CN109266606A - 一种提取血浆外泌体的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种提取血浆外泌体的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于提取血浆外泌体的试剂盒，属于分子生物学领域。所述用于提取血浆外泌体的试剂盒包括链霉亲和素修饰的纳米磁珠溶液、生物素修饰的特异性适配体溶液和磁分离装置，所述特异性适配体能与外泌体特异性结合。利用本发明提供的试剂盒提取血浆外泌体，操作简单，对血浆需求量少，提取得到的外泌体浓度高。

Description

一种提取血浆外泌体的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种提取血浆外泌体的试剂盒及其应用
背景技术
外泌体是直径在40～100nm的膜状囊泡结构，包含有蛋白质，RNA和脂质。外泌体涉及到一系列的生物功能，比如细胞间的信号传导等。外泌体已经被鉴定在生物液体中存在，包括血液，尿液，羊水，唾液，关节液和母乳。血浆的成分比较复杂并且由于含有大约60～80mg/ml的蛋白因而比较粘稠，从血浆中提取得到较纯的外泌体是用于血浆外泌体功能分析的重要保障。
目前已经有很多方法用于外泌体的分离和纯化，最普遍应用的是超速离心法和利用外泌体膜表面抗原的亲和分离法。超速离心提取外泌体需要昂贵的超速离心机设备，且利用超速离心法分离外泌体需要的时间较久，对血浆需求量大；此外，由于血浆的内含物复杂性，在利用超速离心获得外泌体的同时，常掺杂一些低密度脂蛋白和小囊泡，不能特异性提取目标外泌体。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于提取血浆外泌体的试剂盒及其应用，血浆需求量少，操作简单，提取得到的外泌体浓度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种用于提取血浆外泌体的试剂盒，包括亲和素修饰的纳米磁珠溶液、生物素修饰的特异性适配体溶液和磁分离装置，所述特异性适配体能与外泌体特异性结合。
优选的，所述特异性适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，在所述亲和素修饰的纳米磁珠溶液中亲和素的浓度为0.2～0.6mg/ml。
优选的，所述亲和素修饰的纳米磁珠溶液中亲和素为链霉亲和素。
优选的，所述亲和素修饰的纳米磁珠溶液中纳米磁珠的粒径为250～550nm。
优选的，所述生物素修饰的特异性适配体溶液的浓度为50～150μmol/L。
优选的，所述试剂盒还包括pH值7.2～7.4的PBS缓冲液。
本发明提供了上述试剂盒在提取血浆外泌体中的应用，所述血浆外泌体为正常生理状况下产生的生理功能型外泌体。
优选的，上述试剂盒提取血浆外泌体的应用包括如下步骤：
(1)将亲和素修饰的纳米磁珠溶液和生物素修饰的特异性适配体溶液按照体积比1～2:2～4混合，15～30℃条件下摇动反应40～80min，得到亲和素修饰的纳米磁珠与生物素修饰的特异性适配体的复合物溶液；
(2)将所述复合物溶液与血浆稀释液按照体积比5～15:1～3混合，置于15～30℃条件下摇动反应40～80min，得外泌体提取液；
(3)将所述外泌体提取液用磁分离装置吸附，弃上清液，得到吸附有外泌体的磁珠复合物；
(4)用PBS缓冲液清洗和重悬所述磁珠复合物，得到结合外泌体的磁珠复合物溶液。
优选的，在所述步骤(2)血浆稀释液中，血浆稀释用溶液为上述PBS缓冲液；血浆和血浆稀释用溶液的体积比为1～3:5～15。
有益效果：本发明提供了一种用于提取血浆外泌体的试剂盒，包括亲和素修饰的纳米磁珠溶液、生物素修饰的特异性适配体溶液和磁分离装置，所述特异性适配体能与外泌体特异性结合。利用本发明提供的试剂盒提取血浆外泌体，操作简单，对血浆需求量少，提取得到的外泌体浓度高。
附图说明
图1为本发明所述方法制备得到的外泌体磁珠复合物的扫描电镜图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于提取血浆外泌体的试剂盒，包括亲和素修饰的纳米磁珠溶液、生物素修饰的特异性适配体溶液和磁分离装置，所述特异性适配体能与外泌体特异性结合。
本发明提供的试剂盒包括亲和素修饰的纳米磁珠溶液。在本发明中，所述亲和素修饰的纳米磁珠包括纳米磁珠部分和修饰在纳米磁珠上的亲和素。所述亲和素优选为链霉亲和素，所述链霉亲和素在所述亲和素修饰的纳米磁珠溶液中的浓度优选为0.2～0.6mg/ml，更优选为0.4mg/ml。所述纳米磁珠的粒径优选为250～550nm，更优选为300～400nm，最优选为350nm。在本发明的实施例中，所述亲和素修饰的纳米磁珠购买自上海生工生物工程股份有限公司。
