CN115094140A - LncRNA AC026412.3作为肝癌诊断和/或预后标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及LncRNA AC026412.3作为肝癌诊断和/或预后标志物的应用。本发明研究提供了通过研究证实在肝癌患者血清中分离Exosomes后提取RNA，反转录并进行实时荧光定量PCR分析发现LncRNA AC026412.3表达水平上调，利用血清Exosomes来源的LncRNA AC026412.3对肝癌早期诊断的特异性可达80％，灵敏度达到93.33％，提供了LncRNA AC026412.3作为肝癌高危人群的筛查、早期诊断或者肝癌患者的预后判断标志物的应用。

Description

LncRNA AC026412.3作为肝癌诊断和/或预后标志物的应用

技术领域

本发明属于肝癌标志物技术领域，具体涉及LncRNA AC026412.3作为肝癌诊断和/或预后标志物的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

肝癌是常见的消化系统肿瘤之一，近年来其发病率和死亡率不断上升，已成为重要的公共健康问题。目前，手术、化疗和放疗是肝癌的主要治疗手段。虽然以手术为基础的综合治疗显著改善了肝癌患者的预后，但由于早期没有明显的临床症状，大多数肝癌患者初次诊断时已处于晚期，存在远端转移，丧失了根治性手术的机会，预后差、死亡率高、5年生存率低。因此，探索新型诊断标志物对于改善肝癌患者预后具有重要的临床价值。

Exosomes是一类直径为30-150nm的囊泡，含有RNA、脂质和蛋白质等成分。在血液、唾液、尿液、脑脊液和母乳等多种体液中均有存在，可在体液中来回穿梭，在细胞之间运送遗传物质和蛋白质。肿瘤在生长过程中会不断地将Exosomes释放到周围环境中去，同时Exosomes可以在4℃条件下保存96小时或是-70℃下保存更长时间，而且通过在血清中分离Exosomes进行肝癌诊断克服了直接利用血液提取分子进行肿瘤诊断的血液中非检测物质的影响，使检验结果更加真实、精确。这些特点使得Exosomes有助于肿瘤的早期诊断和预后判断。通过研究在膀胱癌患者尿液来源的Exosomes中发现了PCA-3,TMPRSS2两个生物标志物；在黑色素瘤患者血浆Exosomes中肿瘤相关标志物CAV1表达水平明显增加，以此可诊断黑色素瘤，在肺癌模型发现Exosomes中的miRNA可作为肺癌的标志物。

发明内容

本发明通过研究结果显示，血清Exosomes来源的LncRNA AC026412.3在肝癌早期诊断和筛查中的巨大潜力。

基于上述研究成果，提供以下技术内容：

本发明第一方面，提供LncRNA AC026412.3作为肝癌诊断和/或预后标志物的应用。

上述LncRNA AC026412.3来源于血清外泌体(Exosomes)，定位于5号染色体，其序列如SEQ ID NO:1所示。本发明研究发现，上述LncRNA AC026412.3在肝癌患者的临床样本中表达量出现明显的上调，与正常样本中LncRNA AC026412.3的含量具有显著性的差异，且检验结果的灵敏性高，特异性好。该研究结果表明，血清Exosomes来源的LncRNAAC026412.3可作为一种肝癌高危人群的筛查、早期诊断或者肝癌患者的预后评估标志物。

优选的，第一方面所述作为肝癌诊断和/或预后标志物的应用，其应用方式包括但不限于以下任意一种：

(1)LncRNA AC026412.3的检测试剂在制备肝癌诊断和/或预后判断产品中的应用；

(2)通过检测受试者临床样本中LncRNA AC026412.3的表达量确认受试者的患病情况；

(3)通过检测疾病模型中LncRNA AC026412.3的表达量用于筛选具有治疗活性的药物。

上述(1)方面中，所述LncRNA AC026412.3的检测试剂可以是基于本领域任意检测方式所涉及的生化试剂，本发明提供的一种可行的实施方式中，所述检测方法为实时荧光定量PCR方法。

另外，所述肝癌诊断和/或预后判断产品包括但不限于一种检测试纸、检测芯片或检测试剂盒。

本发明第二方面，提供一种肝癌诊断和/或预后检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于检测受试者临床样本中LncRNA AC026412.3含量的生化试剂。

优选的，所述临床样本包括但不限于患者的血液样本、体液、组织、器官或分泌物；进一步的，所述血液样本包括血清、血浆或全血；所述分泌物包括棉拭子、脓液等；更进一步的，所述临床样本为血液样本或组织样本。

