CN108611406A - 利用单细胞pcr检测细胞遗传稳定性的方法 - Google Patents

利用单细胞pcr检测细胞遗传稳定性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108611406A
CN108611406A CN201810446767.5A CN201810446767A CN108611406A CN 108611406 A CN108611406 A CN 108611406A CN 201810446767 A CN201810446767 A CN 201810446767A CN 108611406 A CN108611406 A CN 108611406A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
method described
cracking
copy number
stability
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810446767.5A
Other languages
English (en)
Inventor
董慧芳
徐嘉文
邱沛然
汤传龙
蔡洁行
周伟昌
陈智胜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Original Assignee
Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd filed Critical Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority to CN201810446767.5A priority Critical patent/CN108611406A/zh
Publication of CN108611406A publication Critical patent/CN108611406A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用单细胞PCR检测细胞遗传稳定性的方法，步骤包括：1)流式细胞进行单细胞分选及裂解；2)对裂解后的样品提取DNA进行预扩增；3)对预扩增产物进行qPCR；4)根据基因拷贝数的变化衡量细胞的遗传稳定性。本发明通过高通量地在单细胞水平检测基因拷贝数，实现了在微观水平上对基因拷贝数，细胞的异质性、遗传稳定性和均一性的快速准确测定，从而为药品研发过程中，细胞株的构建和筛选、医药蛋白的生产和质量控制奠定了坚实的基础。