本发明提供的试剂盒包括生物素修饰的特异性适配体溶液，所述特异性适配体能与外泌体特异性结合。在本发明中，所述生物素修饰的特异性适配体溶液的浓度优选为50～150μmol/L，更优选为100μmol/L。所述生物素修饰的特异性适配体包括特异性适配体和修饰在特异性适配体上的生物素两部分。所述生物素为本领域常规市售产品。所述特异性适配体的核苷酸序列优选为5’-Biotin-cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctg-3'(SEQ ID No.1)，其能特异性结合外泌体中的EpCAM(Epithelial celladhesionmolecule,上皮细胞粘附分子)。本发明对生物素修饰特异性适配体的方法不作特别限定，本领域常规方法即可。在本发明的实施例中，所述生物素修饰的特异性适配体由上海生工生物工程股份有限公司合成获得。
本发明提供的试剂盒包括磁分离装置，所述磁分离装置用于磁珠的吸附分离。本发明对所述磁分离装置的具体类型不作特别限定，本领域常规装置均可。
在本发明中，所述用于提取血浆外泌体的试剂盒优选还包括PBS缓冲液。所述PBS缓冲液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.3。所述PBS缓冲液的作用为稀释血浆和清洗、重悬磁珠。本发明对所述PBS缓冲液的来源不作特别限定，本领域常规市售产品即可，在本发明的实施例中，所述PBS缓冲液购买自上海生工生物工程股份有限公司。
本发明还提供了上述试剂盒在提取血浆外泌体中的应用。所述提取血浆外泌体的方法优选包括如下步骤：
(1)将亲和素修饰的纳米磁珠溶液和生物素修饰的特异性适配体溶液按照体积比1～2:2～4混合，15～30℃条件下摇动反应40～80min，得到亲和素修饰的纳米磁珠与生物素修饰的特异性适配体的复合物溶液；
(2)将所述复合物溶液与血浆稀释液按照体积比5～15:1～3混合，置于15～30℃条件下摇动反应40～80min，得外泌体提取液；
(3)将所述外泌体提取液用磁分离装置吸附，弃上清液，得到吸附有外泌体的磁珠复合物；
(4)用PBS缓冲液清洗和重悬所述磁珠复合物，得到结合外泌体的磁珠复合物溶液。
本发明先将所述亲和素修饰的纳米磁珠溶液和生物素修饰的特异性适配体溶液混合，得原料混合液。在本发明中，所述亲和素修饰的纳米磁珠溶液和生物素修饰的特异性适配体溶液的体积比优选为1～2:2～4，更优选为1:2。
得到原料混合液后，本发明将所述原料混合液摇动反应，利用生物素与亲和素的亲合作用将纳米磁珠和特异性适配体连接起来，得到亲和素修饰的纳米磁珠与生物素修饰的特异性适配体的复合物溶液。在本发明中，所述摇动反应的温度优选为15～30℃，更优选为20～25℃。所述摇动反应的时间优选为40～80min，更优选为60min。所述摇动反应的速率优选为120～180rpm，更优选为150rpm。本发明对所述摇动反应的器械不作特别限定，本领域常规用于摇动的工具即可。
得到亲和素修饰的纳米磁珠与生物素修饰的特异性适配体的复合物溶液后，本发明将所述复合物溶液与血浆稀释液混合，得到提取反应液。在本发明中，所述血浆稀释液优选由血浆和所述PBS缓冲液混合制得。所述血浆和PBS缓冲液的混合体积比优选为1～3:5～15，更优选为5:1。在本发明中，所述复合物溶液与血浆稀释液的混合体积比优选为5～15:1～3，更优选为5:1。
得到提取反应液后，本发明将所述提取反应液摇动反应，利用复合物中的特异性适配体吸附血浆中的外泌体，得外泌体提取液。在本发明中，所述摇动反应的温度优选为15～30℃，更优选为20～25℃。所述摇动反应的时间优选为40～80min，更优选为60min。所述摇动反应的速率优选为30～80rpm，更优选为50rpm。本发明对所述摇动反应的器械不作特别限定，本领域常规用于摇动的工具即可。
得到外泌体提取液后，本发明将所述外泌体提取液用磁分离装置吸附，弃上清液，得到吸附有外泌体的磁珠复合物。本发明对所述磁分离装置的具体类型不作特别限定，本领域常规用于磁分离的工具设备均可。在本发明中，所述磁分离装置吸附的方式优选为静置吸附。所述静置吸附的时间优选为5～15min，更优选为8～10min。
得到吸附有外泌体的磁珠复合物后，本发明用PBS缓冲液清洗、重悬磁珠复合物，得到结合外泌体的磁珠复合物溶液。在本发明中，所述清洗的目的是去除磁珠复合物表面吸附的血浆杂质残留，所述清洗的次数优选为2～4次，更优选为3次。清洗后对磁珠复合物进行重悬，所述重悬液的添加量优选为所述纳米磁珠溶液体积的15～25倍，优选为20倍。
下面结合实施例对本发明提供的一种用于提取血浆外泌体的试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
①分别用移液器取5μL蛋白浓度为0.4mg/mL的链霉亲和素修饰的350nm粒径磁珠和10μL浓度为100μM的生物素修饰的特异性EpCAM适配体(序列如SEQ IDNo.1所示)进行混合，然后在室温下150rpm摇动反应1小时。
②用移液器取500μL的血浆稀释于2500μL的PBS缓冲液中，然后4℃，12000g离心30min。取上清与①中得到的反应物混合，然后室温50rpm摇动反应1小时。
③利用外置磁铁的磁性静置吸附磁珠10min，弃掉上清，用PBS清洗磁珠复合物，如此重复3次。最后用100μL的PBS溶解，从而提取出血浆中的外泌体。
④用BCA的方法(购自Thermo Scientific)检测重悬后外泌体的浓度为201μg/ml。
实施例2
