CN103898211A

CN103898211A - 肌萎缩侧索硬化症的基因诊断试剂盒

Info

Publication number: CN103898211A
Application number: CN201410082951.8A
Authority: CN
Inventors: 陈实; 黎寒
Original assignee: JIANGSU XIONGMING MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JIANGSU XIONGMING MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-03-10
Filing date: 2014-03-10
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2034-03-10
Also published as: CN103898211B

Abstract

本发明公开了一种肌萎缩侧索硬化症的基因诊断试剂盒。该试剂盒及检测方法是根据研究报道与肌萎缩侧索硬化症相关的致病基因，包括SOD1、FUS、VAPB、ANG、TARDBP、FIG4、OPTN、VCP、Sigmar1、CHMP2B、PFN1位点，设计和合成各基因特异性引物，通过采集待测个体的标本，运用RT-PCR技术，将得到RT-PCR产物进行测序分析，然后将样本序列与正常基因序列进行比对，确认是否有致病突变。本发明能一次性检测出致病基因蛋白编码区（CDS）所有的致病突变位点，具有简便快速，准备可靠，特异性好，灵敏度高等优点，可以同时检出ALS病人和无症状患者。

Description

肌萎缩侧索硬化症的基因诊断试剂盒

技术领域

发明涉及一种遗传性疾病的基因诊断试剂盒，更具体的说是一种肌萎缩侧索硬化症的基因诊断试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是运动神经元病（motor neuron disease, MND）的一个主要类型，由Charcot在1865年第一次描述。其病变主要累及脊髓前角细胞，脑干运动神经核及锥体束，表现为上.下运动神经元同时受损的特征，属于慢性进行性变性疾病。患者临床表现为上下运动神经元同时受累的症状.受累肢体肌无力.肌萎缩.肌束震颤.痉挛.腱反射活跃.出现病理反射。延髓上运动神经元受累可出现痉挛性构音障碍，表现为言语缓慢.吃力.失真，并常伴有鼻音，下颌反射呈阳性; 延髓下运动神经元受累主要表现为舌肌无力萎缩.纤颤，发音无力和吞咽障碍。该病每年发病率约为2~3/10⁵, 多为中. 老年起病，男性多于女性, 多数患者在出现临床症状后3~5年内死于呼吸肌麻痹，给患者和家庭带来沉重的生理和心理负担。

ALS起病隐匿，疾病早期临床症状不典型，该病的诊断尚存在一定困难。目前国内外临床上一直使用的为1998年世界神经病学联盟推荐的ALS诊断标准。2001年，中华医学会神经病学分会参照世界神经病学联盟的诊断标准提出了我国肌萎缩侧索硬化症的诊断标准，必须有以下神经症状和体征：（1）下运动神经元病孙特征（包括目前临床表现正常，肌肉的肌电图异常）；（2）上运动神经元病损体征；（3）病情逐步发展。根据以上3个特征，又做以下3个程度的诊断：（1）确诊ALS：全身四个区域（脑.颈.胸.腰骶神经支配区）的肌肉群，3个区域有上下运动神经元病损的症状和体征；（2）拟诊ALS：在2个区域有上下运动神经元病损的症状和体征；（3）可能ALS：在一个区域有上下运动神经元病损的症状和体征，或在2~3个区域有上运动神经元病损症状和体征。根据情况选择适当的辅助检查以排除其他疾病，如肌电图，包括运动和感觉神经传导速度和阻滞测定及胸锁乳突肌检查，脊髓和脑干MRI检查和肌肉活检。

根据这些诊断标准，典型的ALS诊断并不困难，但是用于临床工作，这一标准显得过于严格。ALS患者发病早期可以表现为单纯下运动神经元或上运动神经元受累，也可以单纯表现为延髓受累症状，当病情发展至符合该确诊标准时往往延误了最佳治疗时机。甚至约有25%的ALS患者死亡后仍然不能得到诊断，一些不典型的病例也不能得到及时得到诊断，尤其对ALS的临床实验中的患者的筛选非常不利。同时由于ALS神经病变部位的随机性，ALS的临床表现也因人而异，因病变部位而不同，其症状和体征也难以与一些重要疾病鉴别，如椎管源性脊髓病. 多灶性运动神经病，进行性脊肌萎缩症，青年良性远端手肌萎缩症等，单凭临床症状极易误诊。

