CN105368934B - MicroRNA-4454和MicroRNA-7975在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用 - Google Patents

MicroRNA-4454和MicroRNA-7975在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学生物检测技术领域，本发明提供了MicroRNA‑4454和MicroRNA‑7975在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用。本发明通过前期应用Real‑Time PCR Array技术发现了在银屑病患者指甲中MicroRNA‑4454和MicroRNA‑7975水平存在显著下调，进而提供了从人类指甲提取RNA技术方法和试剂盒及利用该试剂盒提取指甲microRNA进行Real‑Time PCR检测，能够准确发现银屑病患者指甲中MicroRNA‑4454和MicroRNA‑7975水平的下调。本发明的试剂盒及方法可早期预测银屑病的发生和进行早期诊断，对于银屑病的防治具有重要意义。本发明是一种早期预测难治性皮肤疾病‑‑银屑病提供了新的临床检测方法。

Description

MicroRNA-4454和MicroRNA-7975在制备检测银屑病试剂或试 剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域，是microRNAs在制备早期筛查或诊断银屑病试剂或试剂盒中的应用。
背景技术
银屑病(Psoriasis,Pso)，俗称牛皮癣，又名白疪。是一种常见的慢性炎症性炎症性皮肤病，病程较长，易复发，少数病例几乎终生不愈。该病发病以青壮年为主，对患者身体健康和精神状况影响较大。临床变现以红斑，鳞屑为主，全身均可发病，以头皮，四肢伸侧较为常见。发病机制目前尚未完全阐明，普遍认为与免疫，遗传，环境，心理等因素有着密切的关联。美国皮肤病协会报道，美国银屑病患者约占人口总数的2％，中国患者发病率约为0.123％，北方高于南方(参见文献A.B.Gottlieb,A.W.Armstrong.Psoriasis outcomemeasures:a report from the GRAPPA 2012annual meeting.J Rheumatol,40(2013),pp.1428–1433)。当前治疗原则仅以局部药物治疗及紫外线治疗为主，缺乏有效根治的方法，仅能控制或减少病患复发。银屑病已严重的危害了人类健康和精神状况，如何早期发现，早期治疗银屑病，成为了当今重要的课题。
目前Pso的研究主要针对Pso的流行病学研究和诱发因素研究，但对其发生机制的研究探讨涉及很少。由于目前Pso的诊断主要依靠临床表现，而缺乏特异性实验室指标，因此为临床工作带来很多不便，增加了误诊与漏诊。对患者而言，面临着经济与精神双方面的负担。因此，从预防和治疗角度，急需寻找较明确的Pso生物学标记物。
microRNA(miRNA)是一类长度约19～25碱基的非编码蛋白质单链小分子RNA，广泛存在于多细胞生物和病毒体内，主要通过核酸序列互补匹配结合到特定的靶mRNA上，抑制靶mRNA翻译过程或降解靶mRNA，是一种起负调控作用的分子。miRNA调控至少30％以上的基因表达，参与多种病理生理过程。在多个组织中，例如，正常与皮肤疾患组织中表达差异。因此，通过表达谱分析寻找疾病相关miRNA并进行发病机理研究，最终应用于皮肤疾患的诊断和治疗，已经成为目前miRNA研究的重要方向(参见文献Jinnin M.Various applicationsof microRNAs in skin diseases.J Dermatol Sci.74(1):3-8.2014)。
已有实验证实，miRNA在血浆和血清中非常稳定，它们被有效保护以免接触RNases，在严酷环境条件下仍能保持稳定。但是，关于指甲中miRNA研究很少有报道，与血清及血浆miRNA相比，指甲中miRNA更加容易获取，对患者而言创伤小，更容易被接受。
目前，对于miRNA的早期诊断作用的研究主要集中在肿瘤方面，与银屑病相关的microRNAs主要为：在银屑病患者皮肤中高表达的miRNA-203(参见文献Sonkoly E,Wei T,Janson PC,A,Lundeberg L,Tengvall-Linder M,Norstedt G,Alenius H,Homey B,Scheynius A,M,Pivarcsi A.MicroRNAs:novel regulators involved in thepathogenesis of psoriasis？PLoS One.2(7):e610.2007)，银屑病患者外周血中低表达的miRNA-424和miRNA-1266(参见文献Ichihara A,Jinnin M,Yamane K,Fujisawa A,SakaiK,Masuguchi S,et al.microRNA-mediated keratinocyte hyperproliferation inpsoriasis vulgaris.Br J Dermatol.65:1003–10.2011；Ichihara A,Jinnin M,Oyama R,Yamane K,Fujisawa A,Sakai K,et al.Increased serum levels of miR-1266inpatients with psoriasis vulgaris.Eur J Dermatol 22:68–71.2012)，以及在银屑病患者发根中高表达的miRNA-19A(参见文献Hirao H,Jinnin M,Ichihara A,Fujisawa A,Makino K,Kajihara I,et al.Detection of hair root miR-19a as a noveldiagnostic marker for psoriasis.Eur J Dermatol[in press].2014)都具有对银屑病的诊断价值。以上研究均提示，miRNAs与银屑病有着密切的关系，角质细胞、血清及发根中miRNA可成为早期特异性潜在标记物。
hsa-mir-4454(MI0016800)与hsa-mir-7975(MI0025751)目前尚无文献报道与银屑病的发生和诊断相关联。
目前尚未见从指甲中获取microRNAs作为银屑病生物学标记物的报道.
