CN104458375B - 核酸适体及其衍生物的用途及对组织冰冻切片的快速成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸适体及其衍生物的用途及对组织冰冻切片的快速成像方法，其用途是在组织冰冻切片中检测特异性生物标志物。其方法是将组织冰冻切片用随机序列封闭非特异性结合，再用信号标记的核酸适体或者核酸适体衍生物进行孵育，观察组织冰冻切片的成像结果，根据信号在组织冰冻切片中的定位来判断病灶位置。本发明为疾病的诊断提供了一种新的有效的分子工具，其方法快速、便捷、廉价。
Description
技术领域
本发明属于病理诊断方法，具体涉及一种核酸适体及其衍生物的用途及对组织冰冻切片的快速成像方法。
背景技术
疾病发生后组织细胞常常出现一系列的病理形态改变，表达出一些特异性生物标志物，通过鉴定组织病理形态学的改变可以对疾病进行诊断。细胞特异性生物标志物的发现有助于疾病的进一步确诊、指导治疗和预后的判断。临床病理形态学工作中最常用的为冰冻切片和石蜡切片。相较石蜡切片而言，冰冻切片制作步骤简单，更接近新鲜组织，最大限度的保存蛋白质的结构甚至功能，无需抗原复性。但目前临床上冰冻切片仅用于显微镜下快速病理形态学诊断。
指数富集的配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，SELEX）是近年发展起来的一项新的筛选技术，通过该技术可筛选到与靶标特异结合的小分子DNA/RNA物质称为核酸适体。由于其与抗体相比与靶标结合的特异性和亲和力相当甚至更强，并有可体外筛选、易于合成与标记、化学稳定性好、无免疫原性与生物毒性、靶分子范围广、分子量小、组织渗透力强、易于固定及化学修饰等优势，核酸适体作为一种新型分子探针用于疾病的诊断和治疗而备受关注。
以肿瘤性疾病为例，上皮细胞粘附分子 (Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)，在上皮来源的恶性肿瘤组织中表达增高，并与肿瘤的发生发展、转移及预后相关，因此，EpCAM可作为生物标记物在多种上皮来源恶性肿瘤的诊断和治疗中发挥作用。EpCAM的抗原表位包括胞内结构域（intracellular domain of epithelial cell adhesionmolecule,EpICD）及胞外结构域（extracellular domain of epithelial cell adhesionmolecule,EpEX）。目前临床上仅能通过EpCAM抗体对组织石蜡切片的免疫染色来定位EpCAM的组织分布，从而达到诊断和靶向治疗的目的。但抗体的生产成本高、耗时长，运输及储存不便，因此价格昂贵，并且需要分别针对其胞内和胞外的不同抗原表位选择anti-EpICD和anti-EpEX两种抗体。同时，临床常用的抗体-石蜡切片的免疫染色步骤繁琐。2011年，WeiDuan研究组筛选了EpCAM的RNA类型核酸适体1。但是RNA很容易被核酸酶降解，限制了它在临床研究的应用。随后，James Yang研究组使用SELEX技术成功筛选了一组EpCAM DNA类型的特异性核酸适体，其中一条最优化者命名为SYL3C 2。
再以肥胖为例，肥胖是现代社会亟待解决的流行病之一，与多种严重危害人类健康的常见病，如2型糖尿病、心脑血管疾病以及癌症等的发生发展密切相关。肥胖是由于白色脂肪组织在体内过度聚集所致，近年来针对作用于脂肪组织的药物开发防止肥胖的策略备受关注。2012年刘慧霞教授团队筛选得到针对白色脂肪组织成熟脂肪细胞的特异性核酸适体Adipo-83。
目前特异性生物标志物的检测主要依赖抗体对组织石蜡切片进行免疫组化实验，步骤繁琐，耗时长。目前还没有关于核酸适体及其衍生物用于组织冰冻切片特异性生物标志物的检测从而达到组织成像目的的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种操作简便、快速、廉价、有利于疾病快速诊断的核酸适体及其衍生物的用途及对组织冰冻切片的快速成像方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