本发明提供的一种实施方式中，所述试剂盒为基于实时荧光定量PCR方法进行检测的试剂盒，所述试剂盒中，包括如下序列的检测引物：

LncRNA AC026412.3：

Primer F 5'-GGCTCATACGCCTTTCTGCTA-3'(SEQ ID NO:1所示)，

Primer R 5'-ATGGAACTGAAACCACAGGCT-3'(SEQ ID NO:2所示)；

GAPDH内参特异性PCR引物：

Primer F 5′-TGGTCACCAGGGCTGCTT-3′(SEQ ID NO:3所示)，

Primer R 5′-AGCTTCCCGTTCTCAGCCTT-3′(SEQ ID NO:4所示)。

优选的，所述试剂盒中包括RNA抽提试剂、反转录试剂及定量PCR反应体系。

进一步的，所述RNA抽提试剂包括Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇和DEPC处理水；

进一步的，所述反转录试剂包括gDNA Clean Reaction Mix、Evo M-MLV RTReaction Mix和DEPC处理水；

进一步的，所述定量PCR所用试剂，包括上述LncRNA LINC00470、GAPDH内参的特异性PCR引物，还包括SYBR Green Pro Taq HS Premix和DEPC处理水。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

本发明通过荧光定量PCR分析发现LncRNA AC026412.3在60例肝癌组织与其癌旁组织中存在差异性表达(P<0.001)(图1)，且在肝癌组织中表达上调。其次通过荧光定量PCR分析发现LncRNA AC026412.3在60例肝癌组织与15例正常人的肝组织中存在差异性表达(P<0.001)(图2)，且在肝癌组织中表达上调。进一步在血清中分离Exosomes用于LncRNAAC026412.3的检测，发现LncRNA AC026412.3的表达与正常人的表达存在明显的差异(P<0.001)(图3)，且与组织中的检测结果相一致。

根据上述结果，将作为LncRNA AC026412.3作为标志物，可以检测各人群中LncRNAAC026412.3的表达水平，从而预测肝癌患者的患病风险，筛查高危人群，并对肝癌患者做出早期、快速的无创性诊断。本发明对肝癌早期诊断特异性好，可达80％，灵敏度可达93.33％(图4)，只需在Exosomes提取RNA即可检测LncRNA AC026412.3的表达水平，操作简单，稳定性好。不仅可用于肝癌的早期诊断而且可以用于肝癌患者的大规模筛查和患病风险的预测，为肝癌的早期诊断和预测提供了强有力的技术支持，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实时荧光定量PCR分析LncRNA AC026412.3在肝癌组织与癌旁组织中的表达差异；

图2为实时荧光定量PCR分析LncRNA AC026412.3在肝癌组织与正常肝组织中的表达差异；

图3为实时荧光定量PCR分析Exosomes来源的LncRNA AC026412.3在肝癌患者与正常人中的表达差异；

图4为ROC分析Exosomes来源的LncRNA AC026412.3对肝癌早期诊断的特异性和灵敏性。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1一种用于肝癌高危人群的筛查、早期诊断或者肝癌患者预后的试剂盒

本实施例中，提供一种可用于肝癌高危人群的筛查、早期诊断或者肝癌患者预后的试剂盒，所述试剂盒用于对受试者临床样品中长链非编码RNA AC026412.3的表达含量进行检测，所述试剂盒中具体包含以下检测试剂(100次反应)：

1.Trizol试剂 110mL

2.三氯甲烷 22mL

3.异丙醇 55mL

4.无水乙醇 80mL

5.DEPC处理水 30mL

6. 5x gDNA Clean Reaction Mix 220μL

7. 5x Evo M-MLV RT Reaction Mix 420μL

8. 2x SYBR Green Pro Taq HS Premix 520μL

9. 10μM LncRNA AC026412.3实时荧光定量PCR特异性引物110μL

AC026412.3 Primer F 5'-GGCTCATACGCCTTTCTGCTA-3'

AC026412.3 Primer R 5'-ATGGAACTGAAACCACAGGCT-3'

10. 10μM GAPDH实时荧光定量PCR特异性引物110μL

GAPDH Primer F 5′-TGGTCACCAGGGCTGCTT-3′，

GAPDH Primer R 5′-AGCTTCCCGTTCTCAGCCTT-3′。

实施例2 LncRNA AC026412.3在肝癌组织与癌旁组织中的表达差异的验证

1、收集待测肝癌组织与癌旁组织放入冻存管中，放至液氮中保存。

2、组织中RNA的抽提：取适量标本于1.5mL EP管中，加入1mL Trizol用手持式组织研磨器研磨成液体状后，加入200μL氯仿，用手剧烈震荡15-30s，室温静置3min，4℃12000g离心15min；取上清于1.5mL无RNA酶EP管中，加入等体积异丙醇混匀，室温静置10min，4℃12000g离心10min；弃上清，加入1mL 75％乙醇(DEPC处理水稀释)震荡洗涤，4℃7500g离心5min，弃上清，打开EP管于室温下晾干，加入DEPC处理水10-30μL溶解RNA。紫外分光光度计测定RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.8-2.0之间时RNA质量良好，抽提合格。

