KR20130102730A - 생체 기능화된 자성 나노입자 및 이를 이용한 핵산의 분리방법 - Google Patents

생체 기능화된 자성 나노입자 및 이를 이용한 핵산의 분리방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20130102730A
KR20130102730A KR1020120023793A KR20120023793A KR20130102730A KR 20130102730 A KR20130102730 A KR 20130102730A KR 1020120023793 A KR1020120023793 A KR 1020120023793A KR 20120023793 A KR20120023793 A KR 20120023793A KR 20130102730 A KR20130102730 A KR 20130102730A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
magnetic
magnetic nanoparticles
nanoparticles
dna
coated
Prior art date
Application number
KR1020120023793A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101402390B1 (ko
Inventor
김영근
임채승
우미경
윤하영
민지현
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR1020120023793A priority Critical patent/KR101402390B1/ko
Publication of KR20130102730A publication Critical patent/KR20130102730A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101402390B1 publication Critical patent/KR101402390B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 생체기능화된 자성 나노입자에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 생체기능화된 자성 나노입자, 이의 제조방법, 상기 자성 나노입자에 생체분자가 결합된 자성 나노복합체, 상기 자성 나노입자를 이용한 핵산의 분리방법에 관한 것이다.

Description

생체 기능화된 자성 나노입자 및 이를 이용한 핵산의 분리방법{Surface-modified nanoparticles and method isolating nucleic acid using it}
본 발명은 생체 기능화된 자성 나노입자 및 이를 이용한 핵산의 분리방법에 관한 것이다.
생물제재(DNA, RNA, 단백질, 세포) 분리는 분자 생물학 분야에 있어 필수적인 기술이다. 특히, DNA의 분리 및 정제 기술의 경우, DNA sequencing, DNA 개체증폭, DNA hybridization, DNA ligation, DNA 복제 그리고 생체검지와 같은 기술의 근간이 되는 기본 기술이며, 이러한 DNA 분리 기술을 질병 진단, 병원균 감지, 유전자 치료와 같은 분야에 적용될 수 있다.
생체조직으로부터 DNA를 분리하기 위하여, 다양한 방법이 수행되고 있는데, 이들은 크게 액상법과 고상법으로 분류된다. 액상추출법의 경우, 원심분리, 침전, 여과와 같은 복잡한 절차를 수반함에 따라 수행하는데 있어서 많은 시간이 요구되며, 더욱이 독성이 있는 화학물질을 사용해야 하는 단점을 가지고 있다.
이러한 이유로 실리카, 유리섬유, 탄소나노튜브, 자성나노입자와 같은 고상 물질을 이용한 대체 기술이 관심을 받고 있다. 고상 매개체 중에서도 자성 나노입자는 손쉬운 조작과 경제성으로 인해 가장 큰 주목을 받아왔다. 자성 나노입자를 이용한 분리기술은 기존의 공정 방식에 비해 짧은 공정 시간과 경제성을 지니고 있어 자동화가 용이하고, 공정에 소모되는 화학물질의 양을 줄일 수 있어 물리/화학적 손상을 경감시킬 수 있는 장점을 지니고 있다.
DNA가 고상 매개체 표면에 부착되는 원리는 보통 수소결합, 소수성 결합 혹은 정전기적 결합으로 설명된다. 이와 같은 결합들은 고상 매개체의 표면 상태와 밀접한 연관성을 지닌다. 이런 점에서 DNA의 부착 및 전달 효율을 높이기 위한 새로운 고상 매개체 표면 수식법에 많은 연구가 집중되고 있다.
최근 진단의학에 있어서는, 질병의 조기진단과 환자의 고통 감소, 간편하고 휴대가 가능한 진단 방향으로 연구가 진행되고 있으며, 특히 핵산 분리에 있어서도 미세유로(Microfluidic channel)를 이용한 랩온어칩(lab-on-a-chip)이 개발되고 있다[비특허문헌 1]. 이에 따라 초고감도를 갖는 진단방법, 적은 샘플 양으로도 기존의 높은 진단감도를 유지할 수 있는 진단 방법 개발이 요구되고 있다.
이를 위해서는 인체에 존재하는 특정 목표핵산이나 생체물질을 효율적으로 추출 분리하여 검사에 사용하는 것이 고민감도 결과를 위해 매우 중요하다.
Azimi SM, Nixon G, Ahern J, Balachandran W. "A magnetic bead-based DNA extraction and purification microfluidic device", Microfluid Nanofluidics. 2011;11:157-65.
