WO2018062263A1 - 核酸の分析方法 - Google Patents

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WO2018062263A1
WO2018062263A1 PCT/JP2017/034932 JP2017034932W WO2018062263A1 WO 2018062263 A1 WO2018062263 A1 WO 2018062263A1 JP 2017034932 W JP2017034932 W JP 2017034932W WO 2018062263 A1 WO2018062263 A1 WO 2018062263A1
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nucleic acid
vesicle
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polymer
biological sample
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PCT/JP2017/034932
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French (fr)
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勝 上野
公子 内田
寛也 藤井
世紀 和久井
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Jsr株式会社
Ｊｓｒライフサイエンス株式会社
ジェイエスアール マイクロ インコーポレイテッド
ジェイエスアール マイクロ エヌ．ブイ．
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/538—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by sorbent column, particles or resin strip, i.e. sorbent materials

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid analysis method, determination method, prognosis determination method, drug efficacy evaluation method, vesicle separation method, nucleic acid analysis or vesicle separation composition, nucleic acid analysis or vesicle separation kit, nonspecific adsorption inhibitor And a non-specific adsorption suppression method.
  • nucleic acids nucleic acid complexes
  • carrier proteins proteins
  • free nucleic acids and the like.
  • exosomes are known as vesicular granules present in body fluids. It is known that various membrane proteins exist on the surface of exosomes as well as general cell surfaces, and microRNA (miRNA) other than various proteins such as cytokines is contained inside exosomes. It has also been found that it is included. In addition, it is known that exosomes are secreted from various cells such as cells of the immune system and various cancer cells. The function of exosomes as a mediator of intercellular communication in vivo, exosomes and physiological phenomena, cancer, etc. Relevance to other diseases has attracted attention and is being investigated.
  • miRNA microRNA
  • exosomes are isolated from circulating blood of ovarian cancer patients, and there is a relationship between the expression level of exosome-derived microRNA and the progression of ovarian cancer.
  • Non-patent Document 1 exosomes are isolated from biological samples such as serum, plasma, blood, etc., and proteins and microRNAs contained in exosomes are used as new biomarkers for early diagnosis of disease and discovery of recurrence There have been attempts to use them (Patent Documents 1 and 2).
  • nucleic acids such as nucleic acids in vesicles such as exosomes, complexes of nucleic acids existing in combination with carrier proteins, and free nucleic acids have different origins depending on the way they exist. It is important to isolate the vesicle, complex, or free nucleic acid that is the analyte.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for analyzing nucleic acid in a vesicle that is less likely to cause a decrease in accuracy due to a non-analyzed substance such as free nucleic acid.
  • the present inventors have made contact with a biological sample containing vesicles containing nucleic acid and a capture carrier that captures vesicles to capture nucleic acid containing a vesicle capturing step of capturing vesicles.
  • a polymer having an acidic group is added to the system to capture vesicles, or a biological sample or a carrier for capturing with a polymer having an acidic group is used as a capture carrier.
  • the present inventors have found that the occurrence of a decrease in accuracy due to nonspecific adsorption of non-analytical substances such as nucleic acids can be suppressed.
  • the present invention provides the following ⁇ 1> to ⁇ 19>.
  • a nucleic acid analysis method comprising a vesicle capturing step of capturing a vesicle by bringing a biological sample containing the vesicle containing the nucleic acid into contact with a capturing carrier that captures the vesicle,
  • the vesicle capturing step is performed by adding a polymer having an acidic group to the system, Analysis method.
  • a nucleic acid analysis method comprising a vesicle capturing step of capturing a vesicle by bringing a biological sample containing the vesicle containing the nucleic acid into contact with a capturing carrier for capturing the vesicle, At least one selected from the biological sample and the capture carrier is treated with a polymer having an acidic group, Analysis method.
  • ⁇ 3> The analysis method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, further including a nucleic acid analysis step of analyzing a nucleic acid contained in the vesicle.
  • ⁇ 4> The analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the capturing carrier is in the form of a particle or a porous film.
  • ⁇ 5> The analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the capture carrier is a magnetic particle.
  • ⁇ 6> The analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the capture carrier has avidins.
  • ⁇ 7> The analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the capture carrier has a ligand.
  • ⁇ 8> The analysis method according to ⁇ 7>, wherein the ligand is an antibody that recognizes an antigen protein present on the surface of a vesicle.
  • the polymer having an acidic group is selected from a milk protein having an acidic group, a synthetic polymer having an acidic group, and a polysaccharide having one or two types selected from a carboxy group and a sulfate group.
  • the analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8> wherein there are two or more kinds.
  • ⁇ 10> The analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein the polymer having an acidic group is a phosphorylated protein.
  • Step (1-1) a step of analyzing a nucleic acid by the analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10> using a biological sample derived from a subject
  • Step (1-2) the step Including the step of comparing the analysis result obtained in (1-1) with the analysis result of a biological sample derived from a healthy person, Judgment method.
  • Step (2-1) A step of analyzing a nucleic acid by the analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10> using a biological sample derived from a subject after treatment, and a step (2-2) The method includes a step of comparing the analysis result obtained in the step (2-1) with the analysis result of a biological sample derived from a subject before treatment, Prognosis determination method.
  • Step (3-1) A step of analyzing nucleic acid by the analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10> above using a biological sample derived from a subject after administration of a therapeutic agent for a disease
  • step (3) -2) comprising a step of comparing the analysis result obtained in the step (3-1) with the analysis result of the biological sample derived from the subject before administration of the disease therapeutic agent, Evaluation methods.
  • a method for separating vesicles comprising a vesicle capturing step of capturing a vesicle by contacting a biological sample containing vesicles containing a nucleic acid with a capturing carrier for capturing the vesicles,
  • the vesicle capturing step is performed by adding a polymer having an acidic group to the system, Separation method.
  • a method for separating vesicles comprising a vesicle capturing step of capturing a vesicle by contacting a biological sample containing vesicles containing a nucleic acid with a capturing carrier for capturing the vesicles, At least one selected from the biological sample and the capture carrier is treated with a polymer having an acidic group, Separation method.
  • a capture carrier for capturing vesicles Including a polymer having an acidic group, Composition for nucleic acid analysis or vesicle separation.
  • a capture carrier for capturing vesicles
  • a liquid agent containing a polymer having an acidic group Kit for nucleic acid analysis or vesicle separation.
  • a non-specific adsorption inhibitor which is a non-specific adsorption inhibitor for suppressing non-specific adsorption of nucleic acid, and includes a polymer having an acidic group.
  • a method for suppressing non-specific adsorption of nucleic acid comprising using a polymer having an acidic group.
  • the nucleic acid analysis method of the present invention is less likely to cause a decrease in accuracy due to non-analyzed substances such as free nucleic acids.
  • the nucleic acid analysis method of the present invention is a nucleic acid analysis method including a vesicle capture step of capturing a vesicle by bringing a biological sample containing the vesicle containing the nucleic acid into contact with a capture carrier for capturing the vesicle. And The vesicle capturing step is performed by adding a polymer having an acidic group to the system, or at least one selected from a biological sample and a capturing carrier is treated with a polymer having an acidic group This is a feature.
  • a polymer having an acidic group may be added to the system of the vesicle capturing step, and the biological sample and / or the capture carrier is acidic.
  • a polymer treated with a polymer having a group a polymer having an acidic group may coexist in the system of the vesicle capturing step.
  • a biological sample and / or a carrier that has been treated with a polymer having an acidic group is used as a capture carrier.
  • a polymer having an acidic group is added to the system of the vesicle capturing step. Also good.
  • the method for treating a biological sample with a polymer having an acidic group is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding a collected biological sample to a container to which a polymer having an acidic group is added. Further, the method for treating the capturing carrier with a polymer having an acidic group is not particularly limited, and examples thereof include a method usually performed as a blocking treatment, and more specifically, a polymer having an acidic group. And a method of adding a capture carrier to a buffer containing, and allowing to stand or mix.
  • the polymer having an acidic group may be added to the system before, during or after the contact between the biological sample and the capture carrier, but before the contact between the biological sample and the capture carrier. It is preferable to add.
  • Examples of acidic groups include carboxy group, phosphoric acid group, sulfuric acid group (—O—SO 3 H), sulfo group (—SO 3 H), phenolic hydroxy group, dihydroxyboryl group, salts and ions thereof. Can be mentioned. Among these, from the viewpoint of suppressing non-specific adsorption, a carboxy group, a phosphate group, a sulfate group, a sulfo group, salts and ions thereof are preferable, and a phosphate group is particularly preferable.
  • Examples of the salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt; ammonium salt; organic ammonium salt; amine salt and the like.
  • the polymer may have an acidic group at the terminal or a side chain.
  • the polymer having an acidic group a water-soluble polymer is preferable.
  • the polymer having an acidic group may be a natural polymer or a synthetic polymer, and may be used alone or in combination of two or more.
  • the polymer having an acidic group may be a partially esterified product.
  • a part of the carboxy group is esterified with ethylene glycol, propylene glycol, or the like.
  • the polymer having an acidic group has a phenolic hydroxy group or has an alcoholic hydroxy group separately from the acidic group, a part of the phenolic hydroxy group or a part or all of the alcoholic hydroxy group is acetic acid. , Nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • Natural polymers having acidic groups include milk proteins having acidic groups; polysaccharides having one or two selected from carboxy groups and sulfate groups; polypeptides such as polyglutamic acid and polyaspartic acid; salts thereof Of these, one of these may be used alone or two or more of them may be used in combination.
  • milk protein which has an acidic group phosphorylated protein is preferable. For example, casein etc. are mentioned.
  • derivatives of milk proteins, such as a partial hydrolyzate and crosslinked protein as milk protein which has an acidic group.
  • compositions include whey protein concentrate, non-fat dry milk, skim milk and the like.
  • polysaccharides having one or two types selected from a carboxy group and a sulfate group include heparin and derivatives thereof, xanthan gum, carrageenan, alginic acid, pectin, farcelan, gum arabic, gatch gum, caraya gum, tragacanth gum, agar, hyaluronic acid , Chondroitin sulfate, dextran sulfate, pentosan polysulfate, carboxymethylated or succinylated polysaccharides (cellulose, dextran, starch, chitosan etc.
  • heparin and its derivatives are preferable from the viewpoint of suppressing nonspecific adsorption.
  • heparin derivatives include untreated heparin, low molecular weight heparin, de-N-sulfated heparin, de-2-O-sulfated heparin, and de6-O-sulfated heparin.
  • a milk protein having an acidic group from the viewpoint of suppressing nonspecific adsorption, a milk protein having an acidic group, and one or two kinds selected from a polysaccharide having one or two kinds selected from a carboxy group and a sulfate group, or Two or more are preferable, phosphorylated protein, heparin and derivatives thereof are more preferable, casein and heparin are further preferable, and casein is particularly preferable.
  • the synthetic polymer having an acidic group examples include a polymer or copolymer having a repeating unit derived from a polymerizable unsaturated monomer having an acidic group or a salt thereof, polyphosphoric acid or a salt thereof, and the like.
  • the polymerizable unsaturated monomer having an acidic group means a compound having a polymerizable unsaturated group and an acidic group in one molecule.
  • the polymerizable unsaturated monomer having an acidic group examples include a polymerizable unsaturated monomer having a phosphoric acid group, a polymerizable unsaturated monomer having a carboxy group, and a polymerizable unsaturated monomer having a sulfo group.
  • the seeds may be used alone or in combination of two or more.
  • a polymerizable unsaturated monomer having a phosphate group and a polymerizable unsaturated monomer having a carboxy group are preferable.
  • the polymerizable unsaturated monomer having a phosphate group is preferably a phosphate group-containing (meth) acrylic acid ester, more preferably a monomer represented by the following formula (1), from the viewpoint of suppressing nonspecific adsorption.
  • Examples of the monomer in which n in the formula (1) is 1 include 2- (meth) acryloyloxyethyl acid phosphate and 2- (meth) acryloyloxypropyl acid phosphate.
  • R 1 and R 2 represent a hydrogen atom or a methyl group
  • n represents an average value of 1 to 8, and preferably an average value of 3 to 6 (the “average value” can be measured by NMR).
  • Examples of the polymerizable unsaturated monomer having a carboxy group include unsaturated groups such as (meth) acrylic acid, crotonic acid, vinyl benzoic acid, cinnamic acid, and hexahydrophthalic acid mono-2- (meth) acryloyloxyethyl.
  • Acid anhydrides of unsaturated dicarboxylic acids such as maleic acid and itaconic anhydride can also be used.
  • unsaturated dicarboxylic acids such as maleic acid and itaconic anhydride
  • unsaturated monocarboxylic acids are preferable, and (meth) acrylic acid is more preferable.
  • Examples of the polymerizable unsaturated monomer having a sulfo group include styrene sulfonic acid, vinyl sulfonic acid, allyl sulfonic acid, methallyl sulfonic acid, 2-sulfoethyl (meth) acrylate, and 2- (meth) acrylamide-2-methylpropane sulfonic acid. Etc.
  • the synthetic polymer having an acidic group may have a repeating unit other than the repeating unit derived from a polymerizable unsaturated monomer having an acidic group or a salt thereof (hereinafter also referred to as other repeating unit).
  • Other repeating units include aromatic vinyl monomers, (meth) acrylate monomers, (meth) acrylamide monomers, esters of saturated carboxylic acids and unsaturated alcohols, alkyl vinyl ethers, vinyl group-containing alcohols, etc.
  • the repeating unit which originates is mentioned. Of these, one kind may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • Ring Q represents an aromatic ring
  • R 3 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 4 represents an alkyl group, an alkoxy group or a halogen atom
  • p represents an integer of 0 to 5.
  • ring Q represents an aromatic ring, preferably a benzene ring, naphthalene ring or pyridine ring, more preferably a benzene ring.
  • R 4 carbon number of the alkyl group represented by R 4
  • the alkyl group may be linear or branched. Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, and a tert-butyl group.
  • the number of carbon atoms of the alkoxy group represented by R 4 is preferably 1 to 4, and more preferably 1 or 2.
  • the alkoxy group may be linear or branched. Examples of the alkoxy group include a methoxy group and an ethoxy group. Moreover, as a halogen atom shown by R ⁇ 4 >, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, etc. are mentioned. P represents an integer of 0 to 5, preferably an integer of 0 to 4, more preferably 0 or 1. When p is an integer of 2 to 5, p R 4 s may be the same or different.
  • aromatic vinyl monomer examples include styrene, ⁇ -methylstyrene, vinyltoluene, 2-methylstyrene, 3-methylstyrene, 4-methylstyrene, 4-ethylstyrene, 4-tert-butylstyrene, 3, 4-dimethylstyrene, 4-methoxystyrene, 4-ethoxystyrene, 2-chlorostyrene, 3-chlorostyrene, 4-chlorostyrene, 2,4-dichlorostyrene, 2,6-dichlorostyrene, 4-chloro-3-
  • styrene monomers such as methylstyrene, 1-vinylnaphthalene, 2-vinylpyridine, 4-vinylpyridine and the like can be mentioned.
  • (meth) acrylate or (meth) acrylamide monomer those represented by the following formula (4) are preferable.
  • R 5 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 6 represents — (C ⁇ O) —O— * or — (C ⁇ O) —NR 8 — *
  • R 8 represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms; the equation (4) shows the position at which the group bonds to R 7 in), R 7 represents an organic group.
  • the organic group represented by R 7 preferably has 1 to 30 carbon atoms, more preferably 2 to 20 carbon atoms, still more preferably 2 to 10 carbon atoms, and particularly preferably 2 to 6 carbon atoms. It is.
  • the organic group include a hydrocarbon group and a group in which a part of carbon atoms of the hydrocarbon group is replaced with a keto group. These hydrocarbon groups are a concept including an aliphatic hydrocarbon group, an alicyclic hydrocarbon group, and an aromatic hydrocarbon group.
  • the aliphatic hydrocarbon group may be linear or branched, and specifically includes a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, and a tert-butyl group.
  • the alicyclic hydrocarbon group is roughly classified into a monocyclic alicyclic hydrocarbon group and a bridged ring hydrocarbon group.
  • Examples of the monocyclic alicyclic hydrocarbon group include cycloalkyl groups such as a cyclopropyl group and a cyclohexyl group.
  • Examples of the bridged ring hydrocarbon group include an isobornyl group, an adamantyl group, and a dicyclopentanyl group.
  • Examples of the aromatic hydrocarbon group include an aryl group such as a phenyl group and an aralkyl group such as a benzyl group.
