性的亚群。研究还发现，EpCAM阳性的癌细胞可以分化为EpCAM阳性和阴性的细胞，而EpCAM阴性的癌细胞只能分化为EpCAM阴性的细胞，说明EpCAM阳性的癌细胞具有多项分化的潜能。
肿瘤的复发、转移是其死亡率居高不下的主要原因，循环血肿瘤细胞则是肿瘤复发、转移的根源。及时发现循环血中肿瘤细胞，可以预防肿瘤复发和转移，提高患者生存率，改善预后。EpCAM抗体与芯片技术结合用于分离肿瘤患者外周血中的肿瘤细胞，结果在99.1％(115/116)的血样品中成功分离出数量不等的肿瘤细胞(其中包括所有7例早期前列腺癌患者)；而且循环血肿瘤细胞数的改变与影像学检查的疾病进程高度关联（4、NagratbS，SequistLV，MabeswaranS，eta1.Isolationofrarecirculatingtumourcellsincancerpatientsbymicrochiptechnology.Nature，2007，450(7173)：1235—1239）。但是，抗体由于分子量较大、位阻大、难储存易降解等缺点，很大程度抑制了循环肿瘤细胞的检测。
EpCAM的表达与肿瘤的预后相关，可作为肿瘤靶向治疗的一个靶位点。但是，目前由于EpCAM的免疫治疗由于抗体特异性差、结合力低等原因，临床试验结果不甚理想。因此设计一种高亲和力和高选择性的识别上皮细胞黏附因子EpCAM的分子探针将会对肿瘤的早期诊断、治疗和预后具有重要的意义。
核酸适体是指从人工合成的单链DNA/RNA文库中筛选得到的能够高特异性地和高亲和力地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。核酸适体借助氢键、范德华力、疏水作用等分子间弱作用力形成特殊的三维结构，如发夹、假结、凸环、G-四聚体等，从而特异地识别靶物质甚至影响其生物活性。核酸适体本身特有的生化特性使其在生物医学应用领域具有诸多优势，如靶分子范围广、亲和力与特异性强、合成修饰方便快速、分子量较小、良好的生物兼容性、无毒、体外稳定性好等。核酸适体可以通过配体指数富集系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)筛选获得，其基本原理是在体外人工化学合成一个寡核苷酸文库，包括RNA、ssDNA或修饰的RNA和ssDNA，通过寡核苷酸文库与目标分子的相互作用，结合PCR技术指数级放大与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过几轮或数十轮筛选富集过程，获得高亲和力和高特异性的核酸适体。
发明内容
本发明的第一目的在于提供具有高特异性和高亲和力的上皮细胞粘附分子的核酸适体EpCAMD。
本发明的第二目的在于提供具有高特异性和高亲和力的表达上皮细胞粘附分子的细胞核酸适体。
本发明的第三目的在于提供上皮细胞粘附分子的核酸适体的制备方法。
所述上皮细胞粘附分子EpCAM(Epithelialcelladhesionmolecule)的核酸适体分别命名为EpCAMA、EpCAMB、EpCAMC、EpCAMD与EpCAMCcut，其序列如下：
EpCAMA：
agcgtcgaataccactacagtttggctctgggggatgtggaggggggtatgggtgggagt60
ctaatggagctcgtggtcag80
EpCAMB：
agcgtcgaataccactacagagctcggggttttttggggttttttggggttttggtgggg60
ctaatggagctcgtggtcag80
EpCAMC：
agcgtcgaataccactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctg60
ctaatggagctcgtggtcag80
EpCAMD：
agcgtcgaataccactacagctccggggtttttgggggtttttctggggttttttggggc60
taatggagctcgtggtcag79
EpCAMCcut：
Cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctg。
所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体及基于上述结构做切短、延长、部分碱基替换的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体具有G四聚体结构或者茎环结构。
所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的制备方法，包括以下步骤：
1）合成单链DNA随机寡核苷酸库；以Ni微珠为基质，筛选除去DNA随机寡核苷酸库中的非特异性结合部分，以上皮细胞粘附分子EpCAM微珠筛选得到与上皮细胞粘附分子EpCAM特异结合的核酸序列；
2）将步骤1）所得与上皮细胞粘附分子EpCAM特异结合的核酸序列进行PCR扩增，PCR扩增产物以链酶亲和素微珠为基质进行分离，通过碱变性解链，过滤，纯化，即得用于次轮筛选的单链DNA文库，形成次一级核酸文库；