更未见一种用于检测指甲中的hsa-mir-4454，hsa-mir-7975含量来早期预测银屑病的检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于寻找到与银屑病相关的新的分子标记物，本发明的另一目的在于提供某一种microRNA在制备早期筛查或临床诊断银屑病试剂或试剂盒中的应用。
由于采血及生检等有创检查容易对患者造成心理负担等问题，所以本发明的另一发明目的在于提供一种检测指甲中的hsa-mir-4454，hsa-mir-7975含量的试剂或试剂盒，以及相关的检测方法。
本发明人为了寻找参与银屑病相关的指甲miRNA，利用miRNA芯片技术筛选了与银屑病相关的miRNA。结果发现与正常人指甲MicroRNA-4454，MicroRNA-7975的表达具有显著差异。
临床上Pso有相对明确的发病时间，为了寻找参与Pso相关的指甲miRNAs，我们利用miRNA的微阵列技术筛选了与Pso相关的miRNA(表1)并进行了qPCR验证检测。结果发现与正常人相比，Pso患者指甲中MicroRNA-4454，MicroRNA-7975的表达水平明显降低(如表1、图2、图4、图5所示)。本发明人认为通过实时定量荧光PCR(Real-time PCR)为基础技术，通过检测Pso患者中指甲中MicroRNA-4454，MicroRNA-7975的表达来实现早期诊断Pso是完全可行的。同时检测了其它实验室从外周血和皮肤中检测发现的若干microRNAs，其中miR-424-5p发生了显著下调，与文献报道的银屑病患者外周血中检测到的miR-424-5p改变情况一致，但目前为止并没有直接证据表明银屑病患者外周血的microRNAs表达谱与指甲中的microRNAs表达谱具有相关性。表1：miRNAs表达微阵列(microRNA microArray)技术对正常人群和银屑病
患者指甲中microRNAs表达谱进行检测的数据结果
本发明的第一方面，提供了MicroRNA-4454和/或MicroRNA-7975作为诊断银屑病的分子标记物的应用。
本发明的第二方面，提供了MicroRNA-4454和/或MicroRNA-7975在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用，该应用也即早期筛查或临床诊断银屑病。
MicroRNA-4454和/或MicroRNA-7975在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用，所述的试剂，为检测生物样品中MicroRNA-4454表达量的寡聚核苷酸和/或MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸。
所述的试剂盒，包含上述试剂，即包含检测生物样品中MicroRNA-4454表达量的寡聚核苷酸和/或MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸。
在本发明的一个优选实施例中，所述的生物样品为指甲。
所述的试剂，可以是单独为检测生物样品中MicroRNA-4454表达量的寡聚核苷酸；也可以是单独为检测MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸；或者为检测MicroRNA-4454与MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸的组合。
检测所述的MicroRNA-4454和/或MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸包括反转录引物、PCR特异性引物等。
在本发明的一个优选实施例中，检测所述的MicroRNA-4454表达量的寡聚核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一个优选实施例中，检测所述的MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第三方面，提供了一种检测指甲中的hsa-mir-4454和/或hsa-mir-7975表达量的试剂或试剂盒。
所述的试剂或试剂盒，是通过检测指甲中的hsa-mir-4454，hsa-mir-7975水平的变化，监测或早期预测银屑病的可能或进程，以便尽早采取措施或药物治疗，防止银屑病症状恶化，进而防止累积全身。
本发明通过对银屑病患者与正常人指甲中hsa-mir-4454，hsa-mir-7975的含量比较发现：银屑病患者指甲中hsa-mir-4454，hsa-mir-7975含量明显低于正常人，约低于正常人群的10倍左右，这个结果显示了hsa-mir-4454，hsa-mir-7975的含量变化情况，可以作为银屑病的早期预测手段。