  • R 8 represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms. Examples of the hydrocarbon group represented by R 8 include the same hydrocarbon groups as represented by R 7 .
  • R 8 is preferably a hydrogen atom.
  • Examples of the (meth) acrylate monomer include methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, n-butyl (meth) acrylate, isobutyl (meth) acrylate, tert-butyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl ( Alkyl (meth) acrylates such as meth) acrylate and lauryl (meth) acrylate; (meth) acrylates having an aromatic ring structure such as benzyl (meth) acrylate; isobornyl (meth) acrylate, adamantyl (meth) acrylate, dicyclopentanyl (Meth) acrylate etc.
  • (meth) acrylamide monomer examples include Nt-butyl (meth) acrylamide, (meth) octylacrylamide, diacetone (meth) acrylamide, and the like.
  • esters of saturated carboxylic acid and unsaturated alcohol examples include vinyl acetate, vinyl propionate, and vinyl neodecanoate.
  • alkyl vinyl ethers examples include methyl vinyl ether and ethyl vinyl ether.
  • vinyl group-containing alcohols include vinyl alcohol.
  • a combination of a polymerizable unsaturated monomer having an acidic group or a salt thereof and a monomer for deriving another repeating unit a combination of a polymerizable unsaturated monomer having a phosphate group or a salt thereof and a (meth) acrylate monomer
  • a combination of a polymerizable unsaturated monomer having a carboxy group or a salt thereof and an aromatic vinyl monomer a combination of a polymerizable unsaturated monomer having a phosphate group or a salt thereof and butyl (meth) acrylate, a carboxy group
  • a combination of a polymerizable unsaturated monomer having a salt or a salt thereof and one or two selected from styrene and ⁇ -methylstyrene is more preferable.
  • the content of the repeating unit derived from the polymerizable unsaturated monomer having an acidic group or a salt thereof is 20% from the viewpoint of dispersibility and solubility in water. ⁇ 80% by weight is preferred.
  • the polymerizable unsaturated monomer having an acidic group is a polymerizable unsaturated monomer having a phosphoric acid group
  • it is more preferably 30 to 70% by mass, particularly preferably 40 to 60% by mass
  • the polymerizable group having an acidic group When the unsaturated monomer is a polymerizable unsaturated monomer having a carboxy group, it is more preferably 20 to 80% by mass, still more preferably 30 to 70% by mass, and particularly preferably 40 to 60% by mass.
  • the content of other repeating units is a residue.
  • the content of the repeating unit contained in the synthetic polymer having an acidic group can be measured by NMR.
  • the weight average molecular weight of the synthetic polymer having an acidic group is preferably 10,000 to 1,000,000, and more preferably 50,000 to 500,000.
  • the weight average molecular weight can be determined in terms of polystyrene using gel permeation chromatography (manufactured by Tosoh Corporation, HLC-82220GPC).
  • the synthetic polymer having an acidic group may be a commercially available product or may be synthesized and used.
  • the synthetic polymer having an acidic group can be synthesized by a known method.
  • Commercially available homopolymers consisting of repeating units derived from a polymerizable unsaturated monomer having a phosphate group include polyphosmer M-101, polyphosmer PE-201, polyphosmer MH-301, polyphosmer PP-401 (above, manufactured by DAP) ) And the like.
  • Examples of the copolymer having a repeating unit derived from a polymerizable unsaturated monomer having a phosphate group and a repeating unit derived from a (meth) acrylate monomer include polyphosmer MHB-10 (manufactured by DAP).
  • styrene / ⁇ -methylstyrene / acrylic acid copolymers such as Jonkrill 6030 manufactured by BASF
  • acrylic acid / ethyl acrylate / Nt-butylacrylamide copolymer BASF Ultrahold 8, Ultrahold Strong, etc.
  • Octylacrylamide / acrylic acid copolymer National Former Anformer V-42, etc.
  • Acrylate / Methacrylate / Acrylic acid / Methacrylic acid copolymer (Union Carbide) Amahold DR25, etc.)
  • acrylates / diacetone acrylamide copolymer plus size L-9540B, etc., manufactured by Kyoyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • methyl vinyl ether / alkyl maleate copolymer manufactured by ISP) Ntrezz ES-225, ES-425, SP-215, etc.
  • vinyl acetate / crotonic acid copolymers such as Jonkrill 6030 manufactured by BASF
  • the concentration of the polymer having acidic groups in the vesicle capturing step is preferably 0.000001 to 25% (w / v), more preferably 0.000005 to 20%, based on the total amount of the liquid phase in the system. (W / v).
  • the unit “% (w / v)” is a unit that means “25 g with respect to 100 mL” when “25% (w / v)”, for example.
  • the concentration of the polymer having an acidic group is preferably 0.00001 to 15% with respect to the total amount of the liquid phase in the system.
  • the concentration of the polymer having an acidic group is preferably 0 with respect to the total amount of the liquid phase in the system. 0.000001 to 10% (w / v).
  • the biological sample is not particularly limited as long as it contains vesicles containing nucleic acids, and examples thereof include various body fluids, fungal fluids, cell culture media, cell culture supernatants, tissue cell disruptions, and the like. Liquid. Cells contained in the culture medium, culture supernatant, and disrupted solution may be derived from eukaryotes or bacteria. Among these, as biological samples, body fluids and cell culture supernatants are preferable, body fluids are more preferable, and human-derived body fluids are particularly preferable.
  • Body fluids include whole blood, serum, plasma, various blood cells, blood clots, platelets, other blood components such as blood components, sweat, gastric fluid, interstitial fluid, joint fluid, aqueous humor, sputum, pleural effusion , Oral mucosa group, bone marrow fluid, semen, digestive fluid, tissue fluid, body fluid, saliva, bile, vaginal fluid, tears, milk, urine, cerebrospinal fluid, nasal fluid, feces, ascites, amniotic fluid, lymph fluid, etc.
  • a blood composition component is preferred.
  • the blood composition component may be treated with an anticoagulant such as citric acid or EDTA.
  • the nucleic acid analysis method of the present invention can be used for a wide variety of biological samples, even when clinical specimens such as serum and plasma are used as biological samples, and the accuracy degradation due to non-specific adsorption hardly occurs.
  • the “biological sample treated with a polymer having an acidic group” used in one embodiment of the present invention is not particularly limited as long as it is treated with the polymer having an acidic group, but heparin And / or biological samples treated with derivatives thereof are preferred.
  • a biological sample previously treated with a polymer having an acidic group may be used, or the biological sample may be treated with a polymer having an acidic group immediately before nucleic acid analysis.
  • “treatment” on a biological sample means adding a polymer having an acidic group to the biological sample.
  • a blood anticoagulant containing a polymer having an acidic group such as heparin is added to the blood sample. And so on.
  • the vesicle containing nucleic acid is not particularly limited as long as it has a lipid bilayer membrane, and examples thereof include cells, exosomes released from cells to the outside of cells, extracellular vesicles, and microvesicles. .
  • the nucleic acid analysis method of the present invention is particularly suitable for the analysis of nucleic acids contained in exosomes.
  • exosome surface antigens include tetraspanins such as CD9, CD63, and CD81; antigen presentation-related proteins such as MHCI and MHCII; adhesion molecules such as integrin, ICAM-1, and EpCAM; cytokines such as EGFRvIII and TGF- ⁇ / Cytokine receptors, enzymes and the like.
  • exosome surface antigens include tetraspanins such as CD9, CD63, and CD81; antigen presentation-related proteins such as MHCI and MHCII; adhesion molecules such as integrin, ICAM-1, and EpCAM; cytokines such as EGFRvIII and TGF- ⁇ / Cytokine receptors, enzymes and the like.
  • the concentration of the biological sample in the vesicle capturing step is preferably 0.1 to 90% (v / v), more preferably 1 to 50% (v / v) with respect to the total amount of the liquid phase in the system. is there.
  • concentration adjustment can be performed using buffer solutions, such as a phosphate buffer solution, a HEPES buffer solution, a Tris buffer solution, a carbonate buffer solution, and a MES buffer solution, for example.
  • the capturing carrier is not particularly limited as long as it can capture vesicles, but a solid phase carrier is usually used. Further, the amount of the capture carrier used is preferably 0.00001 to 0.1 times by mass, more preferably 0.0001 to 0.01 times by mass with respect to the biological sample.
  • the shape of the solid phase carrier is not particularly limited, but for example, tray shape, spherical shape, particle shape (latex particles, etc.), fiber shape, rod shape, disk shape, container shape, cell, microplate, porous film shape, column, test A tube etc. are mentioned, From a viewpoint of solid-liquid separation and the ease of washing
  • Examples of the material of the solid phase carrier include polystyrenes, polyethylenes, polypropylenes, polyesters, poly (meth) acrylonitriles, styrene-butadiene copolymers, poly (meth) acrylates, fluororesins, and crosslinked dextran. And polymer compounds such as polysaccharides; glass; silica; metal; magnetic substance; resin composition containing a magnetic substance; and combinations thereof.
  • the solid support is preferably magnetic particles.
  • magnetic particles include metals such as triiron tetroxide (Fe 3 O 4 ), iron sesquioxide ( ⁇ -Fe 2 O 3 ), various ferrites, iron, manganese, nickel, cobalt, and chromium; cobalt, nickel, Magnetic fine particles made of an alloy such as manganese; magnetic particles containing these magnetic substances in a resin.
  • the resin include a hydrophobic polymer and a hydrophilic polymer. Among these, magnetic particles containing a magnetic substance in a resin are preferable, and those in which a polymer layer is formed on the surface of mother particles containing superparamagnetic fine particles are more preferable.
  • a hydrophobic first polymer layer is formed on the surface of a mother particle containing superparamagnetic fine particles described in JP-A-2008-32411, and at least the surface has a glycidyl group on the first polymer layer.
  • Examples include magnetic particles in which a second polymer layer is formed and a polar group is introduced by chemically modifying the glycidyl group.
  • ferrite represented by Li 0.5 Fe 0.5, etc.) magnetite represented by Fe 3 O 4 include ⁇ -Fe 2 O 3, strong saturation magnetization, and residual magnetization is small in terms, gamma-Fe 2 It is preferable that either one of O 3 and Fe 3 O 4 is included.
  • the monomers for forming the hydrophobic first polymer layer are roughly classified into monofunctional monomers and crosslinkable monomers.
  • the monofunctional monomer include aromatic vinyl monomers such as styrene, ⁇ -methylstyrene, and halogenated styrene; methyl acrylate, methyl methacrylate, ethyl acrylate, ethyl methacrylate, stearyl acrylate, stearyl methacrylate, cyclohexyl acrylate, and cyclohexyl methacrylate.
  • ethylenically unsaturated carboxylic acid alkyl ester monomers such as isobornyl acrylate and isobornyl methacrylate.
  • crosslinkable monomer ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, trimethylolpropane triacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate, pentaerythritol triacrylate, pentaerythritol trimethacrylate, dipentaerythritol hexaacrylate, dipentaerythritol hexa
  • crosslinkable (meth) acrylates such as methacrylate; conjugated diolefins such as butadiene and isoprene, as well as divinylbenzene, diallyl phthalate, allyl acrylate, and allyl methacrylate.
  • the monomer for forming the second polymer layer is mainly intended to introduce a functional group to the particle surface and includes a glycidyl group-containing monomer.
  • a glycidyl group containing monomer 20 mass% or more is preferable in the monomer for forming a 2nd polymer layer.
  • examples of the copolymerizable monomer containing a glycidyl group include glycidyl acrylate, glycidyl methacrylate, and allyl glycidyl ether.
  • the polar group introduced by chemically modifying the glycidyl group of the second polymer layer is preferably a functional group capable of reacting with a ligand, and at least selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom and a sulfur atom Those containing one or more of one kind of atom are more preferable. Of these, an amino group, an aldehyde group, a carboxy group, and an active ester group are more preferable. In particular, when the second polymer layer of the magnetic particle has the polar group and 2,3-dihydroxypropyl group, the binding property to the ligand is good.
  • a solid phase carrier such as magnetic particles may have a substance having a biotin binding site immobilized on the surface thereof. This makes it easier for the biotinylated ligand to bind to the solid support.
  • the substance having a biotin binding site is preferably avidin.
  • the avidins include one or more compounds selected from avidin, streptavidin, tamavidin, and derivatives thereof. Immobilization of a substance having a biotin-binding site on the surface of a solid phase carrier may be performed by a known method such as the method described in Japanese Patent No. 4716034.
  • the “capturing carrier treated with a polymer having an acidic group” used in an embodiment of the present invention is not particularly limited as long as it is treated with the polymer having an acidic group, but is not limited. Those subjected to blocking treatment with a polymer having a group are preferred. Examples of the treatment for the capture carrier include coating by physically adsorbing a polymer having an acidic group on the surface of the capture carrier. When such a capture carrier is used, either a capture carrier previously treated with a polymer having an acidic group may be used, or the capture carrier may be treated with a polymer having an acidic group immediately before nucleic acid analysis. Good.
  • the capture carrier one having a ligand is preferable.
  • a chemical binding method such as a physical adsorption method, a covalent bond method, or an ion bond method is used.
  • the physical adsorption method include a method of directly immobilizing a ligand on a solid phase carrier, a method of chemically binding to another protein such as albumin, and then adsorbing and immobilizing.
  • a chemical bonding method a method of directly bonding on a solid phase carrier using a functional group capable of reacting with a ligand introduced on the surface of the solid phase carrier, or a spacer molecule between the solid phase carrier and the ligand. Examples include a method of binding after introducing a carbodiimide compound (such as a carbodiimide compound), a method of binding a ligand to another protein such as albumin, and then chemically binding the protein to a solid phase carrier.
  • a carbodiimide compound such as a carbodiimide compound
  • ligands include antibodies, antigens, nucleic acids, nucleotides, nucleosides, proteins (for example, proteins such as annexin V that recognize substances such as phosphatidylserine present on the surface of vesicles having lipid bilayers), peptides, amino acids, Examples include polysaccharides, sugars, lipids, vitamins, drugs, substrates, hormones, and neurotransmitters.
  • antibodies, antigens, proteins, and nucleic acids are preferable, antibodies and antigens are more preferable, and antibodies are particularly preferable.
  • the antibody which recognizes the antigen which exists in the vesicle surface is preferable, and the antibody which recognizes the antigen protein which exists in the vesicle surface is more preferable.
  • an antibody that recognizes an antigen protein present on the exosome surface is particularly preferred.
  • the antibody may be biotinylated. Non-specific adsorption can be further suppressed by using a capture carrier in which a biotinylated antibody is bound with avidins.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody is not particularly limited, and a known method such as K.I. Watanabe et al. , Vasohibin as an endothelium-derived negative feedback regulator of angiogenesis, J. et al. Clin. Invest. 114 (2004), 898-907.
  • Monoclonal antibodies that recognize tetraspanins such as exosome surface antigens CD9, CD63, and CD81 can be prepared with reference to International Publication No. 2013/099925.
  • the antibody class includes IgG and IgM, and IgG is preferred. Moreover, you may use the fragment which reduced these molecules. For example, F (ab ′) 2, Fab ′, Fab and the like can be mentioned.
  • a commercially available product may be used as the solid phase carrier to which a ligand that recognizes an antigen present on the surface of the vesicle is bound.
  • a commercially available product may be used as the solid phase carrier to which a ligand that recognizes an antigen present on the surface of the vesicle is bound.
  • Exosome-Human CD9 Isolation Reagent from cell culture
  • Exosome-Human CD63 Isolation / Detection Reagent from cellCultureCulture Media
  • CD81 Exo-Flow Capture kit both manufactured by SBI.
  • the vesicle capturing step the vesicle containing the nucleic acid is captured by the capturing carrier by the contact between the biological sample and the capturing carrier.
  • the vesicle capturing step may be performed by adding a surfactant; a protein such as albumin; a saccharide such as sucrose as necessary.
  • a surfactant is preferable, a nonionic surfactant is more preferable, and a polyethylene glycol type nonionic surfactant is particularly preferable.
  • the surfactant preferably does not contain an aromatic group in the molecule.
  • ethylene oxide adducts examples include ethylene oxide adducts.
  • polyalkylene glycol ethylene oxide adduct is preferable. Specific examples include polyoxyethylene (160) polyoxypropylene (30) glycol and polyoxyethylene (196) polyoxypropylene (67) glycol.
  • the amount used is preferably 0.005 to 10% (w / v), more preferably 0.015, from the viewpoint of suppressing nonspecific adsorption and suppressing damage to vesicles. -3.5% (w / v).