迄今为止，ALS的病因及发病机制尚不明确，可能是多种因素共同作用的结果，其中环境和遗传因素被认为是主要病因，尤其是遗传因素。近年来，随着分子生物学的飞速发展，已发现了多个基因与ALS发病有关，包括SOD1、FUS、VAPB、ANG、TARDBP.FIG4、OPTN、VCP、Sigmar1、CHMP2B、PFN1，并在离体和在体实验中验证了基因突变与发病密切相关。至今报道的各致病基因突变也有多种，如SOD1基因已报道了100多个不同的突变类型，TARDBP基因突变位点达到50多个，这些突变包括错义突变.缺失,无义突变等,分布于各个外显子。ALS疾病具有明显的遗传异质性，不同种族和家系各种原发致病位点分布情况也不一样。

针对肌萎缩侧索硬化症的早期临床诊断较难，且存在一定的误诊和漏诊，利用基因诊断技术将成为确诊的有力手段，不仅可以对患者所患疾病做出判断，也可以对表型正常但携带某种特定疾病基因或者特定疾病的易感性做出判断。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction ,简称PCR技术)是近年发展起来体外扩增特异DNA片段的技术，由于其具有快速.灵敏.特异性强等特点，所以该技术很快用于实践中。

传统的等位基因特异性PCR简便快速等优点，但一次PCR只能鉴别一个突变位点。从中国专利在内的有关资料检索表明，以PCR为基础发展起来的RT-PCR结合现在发展起来的基因测序技术，单管可以同时检测到ALS疾病一个致病基因内所有外显子的多个突变，目前尚未见到这一技术进行ALS疾病分子诊断的专利和报道。本项专利即是利用RT-PCR结合基因测序技术，对ALS各相关致病基因蛋白编码区域（CDS）的所有致病突变位点进行检测，从而对ALS做出快速诊断。

发明内容

本发明的目的是提供一种肌萎缩侧索硬化症（ALS）的基因诊断试剂盒及检测方法，在于为肌萎缩侧索硬化症的相关致病基因提供一种简便快速、准确可靠、特异性好高的基因诊断方法，可应用于患者、表型正常的携带者及产前基因诊断，从而为临床诊断和早期的预防治疗提供参考。

本发明依据国内外对肌萎缩侧索硬化症（ALS）的分子遗传学研究的成果，发现了多个与ALS相关的致病基因，包括SOD1、FUS、VAPB、ANG、TARDBP、FIG4、OPTN、VCP、Sigmar1、CHMP2B、PFN1，发病与上述基因的蛋白编码区（CDS）基因突变密切相关。利用RT-PCR方法结合基因测序技术，就能达到明确全面检测该疾病的目的。

具体的技术方案是：

肌萎缩侧索硬化症的基因诊断试剂盒，包括有用于扩增如下11个基因的引物：SOD1、FUS、VAPB、ANG、TARDBP、FIG4、OPTN、VCP、Sigmar1、CHMP2B、PFN1。

优选地，上述引物是如表1所示，引物在最终扩增体系中的浓度也列于表1。

表1 优选的引物序列以及引物在最终扩增体系中的浓度

Figure 2014100829518100002DEST_PATH_IMAGE002

上述的试剂盒的使用过程如下：

首先，将待测样本进行RNA提取，再将RNA反转录为cDNA，再对cDNA采用上述的引物、扩增体系和扩增参数进行PCR扩增，再对PCR扩增产物进行测序，即可。

上述试剂盒中还可以包括RNA提取试剂盒和/或反转录试剂盒。

有益效果

本发明依据国内外对肌萎缩侧索硬化症的分子生物学和遗传学研究的结果，发现ALS多个致病基因，包括SOD1、FUS、VAPB、ANG、TARDBP、FIG4、OPTN、VCP、Sigmar1、CHMP2B、PFN1，根据各基因保守区设计一对引物，利用引物特异性扩增各基因的全部CDS区，所建立优化的的RT-PCR反应体系结合测序技术保证了检测结果的快速性、准确性和灵敏性。使用本发明的基因诊断试剂盒，可以单管一次性PCR同时检测到一个基因的CDS区内全部的致病突变位点，能够覆盖大多数患者和携带者的诊断，具有简便、高效、准确等优点。该方法可运用于患者、携带者及产前诊断，可为临床确诊疾病提供重要的依据和参考价值，也有利于对该疾病的早期预防治疗，具有巨大的普及和推广应用价值。