本发明试剂盒中的两个检测分子hsa-mir-4454和hsa-mir-7975是根据已知的生物信息学查得的成熟体序列(详见http://www.mirbase.org/)
hsa-mir-4454的成熟体序列：GGAUCCGAGUCACGGCACCA(SEQ ID NO:1)
hsa-mir-7975的成熟体序列：AUCCUAGUCACGGCACCA(SEQ ID NO:2)
所述的试剂，为检测指甲中MicroRNA-4454表达量的寡聚核苷酸和/或MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸。
所述的试剂盒，包含上述试剂，即包含检测指甲中MicroRNA-4454表达量的寡聚核苷酸和/或MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸。
本发明提供了一种早期预测银屑病的hsa-mir-4454和/或hsa-mir-7975检测试剂盒，该试剂盒由反转录系统、引物系统和扩增系统组成，其中的引物系统由特异性的hsa-mir-4454，hsa-mir-7975引物组成，具体序列如下：
hsa-mir-4454引物为：5'-GGATCCGAGTCACGGCACCA-3'(SEQ ID NO:3)
hsa-mir-7975引物为：5'-ATCCTAGTCACGGCACCA-3'(SEQ ID NO:4)
上述试剂盒的反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成，扩增系统由Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR kit试剂组成。
本发明的试剂盒，具体组成如下：
A)非特异反转录引物 1管 100μl/管
B)hsa-mir-4454或hsa-mir-7975特异性PCR上游引物，1管，浓度:10μM，100μl/管；
C)通用3’端实时定量PCR下游引物 1管 100μl/管
D)内参U6 1管 100μl/管
E)标准品 1管 100μl/管
F)萃取液 1管 2000μl/管
G)酶 1管 500μl/管
H)裂解液 1管 500μl管
I)RNA提取液 1管 2000μl/管
J)氯仿 1管 1000μl/管
K)异丙醇 1管 5ml/管
L)70％乙醇 1管 10ml管
M)dd H2O 1管 2000μl/管。
非特异反转录引物：商品化寡聚核苷酸(自动加尾microRNA反转录引物，制造商：日本TAKARA Bio)
hsa-mir-4454与hsa-mir-7975特异性引物：即SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4
通用3’端实时定量PCR下游引物：商品化寡聚核苷酸(制造商：日本TAKARA Bio)
内参U6:商品化寡聚核苷酸(制造商：日本TAKARA Bio)
标准品：50例正常人指甲提取总microRNAs混合物的反转录产物；
萃取液：尿素、Tris-盐酸、十二烷基硫酸钠(SDS)
裂解液：二硫苏糖醇(DTT)
RNA提取液：商品化试剂，制造商：日本NIPPON GENE
使用本发明试剂盒监测或早期预测银屑病，首先，将若干正常人群编组，用本发明试剂盒检测正常人群指甲中hsa-mir-4454，(or hsa-mir-7975)含量，以此作为对照的标准数据。再用相同的方法检测未知患者指甲中hsa-mir-4454，(or hsa-mir-7975)含量，对照上述标准数据，即可初步确定该患者是否为银屑病患者，以便作进一步检查确诊。
本发明的第四方面，提供了上述试剂或试剂盒检测指甲中的hsa-mir-4454和/或hsa-mir-7975表达量的方法，即本发明提供了一种银屑病患者指甲中的hsa-mir-4454和/或hsa-mir-7975的检测方法，具体步骤如下：
按常规采取指甲，用萃取剂等使指甲融解，再用总RNA提取试剂处理，加氯仿离心后取上层水相，并富集指甲中的小RNA；由反转录系统反转录hsa-mir-4454和/或hsa-mir-7975成cDNA；用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定hsa-mir-4454和/或hsa-mir-7975含量。
本发明的试剂盒，可以是单独检测指甲中MicroRNA-4454的表达量；也可以是单独检测MicroRNA-7975的表达量；或者是同时检测MicroRNA-4454和MicroRNA-7975的表达量；当本发明的试剂盒同时检测MicroRNA-4454和MicroRNA-7975的表达量时，敏感性和特异性更高。
本发明为银屑病的早期筛查和临床诊断提供了新检测手段，而且相比于血清学检测无创、无痛、快速、灵敏。
附图说明
图1：指甲融解前后比较，其中A为融解前，B为融解后；