  • reaction temperature in the vesicle capturing step is preferably in the range of 2 to 42 ° C, more preferably in the range of 2 to 32 ° C, and particularly preferably in the range of 2 to 22 ° C.
  • the reaction time is usually 1 minute to 72 hours, preferably 5 minutes to 60 hours, more preferably 10 minutes to 48 hours, and particularly preferably 10 minutes to 36 hours.
  • the pH in the system is not particularly limited, but is preferably in the range of pH 5 to 10, more preferably in the range of pH 6 to 8.
  • the vesicle capturing step is preferably performed in the presence of a buffer solution.
  • the buffer include phosphate buffer, HEPES buffer, Tris buffer, carbonate buffer, MES buffer, and the like.
  • the analysis method of the present invention may include a washing step.
  • the washing step is a step of washing the capturing carrier that has captured the vesicles in the vesicle capturing step.
  • non-analyzed substances such as nucleic acids and proteins are further removed.
  • the system containing the capture carrier capturing the vesicles may be washed as it is.
  • the washing process is usually divided into two types depending on the shape of the capture carrier.
  • the capture carrier is in the form of particles as in the case of magnetic particles, for example, there is a method in which the magnetic particles are dispersed in a cleaning solution for washing, while the capture carrier is in the form of a microplate.
  • the surfactant the same surfactants that may be used in the vesicle capturing step are preferable.
  • the washing step includes collecting the magnetic particles by a magnetic force to separate the magnetic particles and the liquid phase, and separating the magnetic particles separated in the collecting step in the washing liquid. It is preferable to include a dispersion step of dispersing in the water. As a result, unreacted substances and non-analyzed substances in the biological sample can be more efficiently washed and separated and removed from the surface of the magnetic particles. Specifically, a magnetic field was applied to the reaction vessel, and the magnetic particles were collected by adhering to the reaction vessel wall, and then the reaction supernatant was removed, and a washing solution was added as necessary to apply the magnetic field in the same manner. What is necessary is just to repeat the operation of removing the post-supernatant. As the cleaning liquid, a cleaning liquid containing the surfactant and the buffer mentioned in the vesicle capturing step is preferable.
  • the analysis method of the present invention may include a dissociation step of dissociating the captured vesicle from the carrier after the vesicle capturing step or the washing step.
  • a dissociation step of dissociating specific binding by antigen-antibody reaction when the ligand is a specific antibody.
  • various conditions are known by affinity chromatography or the like (for example, “Affinity Chromatography principals & methods” Pharmacia LKB). See Biotechnology).
  • the dissociation step may be performed according to this.
  • acidic solutions such as hydrochloric acid, sulfuric acid, propionic acid, acetic acid, glycine / hydrochloric acid buffer
  • alkaline solutions such as sodium hydroxide aqueous solution, potassium hydroxide aqueous solution, ammonia aqueous solution, diethylamine
  • High ionic strength solution such as 3M sodium chloride aqueous solution and 4.5M magnesium chloride aqueous solution
  • Surfactant-containing solution such as SDS, Triton X-100, Tween 20
  • Buffer containing a substance that lowers the polarity such as dioxane, ethylene glycol
  • Trichloro In addition to chaotropic ions such as acetic acid and thiocyanic acid, buffer solutions containing urea, guanidine hydrochloride and the like can be mentioned.
  • the analysis method of the present invention preferably further includes a nucleic acid analysis step of analyzing a nucleic acid contained in the vesicle after the vesicle capturing step, washing step or dissociation step.
  • Nucleic acid analysis may be performed according to conventional methods. For example, the detection according to well-known methods, such as PCR method, electrophoresis method, sequence method, hybridization method, is mentioned. Examples of the nucleic acid include miRNA and mRNA.
  • the nucleic acid detection method of the present invention detects exosome-derived nucleic acids (miRNA, etc.) By analyzing, it becomes possible to determine physiological phenomena and various diseases. That is, the analysis method of the present invention is useful, for example, as a nucleic acid analysis method for disease determination, prognosis determination, and drug efficacy evaluation.
  • the disease determination method of the present invention is a determination method for determining whether or not a subject has developed a disease, and includes the step (1-1): using a biological sample derived from the subject.
  • Diseases that can be determined by the disease determination method of the present invention include cancer diseases (colorectal cancer, breast cancer, endometrial cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophageal cancer, liver cancer, lung cancer, renal cancer, skin cancer, etc. ), Inflammatory diseases (rheumatic, osteoarthritis, nephropathy, pancreatitis, hepatitis, allergy, etc.), neurodegenerative diseases such as Alzheimer, brain diseases, diseases related to immunodeficiency, infertility, depression, autism, etc. Psychiatric disorders, refractory diseases such as Parkinson's disease, autoimmune diseases, cardiovascular diseases, blood diseases, gastrointestinal diseases, diseases associated with aging, infectious diseases and the like. Among these, it is useful for determination of cancer diseases and immune system diseases, and particularly useful for determination of cancer diseases.
  • cancer diseases colorectal cancer, breast cancer, endometrial cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, esophage
  • the disease determination method of the present invention may be performed in the same manner as a known method except that the nucleic acid is analyzed by the nucleic acid analysis method of the present invention.
  • a disease is determined by performing a statistical analysis based on a signal of a biological sample derived from a control person and performing a comparison.
  • the analysis method is not particularly limited, and a known method can be used.
  • the subsequent determination for example, when the signal of the biological sample derived from the subject is stronger than the signal of the control person, it is determined that the possibility of developing the disease is high.
  • the control person means the average of the same age and the same person as the subject who has not developed the disease, the signal intensity in the control person may be measured together with the signal intensity in the subject, A statistical value obtained from a separately measured value may be used.
  • the prognosis determination method of the present invention is a prognosis determination method for determining the prognosis of a subject after treatment of a disease, and includes step (2-1): using a biological sample derived from the subject after treatment.
  • the analysis result obtained in the step (2-1) is compared with the analysis result of the biological sample derived from the subject before treatment. It is characterized by including a process.
  • the above treatment also includes surgical means such as administration of disease therapeutic agents and surgery.
  • the method for evaluating the efficacy of the present invention is a method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for a disease.
  • Step (3-1) Using a biological sample derived from a subject after administration of the therapeutic agent for a disease, the nucleic acid analysis method of the present invention And (3-2): comparing the analysis result obtained in the above step (3-1) with the analysis result of the biological sample derived from the subject before administration of the disease therapeutic agent It is characterized by.
  • the prognosis determination method and drug efficacy evaluation method of the present invention may be performed in the same manner as known methods, except that the nucleic acid is analyzed by the nucleic acid analysis method of the present invention.
  • the signal intensity derived from the complex in the biological sample derived from the subject after administration of the disease therapeutic agent is derived from the subject before administration of the disease therapeutic agent.
  • the disease therapeutic drug include drugs for treating a disease that can be determined by the disease determination method.
  • Preferred specific examples are anticancer drugs and anti-immune disease drugs.
  • prognosis determination and drug efficacy evaluation for example, statistical analysis is performed based on a signal in a biological sample before administration of a disease therapeutic drug, and the comparison is performed.
  • the analysis method is not particularly limited, and a known method can be used.
  • the subsequent determination for example, when the amount of signal in the biological sample after administration of the disease therapeutic drug is small compared to the amount of signal in the biological sample before administration, the drug may have an effect of suppressing the disease. It is judged that the nature is high.
  • exosomes are secreted from various cells such as cells of the immune system and various cancer cells, changes in blood exosomes before and after administration of disease therapeutic agents (in addition to increase / decrease in abundance, membrane proteins) It is considered possible to evaluate the drug efficacy in patients.
  • a ligand for a membrane protein specific for cancer cells and a ligand for a surface antigen of exosomes, it can be expected to improve the specificity of cancer diagnosis, identify the type of cancer, etc. It is considered possible to develop new diagnostic agents.
  • the vesicle separation method of the present invention includes a vesicle capture step of capturing a vesicle by bringing a biological sample containing the vesicle containing the nucleic acid into contact with a capture carrier for capturing the vesicle. Because The vesicle capturing step is performed by adding a polymer having an acidic group to the system, or at least one selected from a biological sample and a capturing carrier is treated with a polymer having an acidic group It is characterized by this.
  • the vesicle capture step in the vesicle separation method of the present invention may be performed in the same manner as the vesicle capture step of the nucleic acid analysis method of the present invention. Moreover, the same washing
  • the composition for nucleic acid analysis or vesicle separation according to the present invention comprises a capture carrier for capturing vesicles and a polymer having an acidic group.
  • a liquid composition is preferable.
  • the kit for nucleic acid analysis or vesicle separation according to the present invention comprises a capture carrier for capturing vesicles and a liquid agent containing a polymer having an acidic group.
  • the kit may include the capture carrier as a liquid containing the capture carrier.
  • the capturing carrier and the polymer having an acidic group in the composition and kit of the present invention the same nucleic acid analysis method as in the present invention may be used.
  • composition of the present invention and each of the above solutions may contain water, various buffers, and a surfactant.
  • the buffer include phosphate buffer, HEPES buffer, Tris buffer, carbonate buffer, MES buffer, and the like.
  • surfactant include the same surfactants that may be used in the vesicle capturing step.
  • the pH of the composition of the present invention and each of the above liquid preparations is not particularly limited, but is preferably in the range of pH 5 to 10, more preferably in the range of pH 6 to 8.
  • compositions of the present invention for example, a method of adding a polymer having an acidic group to a dispersion of a carrier for capturing, a reaction of a carrier for capturing treated with a polymer having an acidic group, Examples include a method of adding to a buffer.
  • the composition and kit of the present invention are useful for the analysis method, disease determination method, prognosis determination method, drug efficacy evaluation method, and vesicle separation method.
  • the non-specific adsorption inhibitor of the present invention is a non-specific adsorption inhibitor for suppressing non-specific adsorption of nucleic acids, and includes a polymer having an acidic group.
  • the method for suppressing nonspecific adsorption of a nucleic acid of the present invention is characterized by using a polymer having an acidic group.
  • the polymer having an acidic group in the nonspecific adsorption inhibitor and the nonspecific adsorption suppression method the same polymer as the nucleic acid analysis method of the present invention may be used.
  • Specific methods include a method of adding a polymer having an acidic group into the system (in a reaction vessel) and a method of treating a biological sample or a capture carrier.
  • the nonspecific adsorption inhibitor and the nonspecific adsorption suppression method of the present invention can suppress nonspecific adsorption of nucleic acids to the capture carrier and the inner wall of the reaction vessel.
  • the present invention can further provide the following nucleic acid analysis methods and the like.
  • a nucleic acid analysis method comprising a nucleic acid capture step of capturing a nucleic acid by contacting a biological sample containing the nucleic acid with a capture carrier for capturing the nucleic acid, The nucleic acid capturing step is performed by adding a polymer having an acidic group to the system, Analysis method.
  • a nucleic acid analysis method comprising a nucleic acid capturing step of capturing a nucleic acid by bringing a biological sample containing the nucleic acid into contact with a capture carrier for capturing the nucleic acid, At least one selected from the biological sample and the capture carrier is treated with a polymer having an acidic group, Analysis method.
  • a nucleic acid analysis method of the above [1] and [2] nonspecific adsorption of a non-analyzed substance is suppressed, and free nucleic acid in a biological sample can be analyzed with high accuracy.
  • Step (1-1) A step of analyzing a nucleic acid by the analysis method described in [1] or [2] above using a biological sample derived from a subject
  • Step (2-1) A step of analyzing a nucleic acid by the analysis method according to [1] or [2] above using a biological sample derived from a subject after treatment
  • Step (2-2) the step Including the step of comparing the analysis result obtained in (2-1) with the analysis result of the biological sample derived from the subject before treatment, Prognosis determination method.
  • Step (3-1) A method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for a disease
  • Step (3-1) A step of analyzing a nucleic acid by the analysis method according to [1] or [2] above using a biological sample derived from a subject after administration of a therapeutic agent for a disease
  • Step (3-2) A step of comparing the analysis result obtained in the step (3-1) with an analysis result of a biological sample derived from a subject before administration of a disease therapeutic agent, Evaluation methods.
  • a nucleic acid separation method comprising a nucleic acid capturing step of capturing a nucleic acid by bringing a biological sample containing the nucleic acid into contact with a capture carrier for capturing the nucleic acid,
  • the nucleic acid capturing step is performed by adding a polymer having an acidic group to the system, Separation method.
  • a nucleic acid separation method comprising a nucleic acid capture step of capturing a nucleic acid by bringing a biological sample containing the nucleic acid into contact with a capture carrier for capturing the nucleic acid, At least one selected from the biological sample and the capture carrier is treated with a polymer having an acidic group, Separation method.
  • a capture carrier for capturing a nucleic acid Including a polymer having an acidic group, A composition for nucleic acid analysis or nucleic acid separation.
  • a capture carrier for capturing a nucleic acid A liquid agent containing a polymer having an acidic group, Nucleic acid analysis or nucleic acid separation kit.
  • nucleic acid complex capturing step of capturing a nucleic acid complex by bringing a biological sample containing the nucleic acid complex (nucleoprotein or the like) into contact with a capture carrier for capturing the nucleic acid complex
  • the nucleic acid complex capturing step is performed by adding a polymer having an acidic group to the system, Analysis method.
  • nucleic acid including a nucleic acid complex capturing step of capturing a nucleic acid complex by bringing a biological sample containing the nucleic acid complex (nucleoprotein or the like) into contact with a capture carrier for capturing the nucleic acid complex.
  • a method At least one selected from the biological sample and the capture carrier is treated with a polymer having an acidic group, Analysis method.
  • the nucleic acid analysis method of the above [10] and [11] nonspecific adsorption of the non-analyzed substance is suppressed, and the nucleic acid derived from the nucleic acid complex in the biological sample can be analyzed with high accuracy.
  • Step (1-1) A step of analyzing a nucleic acid by the analysis method according to [10] or [11] using a biological sample derived from a subject
  • Step (2-1) A step of analyzing a nucleic acid by the analysis method according to [10] or [11] above using a biological sample derived from a subject after treatment
  • Step (2-2) the step Including the step of comparing the analysis result obtained in (2-1) with the analysis result of the biological sample derived from the subject before treatment, Prognosis determination method.
  • Step (3-1) A step of analyzing a nucleic acid by the analysis method according to [10] or [11] above using a biological sample derived from a subject after administration of a therapeutic agent for a disease, and Step (3-2) A step of comparing the analysis result obtained in the step (3-1) with an analysis result of a biological sample derived from a subject before administration of a disease therapeutic agent, Evaluation methods.
  • a nucleic acid complex including a nucleic acid complex capturing step of capturing the nucleic acid complex by bringing a biological sample containing the nucleic acid complex (nucleoprotein or the like) into contact with a capture carrier for capturing the nucleic acid complex.
  • a separation method of The nucleic acid complex capturing step is performed by adding a polymer having an acidic group to the system, Separation method.
  • a nucleic acid complex including a nucleic acid complex capturing step of capturing a nucleic acid complex by bringing a biological sample containing the nucleic acid complex (nucleoprotein or the like) into contact with a capture carrier for capturing the nucleic acid complex.
  • a separation method of At least one selected from the biological sample and the capture carrier is treated with a polymer having an acidic group, Separation method.
  • a capture carrier for capturing a nucleic acid complex (nucleoprotein, etc.); Including a polymer having an acidic group, A composition for nucleic acid analysis or nucleic acid complex separation.
  • a capture carrier for capturing a nucleic acid complex (nucleoprotein, etc.); A liquid agent containing a polymer having an acidic group, Kit for nucleic acid analysis or nucleic acid complex separation.
  • reaction buffer refers to a buffer used as a medium in the reaction.
  • Reaction buffer of Reference Example 1 Tris-buffered saline (TBS (Sigma 10 ⁇ TBS diluted 10-fold, the same shall apply hereinafter))
  • Reaction buffers of Comparative Examples 1 to 4 and Examples 1 to 12 Tris buffered physiological saline added with each additive substance shown in Table 1 so that the concentration in the reaction buffer is the concentration shown in Table 1.
  • HT29 culture supernatant (Sample 1): ExoCap Streptavidin Kit® Code. It was prepared according to the method described in MEX-SA (manufactured by MBL).
  • Normal human plasma / pool EDTA-2Na (sample 2): manufactured by Kojin Bio Inc.
  • Normal human plasma / pool heparin treatment (sample 3): manufactured by Kojin Bio Inc.
  • Normal human serum / pool (sample 4): manufactured by Kojin Bio Inc. 293T Kiyoshi (Sample 5): ExoCap Streptavidin Kit® Code. It was prepared according to the method described in MEX-SA (manufactured by MBL).