核酸适体及其衍生物的用途，是在组织冰冻切片中用于检测特异性生物标志物。
核酸适体及其衍生物对组织冰冻切片的快速成像方法，是将组织冰冻切片用随机序列封闭非特异性结合，再用信号标记的核酸适体或者核酸适体衍生物进行孵育，观察组织冰冻切片的成像结果，根据信号在组织冰冻切片中的定位来判断病灶位置。
所述核酸适体衍生物是指将核酸适体进行修饰或者改造后的核酸适体，例如携带增强拉曼信号的表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS）粒子，或者携带一种或多种不同的信号分子（例如同位素或者荧光信号）。
本发明的有益效果：
1、本发明首次使用核酸适体及其衍生物来检测组织冰冻切片中的特异性生物标志物，从而达到快速诊断疾病的目的，发现了核酸适体的新用途及为疾病的诊断提供了一种新的有效的分子工具。其方法快速、便捷、廉价。
2、本发明利用核酸适体及其衍生物所携带的信号在组织冰冻切片中形成的图像，根据信号在图像中的有无及强弱判断组织中核酸适体及其衍生物的表达水平，达到对肿瘤诊断、转移、预后的快速判断。相对于石蜡切片，冰冻切片制作步骤简单、快捷，更接近活体组织，最大限度的保存细胞蛋白质的结构甚至功能，无需抗原复性。而且，制作简单廉价，快速便捷，耗时少。
附图说明
图1是携带荧光信号的核酸适体针对组织冰冻切片免疫染色流程图。
图2是携带荧光信号的核酸适体针对组织石蜡切片免疫染色流程图。
图3是携带荧光信号的抗体针对组织石蜡切片免疫染色流程图。
图4是携带CY3的EpCAM核酸适体与结肠癌与直肠癌变组织冰冻切片的免疫染色成像，并与EpCAM抗体与石蜡切片孵育后成像结果的对比图。
图5是将图4中结肠癌和直肠癌成像放大400倍，并借助细胞核染料DAPI定位细胞核的对比图。
图6是携带CY3的EpCAM核酸适体对结肠癌系列冰冻切片的系列免疫染色图（A）和EpCAM核酸适体对结肠癌交界组织冰冻切片免疫染色的放大图（B）。
图7是携带CY3的EpCAM核酸适体对直肠癌系列冰冻切片的系列免疫染色图。
图8是携带CY3的EpCAM核酸适体对EpCAM表达阴性的恶性肿瘤及良性病变的免疫染色成像图。
图9是CY3荧光染料的拉曼图谱。
图10是EpCAM核酸适体与结肠癌变组织冰冻切片的拉曼成像图。
图11是EpCAM核酸适体与直肠癌变组织冰冻切片的拉曼成像图。
图12是核酸适体Adipo-8在大鼠不同组织来源的冰冻切片中的成像图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图进一步说明本发明的技术方案。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得。
实施例中，荧光标记的EpCAM核酸适体是按以下序列合成：5’-CAC TAC AGA GGTTGC GTC TGT CCC ACG TTG TCA TGG GGG GTT GGC CTG-(PEG)3-Cy3-3’。合成随机序列（5'-rN (n=48)-3'）用来阻断非特异性组织染色。荧光标记的成熟脂肪细胞核酸适体Adipo-8是按以下序列合成：5’-ATG AGA AGC GTC GGT GTG GTT AAA CAC GGA ACG AAGGTG CAG GAA GAT TTG TCG ATG CGG TGC CTG AGC GGG CTG GCA AGG CGC ATA-Cy3-3’。对应的随机序列（5'-rN (n=87)-3'）用来阻断非特异性组织染色。以上试剂皆来源于生工生物工程(上海)股份有限公司。DAPI用来染色细胞核（碧云天生物技术研究所）。Anti-EpEX、anti-EpICD及二抗均来自abcam（德国）公司。SERS粒子由厦门大学化学系杨朝勇老师实验室惠赠（粒径分布：52±10nm，壳层厚度：<2nm，吸收峰位置539.5±1.5nm增强性能：检测限可达ppd量级）。