图2：miRNA芯片技术筛选了与Pso相关的miRNAs表达谱中具有代表性的若干microRNAs与正常人群指甲中microRNAs表达谱相比的改变情况，列举的代表性microRNAs为miRNA-203,miRNA-424，miRNA-1266，miRNA-19A，miR-4454以及miR-7975，其中，miR-4454在银屑病患者中的表达水平降低超过检测灵敏度范围，其检测数值降至0，有显著改变，另外，miR-7975与miRNA-424也出现了明显的下调。
图3：标准品倍比稀释法建立标准曲线，其中A为扩增miR-4454的标准曲线，B为扩增miR-7975时的标准曲线；
图4：正常人与银屑病患者指甲中miR-4454的差异表达检测，同时检测了黑色素瘤患者和特应性皮炎患者的指甲microRNA作为对照，其中，相较于正常对照人群，银屑病患者指甲中的miR-4454表达水平明显降低。图中，NS：正常人指甲；Pso：银屑病患者指甲；MM：黑色素瘤患者指甲；AD：特应性皮炎；
图5：正常人与银屑病患者指甲中miR-7975的差异表达检测，同时检测了作为对照的黑色素瘤患者和特应性皮炎患者的指甲microRNAs表达，其中，相较于正常对照人群，银屑病患者指甲中的miR-7975表达水平明显降低。图中，NS：正常人指甲；Pso：银屑病患者指甲；MM：黑色素瘤患者指甲；AD：特应性皮炎；
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
实施例1：制备本发明的试剂盒(供一人用)
本发明的试剂盒组成如下：
A)非特异反转录引物 1管 100μl/管
B)hsa-mir-4454和/或hsa-mir-7975特异性PCR上游引物，1管，浓度:10μM，100μl/管；
C)通用3’端实时定量PCR下游引物 1管 100μl/管
D)内参U6 1管 100μl/管
E)标准品 1管 100μl/管
F)萃取液 1管 2000μl/管
G)酶 1管 500μl/管
H)裂解液 1管 500μl管
I)RNA提取液 1管 2000μl/管
J)氯仿 1管 1000μl/管
K)异丙醇 1管 5ml/管
L)70％乙醇 1管 10ml管
M)dd H2O 1管 2000μl/管。
本发明根据已知的生物信息学查得：
hsa-mir-4454的成熟体序列：GGAUCCGAGUCACGGCACCA(SEQ ID NO:1)，
hsa-mir-7975的成熟体序列：AUCCUAGUCACGGCACCA(SEQ ID NO:2)
其特异性的反转录引物、qRT- PCR的miRNA引物由TAKARA公司负责引物合成。
(1)miRNA实时定量PCR特异性引物：
hsa-mir-4454上游引物为：5'-GGATCCGAGTCACGGCACCA-3'(SEQ ID NO:3)
hsa-mir-7975上游引物为：5'-ATCCTAGTCACGGCACCA-3'(SEQ ID NO:4
(2)非特异反转录引物、通用3’端实时定量PCR下游引物、内参U6引物序列皆为商品化寡聚核苷酸，制造商为日本TAKARA Bio。
制备包括下列组成成分的试剂盒：总RNA提取试剂、氯仿、异丙醇、70％乙醇、特异性hsa-mir-196a引物(100μl/管浓度:10μM)dd H2O(2000μl/管)dd H2O的配置：MiliQ纯水经高压灭菌后，配置成Real-time PCR用的dd H2O。特异性hsa-mir-4454,hsa-mir-7975引物：由TAKARA公司负责引物合成，纯度为PAGE级，终浓度为10μM。
实施例2：本发明的试剂盒的检测
一、采集指甲样本及样本准备：
由于指甲具有取材方便、无创伤性、连续检测的优点，因此从指甲中检测银屑病生物标志物可以将银屑病的转归提高到一个新的水平，从而达到早预防、早治疗的目的。
指甲样本在日本国立熊本大学附属医院皮肤科采集：13例正常人，11例银屑病患者，10例黑色素瘤患者，9例皮肤炎患者。根据美国皮肤病协会(AAD,American Academy ofDermatologyAAD,American Academy of Dermatology)诊断基准进行样品收集：收集病人的指甲(长度约2cm，宽约0.2cm,3-4枚),-80度保存。
二、采集指甲样本的处理及提取其中的RNA：
(1)指甲样本处理：采集的指甲样品dd H2O清洗两次,无水乙醇清洗一次，干燥。加萃取液、酶和裂解液使指甲溶解(见图1)，然后加Isogen reagent(Nippon Gene公司购买)，使用量800μl。
(2)RNA提取：添加过Isogen reagent的样本摇晃混匀，放置冰上30min，加氯仿200μl，混匀，放置冰上30min，12000rpm，4℃离心15min，取上清，放入新的1.5ml EP管中。每管加入500μl异丙醇，摇晃混匀，放置冰上10min左右，12000rpm、4℃离心10min，除去水相。加70％乙醇1000μl，7500rpm，4℃离心10min，除去乙醇。干燥后加dd H2O 50μl使之溶解。使用Eppendorf紫外分光光度仪测定RNA的A260值和A260/A280的比值(1.8-2.2)，以评估其浓度和质量。符合定量检测要求的样本进行下一步反应。