  • Example 6 ExoCap Streptavidin Kit® Code. It was prepared according to the method described in MEX-SA (manufactured by MBL). Normal human plasma / pool citrate treatment (sample 7): Kojin Bio
  • Test Example 1 A negative control in which a mouse antibody that does not react with vesicles is bound to a carrier or a positive control in which a vesicle-specific marker antibody is bound to a carrier, a cell culture supernatant containing vesicles, and a reaction buffer are mixed, After washing, the miRNA in the vesicle was detected, thereby confirming the nonspecific adsorption inhibitory action due to the addition of a surfactant (comparative example) or a polymer having an acidic group (example) to the reaction buffer.
  • a surfactant comparative.glymer having an acidic group
  • HT29 culture supernatant (Sample 1) was added as a sample and reacted at 4 ° C. for 24 hours. (3) Next, it was washed three times with 1 mL of a washing buffer (TBS containing 0.1% by mass of Tween 20, the same applies in Test Example 1). 2 mL of a new Protein LoBind tube (Eppendorf, # 0030108132) was prepared, and 1 mL of a suspension of antibody-immobilized magnetic particles reacted with the HT29 culture supernatant was dispensed. After collecting the antibody-immobilized magnetic particles using a magnetic flux collecting rack, the supernatant was extracted and 0.1 mL of a washing buffer was added.
  • TBS containing 0.1% by mass of Tween 20, the same applies in Test Example 1). 2 mL of a new Protein LoBind tube (Eppendorf, # 0030108132) was prepared, and 1 mL of a suspension of antibody-immobilized magnetic particles reacted with the
  • MicroRNA was recovered from 0.1 mL of this antibody-immobilized magnetic particle solution.
  • miRNeasy Serum / Plasma Kit 50 (QIAGEN, # 217184) was used.
  • TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit manufactured by Life Technologies, # 43666597
  • TaqMan MicroRNA Assays manufactured by Life Technologies, # 186948384
  • TaqMan UniversalMansLife Technologies The recommended protocol was used for the operation. Table 2 shows the results (number of PCR cycles and the difference between the negative control antibody and the positive control antibody when various substances are added to the reaction buffer).
  • Test Example 2 A negative control in which a mouse antibody that does not react with vesicles is bound to a carrier or a positive control in which a vesicle-specific marker antibody is bound to a carrier, and plasma containing vesicles with EDTA or a polymer having an acidic group (heparin)
  • the non-specific adsorption inhibitory effect by treating the biological sample with the polymer having an acidic group was confirmed by mixing the reaction solution with the reaction buffer, washing, and detecting the miRNA in the vesicle.
  • test was performed except that the buffer of Reference Example 1 in Table 1 was used as a reaction buffer, and normal human plasma / pool EDTA-2Na (sample 2) or normal human plasma / pool heparin treatment (sample 3) was used as a sample.
  • the test was conducted in the same manner as in Example 1.
  • Table 3 shows the results (number of PCR cycles and the difference between the negative control antibody and the positive control antibody when normal human plasma is used as a sample).
  • Test Example 3-1 The test was performed in the same manner as in Test Example 1 except that the reaction buffer shown in Table 4 was used as the reaction buffer.
  • Table 4 shows the results (number of PCR cycles and the difference between the negative control antibody and the positive control antibody (CD9 antibody) when various concentrations of casein are added to the reaction buffer).
  • the CD9 antibody was anti-CD326 (EpCAM) mAb-Biotin (MBL, Code No. MEX004-6), and the IgG2a antibody was Mouse IgG1 (MBL, Mouse IgG1 (isotype control) -Biotin, Code No. M075-6).
  • the test was conducted in the same manner as in Test Example 3-1, except that each was changed.
  • Table 5 shows the results (the number of PCR cycles and the difference between the negative control antibody and the positive control antibody (EpCAM antibody) when various concentrations of casein were added to the reaction buffer).
  • Test Example 3-3 A negative control in which a mouse antibody that does not react with vesicles is bound to a carrier or a positive control in which a vesicle-specific marker antibody is bound to a carrier, serum containing vesicles, and a reaction buffer are mixed, washed, By detecting the miRNA in the vesicle, the nonspecific adsorption inhibitory action by adding a polymer having an acidic group to the reaction buffer was confirmed. That is, the test was performed in the same manner as in Test Example 3-1, except that the reaction buffer shown in Table 6 was used as the reaction buffer, and normal human serum / pool (sample 4) was used as the sample. Table 6 shows the results (number of PCR cycles and the difference between the negative control antibody and the positive control antibody when normal human serum is used as a sample and various concentrations of casein are added to the reaction buffer).
  • Test Example 4-1 In Test Example 1, examination was performed by changing the type of biological sample. That is, the test was performed in the same manner as in Test Example 1 except that the reaction buffer shown in Table 7 was used as the reaction buffer, and the 293T culture supernatant (Sample 5) or 22Rv1 culture supernatant (Sample 6) was used as the sample. It was. Table 7 shows the results (the number of PCR cycles and the difference between the negative control antibody and the positive control antibody when the culture supernatant of various cells was used as a sample and casein was added to the reaction buffer).
  • Test Example 4-2 In Test Example 1, examination was performed by changing the type of biological sample. That is, the test example except that the reaction buffer shown in Table 8 was used as the reaction buffer, and normal human plasma / pool citrate treatment (sample 7) or normal human plasma / pool EDTA-2Na (sample 2) was used as the sample. The test was conducted in the same manner as in 1. Table 8 shows the results (number of PCR cycles and the difference between the negative control antibody and the positive control antibody when normal human plasma was used as a sample and casein was added to the reaction buffer).
  • Tamavidin (R) 2 binding beads Dynabeads M-280 Streptavidin (Thermo Fisher Scientific, Inc.), (manufactured by Thermo Fisher Scientific Inc.) Dynabeads MyOne Streptavidin C1, or Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) 0. 5 mg and 2.5 ⁇ L of biotinylated Mouse IgG2a (MBL, Mouse IgG2a (isotype control) -Biotin, Code No. M076-6) were suspended in 1 mL of Washing / Dilution Buffer. For 30 minutes at room temperature The non-magnetic components were removed by magnetic separation to obtain six types of antibodies immobilized magnetic particles.
  • Tests were conducted in the same manner as in Test Example 1 except that the above-mentioned six types of antibody-immobilized magnetic particles were used as antibody-immobilized magnetic particles, and the reaction buffers shown in Table 9 were used as reaction buffers. Table 9 shows the results (number of PCR cycles when various antibody-immobilized magnetic particles are used and casein is added to the reaction buffer).
  • Test Example 5-2 As the antibody-immobilized magnetic particles, Exosome-Human EpCAM Isolation Reagent (manufactured by Thermo Fisher Scientific), Mouse IgG1 (Mouse IgG1 (isotypecontrol) -1 Magnetic bead Co., Ltd., MB1 manufactured by MBL Co., Ltd.) The test was performed in the same manner as in Test Example 1 except that the reaction buffer shown in Table 10 was used, and normal human serum / pool (sample 4) or normal human plasma / pool citrate treatment (sample 7) was used as a sample. went. Table 10 shows the results (number of PCR cycles when normal human serum / plasma was used as a sample and casein was added to the reaction buffer of various antibody-immobilized magnetic particles).
  • mice IgG1 antibody Code No. M075-3 manufactured by MBL
  • mouse IgG2a antibody Code No. M076-3 manufactured by MBL
  • mouse IgG2b antibody Code No. M077-3 manufactured by MBL
  • Tests were conducted in the same manner as in Test Example 1 except that the above three types of antibody-immobilized magnetic particles were used as antibody-immobilized magnetic particles, and the reaction buffers shown in Table 11 were used as reaction buffers. Table 11 shows the results (number of PCR cycles when various antibody-immobilized magnetic particles are used and casein is added to the reaction buffer).
  • Test Example 6 In Test Example 1, examination was performed by changing the pH in the system in the vesicle capturing step. That is, sodium citrate buffer (pH 5.0, pH 6.0), phosphate buffer (pH 7.5), HEPES buffer (pH 7.5), Tris buffer (pH 7) to which a salt having a physiological salt concentration was added. .5, pH 8.0, pH 9.0) or carbonate buffer solution (pH 10.0) with no casein added or casein concentration 1% (w / v) (concentration in reaction buffer) as reaction buffer The test was performed in the same manner as in Test Example 1 except that it was used. Table 12 shows the results (number of PCR cycles and the difference between the negative control antibody and the positive control antibody when casein is added to various reaction buffers).
  • Test Example 7-1 The CD9 antibody was anti-CD326 (EpCAM) mAb-Biotin (MBL, Code No. MEX004-6), and the IgG2a antibody was Mouse IgG1 (MBL, Mouse IgG1 (isotype control) -Biotin, Code No. M075-6).
  • the test was conducted in the same manner as in Test Example 1 except that the reaction buffer shown in Table 13 was used as the reaction buffer. Table 13 shows the results (number of PCR cycles and the difference between the negative control antibody and the positive control antibody when various concentrations of Joncrill 6030 were added to the reaction buffer).
  • Test Example 7-2 The test was performed in the same manner as in Test Example 7-1 except that the reaction buffer shown in Table 14 was used as the reaction buffer. Table 14 shows the results (number of PCR cycles and differences between the negative control antibody and the positive control antibody when various concentrations of polyphosmer were added to the reaction buffer).
  • Test Example 8-1 Antibody-immobilized magnetic particles were prepared in the same manner as in Test Example 1 (1).
  • this capture carrier is referred to as non-blocking particles 1.
  • 0.5 mg of the non-blocking particle 1 was added to 2 mL of Protein LoBind tube (manufactured by Eppendorf, # 0030108132), and 0.3 mL of the reaction buffer of Example 6 shown in Table 1 was added thereto. After blocking for 24 hours, the plate was washed once with 1 mL of a washing buffer (TBS containing 0.1% by mass of Tween 20).
  • This capturing carrier is referred to as blocking particles 1.
  • the CD9 antibody was anti-CD326 (EpCAM) mAb-Biotin (MBL, Code No. MEX004-6), and the IgG2a antibody was Mouse IgG1 (MBL, Mouse IgG1 (isotype control) -Biotin, Code No. M075-6).
  • the test was conducted in the same manner as in Test Example 8-1, except that each was changed.
  • Table 16 shows the results (number of PCR cycles and the difference between the negative control antibody and the positive control antibody (EpCAM antibody) when casein blocking particles are used as the capture carrier).
  • the CD9 antibody was anti-CD326 (EpCAM) mAb-Biotin (MBL, Code No. MEX004-6), and the IgG2a antibody was Mouse IgG1 (MBL, Mouse IgG1 (isotype control) -Biotin, Code No. M075-6).
  • the antibody-immobilized magnetic particles were prepared in the same manner as in (1) of Test Example 1 except that each was changed. In Test Example 8-3, this capture carrier is referred to as non-blocking particles 2.
  • non-blocking particles 2 was added to 2 mL of Protein LoBind tube (manufactured by Eppendorf, # 0030108132), and 0.3 mL of the reaction buffer of Example 10 shown in Table 1 was added thereto. After blocking for 24 hours, the plate was washed once with 1 mL of a washing buffer (TBS containing 0.1% by mass of Tween 20). This capturing carrier is referred to as blocking particles 2. Next, 0.5 mg of non-blocking particles 2 or blocking particles 2 were added to 2 mL of Protein LoBind tube (Eppendorf, # 0030108132), and 0.3 mL of the reaction buffer shown in Table 17 was added as a reaction buffer.
  • TBS containing 0.1% by mass of Tween 20
  • Example 1 To each tube, 0.3 mL of HT29 culture supernatant (Sample 1) was added as a sample and reacted at 4 ° C. for 24 hours. After this reaction, the same operation as (3) of Test Example 1 was performed. Table 17 shows the results (number of PCR cycles and the difference between the negative control antibody and the positive control antibody (EpCAM antibody) when Joncrill 6030 blocking particles are used as the capture carrier).
  • the CD9 antibody was anti-CD326 (EpCAM) mAb-Biotin (MBL, Code No. MEX004-6), and the IgG2a antibody was Mouse IgG1 (MBL, Mouse IgG1 (isotype control) -Biotin, Code No. M075-6).
  • the reaction buffer shown in Table 18 was used as a reaction buffer.
  • normal human serum / pool sample 4
  • normal human serum / pool 10 of the cell culture supernatant shown in Table 18 was used as a 10-fold diluted concentrate was added.
  • Results number of PCR cycles and difference between negative control antibody and positive control antibody (EpCAM antibody) when normal human serum spiked with culture supernatant of various cells is used as sample and casein is added to the reaction buffer) 18 shows.