이에, 본 발명자들은 자성 나노입자에 생체친화적 양친매성 고분자가 코팅되어 있고 표면이 카르복실기로 개질된 자성 나노입자 및 상기 자성 나노입자의 표면에 결합된 생체 분자를 포함하는 자성 나노복합체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 자성 나노입자에 생체친화적 양친매성 고분자가 코팅되어 있고 표면이 카르복실기로 개질된 자성 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 자성 나노복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은
자성 나노입자에 생체친화적 양친매성 고분자가 코팅되어 있고 표면이 카르복실기로 개질된 자성 나노입자를 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은
자성 나노입자의 전구체를 환원제 및 생체친화적 양친매성 고분자를 이용하여 환원시키고, 상기 고분자가 코팅된 자성 나노입자를 형성하는 단계; 및
상기 자성 나노입자의 표면을 카르복실기로 개질시키는 단계
를 포함하는 자성 나노입자의 제조방법을 제공한다
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은
상기 자성 나노입자의 표면에 결합된 생체 분자를 포함하는 자성 나노복합체를 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은
상기 자성 나노입자로 핵산과의 흡착 및 탈착을 통하여 핵산을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 생체 기능화된 자성 나노입자는 생체적합한 고분자로 코팅되어 있으며, 생체기능기를 포함하고 있는 유기/무기 분자에 의해 안정적으로 생체 기능화 되어 있어서 생물 제재의 효과적인 탑재가 가능할 뿐 아니라 세포 및 생체 내로 생리 활성물질을 효과적으로 전달할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명의 생체 기능화된 자성 나노입자는 질병 진단 장치, 약물 전달체 등 다양한 바이오 메디컬 분야에 활용할 수 있다. 특히, 본 발명의 생체 기능화된 자성 나노입자를 이용한 핵산 분리 방법은 90% 이상의 분리 효율을 보였다.
도 1은 본 발명에 따른 생체 기능성 자성나노입자에 DMSA 코팅을 푸리에 변형 적외선 분광기(Fourier Transform Infrared Spectrometer, FTIR)로 확인한 것이다[(a) 양친매성 고분자가 첨가된 열분해법으로 만든 산화철나노입자를 DMSA 코팅한 샘플, (b) 양친매성 고분자가 첨가된 열분해법으로 만든 산화철 나노입자].
도 2는 표면 수식을 가해주기 전과 후의 나노입자를 이용한 DNA 분리 실험 효율을 비교한 것이다[(a) Agarose gel 전기 영동법에 의해 분리된 DNA의 이미지, (b) DNA 분리 효율]
도 3은 실시예 1에 따른 DMSA 표면 수식을 가해준 자성 나노입자와 시중 판매되는 DNA 분리용 나노구조체와의 DNA 분리 효율을 비교한 것이다[(a) Agarose gel 전기 영동법에 의해 분리된 DNA의 이미지, (b) DNA 분리 효율]
도 4는 극미량의 나노입자를 이용하여 얻은 DNA 분리 효율 실험 결과로. DMSA 표면수식을 가해준 자성 나노입자와 시중 판매되는 DNA 분리용 나노구조체를 비교한 것이다[(a) Agarose gel 전기 영동법에 의해 분리된 DNA의 이미지 (b) 나노입자의 농도에 따른 분리효율 비교 그래프]
본 발명은 자성 나노입자에 생체친화적 양친매성 고분자가 코팅되어 있고 표면이 카르복실기로 개질된 자성 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
상기 자성 나노입자(nanoparticles)는 자성을 가지고, 직경이 1nm 내지 1000nm, 바람직하게는 2nm 내지 100nm인 입자라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 금속 물질(metal material), 자성 물질(magnetic material), 또는 자성 합금(magnetic alloy)인 것이 바람직하다. 상기 금속은 특별히 제한되지는 않으나, Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기 자성 물질 역시 특별히 제한되지는 않으나, Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MxOy (M 및 M'는 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, 0 < x ≤3, 0 < y ≤5)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 자성 합금 역시 특별히 제한되지는 않으나, CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe, CoPtAu, FePtAu, CoFe 및 NiFeCo로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
특히, 상기 자성 나노입자는 열분해법으로 합성된 것이 결정성이 우수하며, 10 nm 이하의 작고, 균일한 크기를 가지므로 바람직하다. 이러한 열분해법으로 합성된 자성 나노입자의 경우, 작은 크기가 나노입자의 볼륨 대비 면적이 커지는 효과를 가져왔으며, 이는 DNA 부착을 증대하는데 기여할 수 있다.