附图说明

图1是本发明提供的试剂盒进行RT-RCR检测ALS患病细胞株ND32947和正常细胞株ND29194致病突变位点TARDBP的电泳结果。A、B泳道为细胞株ND32947的电泳结果；D泳道为细胞株ND29194的电泳结果；E泳道：Marker。

图2是ALS患者ND32947成纤维皮肤细胞的部分测序结果，为突变序列，箭头所指为突变位点；

图3是正常人ND29194成纤维皮肤细胞部分测序结果，箭头所指为正常对照序列；

图4是SOD1、VAPB、Sigmar1、PFN基因的扩增产物电泳图，其中1、2泳道是SOD1基因，3泳道是VAPB基因，5泳道是marker，6泳道是Sigmar1，7泳道是PFN1；

图5是OPTN、VCP基因的扩增产物电泳图，其中，泳道1-5是OPTN（退火温度依次分别为55℃、54.3℃、53.1℃、51.3℃、49℃，55℃条件下扩增条带清晰），泳道7是VCP，泳道8是marker；

图6是CHMP2B基因扩增产物电泳道，泳道1是CHMP2B，泳道2是marker；

图7是FUS基因扩增产物电泳道，泳道1是FUS，泳道2是marker；

图8是ANG基因扩增产物电泳道，泳道1是ANG，泳道2是marker；

图9是FIG4基因扩增产物电泳道，泳道1-3是FIG4，泳道4是marker；

图10是marker的产物大小分布图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件( 例如参考J. 萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社) 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 基因的确定、引物设计以及试剂盒组成及扩增程序

本发明涉及的11个基因与ALS疾病相关，已有文献报道了其相关性。11个基因的序列可以通过如下途径获得。

在网址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 根据如下基因ID可检索到基因序列

表2 基因ID

Figure 2014100829518100002DEST_PATH_IMAGE003

引物设计过程上，主要是根据各基因保守区进行设计，利用引物特异性扩增各基因的全部CDS区。正向和反向引物分别设计在5'-UTR和3'-UTR区，确保扩增产物能够覆盖全部的CDS区，能够使该试剂盒检测全部CDS区上的突变位点。

以PFN1基因为例，下载后得到的基因序列如下所示(SEQ ID NO.23)，其中下划为设计引物所对应的结合区，用括号[ ]括起的部分为CDS区。设计引物的扩增产物可以包含全部的CDS区长度。

CCCGCAGGGTCCACACGGGTCGGGCCGGGCGCGCTCCCGTGCAGCCGGCTCCGGCCCCGACCGCCCCATGCACTCCCGGCCCCGGCGCAGGCGCAGGCGCGGGCACACGCGCCGCCGCCCGCCGGTCCTTCCCTTCGGCGGAGGTGGGGGAAGGAGGAGTCATCCCGTTTAACCCTGGGCTCCCCGAACTCTCCTTAATTTGCTAAATTTGCAGCTTGCTAATTCCTCCTGCTTTCTCCTTCCTTCCTTCTTCTGGCTCACTCCCTGCCCCGATACCAAAGTCTGGTTTATATTCAGTGCAAATTGGAGCAAACCCTACCCTTCACCTCTCTCCCGCCACCCCCCATCCTTCTGCATTGCTTTCCATCGAACTCTGCAAATTTTGCAATAGGGGGAGGGATTTTTAAAATTGCATTTGCAAAGTTCGGTGTCTGGGCTGGCGAGTGGGGGAGGGAGGGAATGGGGAGTAGGCCCCGCCCCTACCGTCCTTTGCAAATAAAAATCTAGCGGGGCGGGGGGGGGGAGGAGCAGGAAGTGGCGGTGCGAGGGCTGCTGCACAGCGAGCGGAGCCGCGGTCCGGACGGCAGCGCGTGCCCCGAGCTCTCCGCCTCCCCCCGCCCGCCAGCCGAGGCAGCTCGAGCCCAGTCCGCGGCCCCAGCAGCAGCGCCGAGAGCAGCCCCAGTAGCAGCGCC[ATGGCCGGGTGGAACGCCTACATCGACAACCTCATGGCGGACGGGACCTGTCAGGACGCGGCCATCGTGGGCTACAAGGACTCGCCCTCCGTCTGGGCCGCCGTCCCCGGGAAAACGTTCGTCAACATCACGCCAGCTGAGGTGGGTGTCCTGGTTGGCAAAGACCGGTCAAGTTTTTACGTGAATGGGCTGACACTTGGGGGCCAGAAATGTTCGGTGATCCGGGACTCACTGCTGCAGGATGGGGAATTTAGCATGGATCTTCGTACCAAGAGCACCGGTGGGGCCCCCACCTTCAATGTCACTGTCACCAAGACTGACAAGACGCTAGTCCTGCTGATGGGCAAAGAAGGTGTCCACGGTGGTTTGATCAACAAGAAATGTTATGAAATGGCCTCCCACCTTCGGCGTTCCCAGTACTGA]CCTCGTCTGTCCCTTCCCCTTCACCGCTCCCCACAGCTTTGCACCCCTTTCCTCCCCATACACACACAAACCATTTTATTTTTTGGGCCATTACCCCATACCCCTTATTGCTGCCAAAACCACATGGGCTGGGGGCCAGGGCTGGATGGACAGACACCTCCCCCTACCCATATCCCTCCCGTGTGTGGTTGGAAAACTTTTGTTTTTTGGGGTTTTTTTTTTCTGAATAAAAAAGATTCTACTAACAAGG