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Abstract

フリーの核酸等の分析対象外物質に起因する精度低下が発生しにくい、小胞中の核酸を分析する方法を提供すること。　核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、前記小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、分析方法。

Description

核酸の分析方法
　本発明は、核酸の分析方法、判定方法、予後判定方法、薬効評価方法、小胞の分離方法、核酸分析又は小胞分離用組成物、核酸分析又は小胞分離用キット、非特異吸着抑制剤、及び非特異吸着抑制方法に関する。
　体液中には、小胞中の核酸やキャリアタンパクと結合して存在する核酸（核酸複合体）、フリーの核酸などが存在する。これらはそれぞれ癌の進行や細胞分化など多彩な変化と関係していることが知られており、バイオマーカー開発や、疾患や予後の判定等への応用が期待されている。
　一方、体液中に存在する小胞顆粒としてエクソソームが知られている。エクソソームの表面には、一般的な細胞表面と同様に、種々の膜タンパク質が存在することが知られており、また、エクソソームの内部には、サイトカイン等各種タンパク質以外にもマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれることも分かってきた。また、免疫系の細胞や各種癌細胞等の種々の細胞からエクソソームが分泌されることが知られており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役としてのエクソソームの機能、エクソソームと生理現象や癌等の疾患との関連性が注目され、これについて検討が進められている。例えば、腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭの抗体を用いた場合に、卵巣癌患者の循環血中からエクソソームが分離され、エクソソーム由来のマイクロＲＮＡ発現量と卵巣癌の進行との間に関連性があることが既に報告されており（非特許文献１）、血清、血漿、血液などの生体試料からエクソソームを分離し、エクソソームに含まれるタンパク質やマイクロＲＮＡを新たなバイオマーカーとして疾患の早期診断や再発の発見に利用する試みがされている（特許文献１、２）。
特表２０１０－５３４４８０号公報 特表２０１３－５２６８５２号公報
Ｄ．Ｄ．Ｔａｙｌｏｒ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１０，１３－２１（２００８）
　ところで、エクソソーム等の小胞中の核酸、キャリアタンパクと結合して存在する核酸の複合体、フリーの核酸などの核酸は、その存在の仕方によりそれぞれ由来が異なるため、分析に先立ち、核酸を含む小胞、複合体、フリーの核酸のうち分析対象物であるものを単離しておくことが重要となる。
　しかしながら、細胞培養液の上清や臨床検体等の生体試料はフリーの核酸等を含んでいるため、生体試料から分離した小胞中の核酸を分析する際に、担体や反応容器内壁に対するフリーの核酸等の分析対象外物質の非特異吸着に起因して、抗原抗体反応などの特異反応が阻害されることや陰性と判定されるべき検体が誤って陽性と判定されること（以下、偽陽性とも称する）がある。この偽陽性を減少させるために、小胞の捕捉を界面活性剤存在下で行う、或いは捕捉用担体にタンパク質やポリマーをオーバーコートするなどの手法が用いられてきたが、これまでの手法だけでは限界があった。偽陽性を減少させることは、エクソソームをはじめとする小胞を利用した疾患や予後の判定において、ますます重要な課題となってくる。
　本発明が解決しようとする課題は、フリーの核酸等の分析対象外物質に起因する精度低下が発生しにくい、小胞中の核酸を分析する方法を提供することにある。
　そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、核酸を含む小胞を含有する生体試料と、小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法において、酸性基を有する高分子を系内に添加して小胞の捕捉を行うこと、又は生体試料や捕捉用担体として酸性基を有する高分子で処理されたものを用いることによって、フリーの核酸等の分析対象外物質の非特異吸着に起因する精度低下の発生が抑えられることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下の＜１＞～＜１９＞を提供するものである。
　＜１＞　核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
　前記小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
　分析方法。
　＜２＞　核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
　前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
　分析方法。
　＜３＞　さらに前記小胞に含まれる核酸を分析する核酸分析工程を含む、前記＜１＞又は＜２＞に記載の分析方法。
　＜４＞　前記捕捉用担体が粒子状又は多孔質フィルム状である、前記＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の分析方法。
　＜５＞　前記捕捉用担体が磁性粒子である、前記＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の分析方法。
　＜６＞　前記捕捉用担体がアビジン類を有する、前記＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の分析方法。
　＜７＞　前記捕捉用担体がリガンドを有する、前記＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の分析方法。
　＜８＞　前記リガンドが、小胞表面に存在する抗原タンパク質を認識する抗体である、前記＜７＞に記載の分析方法。
　＜９＞　前記酸性基を有する高分子が、酸性基を有する乳タンパク質、酸性基を有する合成高分子、並びにカルボキシ基及び硫酸基から選ばれる１種又は２種を有する多糖類から選ばれる１種又は２種以上である、前記＜１＞～＜８＞のいずれかに記載の分析方法。
　＜１０＞　前記酸性基を有する高分子がリン酸化タンパク質である、前記＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の分析方法。
　＜１１＞　被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための判定方法であって、
　工程（１－１）：被検者由来の生体試料を用いて前記＜１＞～＜１０＞のいずれかに記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
　工程（１－２）：前記工程（１－１）で得られた分析結果を健常者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
　判定方法。
　＜１２＞　被検者の疾患治療後の予後を判定するための予後判定方法であって、
　工程（２－１）：治療後の被検者由来の生体試料を用いて前記＜１＞～＜１０＞のいずれかに記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
　工程（２－２）：前記工程（２－１）で得られた分析結果を治療前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
　予後判定方法。
　＜１３＞　疾患治療薬の薬効評価方法であって、
　工程（３－１）：疾患治療薬投与後の被検者由来の生体試料を用いて前記＜１＞～＜１０＞のいずれかに記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
　工程（３－２）：前記工程（３－１）で得られた分析結果を疾患治療薬投与前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
　評価方法。
　＜１４＞　核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む小胞の分離方法であって、
　前記小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
　分離方法。
　＜１５＞　核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む小胞の分離方法であって、
　前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
　分離方法。
　＜１６＞　小胞を捕捉する捕捉用担体と、
　酸性基を有する高分子とを含む、
　核酸分析又は小胞分離用組成物。
　＜１７＞　小胞を捕捉する捕捉用担体と、
　酸性基を有する高分子を含む液剤とを備える、
　核酸分析又は小胞分離用キット。
　＜１８＞　核酸の非特異吸着を抑制させるための非特異吸着抑制剤であって、酸性基を有する高分子を含む、非特異吸着抑制剤。
　＜１９＞　酸性基を有する高分子を用いることを特徴とする、核酸の非特異吸着を抑制する方法。
　本発明の核酸分析方法は、フリーの核酸等の分析対象外物質に起因する精度低下が発生しにくい。
＜核酸分析方法＞
　本発明の核酸分析方法は、核酸を含む小胞を含有する生体試料と、小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
　小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うこと、又は
　生体試料及び捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを、特徴とするものである。
（酸性基を有する高分子）
　本発明の核酸分析方法においては、生体試料及び捕捉用担体とは別に、酸性基を有する高分子を小胞捕捉工程の系内に添加してもよく、生体試料及び／又は捕捉用担体として酸性基を有する高分子で処理されたものを用いることで小胞捕捉工程の系内に酸性基を有する高分子を共存せしめてもよい。また、生体試料及び／又は捕捉用担体として酸性基を有する高分子で処理されたものを使用し、更にこれとは別に、酸性基を有する高分子を小胞捕捉工程の系内に添加してもよい。なお、酸性基を有する高分子で生体試料を処理する方法は特に限定されず、例えば、酸性基を有する高分子を加えた容器に、採取した生体試料を添加する方法等が挙げられる。また、酸性基を有する高分子で捕捉用担体を処理する方法も特に限定されるものではなく、例えば、ブロッキング処理として通常行われる方法が挙げられ、より具体的には、酸性基を有する高分子を含むバッファーに捕捉用担体を加え、静置又は混合する方法等が挙げられる。
　このようにして酸性基を有する高分子を用いることによって、捕捉用担体表面に酸性基を有する高分子が付着し、非特異吸着を抑制することができるものと推察される。
　また、酸性基を有する高分子の系内への添加は、生体試料と捕捉用担体の接触前、接触時、接触後のいずれであってもよいが、生体試料と捕捉用担体の接触前に添加するのが好ましい。
　また、酸性基としては、カルボキシ基、リン酸基、硫酸基（－Ｏ－ＳＯ3Ｈ）、スルホ基（－ＳＯ3Ｈ）、フェノール性ヒドロキシ基、ジヒドロキシボリル基、これらの塩やイオン等が挙げられる。これらの中でも、非特異吸着抑制の観点から、カルボキシ基、リン酸基、硫酸基、スルホ基、これらの塩やイオンが好ましく、リン酸基が特に好ましい。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；有機アンモニウム塩；アミン塩等が挙げられる。なお、高分子は、酸性基を末端に有するものでも側鎖に有するものでもよい。
　酸性基を有する高分子としては、水溶性のものが好ましい。また、酸性基を有する高分子は天然高分子でも合成高分子でもよく、１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。なお、酸性基を有する高分子は部分エステル化物であってもよく、例えば、高分子が酸性基としてカルボキシ基を有する場合、カルボキシ基の一部がエチレングリコールやプロピレングリコール等でエステル化されていてもよい。また、酸性基を有する高分子がフェノール性ヒドロキシ基を有する場合や酸性基とは別にアルコール性ヒドロキシ基を有する場合、フェノール性ヒドロキシ基の一部、アルコール性ヒドロキシ基の一部又は全部が、酢酸、硝酸、硫酸、リン酸などと反応していてもよい。
　酸性基を有する天然高分子としては、酸性基を有する乳タンパク質；カルボキシ基及び硫酸基から選ばれる１種又は２種を有する多糖類；ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等のポリペプチド類；これらの塩が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　酸性基を有する乳タンパク質としては、リン酸化タンパク質が好ましい。例えば、カゼイン等が挙げられる。なお、酸性基を有する乳タンパク質として、部分加水分解物や架橋タンパク質等の乳タンパク質の誘導体を用いてもよい。また、酸性基を有する乳タンパク質として、酸性基を有する乳タンパク質を含む組成物を用いてもよい。このような組成物としては、乳漿タンパク質濃厚物、無脂肪乾燥ミルク、スキムミルク等が挙げられる。
　カルボキシ基及び硫酸基から選ばれる１種又は２種を有する多糖類としては、ヘパリンやその誘導体の他、キサンタンガム、カラギーナン、アルギン酸、ペクチン、ファーセラン、アラビアガム、ガッチガム、カラヤガム、トラガントガム、カンテン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ペントサンポリスルファート、カルボキシメチル化又はサクシニル化した多糖類（セルロース、デキストラン、デンプン、キトサンなどをカルボキシメチル化又はサクシニル化したもの）が挙げられる。これらの中では、非特異吸着抑制の観点から、ヘパリンやその誘導体が好ましい。ヘパリン誘導体としては、未処理のヘパリンに加え、低分子量化ヘパリン、脱Ｎ－硫酸化ヘパリン、脱２－Ｏ－硫酸化ヘパリン、脱６－Ｏ－硫酸化ヘパリン等が挙げられる。
　これら酸性基を有する天然高分子の中でも、非特異吸着抑制の観点から、酸性基を有する乳タンパク質、並びにカルボキシ基及び硫酸基から選ばれる１種又は２種を有する多糖類から選ばれる１種又は２種以上が好ましく、リン酸化タンパク質、ヘパリンやその誘導体がより好ましく、カゼイン、ヘパリンが更に好ましく、カゼインが特に好ましい。
　酸性基を有する合成高分子としては、酸性基を有する重合性不飽和モノマー若しくはその塩に由来する繰り返し単位を有する重合体又は共重合体の他、ポリリン酸又はその塩等が挙げられる。
　ここで、酸性基を有する重合性不飽和モノマーとは、重合性不飽和基と酸性基を１分子中に有する化合物を意味する。
　酸性基を有する重合性不飽和モノマーとしては、リン酸基を有する重合性不飽和モノマー、カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマー、スルホ基を有する重合性不飽和モノマーが挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの中では、非特異吸着抑制の観点から、リン酸基を有する重合性不飽和モノマー、カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマーが好ましい。
　リン酸基を有する重合性不飽和モノマーとしては、非特異吸着抑制の観点から、リン酸基含有（メタ）アクリル酸エステル類が好ましく、下記式（１）で表されるモノマーがより好ましい。なお、式（１）中のｎが１であるモノマーとしては、２－（メタ）アクリロイルオキシエチルアシッドホスフェート、２－（メタ）アクリロイルオキシプロピルアシッドホスフェートが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
〔式（１）中、
　Ｒ1及びＲ2は、水素原子又はメチル基を示し、
　ｎは、平均値で１～８を示し、好ましくは平均値で３～６である（なお、「平均値」はＮＭＲで測定できる）。〕
　カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、クロトン酸、ビニル安息香酸、ケイ皮酸、へキサヒドロフタル酸モノ－２－（メタ）アクリロイルオキシエチル等の不飽和モノカルボン酸類；フマル酸、マレイン酸、イタコン酸等の不飽和ジカルボン酸類；マレイン酸モノメチル、マレイン酸モノエチル、イタコン酸モノメチル、イタコン酸モノエチル等の不飽和ジカルボン酸類の部分エステル化物等が挙げられ、無水マレイン酸、無水イタコン酸等の不飽和ジカルボン酸類の酸無水物を用いることもできる。これらの中では、非特異吸着抑制の観点から、不飽和モノカルボン酸類が好ましく、（メタ）アクリル酸がより好ましい。
　スルホ基を有する重合性不飽和モノマーとしては、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、アリルスルホン酸、メタアリルスルホン酸、２－スルホエチル（メタ）アクリレート、２－（メタ）アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸等が挙げられる。
　酸性基を有する合成高分子は、酸性基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩に由来する繰り返し単位以外の繰り返し単位（以下、他の繰り返し単位とも称する）を有していてもよい。
　他の繰り返し単位としては、芳香族ビニル系モノマー、（メタ）アクリレート系モノマー、（メタ）アクリルアミド系モノマー、飽和カルボン酸と不飽和アルコールとのエステル類、アルキルビニルエーテル類、ビニル基含有アルコール類等に由来する繰り返し単位が挙げられる。これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　上記芳香族ビニル系モノマーとしては、下記式（２）で表されるものが好ましく、下記式（３）で表されるものがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
〔式（２）中、
　環Ｑは、芳香環を示し、
　Ｒ3は、水素原子又はメチル基を示し、
　Ｒ4は、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲン原子を示し、
　ｐは０～５の整数を示す。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
〔式（３）中、Ｒ3、Ｒ4及びｐは、式（２）中の各記号と同義である。〕
　式（２）中、環Ｑは、芳香環を示すが、ベンゼン環、ナフタレン環、ピリジン環が好ましく、ベンゼン環がより好ましい。
　式（２）及び（３）中、Ｒ4で示されるアルキル基の炭素数としては、１～４が好ましく、１又は２がより好ましい。また、当該アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられる。
　また、Ｒ4で示されるアルコキシ基の炭素数としては、１～４が好ましく、１又は２がより好ましい。また、当該アルコキシ基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基等が挙げられる。
　また、Ｒ4で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。
　また、ｐは０～５の整数を示すが、０～４の整数が好ましく、０又は１がより好ましい。なお、ｐが２～５の整数の場合、ｐ個のＲ4は同一であっても異なっていてもよい。
　上記芳香族ビニル系モノマーとしては、例えば、スチレン、α－メチルスチレン、ビニルトルエン、２－メチルスチレン、３－メチルスチレン、４－メチルスチレン、４－エチルスチレン、４－ｔｅｒｔ－ブチルスチレン、３，４－ジメチルスチレン、４－メトキシスチレン、４－エトキシスチレン、２－クロロスチレン、３－クロロスチレン、４－クロロスチレン、２，４－ジクロロスチレン、２，６－ジクロロスチレン、４－クロロ－３－メチルスチレン等のスチレン系モノマーの他、１－ビニルナフタレン、２－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン等が挙げられる。
　上記（メタ）アクリレート系又は（メタ）アクリルアミド系のモノマーとしては、下記式（４）で表されるものが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
〔式（４）中、
　Ｒ5は、水素原子又はメチル基を示し、
　Ｒ6は、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－＊、又は－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＲ8－＊（Ｒ8は、水素原子又は炭素数１～１０の炭化水素基を示し、＊は、式（４）中のＲ7と結合する位置を示す）を示し、
　Ｒ7は、有機基を示す。〕
　式（４）中、Ｒ7で示される有機基の炭素数は、好ましくは１～３０であり、より好ましくは２～２０であり、更に好ましくは２～１０であり、特に好ましくは２～６である。
　有機基としては、炭化水素基、炭化水素基の炭素原子の一部がケト基に置き換わった基が挙げられる。これら炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基を包含する概念である。
　脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、２－エチルヘキシル基、ラウリル基等のアルキル基が挙げられる。脂環式炭化水素基は、単環の脂環式炭化水素基と橋かけ環炭化水素基に大別される。単環の脂環式炭化水素基としては、シクロプロピル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基が挙げられる。また、橋かけ環炭化水素基としては、イソボルニル基、アダマンチル基、ジシクロペンタニル基等が挙げられる。芳香族炭化水素基としては、フェニル基等のアリール基、ベンジル基等のアラルキル基が挙げられる。
　また、式（４）中、Ｒ8は、水素原子又は炭素数１～１０の炭化水素基を示す。Ｒ8で示される炭化水素基としては、Ｒ7で示される炭化水素基と同様のものが挙げられる。Ｒ8としては、水素原子が好ましい。
　上記（メタ）アクリレート系モノマーとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ－ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔｅｒｔ－ブチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート等のアルキル（メタ）アクリレート；ベンジル（メタ）アクリレート等の芳香環構造を有する（メタ）アクリレート；イソボルニル（メタ）アクリレート、アダマンチル（メタ）アクリレート、ジシクロペンタニル（メタ）アクリレート等の脂環構造を有する（メタ）アクリレート等が挙げられる。
　上記（メタ）アクリルアミド系モノマーとしては、例えば、Ｎ－ｔ－ブチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）オクチルアクリルアミド、ジアセトン（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
　上記飽和カルボン酸と不飽和アルコールとのエステル類としては、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ネオデカン酸ビニル等が挙げられる。
　また、アルキルビニルエーテル類としては、メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル等が挙げられる。
　また、ビニル基含有アルコール類としては、ビニルアルコール等が挙げられる。