상기 생체친화적 양친매성 고분자는 폴리포스파젠, 폴리락티드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산 또는 그 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카보네이트 및 폴리오르소에스테르, 폴리프로필렌글리콜(PPG), 폴리옥시프로필렌(PPO) 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리 알킬(메타)아크릴레이트 및 폴리비닐 피롤리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 소수성 영역과 폴리에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌(PEO), 폴레에테르이미드(PEI), 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 친수성 영역을 포함한다.
본 발명은 자성 나노입자의 전구체를 환원제 및 생체친화적 양친매성 고분자를 이용하여 환원시키고, 상기 고분자가 코팅된 자성 나노입자를 형성하는 단계; 및
상기 자성 나노입자의 표면을 카르복실기로 개질시키는 단계
를 포함하는 자성 나노입자의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 자성 나노입자를 제조하기 위하여, 우선 (a) 단계 이전에 자성금속 산화물의 전구체 및 환원제를 용매에 용해시켜 균일하게 혼합하는 단계를 수행할 수 있다.
상기 자성 나노입자의 전구체로는 자성 금속 산화물의 전구체로서 금속과 -CO, -NO, -C5H5, 알콕사이드(alkoxide) 또는 기타 공지의 리간드가 결합된 금속화합물을 사용할 수 있으며, 구체적으로 아이언펜타카르보닐(iron pentacarbonyl, Fe(CO)5), 페로센(ferrocene), 또는 망간카르보닐(Mn2(CO)10) 등의 금속 카르보닐계열의 화합물; 또는 철 아세틸아세토네이트(Fe(acac)3) 등의 금속 아세틸아세토네이트 계열의 화합물 등의 다양한 유기금속 화합물들을 사용할 수 있다. 또한, 나노입자 전구체는 금속과 Cl 또는 NO3 등의 공지된 음이온과 결합된 금속이온을 포함한 금속염을 사용할 수 있으며, 구체적으로 삼클로로화철(FeCl3), 이클로로화철(FeCl2), 또는 철 나이트레이트 (Fe(NO3)3) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 환원제는 자성 금속 산화물의 전구체를 각각 산화-환원 반응을 통해 환원시켜 자성 금속 산화물이 하나의 나노 입자로 응집될 수 있도록 도와 준다.
상기 환원제의 종류는 특별히 한정되지 않고, 자성 나노입자의 전구체를 모두 환원시킬 수 있는 것이라면 제한 없이 가능하다. 본 발명에서는 예를 들면, 상기 환원제로서 다이올(예: 헥사데카네디올), 폴리알코올(예: 에틸렌 글리콜, 글리세롤) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 환원제의 함량은 특별히 한정되지 않고, 상기 자성 금속 산화물의 전구체를 모두 환원시킬 수 있는 함량 범위 내에서 적절히 선택될 수 있다.
상기 용매는 특별히 한정되지 않고, 자성 금속 산화물의 전구체 및 환원제를 용해시킬 수 있는 것이라면 모두 사용 가능하다. 본 발명에서는 탄소수 1 내지 12의 알킬기를 가지는 알킬에테르, 탄소수 6 내지 18의 아릴기를 가지는 아릴에테르, 탄소수 7 내지 21의 아랄킬에테르 또는 탄소수 2 내지 12의 알케닐기를 가지는 알케닐에테르 등을 사용할 수 있다.
상기 용매의 함량은 특별히 한정되지 않고, 상기 자성 금속 산화물의 전구체 및 환원제를 모두 용해시킬 수 있는 함량 범위 내에서 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 자성 나노입자의 제조방법은 상기와 같이, 혼합 용액을 제조한 후, 자성 금속 산화물의 전구체를 환원시키는 단계를 수행할 수 있다. 상기 혼합 용액에 포함된 전구체 성분 및 환원제는 산화-환원 반응을 통해 환원제는 산화되고, 상기 각각의 전구체 성분들은 자성 금속 산화물로 각각 환원될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 상기 환원시키는 단계는 상기 혼합 용액을 220℃ 내지 300℃로 가열하고, 상기 온도에서 1 시간 내지 2 시간 동안 유지시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 환원 단계에서 가열 온도가 220℃ 미만이면, 전구체 성분과 환원제의 산화-환원 반응이 미미할 우려가 있고, 300℃를 초과하면, 나노입자의 응집 현상이 발생할 우려가 있다. 또한, 상기 가열 온도의 유지 시간을 상기와 같이 조절함으로써, 각각의 전구체 성분의 환원이 원활히 이루어질 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 자성 나노입자의 제조 방법은 혼합 용액에 포함된 각각의 전구체 성분을 자성 금속 산화물로 환원시키고, 이를 냉각시켜 자성 나노입자를 형성하는 단계를 수행할 수 있다.