在引物设计过程中，采用的标准样品是从Coriell Institute for Medical Research 购买的人皮肤成纤维细胞，包括ALS病人和正常皮肤细胞对照，其详细信息如下，下述的信息都经过Coriell Institute for Medical Research的确认鉴定。

表3 细胞样本信息

Figure 2014100829518100002DEST_PATH_IMAGE005

该试剂盒在使用中，首先是将样本的RNA进行提取，再将RNA逆转录为cDNA，接着通过PCR对cDNA进行扩增，将扩增产物进行测序，获知突变情况。每个基因都分别在单独的扩增体系中采用相应的引物进行PCR扩增。对引物设计以及扩增程序的循环往复的大量试验调整，并结合对模版量、引物的Tm值的相应的优化后，较优的引物序列以及引物在扩增体系中的终浓度如下：

表4引物序列以及引物在最终扩增体系中的浓度

经过大量试验摸索得到的PCR扩增程序是：

表5 扩增程序

Figure 2014100829518100002DEST_PATH_IMAGE008

表5中，首先在94℃下进行预变性，进行一个循环；然后94℃变性，接下来的退火过程中，各个基因对应的引物组需要采用不同的退火温度，退火时间都为30s，接下来各个基因在72℃下进行延伸，各个基因的延伸时间不同，整个变性、退火、延伸过程循环35次；最后，再进行72℃下的5min的一个循环的再延伸。实现扩增全过程。

实施例2 基因诊断肌萎缩侧索硬化症的检测

本发明提供的家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）的基因诊断试剂盒，其检测的样品可以是待测个体的血液、体液、毛发、骨骼、细胞或组织标本等。本实施例中，采用同实施例1的标准细胞株。

一、待测个体人成纤维皮肤细胞RNA的提取：

1. 取待测样品加入1ml Trizol液在冰上混匀，捣碎匀浆；冰上静置10min；

2. 在匀浆液中加入200μl氯仿，用力振摇15s，室温孵育10min

3. 4℃，12000g/min,l离心15min

4. 取水相（上层），加入500μl异丙醇，轻轻晃动，室温孵育10~15min

5. 4℃，12000g/min,l离心10min

6. 弃上清，用1ml 75%乙醇（v/v）洗涤一次，4℃，7500~10000g/min，离心5min

7. 空气干燥超净工作台处晾干，用20～30μl DEPC水溶解（若不能完全溶解可于55~60℃孵育5~10min），得到RNA提取液。

二、样品RNA反转录为cDNA

取2μl RNA提取液95℃预热5～10min，加入含RT反应液的反应管，在PCR仪或者恒温水浴锅中按以下程序进行扩增反应：25℃，5min，42℃孵育60min，最后70℃，15min使反转录酶灭活。最终得到RT-PCR反应模板。

RT反应液的组成是：

表6 RT反应液组成（20μl反应体系）

Figure 2014100829518100002DEST_PATH_IMAGE009

三、对cDNA进行PCR扩增

取2μl RT-PCR反应模板加入到48μl 扩增体系中，每管中加入用于扩增一个基因的引物对，11个基因共分别在11个管中进行反应，引物以及浓度如表4所示，混匀后在PCR仪中按照表5中的程序进行反应。