　酸性基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩と他の繰り返し単位を誘導するモノマーとの組み合わせとしては、リン酸基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩と（メタ）アクリレート系モノマーとの組み合わせ、カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩と芳香族ビニル系モノマーとの組み合わせが好ましく、リン酸基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩とブチル（メタ）アクリレートとの組み合わせ、カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩とスチレン及びα－メチルスチレンから選ばれる１種又は２種との組み合わせがより好ましい。
　このような組み合わせで共重合体とすることによって、水分散性を有し、且つ捕捉用担体へのフリーの核酸等の非特異吸着を抑制する効果に優れる重合体とすることができる。
　酸性基を有する合成高分子において、酸性基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩に由来する繰り返し単位の含有量としては、水への分散性・溶解性の観点から、全繰り返し単位中、２０～８０質量％が好ましい。酸性基を有する重合性不飽和モノマーがリン酸基を有する重合性不飽和モノマーである場合、より好ましくは３０～７０質量％、特に好ましくは４０～６０質量％であり、酸性基を有する重合性不飽和モノマーがカルボキシ基を有する重合性不飽和モノマーである場合、より好ましくは２０～８０質量％、更に好ましくは３０～７０質量％、特に好ましくは４０～６０質量％である。なお、他の繰り返し単位の含有量は、残余である。
　酸性基を有する合成高分子に含まれる繰り返し単位の含有量は、ＮＭＲで測定できる。
　酸性基を有する合成高分子の重量平均分子量としては、１万～１００万が好ましく、５万～５０万がより好ましい。
　上記重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（東ソー社製、ＨＬＣ－８２２２０ＧＰＣ）等を使用し、ポリスチレン換算で求めることができる。
　酸性基を有する合成高分子は、市販品を用いても合成して使用してもよい。酸性基を有する合成高分子は、公知の方法で合成できる。
　リン酸基を有する重合性不飽和モノマーに由来する繰り返し単位からなるホモポリマーの市販品としては、ポリホスマーＭ－１０１、ポリホスマーＰＥ－２０１、ポリホスマーＭＨ－３０１、ポリホスマーＰＰ－４０１（以上、ＤＡＰ社製）等が挙げられる。
　リン酸基を有する重合性不飽和モノマーに由来する繰り返し単位と（メタ）アクリレート系モノマーに由来する繰り返し単位とを有するコポリマーとしては、ポリホスマーＭＨＢ－１０（ＤＡＰ社製）等が挙げられる。
　また、カルボキシ基を有する合成高分子の市販品としては、スチレン／α－メチルスチレン／アクリル酸コポリマー（ＢＡＳＦ社製のジョンクリル６０３０等）、アクリル酸／エチルアクリレート／Ｎ－ｔ－ブチルアクリルアミドコポリマー（ＢＡＳＦ社製のウルトラホールド８、ウルトラホールド・ストロング等）、オクチルアクリルアミド／アクリル酸コポリマー（ナショナル・スターチ社製のアンフォーマーＶ－４２等）、アクリレート／メタクリレート／アクリル酸／メタクリル酸コポリマー（ユニオンカーバイド社製のアマホールドＤＲ２５等）、アクリレーツ／ジアセトンアクリルアミドコポリマー（互応化学工業社製のプラスサイズＬ－９５４０Ｂ等）、メチルビニルエーテル／マレイン酸アルキルコポリマー（ＩＳＰ社製のガントレッツＥＳ－２２５，同ＥＳ－４２５，同ＳＰ－２１５等）、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー（ナショナル・スターチ社製のレジン２８－１３１０等）、酢酸ビニル／クロトン酸／ネオデカン酸ビニルコポリマー（ナショナル・スターチ社製のレジン２８－２９３０等）、酢酸ビニル／クロトン酸／プロピオン酸ビニルコポリマー（ＢＡＳＦ社製のルビセットＣＡＰ等）、ビニルアルコール／イタコン酸コポリマー（クラレ社製のＫＭ－１１８等）等が挙げられる。
　小胞捕捉工程における酸性基を有する高分子の濃度は、系内の液相全量に対して、好ましくは０．０００００１～２５％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．０００００５～２０％（ｗ／ｖ）である。なお、単位「％（ｗ／ｖ）」は、例えば、「２５％（ｗ／ｖ）」のとき、「１００ｍＬに対して２５ｇ」であることを意味する単位である。
　特に、酸性基を有する高分子を系内に添加して小胞捕捉を行う場合、酸性基を有する高分子の濃度は、系内の液相全量に対して、好ましくは０．００００１～１５％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．００００５～１０％（ｗ／ｖ）であり、更に好ましくは０．０００１～７．５％（ｗ／ｖ）であり、特に好ましくは０．０００５～５％（ｗ／ｖ）である。一方、生体試料及び／又は捕捉用担体として、酸性基を有する高分子で処理されたものを用いる場合、酸性基を有する高分子の濃度は、系内の液相全量に対して、好ましくは０．０００００１～１０％（ｗ／ｖ）である。
（生体試料）
　生体試料としては、核酸を含む小胞を含有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、体液、菌体液、細胞培養の培地、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体が挙げられる。培地、培養上清、破砕液に含まれる細胞は、真核生物由来でも細菌由来でもよい。
　これらの中でも、生体試料としては、体液、細胞培養上清が好ましく、体液がより好ましく、ヒト由来の体液が特に好ましい。
　体液としては、全血、血清、血漿、各種血球、血餅、血小板、これら以外の血液成分等の血液組成成分の他、汗、胃液、間質液、関節液、眼房水、喀痰、胸水、口腔粘膜群、骨髄液、精液、消化液、組織液、体腔液、唾液、胆汁、膣液、涙、乳汁、尿、脳脊髄液、鼻腔液、糞便、腹水、羊水、リンパ液等が挙げられ、好ましくは血液組成成分である。なお、血液組成成分は、クエン酸、ＥＤＴＡ等の抗凝固剤で処理されたものでもよい。
　本発明の核酸分析方法は、血清や血漿等の臨床検体を生体試料として用いた場合であっても、非特異吸着に起因する精度低下が発生しにくく、広範な種類の生体試料に利用できる。
　ここで、本発明の一実施形態で使用する「酸性基を有する高分子で処理された生体試料」としては、上記酸性基を有する高分子で処理されたものであれば特に限定されないが、ヘパリン及び／又はその誘導体で処理された生体試料が好ましい。なお、このような生体試料を用いる場合、酸性基を有する高分子で予め処理された生体試料を用いても、核酸分析の直前に、酸性基を有する高分子で生体試料を処理してもよい。なお、生体試料に対する「処理」とは、酸性基を有する高分子を生体試料に添加することをいい、例えば、ヘパリンのような酸性基を有する高分子を含む血液抗凝固剤を血液試料に添加すること等が挙げられる。
　また、核酸を含む小胞は、脂質二重膜を有するものであれば特に限定されるものではなく、細胞、細胞から細胞外に放出されるエクソソーム、細胞外ベシクル、微細小胞等が挙げられる。中でも、本発明の核酸分析方法は、エクソソームに含まれる核酸の分析に特に適する。
　また、小胞は、通常、その表面に抗原が存在する。エクソソームの表面抗原を例に挙げると、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類；ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ等の抗原提示関連タンパク質；インテグリン、ＩＣＡＭ－１、ＥｐＣＡＭなどの接着分子；ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＧＦ－βなどのサイトカイン／サイトカイン受容体、酵素類等が挙げられる。これらの中でも、エクソソームを捕捉する場合は、エクソソーム表面に存在する抗原タンパク質を利用して捕捉するのが好ましい。
　小胞捕捉工程における生体試料の濃度は、系内の液相全量に対して、好ましくは０．１～９０％（ｖ／ｖ）であり、より好ましくは１～５０％（ｖ／ｖ）である。
　なお、濃度調整は、例えば、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等の緩衝液を用いて行うことができる。
（捕捉用担体）
　捕捉用担体としては、小胞を捕捉できるものであれば特に限定されないが、通常、固相担体が用いられる。
　また、捕捉用担体の使用量は、生体試料に対し、好ましくは０．００００１～０．１質量倍、より好ましくは０．０００１～０．０１質量倍である。
　固相担体の形状は特に限定されないが、例えば、トレイ状、球状、粒子状（ラテックス粒子等）、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、多孔質フィルム状、カラム、試験管等が挙げられ、固液分離や洗浄の容易性の観点から、粒子状、多孔質フィルム状が好ましく、粒子状がより好ましい。
　固相担体の材質としては、例えば、ポリスチレン類、ポリエチレン類、ポリプロピレン類、ポリエステル類、ポリ（メタ）アクリロニトリル類、スチレン－ブタジエン共重合体、ポリ（メタ）アクリル酸エステル類、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物；ガラス；シリカ；金属；磁性体；磁性体を含む樹脂組成物；これらの組み合わせ等が挙げられる。
　固相担体としては磁性粒子が好ましい。磁性粒子としては、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、三二酸化鉄（γ－Ｆｅ2Ｏ3）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属；コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる磁性体微粒子；これら磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が挙げられる。樹脂としては、疎水性重合体、親水性重合体などが挙げられる。
　これらの中でも、磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が好ましく、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面にポリマー層が形成されたものがより好ましい。例えば、特開２００８－３２４１１号公報に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層が形成され、当該第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。
　ここで、超常磁性微粒子としては、粒子径２０ｎｍ以下（好ましくは粒子径５～２０ｎｍ）の酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＸＦｅ2Ｏ4（Ｘ＝Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ0.5Ｆｅ0.5等）で表現されるフェライト、Ｆｅ3Ｏ4で表現されるマグネタイト、γ－Ｆｅ2Ｏ3が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない点で、γ－Ｆｅ2Ｏ3及びＦｅ3Ｏ4のいずれか一方を含むことが好ましい。
　また、上記疎水性の第１ポリマー層を形成するためのモノマーは、単官能性モノマー、架橋性モノマーに大別される。
　上記単官能性モノマーとして、例えば、スチレン、α－メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル系モノマー；メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレート等のエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル系モノマーを例示することができる。また、上記架橋性モノマーとして、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレート等の架橋性（メタ）アクリレート；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィンの他、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。
　また、上記第２ポリマー層を形成するためのモノマーは、粒子表面への官能基導入を主目的とするものであり、グリシジル基含有モノマーを含むものである。グリシジル基含有モノマーの含有量としては、第２ポリマー層を形成するためのモノマー中、２０質量％以上が好ましい。ここで、グリシジル基を含む共重合性モノマーとしては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル等が挙げられる。
　第２ポリマー層のグリシジル基を化学修飾することにより導入される極性基としては、リガンドと反応可能な官能基であることが好ましく、酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含むものがより好ましい。中でも、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基、活性エステル基がより好ましい。特に、磁性粒子の第２ポリマー層が前記極性基及び２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する場合、リガンドとの結合性が良好となる。
　また、磁性粒子等の固相担体は、その表面にビオチン類結合部位を有する物質が固定されていてもよい。これにより、ビオチン化されたリガンドが固相担体に結合しやすくなる。
　ビオチン類結合部位を有する物質としては、アビジン類が好ましい。アビジン類としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、及びそれらの誘導体から選ばれる１種又は２種以上の化合物等が挙げられる。固相担体の表面へのビオチン類結合部位を有する物質の固定は、日本国特許第４７１６０３４号公報に記載された方法等の公知の方法により行えばよい。
　ここで、本発明者らの検討の結果、アビジン類を有する捕捉用担体を小胞の捕捉に使用した場合は、フリーの核酸等の分析対象外物質が特に非特異吸着しやすくなり、小胞に含まれる核酸を分析する際にノイズが出やすくなることが判明した。しかしながら、本発明の核酸分析方法を用いた場合においては、アビジン類を有する捕捉用担体を用いたときであっても、小胞捕捉工程における分析対象外物質の非特異吸着を抑えることができ、核酸分析を低ノイズ化できる。
　また、本発明の一実施形態で使用する「酸性基を有する高分子で処理された捕捉用担体」としては、上記酸性基を有する高分子で処理されたものであれば特に限定されないが、酸性基を有する高分子でブロッキング処理されたものが好ましい。捕捉用担体に対する処理としては、酸性基を有する高分子を捕捉用担体の表面に物理的に吸着させる等してコートすること等が挙げられる。このような捕捉用担体を用いる場合、酸性基を有する高分子で予め処理された捕捉用担体を用いても、核酸分析の直前に、酸性基を有する高分子で捕捉用担体を処理してもよい。
（リガンド）
　捕捉用担体としては、リガンドを有するものが好ましい。
　リガンドを固相担体に結合する方法としては、物理的吸着法や、共有結合法、イオン結合法といった化学的に結合する方法などが用いられる。物理的吸着法としては、固相担体にリガンドを直接固定する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定する方法などが挙げられる。化学的に結合させる方法としては、固相担体表面に導入した、リガンドと反応可能な官能基を利用して、固相担体上に直接結合する方法、固相担体とリガンドとの間にスペーサー分子（カルボジイミド化合物など）を化学結合で導入してから結合する方法、アルブミンなどの他のタンパク質にリガンドを結合させた後、そのタンパク質を固相担体に化学結合する方法などが挙げられる。
　リガンドとしては、抗体、抗原、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、タンパク質（例えば、脂質二重膜を有する小胞の表面に存在するホスファチジルセリンなどの物質を認識するアネキシンＶなどのタンパク質）、ペプチド、アミノ酸、多糖、糖、脂質、ビタミン、薬物、基質、ホルモン、神経伝達物質等が挙げられる。これらの中でも、抗体、抗原、タンパク質、核酸が好ましく、抗体、抗原がより好ましく、抗体が特に好ましい。
　上記抗体としては、小胞表面に存在する抗原を認識する抗体が好ましく、小胞表面に存在する抗原タンパク質を認識する抗体がより好ましい。小胞がエクソソームである場合は、エクソソーム表面に存在する抗原タンパク質を認識する抗体が特に好ましい。また、抗体はビオチン化されていてもよい。ビオチン化抗体をアビジン類で結合させた捕捉用担体を用いることによって、非特異吸着を更に抑制できる。
　また、抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
　上記モノクローナル抗体は、特に限定されるものではなく、公知の方法、例えば、Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ　ａｓ　ａｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｆｅｅｄｂａｃｋ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（２００４），８９８－９０７に記載された方法に従って調製したものでよい。また、エクソソームの表面抗原ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類を認識するモノクローナル抗体は、国際公開第２０１３／０９９９２５号等を参照して作製できる。
　なお、上記抗体のクラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭが挙げられるが、ＩｇＧが好ましい。また、これらを低分子化したフラグメントを用いてもよい。例えば、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ等が挙げられる。
　また、小胞表面に存在する抗原を認識するリガンドが結合した固相担体は、市販品を用いてもよい。例えば、Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｈｕｍａｎ　ＣＤ９　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ）、Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｈｕｍａｎ　ＣＤ６３　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉａ）（いずれもＬｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＣＤ９　Ｅｘｏ－Ｆｌｏｗ　Ｃａｐｔｕｒｅ　ｋｉｔ、ＣＤ６３　Ｅｘｏ－Ｆｌｏｗ　Ｃａｐｔｕｒｅ　ｋｉｔ、ＣＤ８１　Ｅｘｏ－Ｆｌｏｗ　Ｃａｐｔｕｒｅ　ｋｉｔ（いずれもＳＢＩ社製）等が挙げられる。
（小胞捕捉工程）
　小胞捕捉工程においては、生体試料と捕捉用担体との接触により、核酸を含む小胞が捕捉用担体に捕捉される。
　小胞捕捉工程は、上記各成分の他に、必要に応じて、界面活性剤；アルブミン等のタンパク質；ショ糖等の糖類等を添加して行ってもよい。
　これらの中では、非特異吸着抑制の観点、小胞へのダメージを抑える観点から、界面活性剤が好ましく、非イオン性界面活性剤がより好ましく、ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤が特に好ましい。また、界面活性剤は、芳香族基を分子中に含まないものが好ましい。
　例えば、高級アルコールエチレンオキサイド付加物、脂肪酸エチレンオキサイド付加物、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物、高級アルキルアミンエチレンオキサイド付加物、脂肪酸アミドエチレンオキサイド付加物、油脂のエチレンオキサイド付加物、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物等が挙げられる。これらの中でも、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物が好ましい。具体的には、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール等が挙げられる。
　界面活性剤を使用する場合、その使用量は、非特異吸着抑制の観点、小胞へのダメージを抑える観点から、好ましくは０．００５～１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１５～３．５％（ｗ／ｖ）である。
　また、小胞捕捉工程における反応温度は、好ましくは２～４２℃の範囲内であり、より好ましくは２～３２℃の範囲内であり、特に好ましくは２～２２℃の範囲内である。また、反応時間は、通常、１分間～７２時間であるが、好ましくは５分間～６０時間、より好ましくは１０分間～４８時間、特に好ましくは１０分間～３６時間である。
　小胞捕捉工程において、系中のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５～１０の範囲、より好ましくはｐＨ６～８の範囲である。
　小胞捕捉工程は、緩衝液の存在下で行うのが好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
（洗浄工程）
　本発明の分析方法は、洗浄工程を含んでいてもよい。洗浄工程は、上記小胞捕捉工程で小胞を捕捉した捕捉用担体を洗浄する工程である。これによって、未反応の成分や未反応の標識物質の他、核酸や蛋白質等の分析対象外物質が更に除去される。小胞を捕捉した捕捉用担体を含む系をそのまま洗浄してもよい。
　上記洗浄工程は、通常、捕捉用担体の形状により２種類に分けられる。磁性粒子のように捕捉用担体が粒子状である場合には、例えば洗浄液中に磁性粒子を分散させて洗浄する方法が挙げられ、一方、捕捉用担体がマイクロプレートのような形態である場合には、その表面に洗浄液を接触させて洗浄する方法が挙げられる。いずれの態様であっても、本発明においては、洗浄液として、界面活性剤を含む洗浄液を使用することが好ましい。界面活性剤としては、上記小胞捕捉工程で使用してもよいものと同様のものが好ましい。
　また、捕捉用担体が磁性粒子の場合、洗浄工程としては、磁性粒子を磁力により集めて磁性粒子と液相とを分離する集磁工程、及び該集磁工程で分離された磁性粒子を洗浄液中に分散させる分散工程とを含むことが好ましい。これによって、未反応の物質や生体試料中の分析対象外物質を磁性粒子表面からさらに効率よく洗浄・分離除去できる。
　具体的には、反応容器に磁場を作用させ、磁性粒子を反応容器壁に付着させて集めた後、反応上清を除去し、さらに必要に応じて洗浄液を加え、同様に磁場を作用させた後上清を除去する操作を繰り返すことにより行えばよい。洗浄液としては、上記小胞捕捉工程で挙げた界面活性剤と緩衝液を含む洗浄液が好ましい。
（解離工程）
　本発明の分析方法は、上記小胞捕捉工程又は洗浄工程の後、捕捉された小胞を担体から解離する解離工程を含んでいてもよい。
　リガンドが特定の抗体である場合に抗原・抗体反応による特異的な結合が解離する条件としては、アフィニティークロマトグラフィー等で種々のものが知られている（例えば、 "Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　＆　ｍｅｔｈｏｄｓ"  Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ参照）。上記解離工程はこれに準じて行えばよい。即ち、本発明で使用される解離液としては、塩酸、硫酸、プロピオン酸、酢酸、グリシン／塩酸バッファー等の酸性溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、アンモニア水溶液、ジエチルアミン等のアルカリ性溶液；３Ｍ塩化ナトリウム水溶液、４．５Ｍ塩化マグネシウム水溶液等の高イオン強度溶液；ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤含有溶液；ジオキサン、エチレングリコール等の極性を下げる物質を含有する緩衝液；トリクロロ酢酸、チオシアン酸などのカオトロピックイオンの他、尿素、塩酸グアニジン等を含有する緩衝液が挙げられる。