①分别用移液器取5μL蛋白浓度为0.35mg/mL的链霉亲和素修饰的480nm粒径磁珠和12μL浓度为110μM的生物素修饰的特异性EpCAM适配体(序列如SEQ ID No.1所示)进行混合，然后在室温下140rpm摇动反应65min。
②用移液器取500μL的血浆稀释于2500μL的PBS缓冲液中，然后4℃，12000g离心30min。取上清与①中得到的反应物混合，然后室温55rpm摇动反应1小时。
③利用外置磁铁的磁性静置吸附磁珠8min，弃掉上清，用PBS清洗磁珠复合物，如此重复3次。最后用100μL的PBS溶解，从而提取出血浆中的外泌体。
④用BCA的方法(购自Thermo Scientific)检测重悬后外泌体的浓度为215μg/ml。
实施例3
①分别用移液器取5μL蛋白浓度为0.45mg/mL的链霉亲和素修饰的300nm粒径磁珠和9μL浓度为90μM的生物素修饰的特异性EpCAM适配体(序列如SEQ ID No.1所示)进行混合，然后在室温下160rpm摇动反应55min。
②用移液器取500μL的血浆稀释于2500μL的PBS缓冲液中，然后4℃，12000g离心30min。取上清与①中得到的反应物混合，然后室温45rpm摇动反应1小时。
③利用外置磁铁的磁性静置吸附磁珠12min，弃掉上清，用PBS清洗磁珠复合物，如此重复3次。最后用100μL的PBS溶解，从而提取出血浆中的外泌体。
④用BCA的方法(购自Thermo Scientific)检测重悬后外泌体的浓度为209μg/ml。
实施例4
扫描电镜(Zeiss,18)和离子溅射仪北京意力博通，ETD-2000C溅射蒸碳仪用来观测外泌体的型态和直径。
①在载物盘上粘上双面胶带，然后粘上干净的薄铜片，然后把5μL外泌体磁珠复合物溶液小心滴在铜片上，自然干燥；
②完全干燥之后用离子溅射仪镀金，真空度为2～4Pa，溅射电流为20mA，溅射时间为30s。
③外泌体磁珠复合物的扫描电镜图见图1。如图1所示，外泌体(圈里的球状物)被蒱获在磁珠的表面。
对比例1
①用移液器取5mL的血浆，然后4℃，300g离心10min；
②取上清，然后4℃，2000g离心30min；
③取上清12000g，4℃离心30min；
④取上清，0.22微米滤膜过滤；
⑤取滤液，100000g，4℃离心90min；
⑥弃上清，用PBS清洗沉淀，100000g，4℃离心90min；
⑦200微升PBS溶解沉淀；
⑧用BCA的方法(购自Thermo Scientific)检测重悬后外泌体的浓度为40μg/ml。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽科技学院
<120> 一种提取血浆外泌体的试剂盒及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctg 48

Claims (10)

1.一种用于提取血浆外泌体的试剂盒，其特征在于，包括亲和素修饰的纳米磁珠溶液、生物素修饰的特异性适配体溶液和磁分离装置；所述特异性适配体能与外泌体特异性结合。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性适配体的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在所述亲和素修饰的纳米磁珠溶液中亲和素的浓度为0.2～0.6mg/ml。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和素修饰的纳米磁珠溶液中亲和素为链霉亲和素。
5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和素修饰的纳米磁珠溶液中纳米磁珠的粒径为250～550nm。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素修饰的特异性适配体溶液的浓度为50～150μmol/L。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括pH值7.2～7.4的PBS缓冲液。
8.权利要求1～7任一项所述试剂盒在提取血浆外泌体中的应用，所述血浆外泌体为正常生理状况下产生的生理功能型外泌体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将亲和素修饰的纳米磁珠溶液和生物素修饰的特异性适配体溶液按照体积比1～2:2～4混合，在15～30℃条件下摇动反应40～80min，得到复合物溶液；
(2)将所述复合物溶液与血浆稀释液按照体积比5～15:1～3混合，在15～30℃条件下摇动反应40～80min，得外泌体提取液；
(3)将所述外泌体提取液用磁分离装置吸附，弃上清液，得到吸附有外泌体的磁珠复合物；
(4)用PBS缓冲液清洗和重悬所述磁珠复合物，得到结合外泌体的磁珠复合物溶液。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在所述步骤(2)血浆稀释液中，血浆稀释用溶液为权利要求7所述PBS缓冲液；血浆和血浆稀释用溶液的体积比为1～3:5～15。
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