PCR扩增中的扩增体系如表7所示。

表7 PCR扩增体系组成（50μl反应体系）

Figure 2014100829518100002DEST_PATH_IMAGE010

四、测序

反应结束后，对产物进行电泳分离，对目的产物进行切胶后做T-A克隆，直接进行测序，委托南京金斯瑞生物科技公司。图1所示的是TARDBP基因的扩增产物的电泳结果，从图中可以看出，扩增产物呈清晰、单一的条带，可见其扩增效率高，无特异性产物出现，公开序列经过扩增后其产物大小预计在1293 bp，其实际大小为1293bp，其大小与预期相符。

结果：

应用DNAMAN 软件进行序列比对分析。将测序得到的序列与NCBI检索到的标准序列进行比对，确定是否存在致病突变位点。TARDBP基因部分测序结果如图2和图3所示。突变位点在图2中用箭头进行标注。

采用的样品的测定部分序列是：

正常：

CAGGGTGGATTTGGTAATAGCAGAGGGGGTGGAGCTGGTTTGGGAAACAATCAAGGTAGTAATATGGGTGGTGGGATGAACTT

突变：

CAGGGTGGATTTGGTAATAGCAGAGGGGGTGGAGCTAGTTTGGGAAACAATCAAGGTAGTAATATGGGTGGTGGGATGAACTT

下划为正常与突变的位点对比。

上列为正常细胞样品的序列，下列为ALS病变的标准样品的序列，可以看出，存在有一个位点的不同。上述的序列测定结果与数据库中公开的序列一致。

另外，其它的基因的扩增产物电泳结果如图4～图9所示，从图中可以看出，可以在预计片段大小处获得清晰、单一的扩增产物，对正常人的细胞株样品经过切胶后做T-A克隆后测序，测定结果与已经公开的序列完全一致，扩增片段大小与预测值一致，证实了本试剂盒可以有效地对目标序列区域进行扩增，并可以良好地对扩增产物进行测序、考察突变情况。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏雄鸣医药科技有限公司

<120> 肌萎缩侧索硬化症的基因诊断试剂盒

<130> 无

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcgagttat ggcgacgaa 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agggaatgtt tattgggcga tc 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcagcggtg ttggaacttc 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggagccaggc taattaatac gg 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctaaggaac atggcgaagg 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctacctcta caaggcaatc tt 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caaccccacc tagatgca 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccttggcaa tgaatgtt 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cggcctagcg ggaaaagtaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

taccaaccaa ccacaacccc 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tagtgcctaa tgggtgtt 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcaagtgaca gaaaagga 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtgggcaact tttggagtga 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caacagtttt ggggaggtga t 21

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgcgaccgtc gtttgagt 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aatggagcag gctgtggg 18

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gaggccgtga gcgcaa 16

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tgtctatccg caggtcttcc t 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cctgtccttt tcctcctgtc c 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agaaatctgc actgtgcttg g 21

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gagcagcccc agtagcag 18

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tgtatgggga ggaaaggggt 20

Claims

1.一种肌萎缩侧索硬化症的基因诊断试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增如下11个基因的引物：SOD1、FUS、VAPB、ANG、TARDBP、FIG4、OPTN、VCP、Sigmar1、CHMP2B、PFN1。

2.根据权利要求1所述的肌萎缩侧索硬化症的基因诊断试剂盒，其特征在于，所述的引物如下所示：SOD1，SEQ ID NO.1～2；FUS，SEQ ID NO.3～4；VAPB，SEQ ID NO.5～6；ANG，SEQ ID NO.7～8；TARDBP，SEQ ID NO.9～10；FIG4，SEQ ID NO.11～12；OPTN，SEQ ID NO.13～14；VCP，SEQ ID NO.15～16；Sigmar1，SEQ ID NO.17～18；CHMP2B，SEQ ID NO.19～20；PFN1，SEQ ID NO.21～22。

3.根据权利要求1所述的肌萎缩侧索硬化症的基因诊断试剂盒，其特征在于：各个引物在扩增体系中的终浓度都是0.4 μM。

4.根据权利要求1所述的肌萎缩侧索硬化症的基因诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的扩增体系由以下组成：10× 缓冲液，5.0μl；10mM dNTP，1.0μl；正向引物，2.0μl；反向引物，2.0μl；Taq酶，0.2μl；dd H₂O，补足至50μl。

5.根据权利要求1所述的肌萎缩侧索硬化症的基因诊断试剂盒，其特征在于：还包括有RNA提取试剂盒和/或反转录试剂盒。