三、指甲中miRNA水平再现性
首先，取正常人拇指每7天取一次，共取3次，分别提取RNA，选择miRNA-4454，miRNA-7975引物以及随机选取miRNA-16引物和内参引物U6，进行Real-time PCR反应，比较3次正常人拇指指甲中miRNA-4454，miRNA-7975，miRNA-16的水平，(见表2)。Real-time PCR结果，3次提取的指甲miRNA含量无明显差异。
然后，从正常人拇指，食指，中指，无名指以及小指采取指甲，分别提取RNA，进行进行Real-time PCR反应，比较正常人五指之间miRNA的水平，(见表3)。
Real-time PCR结果，正常人五指之间指甲中miRNA含量无明显差别。
表2：从正常人指甲中提取miRNA再现性检测
拇指指甲 miR-4454 miR-7975 miR-16 U6
1回Ct 20.99 20.84 31.08 27.75
2回Ct 19.67 19.91 28.81 26.48
3回Ct 19.66 19.91 28.73 26.67
表3：从正常人指甲中提取miRNA
Ct miR-4454 miR-7975 miR-16 U6
拇指指甲 20.47 20.68 30.24 27.99
食指指甲 19.81 20.21 29.45 26.69
中指指甲 20.91 20.94 30.56 28.12
无名指指甲 21.27 21.34 30.96 28.94
小指指甲 22.26 22.38 33.26 29.49
四、miRNA的实时定量
1.反转录成hsa-mir-4454，hsa-mir-7975的cDNA
取富集液50ng为模板，以设计的特异性hsa-mir-4454，hsa-mir-7975反转录引物进行反转录。按照mRQ Buffer(2X)5μl、mRQ Enzyme Mix 1.25μl(Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR kit)(TAKARA公司)、富集的小RNA50ng、DEPC ddH2O(补充dd H2O使总体积达到10μl)进行反转录，10倍稀释。以上步骤所用的tip头、EP管均经过DEPC水处理后高压灭菌。
2.Real-time PCR定量miRNA
采用TaKaRa公司的Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR试剂和TP800实时定量PCR仪，按照下述体系进行PCR反应：
经过预实验确立了hsa-mir-4454，hsa-mir-7975引物的合适退火温度，最终确定以下条件：
Denaturation
Dissociation Curve
95℃ 60s
55℃ 30s
95℃ 30s
本实验采用标准反转录产物倍比稀释法建立标准曲线，反转录产物10倍，100倍，1000倍稀释。按照上述Real-time PCR条件，对前期制备的各样本的反转录产物进行检测。每批次PCR均设立标准曲线作为批次间参照，并依据标准曲线设立CT值阈值。每样本均做3个平行复管，取其平均值分析，每个PCR测定中都包括阴性(水)对照(见图3)。为防止污染，所有反应均在专区的清洁实验台进行，模板添加和引物添加不在同区操作。为防止引物二聚体和非特异性扩增，所有反应均在冰上操作。
获得的各样本hsa-mir-4454，(or hsa-mir-7975)表达量均由标准曲线转换为相对定量值，目标基因表达量/持家基因cel-miR39表达量进行标准归一化处理。最终获得比值进行比较和统计分析。通过法计算hsa-mir-4454，(or hsa-mir-7975)在银屑病患者指甲当中的相对表达量，银屑病患者指甲中hsa-mir-4454，(or hsa-mir-7975)的表达平均水平比正常人表达水平低数倍，正常人指甲中的hsa-mir-4454，(or hsa-mir-7975)量视为1。
实施例3：银屑病患者指甲当中hsa-mir-4454含量检测
按照实施例2相同的方法，把采集的11例银屑病患者指甲中hsa-mir-4454与正常人指甲中的hsa-mir-4454作比较，结果为银屑病患者指甲中hsa-mir-4454的含量低于正常人指甲中的10倍左右。采用t检验，结果P<0.01,认为银屑病患者指甲中hsa-mir-4454的含量明显低于正常人，而其他皮肤疾患无显著差异。(见图4)
实施例4：银屑病患者指甲当中hsa-mir-7975含量检测
