CN110452910A - 一种fus突变基因、检测引物和试剂盒 - Google Patents

一种fus突变基因、检测引物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种FUS突变基因、检测引物和试剂盒。本发明所提供的FUS突变基因经检测和验证，为ALS致病基因，可用来构建ALS致病基因检测方法以及制备相应引物和试剂盒；本发明还提供用于检测FUS基因突变的引物，可检测出FUS基因第14内含子的1541位点剪切突变(c.1541+1G>A)是否存在，可用于ALS疾病的产前诊断和遗传咨询，减少出生缺陷，并且本发明相应的提供了试剂盒，用于诊断ALS疾病。

Description

一种FUS突变基因、检测引物和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物技术领域，尤其涉及一种FUS突变基因、检测引物和试剂盒。
背景技术
肌萎缩侧索硬化症(ALS)是以皮层、脑干和脊髓前索的运动神经元变性为特征的进行性疾病。患者的临床表现通常有上运动神经元瘫痪和下运动神经元瘫痪的表现。ALS通常先累及一个部位的神经元(头/颈/胸/腰)，之后逐渐扩展到其他区域。典型的表现包括肢体起病和延髓起病，呼吸衰竭起病较少。通常临床表现随着时间而逐渐进展，没有缓解期。最终患者逐渐致残和死亡，目前尚无根治的办法。治疗以支持治疗和姑息治疗为主，目的是改善患者的生存质量。因此，越早诊断，对患者提早干预，对提高患者生存质量有重要意义。
ALS相关基因突变情况：C9orf72，SOD1，TARDBP和FUS等基因的突变可以引起家族性ALS并诱发散发性ALS。其中，C9orf72基因的突变，在美国和欧洲占家族性ALS的30％至40％。在世界范围内，SOD1基因突变导致15％至20％家族性ALS。TARDBP和FUS基因突变各占约5％的病例，其他与家族性ALS相关的基因占很小部分。估计有60％的家族性ALS患者具有已鉴定的基因突变，剩下的患者则病因不明。
FUS是FUS RNA Binding Protein的简称，该基因编码的多功能蛋白质是异质核核糖核蛋白(hnRNP)复合物的重要组成部分。hnRNP复合物参与mRNA前体的剪接过程，以及加工好的mRNA向细胞质的输送过程。FUS蛋白属于RNA结合蛋白的FET家族，涉及的细胞过程包括基因表达的调控、基因组完整性的维持和mRNA/微小RNA的加工过程。FUS可以结合单链和双链DNA并促进互补单链DNA的ATP非依赖性退火过程和超螺旋双链DNA中的D-环形成过程。
FUS基因的致病突变位点多位于蛋白的末端，形成该基因的突变热点区域。研究ALS疾病的易感基因，对开展遗传咨询，阐述其发病机制，明确疾病诊断，探索诊断治疗方法有重要价值。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种FUS突变基因、检测引物和试剂盒，用于FUS基因突变检测时，具有准确度高、特异性高和灵敏度高等优点。
本发明的技术方案如下：
一种肌萎缩侧索硬化症FUS突变基因，其中，所述FUS突变基因第14内含子的1541位点具有c.1541+1G>A突变位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一种检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的引物，其中，所述引物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，所述引物的下游引物如SEQ ID NO.2所示。
一种检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其中，所述试剂盒包含所述的引物。
所述的检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、dNTP、Eva Green、taq聚合酶。
所述的检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其中，所述PCR缓冲液为Tris-Cl缓冲液。
所述的检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其中，所述dNTP为0.2mM。
所述的检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其中，所述Eva Green为Biotium荧光染料。
所述的检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其中，所述taq聚合酶为1U。