实施例1、EpCAM核酸适体在结肠癌及直肠癌变组织冰冻切片的成像应用
本发明提供的核酸适体及其衍生物对组织冰冻切片的快速成像方法，包括以下步骤：
1、肿瘤标本的收集：
手术室进行标本取样，分别在同一患者的癌组织肿块处、癌组织肿块与正常组织交界处及正常组织处取样，分别标记为：癌变组织、交界组织、正常组织，然后立即进行冰冻切片的制作，用于CY3标记的SYL3C染色以及苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin，HE )切片的制作。所有标本均来源于中南大学湘雅医院；
2、组织冰冻切片的制作：
所取组织的规格为：长×宽×厚=24×24×2mm左右，将组织标本用组织支承器放平摆好，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，将冷冻好的组织块夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键、转动旋钮，将组织修平，调整切片厚度为5微米，将切出的冰冻切片粘附在防脱玻片上，每例患者的癌变组织、交界组织、正常组织分别连续切片制作2张组织冰冻切片，分别用于进行后续的HE染色和核酸适体对组织EpCAM检测的荧光成像；
3、组织石蜡切片制作：
参见常规流程，具体步骤包括固定（时间为隔夜），洗涤和脱水（6小时），透明（1小时20分钟），浸蜡和包埋（4小时），切块，贴片与烤片；
4、核酸适体针对组织冰冻切片的孵育及HE染色：
（1）、用随机序列封闭非特异性结合，将组织冰冻切片滴加浓度为1μmol/L的随机序列200微升，4℃或者室温环境下在水平摇床孵育10分钟；
（2）、用带荧光信号CY3的特异性EpCAM核酸适体SYL3C进行孵育，每一块组织冰冻切片滴加浓度为250nmol/L的EpCAM核酸适体SYL3C 150微升，4℃或者室温环境下在水平摇床孵育15分钟；
（3）、用细胞核染色剂DAPI进行孵育，每一块组织冰冻切片滴加浓度为1μg/ml的DAPI染色剂30微升，4℃或者室温环境下在水平摇床孵育3分钟；
（4）、将组织冰冻切片置于50ml离心管中，倒入40ml D-PBS进行洗涤，4℃或者室温环境下在水平摇床洗涤3次，每次5分钟；
（5）、与此同时，为了验证核酸适体对组织切片成像的特异性，将制作组织冰冻切片时来源于同一样本的另外一张相应组织冰冻切片进行HE染色作为标准对照；
（6）、若进行拉曼成像，则将SERS粒子均匀喷洒在上述切片表面；
（7）、若将核酸适体所携带的信号分子更换为放射性同位素，则可同理进行放射性成像；
5、核酸适体针对组织石蜡切片的孵育：
（1）脱蜡：将石蜡切片浸入二甲苯中3次，每次10min；
（2）水化：已脱蜡的切片依次浸入无水乙醇、95%乙醇和70%乙醇中，每次浸没10min；
（3）抗原复性：水化的切片用TE Buffer（pH8.0）洗涤后，于沸腾TE Buffer中放置15min；
（4）所述用随机DNA序列封闭非特异性结合：在切片的组织上滴加浓度为1μmol/L的随机序列200微升，低温（4摄氏度）环境下在水平摇床孵育30min；
（5）所述用带荧光信号的SYL3C进行孵育：切片的相应组织滴加浓度为250nmol/L的核酸适体150微升，室温环境下在水平摇床孵育60min；
（6）洗涤非特异性结合：将切片置于50ml离心管中，倒入40ml D-PBS进行洗涤，低温（4摄氏度）环境下在水平摇床洗涤3次，每次15分钟。荧光显微镜下观察结果；
同时取来源于同一个肿瘤组织的石蜡切片用商品化的抗体（包括针对胞内结构域抗体EpICD，与针对胞外结构域抗体EpEX）与石蜡切片孵育，方法参照经典免疫荧光法。成像结果与SYL3C所得成像结果进行对比；
6、结果观察：