상기와 같이, 각각의 전구체 성분을 자성금속 산화물이 서로 응집되면서 나노 크기의 입자를 형성할 수 있다. 본 발명에서 상기 냉각 온도는 특별히 한정되지 않고, 상기 나노 크기의 입자가 형성될 수 있는 온도라면 제한이 없지만, 바람직하게는 상온으로 냉각시킬 수 있다. 본 발명에서 상기 혼합 용액을 냉각시키는 방법은 특별히 한정되지 않고, 이 분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 수단이라면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 자성 나노입자의 제조 방법은 상기 (a) 단계 이후, 원심 분리 및 자성분리를 이용하여 (a) 단계에서 형성된 자성 나노입자를 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 (a) 단계 이후, 무수 에탄올(anhydrous ethanol)을 상기 자성 나노입자에 첨가하고, 원심 분리 및 자성 분리를 수행함으로써, 전구체 성분 및 환원제의 잔여물을 제거하고, 자성 나노입자만을 분리할 수 있다.
다음으로, 상기 분리된 자성 나노입자를 카르복실기로 표면을 개질하는 단계로서, 구체적으로 DMSA(meso-2,3-dimercaptosuccinic acid) 또는 N-(포스포노메틸)이미노디아세틱에시드 하이드레이트(N-(Phosphonomethyl)iminodiacetic acid hydrate)로 표면 코팅한다. 이때, DMSA 코팅 시 DMSO를 에탄올에 분산시킴으로써 기존 헥산을 사용하여 DMSO를 코팅시키는 것보다 핵산 부착 효율을 증가시킬 수 있다. 이는 DMSA가 보통 DMSO에 잘 용해되며, DMSO가 에탄올에 잘 섞이는 점을 이용하였다. 또한, DMSA는 티올기에 의하여 탈수소화 반응을 통하여 단단히 결합하게 되므로, 다른 물질에 비해 더 많은 카르복실기가 표면에 존재할 수 있어 부착 효율이 증가될 수 있다.
이렇게 카르복실기로 표면 개질된 자성 나노입자는 생체 분자와 결합이 가능하다.
본 발명은 또한, 상기 카르복실기로 표면 개질된 자성 나노입자의 표면에 결합된 생체 분자를 포함하는 자성 나노복합체를 포함한다.
상기 생체 분자는 항원, 항체, 핵산, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
특히, 상기 생체 분자 중 핵산의 경우에는 혈액, 조직, plant, 배양된 동물세포, 박테리아, 파지, 바이러스에서 얻은 모든 핵산(genomic DNA 와 RNA)을 포함할 수 있으며, 박테리아에서 얻은 모든 플라스미드 DNA, PCR을 통해 증폭한 모든 PCR 산물을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 카르복실기로 표면 개질된 자성 나노입자로 핵산과의 흡착 및 탈착을 통하여 핵산을 분리하는 방법을 포함한다.
카르복실기로 표면 개질된 자성 나노입자로의 핵산의 흡착과 탈착 기술의 원리는 다음과 같다.
핵산은 바인딩버퍼(5 내지 20 wt% polyethylene glycol과 1 내지 5M NaCl)에 의해 침전이 되는데, 이때 NaCl은 salting out 효과를 나타나게 해주고, 폴리에틸렌글리콜은 핵산의 나노입자로의 흡착 효율을 증가시킨다. 바인딩 버퍼를 섞은 핵산에 카르복실기로 표면 개질된 자성 나노입자를 넣어 줌으로써 핵산과 나노입자의 카르복실기 사이에 수소결합을 유도하여 핵산이 나노입자에 흡착이 된다. 세척을 통해 폴리에틸렌글리과 NaCl이 제거되며, 자성 나노입자를 상온에서 1 내지 10분간 말려준 후 중성의 TE 버퍼(Tris-HCl, EDTA)를 넣어주는데, 이때 카르복실기가 COO- 상태가 되므로 음전하를 띄게 되어 동일한 음전하를 갖는 핵산을 미뤄내게 되며, 또한 낮은 염 농도의 TE 버퍼에서는 DNA가 물로의 친화도가 증가한다. 따라서 같은 전하끼리의 반발력과 DNA의 물 친화도 증가로 인해 DNA가 나노입자로부터 분리된다. 그리고 바인딩버퍼, 세척액, TE 버퍼로부터 자성 나노입자의 분리는 자석을 이용하여 나노입자를 한곳으로 모이게 함으로서 쉽게 상층액을 제거할 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: DMSA 가 코팅된 자성 나노입자 합성
마그네타이트(Fe3O4) 나노입자의 합성은 변형된 폴리올 방법을 통해 수행되었다.