按照实施例3相同的方法，把采集的11例银屑病患者指甲中hsa-mir-7975与正常人指甲中的hsa-mir-7975作比较，结果为银屑病患者指甲中hsa-mir-7975的含量低于正常人指甲中的10-20倍左右。采用t检验，结果P<0.001,同样认为银屑病患者指甲中hsa-mir-7975的含量明显低于正常人，而其他皮肤疾患无显著差异。(见图5)
实施例5：检测实例1
用实施例1的试剂盒，按照实施例2相同的方法，对于某皮炎患者(发病8天，膝关节附近皮肤呈红色斑块隆起，表面有层状银白色鳞屑)进行指甲中hsa-mir-4454含量的检测，通过法计算数值，与正常人指甲中的hsa-mir-4454作比较，低于10倍；
再测hsa-mir-7975含量，通过法计算数值，与正常人指甲中的hsa-mir-7975作比较，低于10-20倍；
再结合临床现在的诊断标准，确认为银屑病患者。
实施例6：检测实例2
用实施例1的试剂盒，按照实施例2相同的方法，对某皮炎患者(发病7天，躯干部皮肤边缘损害不明显，基底浸润较轻，皮疹上的鳞屑呈糠秕状，症状疑似银屑病患者)进行指甲中hsa-mir-4454含量的检测，通过法计算数值，与正常人指甲中的hsa-mir-4454作比较，无显著差别；
再测hsa-mir-7975含量，通过法计算数值，与正常人指甲中的hsa-mir-7975作比较，无显著差别；
再结合临床上已有的诊断标准，排除为银屑病患者。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (8)

1.检测MicroRNA-4454或MicroRNA-7975表达量的试剂在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的检测MicroRNA-4454或MicroRNA-7975表达量的试剂在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂选自以下任一或两者的组合：
检测生物样品中MicroRNA-4454表达量的寡聚核苷酸、
检测生物样品中MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸。
3.根据权利要求1所述的检测MicroRNA-4454或MicroRNA-7975表达量的试剂在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂盒，包含以下任一或两者组合的试剂：
检测生物样品中MicroRNA-4454表达量的寡聚核苷酸、
检测生物样品中MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸。
4.根据权利要求2或3所述的检测MicroRNA-4454或MicroRNA-7975表达量的试剂在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的生物样品为指甲。
5.根据权利要求2或3所述的检测MicroRNA-4454或MicroRNA-7975表达量的试剂在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，检测所述的MicroRNA-4454表达量的寡聚核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；检测所述的MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求1所述的检测MicroRNA-4454或MicroRNA-7975表达量的试剂在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂盒由反转录系统、引物系统和扩增系统组成，其中的引物系统选自以下任一或两者的组合：
hsa-mir-4454引物为：5'-GGATCCGAGTCACGGCACCA-3'(SEQ ID NO:3)、
hsa-mir-7975引物为：5'-ATCCTAGTCACGGCACCA-3'(SEQ ID NO:4)。
7.根据权利要求6所述的检测MicroRNA-4454或MicroRNA-7975表达量的试剂在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂盒中的反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成，扩增系统由Mir-XTM miRNA First-StrandSynthesis and SYBR qRT-PCR kit试剂组成。
8.根据权利要求6所述的检测MicroRNA-4454或MicroRNA-7975表达量的试剂在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂盒组成如下：
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