3、LncRNA AC026412.3反转录：使用艾科瑞生物工程有限公司的反转录预混型试剂盒。

步骤1：去除基因组DNA

反应条件：42℃，2min；

4℃，hold。

步骤2：反转录反应

反应条件：37℃，15min；

85℃，5s，

4℃，hold。

4、安升达(南京)生命科学技术有限公司合成的AC026412.3特异性引物进行实时定量PCR。10μL反应体系如下：

5、-2^ΔΔCT指标的测定：本实验数据采用相对定量的分析方法，GAPDH作为内参基因，数据利用软件GraphPad Prism 8进行分析。分析发现，与LncRNA AC026412.3在癌旁组织中的表达相比，60例肝癌患者中LncRNA AC026412.3的表达明显上调，差异有显著性(P<0.001)。

实施例3 LncRNA AC026412.3在肝癌组织与正常肝组织中的表达差异的验证

1、收集待测肝癌组织与正常肝组织放入冻存管中，放至液氮中保存。

2、组织中RNA的抽提：取适量标本于1.5mL EP管中，加入1mL Trizol用手持式组织研磨器研磨成液体状后，加入200μL氯仿，用手剧烈震荡15-30s，室温静置3min，4℃12000g离心15min；取上清于1.5mL无RNA酶EP管中，加入等体积异丙醇混匀，室温静置10min，4℃12000g离心10min；弃上清，加入1mL 75％乙醇(DEPC处理水稀释)震荡洗涤，4℃7500g离心5min，弃上清，打开EP管于室温下晾干，加入DEPC处理水10-30μL溶解RNA。紫外分光光度计测定RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.8-2.0之间时RNA质量良好，抽提合格。

3、LncRNA AC026412.3反转录：使用艾科瑞生物工程有限公司的反转录预混型试剂盒。

步骤1：去除基因组DNA

反应条件：42℃，2min；

4℃，hold。

步骤2：反转录反应

反应条件：37℃，15min；

85℃，5s，

4℃，hold。

4、安升达(南京)生命科学技术有限公司合成的AC026412.3特异性引物进行实时定量PCR。10μL反应体系如下：

5、-2^ΔΔCT指标的测定：本实验数据采用相对定量的分析方法，GAPDH作为内参基因，数据利用软件GraphPad Prism 8进行分析。分析发现，与LncRNA AC026412.3在正常肝组织中的表达相比，60例肝癌患者中LncRNA AC026412.3的表达明显上调，差异有显著性(P<0.001)。

实施例4血清Exosomes来源的LncRNA AC026412.3用于肝癌诊断的特异性，灵敏性的检测

1、血清中Exosomes的分离

1.1外周血血清的分离：采用血液促凝管，采集待测个体血液2mL。采血后3500rpm离心10min，吸取血清置于1.5mL EP管中，-80℃冰箱保存。

1.2血清中Exosomes的分离：每个血清样本500μL中加入100μL的Total ExosomeIsolation Reagent，涡旋混匀，4℃反应30min。室温下10000g离心10min。EP管底部存有Exosomes，用200μL PBS重悬Exosomes。(选择已商品化的Exosomes分离试剂盒)

2、Exosomes中RNA的提取纯化(选择已商品化的Exosomes分离纯化RNA试剂盒)

2.1Exosomes中RNA的提取：加入200μL的2X Denaturing Solution混匀，冰上孵化5min，再加入400μL的acid-Phenol:Chloroform，涡旋60s。室温下12000g离心10min，上清中含有RNA。

2.2RNA的纯化：将300μL上清液吸取到无酶的EP管中，加入375μL的无水乙醇，两者混匀。将混合液加入过滤柱中，10000g离心15s，将收集管中的混合液倒掉。加入700μL的miRNA Wash Solution 1，室温下10000g离心15s，倒掉收集管中的混合液。加入500μL的Wash Solution 2/3，室温下10000g离心15s，重复此步骤。将过滤柱放进收集管中10000g离心1min。将过滤柱放入新的收集管中加入35μL的Elution Solution，室温下10000g离心30s，即可得到纯化的RNA。