将EpCAM核酸适体孵育的组织冰冻切片及石蜡切片使用正置荧光显微镜观察结果，并与经典的抗体免疫荧光方法染色的冰冻切片进行对比，根据免疫荧光染色判断病变位置，同时比照光镜下HE染色切片的病变定位，同理，将EpCAM核酸适体孵育的组织冰冻切片喷洒SERS粒子后使用拉曼显微镜观察结果，根据拉曼信号判断病变位置。
实施例2、核酸适体Adipo8在大鼠脂肪组织冰冻切片特异性成像的应用
本发明提供的核酸适体及其衍生物对组织冰冻切片的快速成像方法，包括以下步骤：
1、组织标本的收集：
动物标本均取自同一大鼠。分别取附睾脂肪组织、肝脏、骨骼肌组织，然后立即进行冰冻切片的制作，用于CY3荧光标记的Adipo-8染色以及HE染色切片的制作；实验动物来源于中南大学湘雅医院动物实验中心；
2、冰冻切片的制作：同实施例1所述；
3、核酸适体针对组织冰冻切片的孵育及HE染色：
（1）、用随机序列封闭非特异性结合，将组织冰冻切片上的组织滴加浓度为1μmol/L的随机序列200微升，4℃或者室温环境下在水平摇床孵育10分钟；
（2）、用带荧光信号的特异性核酸适体进行孵育，每一块组织冰冻切片的组织滴加浓度为250nmol/L的核酸适体Adipo-8 150微升，4℃或者室温环境下在水平摇床孵育15分钟；
（3）、将组织冰冻切片置于50ml离心管中，倒入40ml D-PBS进行洗涤，4℃或者室温环境下在水平摇床洗涤3次，每次5分钟；
（4）、与此同时，为了验证核酸适体对组织切片成像的特异性，将制作组织冰冻切片时来源于同一组织的另外一张相应组织冰冻切片进行HE染色，作为标准对照，以用作后续观察结果时进行对比；
4、结果观察：
将成熟脂肪细胞核酸适体Adipo-8孵育的组织冰冻切片使用正置荧光显微镜观察结果，根据免疫荧光染色定位成熟脂肪细胞；同时与光镜下HE染色的组织冰冻切片作对比。
上述实施例中，肿瘤标本的收集、组织冰冻切片和组织石蜡切片的制作、组织冰冻切片的孵育及HE染色、组织石蜡切片的孵育均为本领域的常规操作，操作中涉及的各项技术要求如切片的大小、各操作的时间和温度、使用的材料、材料的用量等均可根据操作规范确定，它们均不构成对本发明的限定。
本发明的实验例1：
1、结直肠癌组织冰冻切片用EpCAM核酸适体SYL3C进行特异性免疫染色成像结果与SYL3C针对石蜡切片进行特异性免疫染色及商品化EpCAM抗体免疫染色成像结果对比。
分别将来自于同一结肠癌、直肠癌患者的正常组织、癌变组织以及正常组织与癌变组织交界的交界组织制作成系列的组织冰冻切片及石蜡切片。
冰冻及石蜡切片制作及HE染色参照前述方法：
图1是EpCAM核酸适体针对冰冻组织切片免疫染色流程图，图中显示使用荧光信号CY3标记的SYL3C在室温下孵育组织冰冻切片15min后即可置于荧光显微镜下观察成像结果。为了对比SYL3C与已经商品化并应用于临床的EpCAM抗体，分别用SYL3C及EpCAM抗体（anti-EpEX、anti-EpICD）孵育石蜡切片，并对比成像效果。石蜡切片在孵育前首先要置于100℃下进行抗原复性24h，然后使用SYL3C-CY3在室温下孵育1h，即可置于荧光显微镜下观察（参见图2）。使用EpCAM抗体（anti-EpEX或者anti-EpICD）孵育石蜡切片时，除需要抗原复性24h外，首先需要在37℃下分别使用anti-EpEX或者anti-EpICD的一抗孵育1h对EpCAM进行定位，再通过CY3标记的相应的二抗进行30min的二次孵育显色，方可在荧光显微镜下观察（参见图3）。虽然EpCAM核酸适体与冰冻切片及石蜡切片均能清晰成像，但在冰冻切片的成像步骤更为便捷省时；同时与抗体石蜡切片的经典方法比较，核酸适体可一次性成像显示EpCAM的胞内及胞外部分，而使用抗体则需要分别使用针对EpEX或EpICD的一抗，还需相应的二抗进行显色。
图4为EpCAM核酸适体与结肠癌与直肠癌组织冰冻切片的免疫染色成像（放大200倍），并与EpCAM抗体与石蜡切片孵育后成像结果进行对比：a）病例1、2均通过HE染色病理确认诊断；b）组织冰冻切片使用EpCAM核酸适体染色成像；c）组织石蜡切片使用EpCAM核酸适体染色成像；d）组织石蜡切片使用anti-EpEX染色成像；e）组织石蜡切片使用anti-EpICD染色成像；