（核酸分析工程）
　本発明の分析方法は、小胞捕捉工程、洗浄工程又は解離工程の後に、さらに小胞に含まれる核酸を分析する核酸分析工程を含むことが好ましい。
　核酸の分析は常法にしたがっておこなえばよい。例えば、ＰＣＲ法、電気泳動法、シーケンス法、ハイブリダイゼーション法等の公知の方法に従った検出が挙げられる。核酸としては、ｍｉＲＮＡやｍＲＮＡ等が挙げられる。
　特に、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、本発明の核酸の検出方法によれば、エクソソーム由来の核酸（ｍｉＲＮＡ等）を検出し、それを解析することによって、生理現象や各種疾患の判定が可能になる。
　すなわち、本発明の分析方法は、例えば、疾患判定や予後判定、薬効評価のための核酸分析方法として有用である。
＜疾患判定方法＞
　本発明の疾患判定方法は、被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための判定方法であって、工程（１－１）：被検者由来の生体試料を用いて本発明の核酸分析方法により核酸を分析する工程、及び工程（１－２）：前記工程（１－１）で得られた分析結果を健常者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とするものである。
　例えば、核酸分析がシグナル強度の測定である場合は、被検者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合に、被検者が疾患を発症していると判定すればよい。
　本発明の疾患判定方法で判定可能な疾患としては、癌疾患（大腸癌、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌、腎癌、皮膚癌など）、炎症系疾患（リウマチ、変形性関節症、腎症、膵炎、肝炎、アレルギーなど）、アルツハイマー等の神経変性疾患、脳疾患、免疫不全に関連する疾患、不妊、うつ病、自閉症等の精神疾患、パーキンソン病等の難治療性疾患、自己免疫性疾患、循環器疾患、血液疾患、消化器疾患、老化に伴う疾患、感染症等が例示される。これらの中でも、癌疾患、免疫系疾患の判定に有用であり、特に癌疾患の判定に特に有用である。
　本発明の疾患判定方法は、本発明の核酸分析方法により核酸を分析すること以外は公知の手法と同様にして行えばよい。例えば、疾患の判定は、対照者由来の生体試料のシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、被検者由来の生体試料のシグナルが対照者におけるシグナルと比べて強い場合に、疾患を発症している可能性が高いと判断される。なお、本発明において、対照者とは、疾患を発症していない被検者と同年代・同性の者の平均をいい、対照者におけるシグナル強度は被検者におけるシグナル強度と共に測定してもよく、別途予め測定した値から得られた統計値を用いてもよい。
＜予後判定方法及び薬効評価方法＞
　本発明の予後判定方法は、被検者の疾患治療後の予後を判定するための予後判定方法であって、工程（２－１）：治療後の被検者由来の生体試料を用いて本発明の核酸分析方法により核酸を分析する工程、及び工程（２－２）：前記工程（２－１）で得られた分析結果を治療前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とするものである。上記治療には疾患治療薬の投与や手術等の外科的手段も含まれる。
　本発明の薬効評価方法は、疾患治療薬の薬効評価方法であって、工程（３－１）：疾患治療薬投与後の被検者由来の生体試料を用いて本発明の核酸分析方法により核酸を分析する工程、及び工程（３－２）：前記工程（３－１）で得られた分析結果を疾患治療薬投与前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とするものである。
　本発明の予後判定方法及び薬効評価方法は、本発明の核酸分析方法により核酸を分析すること以外は公知の手法と同様にして行えばよい。例えば、疾患治療薬を投与した場合を例に説明すると、疾患治療薬の投与後の被検者由来の生体試料における複合体由来のシグナル強度が、疾患治療薬の投与前の被検者由来の生体試料における複合体由来のシグナル強度より弱いと認められる場合に、予後が良好である可能性が高い、或いは疾患治療薬が薬効を示している可能性が高いと判定すればよい。上記疾患治療薬としては、上記疾患判定方法で判定可能な疾患を治療する薬物が挙げられる。好適な具体例は、抗癌剤、抗免疫系疾患薬である。
　より具体的には、予後判定及び薬効評価は、例えば、疾患治療薬の投与前の生体試料におけるシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、疾患治療薬の投与後の生体試料におけるシグナル量が投与前の生体試料におけるシグナル量と比べて少ない場合に、該薬が疾患を抑える効果を有している可能性が高いと判断される。
　特に、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、疾患治療薬の投与の前後での血中エクソソームの変化（存在量の増減だけに加え、膜タンパク質の量の変動を含む）を測定することにより、患者における薬効を評価することが可能になると考えられる。また、例えば、癌細胞に特異的な膜タンパク質に対するリガンドとエクソソームの表面抗原に対するリガンドとを組み合わせれば、癌診断の特異性の向上や癌種の特定などが期待でき、より癌疾患に特異的な診断薬の開発が可能となると考えられる。
＜小胞分離方法＞
　本発明の小胞分離方法は、核酸を含む小胞を含有する生体試料と、小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む小胞の分離方法であって、
　小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うこと、又は
　生体試料及び捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とするものである。
　本発明の小胞分離方法における小胞捕捉工程は、本発明の核酸分析方法の小胞捕捉工程と同様にして行えばよい。また、本発明の核酸分析方法と同様の洗浄工程、解離工程を含んでいてもよい。
　本発明の小胞分離方法によれば、フリーの核酸等の分析対象外物質を除去することができる。
＜組成物及びキット＞
　本発明の核酸分析又は小胞分離用組成物は、小胞を捕捉する捕捉用担体と、酸性基を有する高分子とを含むことを特徴とするものである。本発明の組成物としては、液状組成物が好ましい。
　本発明の核酸分析又は小胞分離用キットは、小胞を捕捉する捕捉用担体と、酸性基を有する高分子を含む液剤とを備えることを特徴とするものである。当該キットは、上記捕捉用担体を、捕捉用担体を含む液剤として備えていてもよい。
　これら本発明の組成物及びキットにおける捕捉用担体、酸性基を有する高分子は、本発明の核酸分析方法と同様のものを用いればよい。
　本発明の組成物及び上記各液剤は、水、各種緩衝液、界面活性剤を含んでいてもよい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。界面活性剤としては、上記小胞捕捉工程で用いてもよいものと同様の界面活性剤が挙げられる。
　また、本発明の組成物及び上記各液剤のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５～１０の範囲、より好ましくはｐＨ６～８の範囲である。
　なお、本発明の組成物の調製方法としては、例えば、捕捉用担体の分散液に、酸性基を有する高分子を添加する方法、酸性基を有する高分子で処理された捕捉用担体を、反応バッファーに添加する方法等が挙げられる。
　本発明の組成物及びキットは、上記分析方法、疾患判定方法、予後判定方法、薬効評価方法、小胞分離方法に有用である。
＜非特異吸着抑制剤及び非特異吸着抑制方法＞
　本発明の非特異吸着抑制剤は、核酸の非特異吸着を抑制させるための非特異吸着抑制剤であって、酸性基を有する高分子を含むものである。
　本発明の核酸の非特異吸着を抑制する方法は、酸性基を有する高分子を用いることを特徴とするものである。
　これら非特異吸着抑制剤及び非特異吸着抑制方法における酸性基を有する高分子は、本発明の核酸分析方法と同様のものを用いればよい。具体的な方法としては、酸性基を有する高分子を系内（反応容器内）に添加する方法、生体試料や捕捉用担体を処理する方法が挙げられる。
　本発明の非特異吸着抑制剤及び非特異吸着抑制方法により、捕捉用担体や反応容器内壁に対する核酸の非特異吸着を抑制できる。
　上述した実施形態の他、本発明によれば、更に以下の核酸の分析方法等を提供できる。
　〔１〕　核酸を含有する生体試料と、前記核酸を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸を捕捉する核酸捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
　前記核酸捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
　分析方法。
　〔２〕　核酸を含有する生体試料と、前記核酸を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸を捕捉する核酸捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
　前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
　分析方法。
　上記〔１〕及び〔２〕の核酸分析方法によれば、分析対象外物質の非特異吸着が抑制され、生体試料中のフリーの核酸を高精度で分析できる。
　〔３〕　被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための判定方法であって、
　工程（１－１）：被検者由来の生体試料を用いて前記〔１〕又は〔２〕に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
　工程（１－２）：前記工程（１－１）で得られた分析結果を健常者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
　判定方法。
　〔４〕　被検者の疾患治療後の予後を判定するための予後判定方法であって、
　工程（２－１）：治療後の被検者由来の生体試料を用いて前記〔１〕又は〔２〕に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
　工程（２－２）：前記工程（２－１）で得られた分析結果を治療前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
　予後判定方法。
　〔５〕　疾患治療薬の薬効評価方法であって、
　工程（３－１）：疾患治療薬投与後の被検者由来の生体試料を用いて前記〔１〕又は〔２〕に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
　工程（３－２）：前記工程（３－１）で得られた分析結果を疾患治療薬投与前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
　評価方法。
　〔６〕　核酸を含有する生体試料と、前記核酸を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸を捕捉する核酸捕捉工程を含む核酸の分離方法であって、
　前記核酸捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
　分離方法。
　〔７〕　核酸を含有する生体試料と、前記核酸を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸を捕捉する核酸捕捉工程を含む核酸の分離方法であって、
　前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
　分離方法。
　〔８〕　核酸を捕捉する捕捉用担体と、
　酸性基を有する高分子とを含む、
　核酸分析又は核酸分離用組成物。
　〔９〕　核酸を捕捉する捕捉用担体と、
　酸性基を有する高分子を含む液剤とを備える、
　核酸分析又は核酸分離用キット。
　〔１０〕　核酸複合体（核タンパク質等）を含有する生体試料と、前記核酸複合体を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸複合体を捕捉する核酸複合体捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
　前記核酸複合体捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
　分析方法。
　〔１１〕　核酸複合体（核タンパク質等）を含有する生体試料と、前記核酸複合体を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸複合体を捕捉する核酸複合体捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
　前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
　分析方法。
　上記〔１０〕及び〔１１〕の核酸分析方法によれば、分析対象外物質の非特異吸着が抑制され、生体試料中の核酸複合体由来の核酸を高精度で分析できる。
　〔１２〕　被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための判定方法であって、
　工程（１－１）：被検者由来の生体試料を用いて前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
　工程（１－２）：前記工程（１－１）で得られた分析結果を健常者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
　判定方法。
　〔１３〕　被検者の疾患治療後の予後を判定するための予後判定方法であって、
　工程（２－１）：治療後の被検者由来の生体試料を用いて前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
　工程（２－２）：前記工程（２－１）で得られた分析結果を治療前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
　予後判定方法。
　〔１４〕　疾患治療薬の薬効評価方法であって、
　工程（３－１）：疾患治療薬投与後の被検者由来の生体試料を用いて前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
　工程（３－２）：前記工程（３－１）で得られた分析結果を疾患治療薬投与前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
　評価方法。
　〔１５〕　核酸複合体（核タンパク質等）を含有する生体試料と、前記核酸複合体を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸複合体を捕捉する核酸複合体捕捉工程を含む核酸複合体の分離方法であって、
　前記核酸複合体捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
　分離方法。
　〔１６〕　核酸複合体（核タンパク質等）を含有する生体試料と、前記核酸複合体を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸複合体を捕捉する核酸複合体捕捉工程を含む核酸複合体の分離方法であって、
　前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
　分離方法。
　〔１７〕　核酸複合体（核タンパク質等）を捕捉する捕捉用担体と、
　酸性基を有する高分子とを含む、
　核酸分析又は核酸複合体分離用組成物。
　〔１８〕　核酸複合体（核タンパク質等）を捕捉する捕捉用担体と、
　酸性基を有する高分子を含む液剤とを備える、
　核酸分析又は核酸複合体分離用キット。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　まず、試験に先立ち、参考例１、比較例１～４及び実施例１～１２の反応バッファーとして、以下の反応バッファーを準備した。なお、「反応バッファー」とは、反応の際に媒体として使用するバッファーをいう。
　参考例１の反応バッファー：トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製１０×ＴＢＳを１０倍希釈、以下同じ））
　比較例１～４及び実施例１～１２の反応バッファー：トリス緩衝生理食塩水に、表１に示す各添加物質を、反応バッファー中の濃度が表１に示す濃度になるように添加したもの
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　次に、以下のサンプル（生体試料）を準備した。
　ＨＴ２９培養上清（サンプル１）：ＥｘｏＣａｐ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｋｉｔ（登録商標）Ｃｏｄｅ．　ＭＥＸ－ＳＡ（ＭＢＬ社製）に記載の方法に従い調製した。
　正常ヒト血漿・プール　ＥＤＴＡ－２Ｎａ（サンプル２）：コージンバイオ社製
　正常ヒト血漿・プール　ヘパリン処理（サンプル３）：コージンバイオ社製
　正常ヒト血清・プール（サンプル４）：コージンバイオ社製
　２９３Ｔ培養上清（サンプル５）：ＥｘｏＣａｐ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｋｉｔ（登録商標）Ｃｏｄｅ．　ＭＥＸ－ＳＡ（ＭＢＬ社製）に記載の方法に従い調製した。
　２２Ｒｖ１培養上清（サンプル６）：ＥｘｏＣａｐ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｋｉｔ（登録商標）Ｃｏｄｅ．　ＭＥＸ－ＳＡ（ＭＢＬ社製）に記載の方法に従い調製した。
　正常ヒト血漿・プール　クエン酸処理（サンプル７）：コージンバイオ社製
（試験例１）
　小胞とは反応しないマウス抗体を担体に結合させた陰性対照又は小胞特異的マーカー抗体を担体に結合させた陽性対照と、小胞を含む細胞培養上清と、反応バッファーとを混合し、洗浄後、小胞内のｍｉＲＮＡを検出することで、反応バッファーへの界面活性剤（比較例）又は酸性基を有する高分子（実施例）の添加による非特異吸着抑制作用を確認した。具体的手順を以下に示す。
　（１）　ビオチン化されたＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ａ（ＭＢＬ社製、Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ａ　（ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｍ０７６－６）２．５μＬ、又はＡｎｔｉ－ＣＤ９　ｍＡｂ（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．ＭＥＸ００１－６）２．５μＬと、ＥｘｏＣａｐ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｋｉｔ(登録商標)Ｃｏｄｅ．　ＭＥＸ－ＳＡ（ＭＢＬ社製）０．５ｍｇとをＷａｓｈｉｎｇ／Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　１ｍＬに懸濁させ、この懸濁溶液を室温で３０分間攪拌し、非磁性成分を磁気分離により除去し、抗体固定化磁性粒子を得た。
　（２）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＬｏＢｉｎｄチューブ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、上記抗体固定化磁性粒子をそれぞれ０．５ｍｇ加え、反応バッファーとして表２に示す反応バッファーを０．３ｍＬ添加した。各チューブに、サンプルとしてＨＴ２９培養上清（サンプル１）を０．３ｍＬ添加し、４℃で２４時間反応させた。
　（３）　次に、洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ、試験例１において以下同じ）１ｍＬで３回洗浄した。新しいＰｒｏｔｅｉｎ　ＬｏＢｉｎｄチューブ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を用意し、ＨＴ２９培養上清を反応させた抗体固定化磁性粒子の懸濁液を１ｍＬ分注した。集磁ラックを用いて、抗体固定化磁性粒子を集磁後、上清を抜き取り、洗浄バッファーを０．１ｍＬ添加した。この抗体固定化磁性粒子液０．１ｍＬより、ｍｉｃｒｏＲＮＡを回収した。ｍｉｃｒｏＲＮＡの回収にはｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ　Ｋｉｔ（５０）（ＱＩＡＧＥＮ社製、＃２１７１８４）を用いた。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ－２１）の定量には、ＴａｑＭａｎ　ＭｉｃｒｏＲＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製、＃４３６６５９７）、ＴａｑＭａｎ　ＭｉｃｒｏＲＮＡ　Ａｓｓａｙｓ（ライフテクノロジーズ社製、＃１８６９４８３８４）及びＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ＩＩ，　ｎｏ　ＵＮＧ（ライフテクノロジーズ社製、＃４４４００４０）を用い、操作については推奨プロトコールに従った。結果（反応バッファーに各種物質を添加した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体のＰＣＲサイクル数およびその差）を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表２に示すとおり、ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ２０、ＣＨＡＰＳＯ、デオキシコール酸を系内に添加した場合は、小胞捕捉工程における非特異吸着の抑制は確認できなかったが、酸性基を有する高分子であるカゼインを系内に添加した場合は、小胞捕捉工程におけるフリーの核酸等の非特異吸着を抑制できた。
（試験例２）
　小胞とは反応しないマウス抗体を担体に結合させた陰性対照又は小胞特異的マーカー抗体を担体に結合させた陽性対照と、ＥＤＴＡ又は酸性基を有する高分子（ヘパリン）で小胞を含む血漿を処理したものと、反応バッファーとを混合し、洗浄後、小胞内のｍｉＲＮＡを検出することで、酸性基を有する高分子で生体試料を処理することによる非特異吸着抑制作用を確認した。
　すなわち、反応バッファーとして表１の参考例１のバッファーを使用し、サンプルとして正常ヒト血漿・プール　ＥＤＴＡ－２Ｎａ（サンプル２）又は正常ヒト血漿・プール　ヘパリン処理（サンプル３）を使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果（サンプルとして正常ヒト血漿を使用した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体のＰＣＲサイクル数およびその差）を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表３に示すとおり、ＥＤＴＡで処理した生体試料を用いた場合は、小胞捕捉工程における非特異吸着の抑制は確認できなかったが、酸性基を有する高分子であるヘパリンで処理した生体試料を用いた場合は、小胞捕捉工程におけるフリーの核酸等の非特異吸着を抑制できた。
（試験例３－１）
　反応バッファーとして表４に示す反応バッファーを使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果（反応バッファーに各種濃度のカゼインを添加した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体（ＣＤ９抗体）のＰＣＲサイクル数およびその差）を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（試験例３－２）