전구체인 철 아세틸아세토네이트(iron acetylacetonate,Fe(acac)3, 0.1766 g), 환원제인 1,2-헥사데카네디올(hexadecanediol, 0.6468 g), 계면활성제로 poly(enthylene oxide)-block-poly (propylene oxide)-block-poly(ethylene oxide) (PEO-PPO-PEO) 또는 poly(ethylene glycol)-poly(propylene glycol)-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) (0.4~1.2 g)를 사용하였다. 상기 화학 재료들을 디옥틸에테르(Wako사(제)) (10~15 ㎖)에 넣어서 섞은 후, 섞은 용액을 자기 스터어링을 유지한 채로 240 ~ 300℃까지 가열시켰다. 그리고 반응 용액을 상온까지 냉각시킨 후, 에탄올을 추가한 후 원심분리기를 이용해서 세척과정을 행하였다. 그 후 외부의 자기장을 이용한 추출 과정을 통해 양친매성 고분자가 코팅된 자성 나노입자를 얻었다.
자성 나노입자의 표면 처리는 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 안의 DMSA(meso-2,3-dimercaptosuccinic acid)를 나노입자 에멀젼에 추가함으로 이루어진다. 구체적으로, DMSA를 50 mM의 농도로 DMSO에 용해시킨 용액 중 20 ml를 취하였다. 그 뒤 Fe3O4 나노입자를 20 mM의 농도로 에탄올에 분산시킨 용액 중 10 ml를 추출하여 20 ml의 DMSA/DMSO 용액과 섞어주었다. 이후 혼합용액을 수조 상에서 3시간 이상 초음파 처리하였다. 이때 수조의 온도는 4℃로 유지시켰다. 초음파 처리가 끝난 뒤, 2~3 차례 에탄올과 원심분리기를 이용한 세척과정을 통해 잔여물을 제거해주었다. 최종적으로 석출된 나노입자들은 에탄올 혹은 증류수에 분산시켜 보관하였다. 이 자성 나노입자는 고해상도투과전자현미경(HRTEM)을 포함한 전자현미경(TEM)과 제타 전위 측정기(zeta potential) 측정, 진동 시료형 자성 측정계(vibrating sample magnetometer, VSM), 푸리에 변형 적외선 분광기(Fourier transformation infrared spectroscopy, FTIR)에 의해서 분석될 수 있다.
실시예 2: 자성 나노입자의 DNA 의 흡·탈착 방법
자성 나노입자의 DNA의 흡·탈착 효율을 확인하기 위해 DMSA 코팅된 자성 입자를 이용하여 DNA 흡·탈착 실험을 수행하였다.
핵산의 흡·탈착 실험에 사용할DNA source로는 모든 종류의 PCR 산물이 가능하며, 본 흡·탈착 실험에서 사용한 PCR 산물은 invitrogen사의 topo TA cloning kit의 control DNA와 control 프라이머를 이용하여 kit의 매뉴얼에 따라 증폭한 700 bp의 PCR 산물을 사용하였다. 15 ㎕의 PCR 산물(1 ㎍ DNA)를 15 ㎕의 바인딩 버퍼(18.2 wt% polyethylene glycol 8000 (시그마), 4M NaCl (시그마))와 섞어 준 후, 250 ㎍의 자성 나노입자를 넣고 상온에서 10분간 반응시켰다. 자석을 이용하여 DNA가 흡착된 자성 입자를 분리하고, 상층액을 제거 후 분리된 자성 입자에 세척액(70% 에탄올 - 30% 3차 증류수) 200 ㎕ 넣어 세척하였다. 이러한 세척을 2회 수행 후 자석을 이용 자성 입자를 분리하여 세척액을 제거하였고, 자성 입자를 상온에서 3분간 말려주었다. 여기에 30 ㎕의 TE 버퍼(10mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.8)를 넣고 50℃에서 10분간 인큐베이팅(incubating)하였다. 자석을 이용하여 자성 입자를 분리하고 DNA가 탈착된 TE 버퍼를 회수하여 흡·탈착 효율을 분석하였다.