3）将步骤2）所得的单链DNA文库进行下一轮筛选，经过12轮筛选后获得目的寡核苷酸序列；克隆测序所述目的寡核苷酸序列，并通过流式分析法鉴定其与靶蛋白结合的特异性和亲和力。
在步骤1）中，所述单链DNA随机寡核苷酸库的两端为固定序列，中间为40个碱基的随机序列，即为5′-AGCGTCGAATACCACTACAG-40nt-CTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3′，库容量为1015以上。
在步骤2）中，所述PCR扩增的引物为：
引物1：5′-FAM-AGCGTCGAATACCACTACAG-3′；
引物2：5′-Biotin-CTGACCACGAGCTCCATTAG-3′；
所述PCR扩增产物为3’端带有生物素标记、5’端带有FAM标记的双链DNA文库。
所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体作为与表达EpCAM蛋白的细胞系的核酸适配体。
本发明所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的制备方法包括：设计并合成单链DNA随机寡核苷酸库，筛选目的寡核苷酸序列，并通过流式分析法鉴定其与靶蛋白结合的特异性和亲和力。筛选获得的核酸适体无毒性，分子量小，渗透性好，易于合成与标记，只特异性识别EpCAM蛋白，并且特异性识别表达EpCAM蛋白的细胞系，对不表达此蛋白的细胞系不具有识别功能。
本发明的优点在于：首先，通过真核表达的His标签的识别上皮细胞黏附因子EpCAM的蛋白，进而通过Hid与Ni的亲和反应把靶蛋白固定到微珠上，避免了传统方法中通过共价反应偶联到微珠上对蛋白质构象的影响，保证了蛋白的天然构象，保证筛选得到的核酸适配体可以识别膜上表达上皮细胞黏附因子EpCAM的蛋白。其次，微珠-流式细胞分析法相结合的筛选方法使得筛选与检测更为简便快速。而且，筛选获得的核酸适体无毒性，分子量小，渗透性好，易于合成与标记。通过SELEX方法筛选获得的核酸适体只特异性识别皮细胞粘附分子EpCAM，对其他同源蛋白不具有识别功能。上述优点使得所述核酸适体成为皮细胞粘附分子EpCAM检测的有力工具，识别上皮细胞黏附因子EpCAM的核酸适配体在肿瘤的早期诊断、循环肿瘤细胞的捕获、组织、活体成像和癌症治疗中具有重要的意义。
附图说明
图1为流式细胞仪检测筛选进程中DNA随机寡核苷酸库对上皮细胞黏附因子EpCAM的富集图。在图1中，横坐标为荧光强度，纵坐标为微珠数，曲线A为初始DNA随机寡核苷酸库，曲线B为第5轮DNA随机寡核苷酸库，曲线C为第12轮DNA随机寡核苷酸库。
图2为流式细胞仪检测筛选进程中DNA随机寡核苷酸库对于Ni微珠的富集图。在图2中，横坐标为荧光强度，纵坐标为微珠数，曲线A为初始DNA随机寡核苷酸库，曲线B为第5轮DNA随机寡核苷酸库，曲线C为第12轮DNA随机寡核苷酸库。
图3为流式细胞仪测定所得第12轮DNA随机寡核苷酸库对上皮细胞黏附因子EpCAM的解离常数。在图3中，横坐标为DNA浓度（nM），纵坐标为平均荧光强度，●代表初始DNA随机寡核苷酸库，▽代表第12轮DNA随机寡核苷酸库。
图4为流式细胞仪测定所得核酸适体EpCAMA、EpCAMB、EpCAMC、EpCAMD对上皮细胞粘附分子EpCAM蛋白的偏移。在图4中，横坐标为荧光强度，纵坐标为微珠数。曲线a为0th；b为12th；c为EpCAMA；d为pCAMB；e为pCAMC；f为pCAMD。
图5和6为流式细胞仪测定所得核酸适体EpCAMA、EpCAMB、EpCAMC、EpCAMD对各种细胞系的偏移。在图5和6中，横坐标为荧光强度，纵坐标为微珠数；曲线a为RS；b为EpCAMA；c为EpCAMB；d为EpCAMC；f为EpCAMD。
图7为流式细胞仪测定所得核酸适体EpCAMA对HEK-293T和MDA-MB-231细胞系的解离常数。在图7中，横坐标为DNA浓度（nmol/L），纵坐标为平均荧光强度，●代表MDA-MB-231细胞系，〇代表HEK-293T细胞系。
图8为流式细胞仪测定所得核酸适体EpCAMC对HEK-293T和MDA-MB-231细胞系的解离常数。在图8中，横坐标为DNA浓度（nmol/L），纵坐标为平均荧光强度，〇代表MDA-MB-231细胞系，●代表HEK-293T细胞系。
图9为通过圆二色谱法检测所得EpCAMA、EpCAMB、EpCAMD核酸适体形成平行G四聚体结构。在图9中，横坐标为波长（nm），纵坐标为实测椭圆度（mdeg）；曲线a为EpCAMA；b为EpCAMB；c为pCAMD。
具体实施方式
实施例1体外筛选与上皮细胞粘附分子EpCAM特异结合的核酸适体
1）将合成好的5nmol单链DNA核酸库溶于结合缓冲液（12mmol/LPBS，0.55mmol/LMgCl2）中，进行热处理：95℃加热5min，在冰上放置10min，然后室温下放置10min；
2）将处理好的单链DNA核酸库与Ni微珠进行孵育，收集未与Ni微珠结合的液体；
3）将未与Ni微珠结合的液体与EpCAMNi微珠一起于37℃下孵育40min；