　ＣＤ９抗体をＡｎｔｉ－ＣＤ３２６　（ＥｐＣＡＭ）　ｍＡｂ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．ＭＥＸ００４－６）に、ＩｇＧ２ａ抗体をＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ１（ＭＢＬ社製　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　（ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｍ０７５－６）に、それぞれ変更した以外は、試験例３－１と同様にして試験を行った。結果（反応バッファーに各種濃度のカゼインを添加した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体（ＥｐＣＡＭ抗体）のＰＣＲサイクル数およびその差）を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表４、５に示すとおり、０．１％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、２．５％（ｗ／ｖ）、５．０％（ｗ／ｖ）のいずれのカゼイン濃度の反応バッファーを用いた場合においても、フリーの核酸等の非特異吸着を抑制できた。
（試験例３－３）
　小胞とは反応しないマウス抗体を担体に結合させた陰性対照又は小胞特異的マーカー抗体を担体に結合させた陽性対照と、小胞を含む血清と、反応バッファーとを混合し、洗浄後、小胞内のｍｉＲＮＡを検出することで、反応バッファーへの酸性基を有する高分子の添加による非特異吸着抑制作用を確認した。
　すなわち、反応バッファーとして表６に示す反応バッファーを使用し、サンプルとして正常ヒト血清・プール（サンプル４）を使用した以外は、試験例３－１と同様にして試験を行った。結果（サンプルとして正常ヒト血清を使用し、反応バッファーに各種濃度のカゼインを添加した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体のＰＣＲサイクル数およびその差）を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（試験例４－１）
　試験例１において、生体試料の種類を変更した検討を行った。
　すなわち、反応バッファーとして表７に示す反応バッファーを使用し、サンプルとして２９３Ｔ培養上清（サンプル５）又は２２Ｒｖ１培養上清（サンプル６）を使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果（サンプルとして各種細胞の培養上清を使用し、反応バッファーにカゼインを添加した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体のＰＣＲサイクル数およびその差）を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（試験例４－２）
　試験例１において、生体試料の種類を変更した検討を行った。
　すなわち、反応バッファーとして表８に示す反応バッファーを使用し、サンプルとして正常ヒト血漿・プール　クエン酸処理（サンプル７）又は正常ヒト血漿・プール　ＥＤＴＡ－２Ｎａ（サンプル２）を使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果（サンプルとして正常ヒト血漿を使用し、反応バッファーにカゼインを添加した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体のＰＣＲサイクル数およびその差）を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（試験例５－１）
　Ｔａｍａｖｉｄｉｎ（登録商標）２，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（日本たばこ産業社製）、Ｔａｍａｖｉｄｉｎ（登録商標）２－ＲＥＶ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（日本たばこ産業社製）、Ｔａｍａｖｉｄｉｎ（登録商標）２－ＬＰＩ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（日本たばこ産業社製）をhttp://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/5324-MS300CA_j.PDFに記載のプロトコールに従い、磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製　ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）に結合させたものを準備した。これらのＴａｍａｖｉｄｉｎ（登録商標）２結合ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　ＭｙＯｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｃ１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、又はＤｙｎａｂｅａｄｓ　ＭｙＯｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｔ１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．５ｍｇと、ビオチン化されたＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ａ（ＭＢＬ社製、Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ａ　（ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｍ０７６－６）２．５μＬとを、Ｗａｓｈｉｎｇ／Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　１ｍＬに懸濁させ、この懸濁溶液を室温で３０分間攪拌し、非磁性成分を磁気分離により除去し、６種類の抗体固定化磁性粒子を得た。
　抗体固定化磁性粒子として上記６種類の抗体固定化磁性粒子を使用し、反応バッファーとして表９に示す反応バッファーを使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果（各種抗体固定化磁性粒子を使用し、反応バッファーにカゼインを添加した場合のＰＣＲサイクル数）を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
（試験例５－２）
　抗体固定化磁性粒子として、Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｈｕｍａｎ　ＥｐＣＡＭ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１（Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１（ｉｓｏｔｙｐｅｃｏｎｔｒｏｌ）－Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ（ＭＢＬ社製　Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｍ０７５－１１））を使用し、反応バッファーとして表１０に示す反応バッファーを使用し、サンプルとして正常ヒト血清・プール（サンプル４）又は正常ヒト血漿・プール　クエン酸処理（サンプル７）を使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果（サンプルとして正常ヒト血清・血漿を使用し、各種抗体固定化磁性粒子の反応バッファーにカゼインを添加した場合のＰＣＲサイクル数）を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
（試験例５－３）
　マウスＩｇＧ１抗体（ＭＢＬ社製　Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｍ０７５－３）、マウスＩｇＧ２ａ抗体（ＭＢＬ社製　Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｍ０７６－３）、又はマウスＩｇＧ２ｂ抗体（ＭＢＬ社製　Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｍ０７７－３）をhttp://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/5324-MS300CA_j.PDFに記載のプロトコールに従い、磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）に結合させたものを抗体固定化磁性粒子として準備した。
　抗体固定化磁性粒子として上記３種類の抗体固定化磁性粒子を使用し、反応バッファーとして表１１に示す反応バッファーを使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果（各種抗体固定化磁性粒子を使用し、反応バッファーにカゼインを添加した場合のＰＣＲサイクル数）を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
（試験例６）
　試験例１において、小胞捕捉工程の系内のｐＨを変更した検討を行った。
　すなわち、生理的塩濃度の塩を添加したクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、トリス緩衝液（ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０）又は炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）を、カゼイン無添加又はカゼイン濃度１％（ｗ／ｖ）（反応バッファー中の濃度）としたものを、反応バッファーとして使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果（各種反応バッファーにカゼインを添加した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体のＰＣＲサイクル数およびその差）を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
（試験例７－１）
　ＣＤ９抗体をＡｎｔｉ－ＣＤ３２６　（ＥｐＣＡＭ）　ｍＡｂ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．ＭＥＸ００４－６）に、ＩｇＧ２ａ抗体をＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ１（ＭＢＬ社製　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　（ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｍ０７５－６）に、それぞれ変更し、反応バッファーとして表１３に示す反応バッファーを使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果（反応バッファーに各種濃度のジョンクリル６０３０を添加した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体のＰＣＲサイクル数およびその差）を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
（試験例７－２）
　反応バッファーとして表１４に示す反応バッファーを使用した以外は、試験例７－１と同様にして試験を行った。結果（反応バッファーに各種濃度のポリホスマーを添加した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体のＰＣＲサイクル数およびその差）を表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　表１３、１４に示すとおり、酸性基を有する高分子であるジョンクリル６０３０、ポリホスホマーを系内に添加することによって、小胞捕捉工程におけるフリーの核酸等の非特異吸着を抑制できた。
（試験例８－１）
　試験例１の（１）と同様に抗体固定化磁性粒子を調製した。試験例８－１において、この捕捉用担体を非ブロッキング粒子１と称する。
　次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＬｏＢｉｎｄチューブ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、上記非ブロッキング粒子１を０．５ｍｇ加え、これに表１で示した実施例６の反応バッファーを０．３ｍＬ添加し、４℃、２４時間ブロッキング処理した後、洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）１ｍＬで１回洗浄した。この捕捉用担体をブロッキング粒子１と称する。
　次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＬｏＢｉｎｄチューブ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、非ブロッキング粒子１又はブロッキング粒子１をそれぞれ０．５ｍｇ加え、反応バッファーとして表１５に示す反応バッファーを０．３ｍＬ添加した。各チューブに、サンプルとしてＨＴ２９培養上清（サンプル１）を０．３ｍＬ添加し、４℃で２４時間反応させた。この反応後は、試験例１の（３）と同様の操作を行った。結果（捕捉用担体としてカゼインブロッキング粒子を使用した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体（ＣＤ９抗体）のＰＣＲサイクル数およびその差）を表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
（試験例８－２）
　ＣＤ９抗体をＡｎｔｉ－ＣＤ３２６　（ＥｐＣＡＭ）　ｍＡｂ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．ＭＥＸ００４－６）に、ＩｇＧ２ａ抗体をＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ１（ＭＢＬ社製　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　（ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｍ０７５－６）に、それぞれ変更した以外は、試験例８－１と同様にして試験を行った。結果（捕捉用担体としてカゼインブロッキング粒子を使用した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体（ＥｐＣＡＭ抗体）のＰＣＲサイクル数およびその差）を表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
（試験例８－３）
　ＣＤ９抗体をＡｎｔｉ－ＣＤ３２６　（ＥｐＣＡＭ）　ｍＡｂ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．ＭＥＸ００４－６）に、ＩｇＧ２ａ抗体をＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ１（ＭＢＬ社製　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　（ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｍ０７５－６）に、それぞれ変更する以外は、試験例１の（１）と同様に抗体固定化磁性粒子を調製した。試験例８－３において、この捕捉用担体を非ブロッキング粒子２と称する。
　次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＬｏＢｉｎｄチューブ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、上記非ブロッキング粒子２を０．５ｍｇ加え、これに表１で示した実施例１０の反応バッファーを０．３ｍＬ添加し、４℃、２４時間ブロッキング処理した後、洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）１ｍＬで１回洗浄した。この捕捉用担体をブロッキング粒子２と称する。
　次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＬｏＢｉｎｄチューブ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、非ブロッキング粒子２又はブロッキング粒子２をそれぞれ０．５ｍｇ加え、反応バッファーとして表１７に示す反応バッファーを０．３ｍＬ添加した。各チューブに、サンプルとしてＨＴ２９培養上清（サンプル１）を０．３ｍＬ添加し、４℃で２４時間反応させた。この反応後は、試験例１の（３）と同様の操作を行った。結果（捕捉用担体としてジョンクリル６０３０ブロッキング粒子を使用した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体（ＥｐＣＡＭ抗体）のＰＣＲサイクル数およびその差）を表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　表１５～１７に示すとおり、酸性基を有する高分子であるカゼイン、ジョンクリル６０３０で処理した捕捉用担体を用いることにより、小胞捕捉工程におけるフリーの核酸等の非特異吸着を抑制できた。
（試験例９）
　ＣＤ９抗体をＡｎｔｉ－ＣＤ３２６　（ＥｐＣＡＭ）　ｍＡｂ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．ＭＥＸ００４－６）に、ＩｇＧ２ａ抗体をＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ１（ＭＢＬ社製　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　（ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）－Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｍ０７５－６）に、それぞれ変更し、反応バッファーとして表１８に示す反応バッファーを使用し、サンプルとして、正常ヒト血清・プール（サンプル４）、又は正常ヒト血清・プールに表１８に示す細胞培養上清の１０倍濃縮液を１０倍希釈となるように添加したものを使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果（サンプルとして各種細胞の培養上清をスパイクした正常ヒト血清を使用し、反応バッファーにカゼインを添加した場合の陰性対照抗体と陽性対照抗体（ＥｐＣＡＭ抗体）のＰＣＲサイクル数およびその差）を表１８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022

Claims (19)

  1. 　核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
    　前記小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
    　分析方法。
  2. 　核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
    　前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
    　分析方法。
  3. 　さらに前記小胞に含まれる核酸を分析する核酸分析工程を含む、請求項１又は２に記載の分析方法。
  4. 　前記捕捉用担体が粒子状又は多孔質フィルム状である、請求項１～３のいずれか１項に記載の分析方法。
  5. 　前記捕捉用担体が磁性粒子である、請求項１～３のいずれか１項に記載の分析方法。
  6. 　前記捕捉用担体がアビジン類を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の分析方法。
  7. 　前記捕捉用担体がリガンドを有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の分析方法。
  8. 　前記リガンドが、小胞表面に存在する抗原タンパク質を認識する抗体である、請求項７に記載の分析方法。
  9. 　前記酸性基を有する高分子が、酸性基を有する乳タンパク質、酸性基を有する合成高分子、並びにカルボキシ基及び硫酸基から選ばれる１種又は２種を有する多糖類から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１～８のいずれか１項に記載の分析方法。
  10. 　前記酸性基を有する高分子がリン酸化タンパク質である、請求項１～９のいずれか１項に記載の分析方法。
  11. 　被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための判定方法であって、
    　工程（１－１）：被検者由来の生体試料を用いて請求項１～１０のいずれか１項に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
    　工程（１－２）：前記工程（１－１）で得られた分析結果を健常者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
    　判定方法。
  12. 　被検者の疾患治療後の予後を判定するための予後判定方法であって、
    　工程（２－１）：治療後の被検者由来の生体試料を用いて請求項１～１０のいずれか１項に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
    　工程（２－２）：前記工程（２－１）で得られた分析結果を治療前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
    　予後判定方法。
  13. 　疾患治療薬の薬効評価方法であって、
    　工程（３－１）：疾患治療薬投与後の被検者由来の生体試料を用いて請求項１～１０のいずれか１項に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
    　工程（３－２）：前記工程（３－１）で得られた分析結果を疾患治療薬投与前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
    　評価方法。
  14. 　核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む小胞の分離方法であって、
    　前記小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
    　分離方法。
  15. 　核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む小胞の分離方法であって、
    　前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
    　分離方法。
  16. 　小胞を捕捉する捕捉用担体と、
    　酸性基を有する高分子とを含む、
    　核酸分析又は小胞分離用組成物。
  17. 　小胞を捕捉する捕捉用担体と、
    　酸性基を有する高分子を含む液剤とを備える、
    　核酸分析又は小胞分離用キット。
  18. 　核酸の非特異吸着を抑制させるための非特異吸着抑制剤であって、酸性基を有する高分子を含む、非特異吸着抑制剤。
  19. 　酸性基を有する高分子を用いることを特徴とする、核酸の非特異吸着を抑制する方法。
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