3、采用实施例2中步骤3进行反转录及实时定量的方法检测LncRNA AC026412.3。

4、-2^ΔΔCT指标的测定：本实验数据采用相对定量的分析方法，GAPDH作为内参基因，数据利用软件GraphPad Prism 8进行分析。分析发现：与正常人LncRNA AC026412.3的表达相比，50例患者血清Exosomes中LncRNA AC026412.3的表达差异明显(P<0.001),在肝癌患者中表达上调，该结果与实施例2和实施例3组织中的检测结果相一致，说明通过血清Exosomes来源的LncRNA AC026412.3表达水平的检测，即可判断该患者是否罹患肝癌。同时，通过ROC分析发现利用血清Exosomes中LncRNA AC026412.3用于肝癌早期的诊断ROCcurve下方的面积(Area Under Roc Curve，AUC)可达0.95，特异性可达80％，灵敏度达到93.33％。因此血清Exosomes来源的LncRNA AC026412.3能较好地用于肝癌的早期诊断。

上述实施例中的检测方法只需500μL血清便可分离出足够Exosomes用于LncRNAAC026412.3的表达水平检测，说明该方法具有较好地操作性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东第一医科大学第一附属医院（山东省千佛山医院）

<120> LncRNA AC026412.3作为肝癌诊断和/或预后标志物的应用

<130> 2022705112

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggctcatacg cctttctgct a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggaactga aaccacaggc t 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggtcaccag ggctgctt 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcttcccgt tctcagcctt 20

Claims (10)

1.LncRNA AC026412.3作为肝癌诊断和/或预后标志物的应用。

2.如权利要求1所述LncRNA AC026412.3作为肝癌诊断和/或预后标志物的应用，其特征在于，所述LncRNA AC026412.3的序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1所述LncRNA AC026412.3作为肝癌诊断和/或预后标志物的应用，其特征在于，所述作为肝癌诊断和/或预后标志物的应用，其应用方式包括但不限于以下任意一种：

(1)LncRNA AC026412.3的检测试剂在制备肝癌诊断和/或预后判断产品中的应用；

(2)通过检测受试者临床样本中LncRNA AC026412.3的表达量确认受试者的患病情况；

(3)通过检测疾病模型中LncRNA AC026412.3的表达量用于筛选具有治疗活性的药物。

4.如权利要求/3所述LncRNA AC026412.3作为肝癌诊断和/或预后标志物的应用，其特征在于，(1)方面中，所述LncRNA AC026412.3的检测试剂可以是基于本领域任意检测方式所涉及的生化试剂；

具体的，所述检测方法为实时荧光定量PCR方法；

或，所述肝癌诊断和/或预后判断产品包括但不限于一种检测试纸、检测芯片或检测试剂盒。

5.一种肝癌诊断和/或预后检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括用于检测受试者临床样本中LncRNA AC026412.3含量的生化试剂。

6.如权利要求5所述肝癌诊断和/或预后检测试剂盒，其特征在于，所述临床样本包括但不限于患者的血液样本、体液、组织、器官或分泌物；进一步的，所述血液样本包括血清、血浆或全血；所述分泌物包括棉拭子、脓液；更进一步的，所述临床样本为血液样本或组织样本。

7.如权利要求5所述肝癌诊断和/或预后检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为基于实时荧光定量PCR方法进行检测的试剂盒，所述试剂盒中，包括如下序列的检测引物：

LncRNA AC026412.3：

Primer F 5'-GGCTCATACGCCTTTCTGCTA-3'，

Primer R 5'-ATGGAACTGAAACCACAGGCT-3'；

GAPDH内参特异性PCR引物：

Primer F 5′-TGGTCACCAGGGCTGCTT-3′，

Primer R 5′-AGCTTCCCGTTCTCAGCCTT-3′。

8.如权利要求5所述肝癌诊断和/或预后检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括RNA抽提试剂、反转录试剂及定量PCR反应体系。

9.如权利要求8所述肝癌诊断和/或预后检测试剂盒，其特征在于，所述RNA抽提试剂包括Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇和DEPC处理水。

10.如权利要求8所述肝癌诊断和/或预后检测试剂盒，其特征在于，所述反转录试剂包括gDNA Clean Reaction Mix、Evo M-MLV RT Reaction Mix和DEPC处理水；

或，所述定量PCR所用试剂，包括上述LncRNA LINC00470、GAPDH内参的特异性PCR引物，还包括SYBR Green Pro Taq HS Premix和DEPC处理水。

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