실시예 3: DNA 의 흡·탈착 효율 분석
DNA의 흡·탈착 효율 분석은 아가로스 겔 전기영동 후 DNA 밴드 분석과, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용한 흡광도 측정을 통해 분석하였다. 아가로스 겔 전기영동 분석은 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)가 1 L 당 0.5 mg이 첨가된 1.5% 아가로스 겔을 이용하여 150 V에서 15분간 전기영동 후 겔 이미지 시스템(Molecular Imager ChemicDocTM XRS Imaging system (Bio Rad laboratories))을 이용하여 DNA 밴드를 가시화 하였고 Quantity One software(Bio Rad laboratories)를 이용하여 DNA 정량 분석하였다. 흡광도 측정은 NanoDrop 2000/2000C 분광광도계(Bio Rad laboratories)를 통해 260 nm와 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 DNA 정량 분석하였다.
실시예 4: DMSA 코팅된 자성 나노입자의 DNA 흡·탈착 효율 분석
상기 실시예 1에 따라 제작된 DMSA 코팅된 자성 나노입자의 DNA 흡·탈착 효율을 확인하기 위해 코팅하지 않은 자성 입자의 DNA 흡·탈착 효율과 비교하였다.
DNA 흡·탈착 실험은 상기 실시예 2에 따라 수행하였고, 단 자성 나노입자는 DMSA 코팅한 것과 코팅하지 않은 것을 각각 사용하여 실시하였다. 분석은 상기 실시예 3에 따라 수행하였으며, 아가로스 겔 전기영동 시 Input DNA는 30 ㎕의 볼륨에 1 ㎍ PCR 산물이 되도록 한 것으로 흡,탈착이 100 %인 경우를 보여주는 대조군이며, 각 탈착된 DNA가 녹아있는 샘플과 대조군을 각각 4 ㎕씩 아가로스 겔에 로딩하여 분석하였다. 또한, 각 탈착된 DNA는 NanoDrop 2000/2000C 분광광도계(Bio Rad laboratories)를 이용하여 정량분석을 하였다.
도 2 (a)의 아가로스 겔 전기영동 분석 결과와, (b) 의 DNA 흡·탈착 효율을 정량화한 결과를 보면, DMSA 코팅한 자성 입자의 경우 DNA 흡·탈착 효율(93%)이 코팅하지 않은 자성 입자의 효율(21%)에 비해 상당히 증가함을 보여준다.
실시예 5: 상용화 비드( NucliSENS easy MAG Magnetic Silica )와의 분리 효율 비교
DMSA 코팅된 자성 입자의 DNA 흡·탈착 효율을 기존에 시판되고 있는 상용화 비드 (NucliSENS easy MAG Magnetic Silica (BIOMERIEUX))와 비교하였다.
NucliSENS easy MAG Magnetic Silica를 이용한 실험은 상기 실시예 2에서 사용한 동일한 PCR 산물을 DNA source로 이용하였고, DNA easy MAG system 방법에 따라 수행하였다. 15 ㎕의 PCR 산물(1 ㎍ DNA)를 150 ㎕의 easy MAG lysis buffer(BIOMERIEUX)와 섞은 후 NucliSENS easy MAG Magnetic Silica를 250 ㎍를 넣고 상온에서 10분간 인큐베이팅(incubating)하였다. 자석을 이용하여 Magnetic Silica를 분리 후 상층액을 제거하고, 500 ㎕의 easyMAG Extraction buffer 1 (BIOMERIEUX)에 1회 세척하였다. 세척액을 제거 후 다시 500 ㎕의 easyMAG Extraction buffer 2(BIOMERIEUX)를 이용 세척하였다. 자석을 이용 자성 실리카(Magnetic Silica)를 분리 후 세척액을 제거하고 Extraction buffer 3(BIOMERIEUX)을 30 ㎕ 넣고 50℃에서 10분간 인큐베이팅(incubating)하였다. 자석을 이용하여 자성 입자를 분리하고 DNA가 탈착된 Extraction buffer 3을 회수하여 흡·탈착 효율을 분석하였다. DMSA 코팅된 자성 나노입자의 DNA 흡·탈착 실험은 상기 실시예 2와 동일하게 수행하였다. 분석은 상기 실시예 3에 따라 분석하였는데, 아가로스 겔 전기영동 시 로딩 DNA 용액의 부피는 4 ㎕와 2 ㎕로 하였으며, 대조군으로 30 ㎕의 부피에 1 ㎍ PCR 산물을 녹인 샘플을 이용하였다.