以HE染色片作为形态辨认（参见图4a）。在组织冰冻切片及石蜡切片上的成像均显示，核酸适体SYL3C能特异性识别癌巢，而在正常结肠信号弱（图4b和c）。同样的，anti-EpEX和anti-EpICD可特异性识别癌巢，在正常结肠显示弱信号（参见图4d和e）。
图5系将图4结肠癌和直肠癌成像放大400倍，图5a为病例HE染色切片；图5b借助细胞核染料DAPI定位细胞核，可看到核酸适体SYL3C同时结合胞内和胞膜的EpCAM（参见图5c），而anti-EpEx只结合胞膜上EpCAM（参见图5d），anti-EpICD只结合在胞膜内的胞浆及胞核的EpCAM（参见图5e），说明用核酸适体SYL3C可一次性识别EpCAM胞内及胞外结构域。而使用EpCAM抗体成像则需要分别使用anti-EpICD和anti-EpEx对胞膜内、外的EpCAM各自定位，并需要使用二抗进一步孵育显色。
2、结直肠癌组织冰冻切片用EpCAM核酸适体SYL3C进行特异性免疫染色。
图6（A）为EpCAM核酸适体对同一患者结肠癌系列组织冰冻切片的系列免疫染色（放大200倍）；（B）为EpCAM核酸适体对结肠癌交界组织冰冻切片免疫染色的放大图（放大400倍）。来源于同一病人结肠的正常组织、癌变组织以及正常组织与癌变组织交界的交界组织被制作成系列组织冰冻切片，用EpCAM核酸适体SYL3C进行孵育及荧光成像，发现EpCAM在结肠的正常组织中弱表达，在交界组织与癌变组织中依次表达增强（参见图6A）。尤其在交界组织中主要表达在胞膜上及胞质中，基本不表达于胞核(参见图6A的第二行及图6B白色箭头标注)。而在癌变组织中基本表达在胞核中（参见图6A第三行第二列）。
同样，来源于同一病人直肠的正常组织、癌变组织和正常组织与癌变组织交界的交界组织被制作成系列组织冰冻切片，用EpCAM核酸适体SYL3C进行孵育及荧光成像。EpCAMaptamer 荧光信号在正常组织中信号弱（参见图7第一行第二列）。交界部位切片右侧为直肠的正常组织，左侧为癌变组织。我们可以看到左侧癌巢有强烈的荧光信号，而右侧正常组织信号微弱（参见图7的第二行），形成了鲜明的对比。
3、EpCAM核酸适体与不表达EpCAM的组织无交叉反应。
应用核酸适体SYL3C对结肠炎及结肠息肉的组织冰冻切片进行成像，两者均无特异性荧光信号（参见图8第一行以及第二行）。最后，收集若干例EpCAM表达阴性的肿瘤（垂体瘤\脑膜瘤\肾透明细胞癌），将核酸适体SYL3C与它们的组织冰冻切片孵育后均显示无荧光信号（参见图8第三行、第四行、第五行）。所得成像仅见微弱的背景信号。
4、将荧光信号变更为拉曼信号输出，同样能进行成像，从而对病灶进行定位。
由于荧光分子CY3自带特征性拉曼信号（参见图9），可以将荧光信号转换为拉曼信号进行成像观察。应用荧光标记的核酸适体SYL3C-CY3对结肠癌及直肠癌切片进行孵育，后表面喷洒SERS粒子，然后置于拉曼显微镜下观察，可以通过捕捉拉曼信号的输出对组织进行成像，从而通过拉曼信号对癌巢进行定位（参见图10以及图11）。
结果表明：
1、核酸适体SYL3C与结直肠癌的冰冻和石蜡切片均有特异性结合，可以区别正常组织及癌变组织，且本发明方法具有以下优势：1）石蜡切片制作费时，步骤繁琐，进行孵育之前需要在100℃条件下进行较长时间的抗原复性，相对而言，组织冰冻切片更接近新鲜组织，且制作方法比石蜡切片更加简便、快捷；2）核酸适体SYL3C针对冰冻切片的孵育方法步骤更简单，耗时短。
2、试验以商品化的EpCAM抗体及免疫荧光方法作为标准对照，尽管核酸适体SYL3C对癌变组织的成像效果与商品化EpCAM抗体相当，但是，核酸适体SYL3C可一次性EpCAM的胞外及胞内结构域进行成像，而抗体成像方法则需要针对EpEX和EpICD的两种抗体分别成像，并且需要二抗显色。加之核酸适体具有费用低廉、且易于储存、与组织切片反应时间更短且方法简单等优于抗体的独特优势，使得EpCAM特异性核酸适体有望代替抗体。