所述的检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其中，所述引物中的上游引物和下游引物均为0.25μM。
有益效果：本发明所提供的FUS突变基因经检测和验证，为ALS致病基因，可用来构建ALS致病基因检测方法以及制备相应引物和试剂盒；本发明还提供用于检测FUS基因突变的引物，可检测出FUS基因第14内含子的1541位点剪切突变(c.1541+1G>A)是否存在，可用于ALS疾病的产前诊断和遗传咨询，减少出生缺陷，并且本发明相应的提供了试剂盒，用于诊断ALS疾病。
附图说明
图1a和1b为本发明实施例1的测序结果图。
图2为本发明实施例1的进化保守性分析结果图。
图3为本发明实施例1的电泳图。
图4为本发明实施例1的先证者所在家系的遗传图谱。
具体实施方式
本发明提供一种FUS突变基因、检测引物和试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种肌萎缩侧索硬化症FUS突变基因(即FUS基因具有一新发突变位点)。该突变位点为第14内含子的第一个碱基(即c.1541+1G>A)，FUS突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：ccctggcaag atggattcca gataagactt taaatcagaa taaaaaagtagagcagttga(基因组位置NC_000016.10g.10981-g.11040；突变位点：c.1541+1G>A)。其中，c.1541+1G>A突变是指FUS基因编码序列第1541位点下游(3’端)处于第14内含子的第一个碱基G核苷酸突变成A核苷酸，即由之前的ggtaagactt突变为gataagactt。FUS突变位点(c.1541+1G>A)经检测和验证，为ALS致病基因位点，可用来构建ALS致病基因检测方法以及制备相应引物和试剂盒。
本发明提供一种检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的引物，根据GenBank公布的与ALS预后相关的各个突变基因的序列，利用Primer Premier5.0引物设计软件进行引物设计。
所述引物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，所述引物的下游引物如SEQ ID NO.2所示。
本发明设计的具体引物情况如表1所示。
表1
本发明提供的引物是针对FUS基因突变区进行检测。
本发明还提供一种检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，所述试剂盒包含所述的引物。即所述的试剂盒含有检测FUS突变位点(c.1541+1G>A)的试剂。即所指试剂盒含有的操作说明书中描述有如下内容：如果FUS基因编码序列第1541位点下游(3’端)处于第14内含子的第一个碱基突变(c.1541+1G>A)，则提示检测对象为ALS的可能。
进一步，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、dNTP、Eva Green、taq聚合酶。
进一步，所述PCR缓冲液为1×PCR buffer，具体可为Tris-Cl缓冲液。
进一步，所述dNTP为0.2mM。
进一步，所述Eva Green为Biotium荧光染料。
进一步，所述taq聚合酶为1U。
进一步，所述试剂盒还可包括：模板DNA。
本发明还提供一种检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的方法，包括如下步骤：
S1、提取基因组DNA；
S2、采用所述的试剂盒，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应；
S3、采用PCR扩增产物进行测序反应；
S4、对测序结果进行分析，确定所述基因突变是否存在。
在所述步骤S1中，采用通用方法或试剂盒从外周血白细胞中提取基因组DNA。
在所述步骤S2中，采用PCR-HRM方法进行扩增。HRM(high-resolution melting，高分辨融解曲线技术)是一种低成本、高通量、快速，且不受位点局限的检测方法。
进一步，所述PCR扩增反应包括如下步骤：
预热；
扩增循环：变性、褪火和延伸；
保存。
其中的预热是指热启动，即先进行预热。
其中的扩增循环是指变性、褪火和延伸循环进行多次。最后保存得到的PCR扩增产物。
所述PCR扩增反应还包括：对保存的PCR扩增产物进行HRM分析。即分析PCR扩增产物是否异常。
进一步，HRM分析的融解曲线条件优选为：95℃热变性15sec，随后褪火55℃持续15sec，然后以+0.2℃/s的速率提升温度至95℃。