도 2에서 (a)의 아가로스 겔 전기영동 분석 사진과, (b)의 NanoDrop 2000/2000C 분광광도계(Bio Rad laboratories)를 이용한 정량 분석 결과 상용화 비드(NucliSENS easy MAG Magnetic Silica)의 경우 75% 정도의 효율을 보이는 반면, DMSA 첨가된 자성 나노입자의 경우 91%의 높은 DNA 흡·탈착 효율을 보여주고 있다.
실시예 6: 극미량의 DMSA 코팅 자성 입자와 상용화 비드( NucliSENS easy MAG Magnetic Silica )를 이용한 DNA 흡· 탈착 효율 비교
극미량의 입자를 이용하였을 시 DMSA 코팅 자성 나노입자와 상용화 비드(NucliSENS easy MAG Magnetic Silica)의 DNA 흡·탈착 효율 비교 실험을 수행하였다.
DMSA 코팅 자성 입자를 이용한 실험은 상기 실시예 2와 동일하고, 상용화 비드 (NucliSENS easy MAG Magnetic Silica)를 이용한 실험은 상기 실시예 5와 동일하다. 단, DNA 결합 시 사용된 입자의 최종 농도는 0.04 ㎍/㎕, 0.08 ㎍/㎕, 0.16 ㎍/㎕, 0.32 ㎍/㎕, 0.64 ㎍/㎕, 1.28 ㎍/㎕이다.
도 4의 (a) 아가로스 겔 전기영동 결과와, (b) NanoDrop 2000/2000C 분광광도계(Bio Rad laboratories)을 통한 정량분석을 이용하여 계산된 DNA 흡·탈착 효율 그래프를 보면, 상용화 비드 (NucliSENS easy MAG Magnetic Silica)의 경우 0.2 ㎍/㎕ 이하의 농도에서는 DNA 흡·탈착이 보여 지지 않는 반면, DMSA 코팅 자성 입자의 경우 0.2 ㎍/㎕ 이하의 극미량에서 50 % 내외의 효율로 DNA 흡·탈착이 확인되었다.

Claims (10)

  1. 자성 나노입자에 생체친화적 양친매성 고분자가 코팅되어 있고 표면이 카르복실기로 개질된 자성 나노입자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 생체친화적 양친매성 고분자는 폴리포스파젠, 폴리락티드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산 또는 그 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카보네이트 및 폴리오르소에스테르, 폴리프로필렌글리콜(PPG), 폴리옥시프로필렌(PPO) 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리 알킬(메타)아크릴레이트 및 폴리비닐 피롤리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 소수성 영역과 폴리에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌(PEO), 폴레에테르이미드(PEI), 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 친수성 영역을 포함하는 자성 나노입자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성 나노입자는 열분해법으로 합성된 자성 나노입자.
  4. 자성 나노입자의 전구체를 환원제 및 생체친화적 양친매성 고분자를 이용하여 환원시키고, 상기 고분자가 코팅된 자성 나노입자를 형성하는 단계; 및
    상기 자성 나노입자의 표면을 카르복실기로 개질시키는 단계
    를 포함하는 자성 나노입자의 제조방법
  5. 제 4 항에 있어서,
    자성 금속 산화물의 전구체는 금속 카르보닐계열의 화합물; 금속 아세틸아세토네이트 계열의 화합물 또는 금속염인 자성 나노입자의 제조방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    환원제는 다이올 또는 폴리알코올인 자성 나노입자의 제조방법.
  7. 제 4 항에 있어서,
    카르복실기로 표면 개질은 DMSA(meso-2,3-dimercaptosuccinic acid) 또는 N-(포스포노메틸)이미노디아세틱에시드 하이드레이트(N-(Phosphonomethyl)iminodiacetic acid hydrate)로 표면 코팅하는 자성 나노입자의 제조방법.
  8. 청구항 1의 자성 나노입자의 표면에 결합된 생체 분자를 포함하는 자성 나노복합체.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 생체 분자는 항원, 항체, 핵산, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 자성 나노복합체.
  10. 청구항 1의 자성 나노입자로 핵산과의 흡착 및 탈착을 통하여 핵산을 분리하는 방법.