Description

利用单细胞PCR检测细胞遗传稳定性的方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别是涉及细胞遗传稳定性的检测方法，更具体地说，是涉及利用单细胞PCR检测单细胞水平的基因拷贝数，并以此衡量细胞遗传稳定性和均一性的方法。
背景技术
在单克隆抗体的生产过程中，细胞的遗传稳定性对抗体的质量、产量和安全具有重要的影响，也会直接影响到药品的审批和临床研究。不管是通过很多轮的有限稀释(Limited Dilution)，得到的单细胞克隆总是会发生变化，异质性不断提高，直至成为一个不均一的细胞群，产量在不停的培养过程中下降。造成产量下降的原因可能是基因组的不稳定(例如易位、倒位、缺失和突变等)，或者表达调控水平的下降。虽然高拷贝数并不意味着高产量，损失了拷贝数也并不一定会影响产量，但是拷贝数如果发生变化，显然是对基因组不稳定性的反应，可能会影响到单克隆抗体的研发、审批、生产和销售。
拷贝数变化的机理目前还并不十分明确，但是一般认为，在细胞传代和培养过程中，基因组会因为不稳定而发生断裂、缺失，或者基因被甲基化沉默。目前通常采用qPCR或者液滴数字PCR的方法来测定基因的拷贝数，但是测定的只是细胞群体中的平均值，即在宏观的角度计算细胞群体的拷贝数平均值。虽然这些技术在细胞株开发过程中起到了重要的作用，但是这些技术因为测量的是细胞群体的平均值，并不能真实反应每一个细胞的拷贝数情况，所以也不能反应细胞群体的异质性。在细胞变异比较大的时候，这些方法的误差可能会很大，从而会给细胞株的筛选和稳定性检测提供错误的判断。细胞群体的变异，是由每一个细胞的变异组成的，因此分析每个细胞的拷贝数变化情况对细胞整体的稳定性及均一性有着重要的意义。
商业生产的细胞株一旦被确定，其遗传稳定性作为其自然属性是无法改变的，而细胞株的其它性状，比如表达水平、翻译后修饰等，都可以通过工艺开发等手段来调控。因此，遗传稳定性在药品的开发过程中有着举足轻重的作用，会影响细胞株的选择、整体的药物开发、医药蛋白的生产、质量控制、临床试验和市场销售等环节。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种利用单细胞PCR检测细胞遗传稳定性的方法，它可以有效、准确、灵敏、可靠地测定细胞株的遗传稳定性和均一性。
为解决上述技术问题，本发明的利用单细胞PCR检测细胞遗传稳定性的方法，包括以下步骤：
1)流式细胞进行单细胞分选及裂解；
2)对裂解后的样品提取DNA进行目标基因预扩增；
3)对预扩增产物进行目标基因及内参基因的qPCR；
4)根据基因拷贝数的变化衡量细胞的遗传稳定性。
所述单细胞可以选用中国仓鼠卵巢细胞。
上述步骤1)，裂解方法优选为：25-55℃裂解，然后在65-100℃失活。裂解所用缓冲液的成分优选为包括0.1％-5.0％蛋白酶K和0.001％-0.5％SDS。
上述步骤2)，预扩增引物包括目标基因正向引物和反向引物。PCR反应条件优选为：90-95℃2-12min；90-95℃10-120s，50-65℃30-180s，68-72℃30-180s，共3-30个循环。
上述步骤3)，qPCR反应条件优选为：90-95℃2-12min；90-95℃10-120s，50-65℃30-180s，68-72℃30-180s，共20-50个循环。
上述步骤4)，根据基因拷贝数的变化，用目标基因丢失率、两组Ct平均值的差值、样品标准差三个指标衡量细胞的遗传稳定性。
本发明通过高通量地在单细胞水平检测基因拷贝数，实现了在微观水平上对单细胞的基因拷贝数、异质性、遗传稳定性和均一性的快速准确测定，从而为药品研发过程中，细胞株的构建和筛选、医药蛋白的生产和质量控制奠定了坚实的基础。
附图说明
图1是本发明实施例利用单细胞PCR检测细胞的基因拷贝数并以此来衡量遗传稳定性的方法流程示意图。
图2是本发明实施例的96孔板细胞分选设计图。
图3是本发明实施例的两组传代细胞的目标基因单细胞Ct值。
具体实施方式
为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图及具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本实施例采用CHO(Chinese Hamster Ovary，中国仓鼠卵巢细胞)细胞株来检测单细胞的遗传稳定性和均一性。
此技术因为可以测定单细胞的基因信号，所以需要有严格的环境和物料管理措施，需要有独立的实验室进行不同操作，防止交叉污染。
本实施例利用单细胞PCR检测单细胞水平的基因拷贝数，并衡量细胞遗传稳定性和均一性的方法，具体包括如下步骤：
1.单细胞分选及裂解
使用流式细胞仪，将单细胞分选到含有新鲜裂解液的96孔板里。细胞分选设计如图2所示。
将分选的细胞存放在-80℃冰箱中，或者直接使用下面方法裂解：25-55℃裂解，然后65-100℃失活。裂解细胞时所使用的缓冲液成分为：0.1％-5％蛋白酶(Proteinase)K，0.001％-0.5％SDS。裂解结束以后可以将样品放在-20℃保存。
2.预扩增
对裂解后的样品提取DNA，进行目标基因预扩增。
PCR反应条件为：90-95℃2-12min；90-95℃10-120s，50-65℃30-180s，68-72℃30-180s，共3-30个循环。
3.qPCR
对预扩增产物进行目标基因及内参基因的qPCR。
qPCR反应条件为：90-95℃2-12min；90-95℃10-120s，50-65℃30-180s，68-72℃30-180s，共20-50个循环。
4.基因拷贝数变化分析
对qPCR扩增产物，分别用目标基因丢失率、两组Ct平均值的差值、样品标准差来衡量本实施例的细胞株的遗传稳定性。如图3所示，图中每个点代表目标基因单细胞的Ct值，直线分别代表Ct平均值和样品标准偏差。本实施例的目标基因丢失率为0，两组Ct平均值的差值为0.2，两组样品标准差均为0.5，充分说明此两组传代细胞是非常稳定的。
本实施例在使用流式细胞仪获得单细胞以后，后续整个实验过程都使用工作站进行取样、加样，以最大程度提高通量。

Claims (8)

1.利用单细胞PCR检测细胞遗传稳定性的方法，其特征在于，步骤包括：
1)流式细胞进行单细胞分选及裂解；
2)对裂解后的样品提取DNA进行目标基因预扩增；
3)对预扩增产物进行目标基因及内参基因的qPCR；
4)根据基因拷贝数的变化衡量细胞的遗传稳定性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)，裂解方法为：25-55℃裂解，然后在65-100℃失活。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)，裂解所用缓冲液的成分包括0.1％-5.0％蛋白酶K和0.001％-0.5％SDS。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)，预扩增引物包括目标基因正向引物和反向引物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)，预扩增PCR反应条件为：90-95℃2-12min；90-95℃10-120s，50-65℃30-180s，68-72℃30-180s，共3-30个循环。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)，qPCR反应条件为：90-95℃2-12min；90-95℃10-120s，50-65℃30-180s，68-72℃30-180s，共20-50个循环。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)，根据基因拷贝数的变化，用目标基因丢失率、两组Ct平均值的差值、样品标准差三个指标衡量细胞的遗传稳定性。
CN201810446767.5A 2018-05-11 2018-05-11 利用单细胞pcr检测细胞遗传稳定性的方法 Pending CN108611406A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810446767.5A CN108611406A (zh) 2018-05-11 2018-05-11 利用单细胞pcr检测细胞遗传稳定性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810446767.5A CN108611406A (zh) 2018-05-11 2018-05-11 利用单细胞pcr检测细胞遗传稳定性的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108611406A true CN108611406A (zh) 2018-10-02