3、将所述核酸适体进行修饰或者改造，得到相应核酸适体衍生物，所述核酸适体衍生物可为：携带其他信号的颗粒，例如携带拉曼信号的SERS粒子，可将孵育后的组织冰冻切片进行拉曼成像；或者同时携带多种不同信号分子，可同时通过不同方式进行成像分析；以上均能达到快速、便捷、廉价的检测组织中特定生物标志物，并且准确定位，从而达到快速诊断疾病的目的。
4、实验过程中发现，因为EpCAM广泛表达于上皮来源的恶性肿瘤，应用核酸适体SYL3C孵育非上皮来源肿瘤后显示无荧光信号，因此可以认为SYL3C对于鉴别上皮来源及非上皮来源的恶性肿瘤有一定意义。
5、EpCAM还是抗肿瘤治疗的靶点。2009年，一种抗EpCAM的三功能抗体，卡妥索单抗（Catumaxomab）被获准治疗Epcam阳性肿瘤患者的恶性腹水。近期，许多用于诊断和治疗的基于EpCAM的抗体已诞生。但是，由于抗体的分子量大及不稳定性，导致在最初的临床试验中无法提供一个客观的临床响应，并限制了它在癌症检测的灵敏度。鉴于SYL3C可高亲和力特异性识别癌变组织中的EpCAM，因此未来有望利用SYL3C对上皮来源的肿瘤性疾病进行的靶向治疗。
本发明的实验例2：
动物标本均取自同一只大鼠。分别取附睾脂肪组织、肝脏、骨骼肌组织，然后立即进行组织冰冻切片的制作，用于荧光标记的Adipo-8染色以及HE染色切片的制作；图12是携带CY3的核酸适体Adipo-8在大鼠不同组织来源的组织冰冻切片中的成像图，应用荧光标记的核酸适体Adipo-8对组织冰冻切片进行染色后发现：仅在脂肪组织冰冻切片中见到围绕细胞膜排列的特异性荧光信号，而骨骼肌及肝脏组织中仅见微弱的非特异性荧光信号。
结果表明：
1、Adipo-8能特异性识别脂肪组织冰冻切片，而与其他来源的组织细胞无交叉反应。
2、近年来针对作用于脂肪组织的药物开发防治肥胖及相关疾病的策略备受关注。但现有的针对脂肪组织的小分子药物缺乏特异性，毒副作用大，目前对脂肪细胞表面生物标记物及理化特征认知亦有限。因此，Adipo-8这种新型的脂肪细胞表面探针的发现为肥胖及其相关疾病的诊断及治疗提供了新的分子工具。
综上实例所述：本发明为核酸适体及其衍生物对组织冰冻切片的成像，为相关疾病的快速诊断及治疗提供了一种新的思路及方法。
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3.Liu J, Liu H, Sefah K, et al. Selection of aptamers specific foradipose tissue. PloS one. 2012;7(5):e37789.
Claims (1)
1.一种核酸适配体及其衍生物对组织冰冻切片的快速成像方法，其特征是，所述快速成像方法为：
(1)取长为24mm，宽为24mm，厚为2mm的癌组织，用组织支承器放平摆好，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻；然后将冰冻后的组织修平，调整切片厚度为5um；然后粘附在防脱玻片上得到癌组织冰冻切片；在所述癌组织冰冻切片上滴加浓度为1μmol/L的随机序列200μL，在4℃下水平摇床孵育10min，
(2)每一块组织冰冻切片滴加浓度为250nmol/L的CY3标记的EpCAM核酸适配体SYL3C150μL，在4℃下水平摇床孵育15min；
(3)将SERS粒子均匀喷洒在癌组织冰冻切片表面，所述快速成像方法排除疾病的治疗和诊断方法；
所述EpCAM核酸适配体的序列为：5’-CAT TAC AGA GGT TGC GTC TGT CCC ACG TTGTCA TGG GGG GTT GGC CTG-(PEG3)-CY3-3’；
所述随机序列为：5’-rN-3’，N＝48。
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