KR1020120023793A 2012-03-08 2012-03-08 생체 기능화된 자성 나노입자 및 이를 이용한 핵산의 분리방법 KR101402390B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120023793A KR101402390B1 (ko) 2012-03-08 2012-03-08 생체 기능화된 자성 나노입자 및 이를 이용한 핵산의 분리방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120023793A KR101402390B1 (ko) 2012-03-08 2012-03-08 생체 기능화된 자성 나노입자 및 이를 이용한 핵산의 분리방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130102730A true KR20130102730A (ko) 2013-09-23
KR101402390B1 KR101402390B1 (ko) 2014-06-11

Family

ID=49452278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120023793A KR101402390B1 (ko) 2012-03-08 2012-03-08 생체 기능화된 자성 나노입자 및 이를 이용한 핵산의 분리방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101402390B1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180074123A (ko) * 2016-12-23 2018-07-03 주식회사 제놉시 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체
CN109674765A (zh) * 2019-03-06 2019-04-26 武汉轻工大学 一种表面功能化的纳米粒子及其制备方法以及dna释放载体
CN117735713A (zh) * 2023-12-19 2024-03-22 江苏金山新材料科技有限公司 一种改性玉米淀粉制备的生物质碳源及其制备方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180072014A (ko) 2016-12-20 2018-06-29 성균관대학교산학협력단 항체가 고정된 자성 나노입자 클러스터를 포함하는 진단용 소재 및 그의 제조방법

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180074123A (ko) * 2016-12-23 2018-07-03 주식회사 제놉시 자성 나노 입자가 탑재된 전도성 고분자 및 양이온성 고분자를 포함하는 세포-유리(cell-free) DNA 검출 및 회수용 자성 나노 구조체
CN109674765A (zh) * 2019-03-06 2019-04-26 武汉轻工大学 一种表面功能化的纳米粒子及其制备方法以及dna释放载体
CN117735713A (zh) * 2023-12-19 2024-03-22 江苏金山新材料科技有限公司 一种改性玉米淀粉制备的生物质碳源及其制备方法
CN117735713B (zh) * 2023-12-19 2024-05-24 江苏金山新材料科技有限公司 一种改性玉米淀粉制备的生物质碳源及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR101402390B1 (ko) 2014-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kudr et al. Magnetic nanoparticles: From design and synthesis to real world applications
Niemirowicz et al. Magnetic nanoparticles as new diagnostic tools in medicine
Min et al. Isolation of DNA using magnetic nanoparticles coated with dimercaptosuccinic acid
Mollarasouli et al. Magnetic nanoparticles in developing electrochemical sensors for pharmaceutical and biomedical applications
Silva et al. Gold coated magnetic nanoparticles: from preparation to surface modification for analytical and biomedical applications
Tai et al. Recent research progress on the preparation and application of magnetic nanospheres
Saiyed et al. Application of magnetic techniques in the field of drug discovery and biomedicine
Herrmann et al. High-strength metal nanomagnets for diagnostics and medicine: carbon shells allow long-term stability and reliable linker chemistry
Pan et al. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells
Gambhir et al. Multifunctional surface functionalized magnetic iron oxide nanoparticles for biomedical applications: A review
US8512946B2 (en) Composite particles
Sosa‑Acosta et al. DNA-iron oxide nanoparticles conjugates: Functional magnetic nanoplatforms in biomedical applications
KR101402390B1 (ko) 생체 기능화된 자성 나노입자 및 이를 이용한 핵산의 분리방법
Šafařík et al. Magnetic nanoparticles for biomedicine
Ortega et al. Biomedical applications of magnetite nanoparticles
Kadam et al. Selective, agglomerate-free separation of bacteria using biofunctionalized, magnetic janus nanoparticles
Khizar et al. Contribution of magnetic particles in molecular diagnosis of human viruses
Binandeh Performance of unique magnetic nanoparticles in biomedicine
Wang et al. Highly efficient and multidimensional extraction of targets from complex matrices using aptamer-driven recognition
Rashid et al. Surface modification and bioconjugation of anti-CD4 monoclonal antibody to magnetic nanoparticles as a highly efficient affinity adsorbent for positive selection of peripheral blood T CD4+ lymphocytes
Elingarami et al. A short review on current use of magnetic nanoparticles for bio-separation, sequencing, diagnosis and drug delivery
Elaissari et al. Biomedical application for magnetic latexes
Jeevanandam et al. Biofunctional nanoparticles for protein separation, purification and detection
WO2014090311A1 (en) Iron oxide nanoparticles with a graphene coating
Han et al. Magnetic nanoparticles for bioseparation, biosensing, and regenerative medicine

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170328

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180406

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190411

Year of fee payment: 6