Family

ID=63662893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810446767.5A Pending CN108611406A (zh) 2018-05-11 2018-05-11 利用单细胞pcr检测细胞遗传稳定性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108611406A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1861806A (zh) * 2005-05-13 2006-11-15 上海师范大学 一种检测K562单细胞表达p16基因的方法
CN100480386C (zh) * 2001-11-21 2009-04-22 海康生命科技有限公司 一种dna提取方法及其在检测食品中的转基因成分中的应用
WO2014152676A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 New York University A method for a single cell analysis of telomer length
CN104911274A (zh) * 2015-07-06 2015-09-16 四川医科大学 一种单细胞实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN107723343A (zh) * 2017-11-28 2018-02-23 宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司 一种基因定量分析的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100480386C (zh) * 2001-11-21 2009-04-22 海康生命科技有限公司 一种dna提取方法及其在检测食品中的转基因成分中的应用
CN1861806A (zh) * 2005-05-13 2006-11-15 上海师范大学 一种检测K562单细胞表达p16基因的方法
WO2014152676A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 New York University A method for a single cell analysis of telomer length
CN104911274A (zh) * 2015-07-06 2015-09-16 四川医科大学 一种单细胞实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN107723343A (zh) * 2017-11-28 2018-02-23 宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司 一种基因定量分析的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
闵智慧等: "第三代流式细胞分选仪及96孔板分选单个细胞的方法及参数优化", 《中国临床医学》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Dissimilation of synonymous codon usage bias in virus–host coevolution due to translational selection
Kispal et al. Biogenesis of cytosolic ribosomes requires the essential iron–sulphur protein Rli1p and mitochondria
Sharaf et al. HIV-1 proviral landscapes distinguish posttreatment controllers from noncontrollers
Kraut-Cohen et al. Translation-and SRP-independent mRNA targeting to the endoplasmic reticulum in the yeast Saccharomyces cerevisiae
Haynes et al. Standard reference material 2366 for measurement of human cytomegalovirus DNA
Welsh et al. Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV): propagation, quantitation, and storage
Bokulich et al. Sulfur dioxide treatment alters wine microbial diversity and fermentation progression in a dose-dependent fashion
Bagamery et al. A putative bet-hedging strategy buffers budding yeast against environmental instability
Zhao et al. High‐throughput gene replacement in Aspergillus fumigatus
Kobayashi et al. Gene-specific inhibition of reovirus replication by RNA interference
Langenberg et al. Glycolytic functions are conserved in the genome of the wine yeast Hanseniaspora uvarum, and pyruvate kinase limits its capacity for alcoholic fermentation
Gallet et al. Small bottleneck size in a highly multipartite virus during a complete infection cycle
Pane et al. Flow cytometry: evolution of microbiological methods for probiotics enumeration
Conacher et al. Real-time monitoring of population dynamics and physical interactions in a synthetic yeast ecosystem by use of multicolour flow cytometry
CN101565741B (zh) 实时荧光定量PCR检测Vero细胞DNA残留的试剂盒
CN108611406A (zh) 利用单细胞pcr检测细胞遗传稳定性的方法
Ishikawa et al. Genetic knockdown of genes that are obscure, conserved and essential using CRISPR interference methods in the fission yeast S. pombe
Ghosh et al. Evidence of positive regulation of mycobacteriophage D29 early gene expression obtained from an investigation using a temperature-sensitive mutant of the phage
Uchiyama et al. The B-subunit of DNA polymerase α-primase associates with the origin recognition complex for initiation of DNA replication
US20100304375A1 (en) Influenza Virus Genome Replication and Transcription System in Yeast Cells
Mathiowetz et al. Protocol for performing pooled CRISPR-Cas9 loss-of-function screens
US20200181678A1 (en) Cell-Based Reporter Assay for Live Virus Vaccines
CN112779324B (zh) 用于单细胞检测和分析的方法及其应用
CN105648037B (zh) 一种重组慢病毒在hiv表型耐药检测中的应用
Leisova‐Svobodova et al. Detection of Garlic Viruses Using SYBR Green Real‐time Reverse Transcription‐Polymerase Chain Reaction

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20181002