4）使用结合缓冲液洗涤孵育后的EpCAMNi微珠，再将结合了寡核苷酸的EpCAMNi微珠做PCR反应；
PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃30s，53℃30s，68℃30s，扩增10个循环，最后68℃终延伸5min，
引物1：5′-FAM-AGCGTCGAATACCACTACAG-3′；
引物2：5′-Biotin-CTGACCACGAGCTCCATTAG-3′；
5）PCR反应结束后，产物为3’端带有生物素标记，5’端带有FAM标记的双链DNA，加入链酶亲和素微珠，反应30min，然后用0.1mol/LNaOH进行单链化，经脱盐柱纯化即得到用于下一轮筛选的单链DNA文库；
6）之后每轮使用200pmol的单链DNA文库，并且逐步增加洗涤次数以增强筛选强度。共进行12轮筛选，而后通过流式细胞仪检测单链DNA文库的富集情况，结果显示第12轮库与靶蛋白EpCAM有比较明显的结合（参见图1），而与Ni蛋白没有结合（参见图2），最后把第12轮库送去克隆测序。
实施例2以流式分析法检测所得单链DNA与上皮细胞粘附分子EpCAM的结合能力
首先PCR扩增带荧光标记的单链DNA，使用引物2：5′-Biotin-CTGACCACGAGCTCCATTAG-3′与引物3：5′-FAM-AGCGTCGAATACCACTACAG-3′，PCR产物为5’端带有FAM并且3’端带有生物素的双链DNA，加入链酶亲和素微珠，反应30min，然后用0.1mol/LNaOH进行单链化，经脱盐柱纯化即得到用于流式分析的带FAM标记的单链DNA。
使用0nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，20nmol/L，50nmol/L，100nmol/L，200nmol/L浓度梯度的单链DNA与靶蛋白EpCAMNi微珠来测定解离常数（Kd=22.8±6.0）。用200μl结合缓冲液配置上述各浓度的DNA溶液，95℃加热5min，冰上放置10min，然后室温下放置10min。加入155nmol/L的EpCAM微珠，37℃下孵育40min。使用结合缓冲液洗涤微珠3次，而后把微珠重悬在250μL结合缓冲液中。设置未经过筛选的初始DNA随机寡核苷酸库作对照。
使用BD公司的FACSAria流式细胞仪对微珠进行荧光测定，而后用sigmaplot软件作图，计算出所得核酸适体的解离常数（参见图3、7和8）。
实施例3筛选得到核酸适配体与各种细胞系特异结合
1）将合成好的5nmol单链DNA核酸溶于结合缓冲液（12mmol/LPBS，0.55mmol/LMgCl2）中，进行热处理：95℃加热5min，在冰上放置10min，然后室温下放置10min；
2）将处理好的单链DNA核酸与10000个细胞种于24孔板24h进行孵育，37℃下孵育30min或者4℃下孵育40min。
3）孵育好后，去缓冲溶液洗两次，再将细胞刮下来溶于200μL缓冲溶液，使用BD公司的FACSAria流式细胞仪对微珠进行荧光测定（参见图5和6）。
实施例4以圆二色谱法测定所得核酸适体EpCAMA形成平行G四聚体结构
用结合缓冲液配制1μmol/L核酸适体EpCAMA溶液，进行热处理：95℃加热5min，冰上放置10min，然后室温下放置10min。而后使用圆二色谱仪以0.1nm为步长扫描400nm到200nm的CD光谱，重复扫描8次，结果分别在240nm与260nm处形成一个负峰和正峰，此峰型与文献（5、SattanathanParamasivan,IulianRujan,PhilipH.Bolton.CirculardichroismofquadruplexDNAs:Applicationstostructure,cationeffectsandligandbinding,2007,43:324-331.）中报道的平行G四聚体的特征峰吻合，由此可判断所获得的核酸适体EpCAMA具有平行G四聚体结构（参见图9）。
Claims (2)
1.上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，其特征在于所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体命名为EpCAMD，其序列如下：
agcgtcgaataccactacagctccggggtttttgggggtttttctggggttttttggggc60
taatggagctcgtggtcag79
所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体具有G四聚体结构或者茎环结构。
2.如权利要求1所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体在用于上皮细胞粘附分子EpCAM阳性细胞系的检测与识别中的应用，但不用于疾病的诊断和治疗。
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