在所述步骤S3中，采用PCR扩增产物进行测序反应；
HRM分析判定为异常的PCR扩增产物经由直接DNA测序法(PRISM377，ABI)进行测序，以在后续步骤中核查判断是否有突变。
在所述步骤S4中，对测序结果进行分析，确定所述基因突变是否存在。
本发明的检测方法可以灵敏筛选并快速检测FUS基因中ALS相关突变位点。
实施例1：
临床资料
先证者，男性，51岁开始出现颈项无力，吞咽困难。5个月后出现右下肢渐进性无力，无意识障碍。该先证者出现症状后13个月去世。该先证者的女儿在20岁时开始出现右下肢无力，随后快速进展为四肢无力，症状出现12个月后死于呼吸衰竭。先证者的妹妹跟先证者有同样的基因变异，和相似的临床表型，症状出现后生存期仅仅为8个月。
方法的建立
获取ALS致病基因FUS(NM_004960.3)的突变热点区域在ClinVar上的ALS所有相关突变。并设计PCR-HRM引物，引物序列及扩增片段长度见表1。
FUS基因突变的检测
S1、采用通用方法或试剂盒从外周血白细胞中提取基因组DNA；
S2、采用所述的试剂盒，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应；
扩增反应体系采用Eco Real-Time PCR System(Illumina)，反应体系为10μL，包含：模板DNA(20ng)，1×PCR buffer,dNTP(0.2mM),Eva Green(Biotium),Taq聚合酶(1U)和上下游引物(各0.25μM)。
扩增反应条件如下：
预热：95℃热启动5min；
扩增循环阶段：95℃变性20sec，60℃褪火20sec和72℃延伸20sec，变性、褪火和延伸共进行50个循环；
保存。
融解曲线条件：95℃热变性15sec，随后褪火55℃持续15sec，然后以+0.2℃/s的速率提升温度至95℃。
S3、采用PCR扩增产物进行测序反应；
其中，HRM异常的PCR产物经由直接DNA测序法(PRISM377，ABI)核查判定是否有突变。
S4、对测序结果进行分析，确定所述基因突变是否存在。
测序结果分析所依赖的权威数据库如下：鉴定已知突变，参考ALS在线遗传数据库(http://alsod.iop.kcl.ac.uk/)和NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和ExAC数据库(http://exac.broadinstitute.org)。判定是否为新发突变，参考HGMD数据库(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac)和dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)。对于3'UTR位点的突变和新型选择性剪切位点的突变分析，参考UCSC基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu/)，TargetScan数据库(http://www.targetscan.org/vert_71/)和人类选择性剪切位点寻找数据库(http://www.umd.be/HSF3/)。
本发明采用minigene测试法来确定新发现选择性剪切突变位点的功能效应(针对FUS基因上尚未报道的新型的剪切突变(c.1541+1G>A))。PCR扩增上述基因组DNA作为minigene报告子。扩增区域包括第13号外显子至FUS基因的3'UTR区。FUS的minigene扩增产物由限制性内切酶BamHI和XhoI(Thermo)切断后克隆到pCDNA3.1(+)报告载体中。然后转染U87细胞。24小时后提取细胞总RNA，PCR分析minigene选择性剪切情况。
结果1：PCR-HRM检测与DNA测序结果，如图1a和1b所示，图1a为均一化熔解曲线，图1b为病例对照对比图。
PCR-HRM检测发现该例先证者融解曲线有异常波形，直接DNA测序发现先证者为c.1541+1G>A杂合突变。
结果2：选择性剪切位点进化保守性分析结果，如图2所示。
选择性剪切位点c.1541+1G在多种物种中是进化保守的。
结果3：选择性剪切位点minigene测试结果。
选择性剪切位点minigene测试分析显示，先证者基因组DNA因突变的存在，导致体外转录实验中第14号外显子的选择性剪切缺失。如图3所示，电泳图提示先证者转录后产物短于正常人。因此，提示c.1541+1G>A突变可以引起FUS基因的选择性剪切，使得第14号外显子缺失，进而影响到FUS蛋白的功能。
在本例中，如图4所示，先证者、先证者女儿、先证者妹妹都出现相似的症状，并且享有相同的FUS突变位点(c.1541+1G>A)，提示该位点极有可能是ALS的致病位点。该位点是ALS的新发现的致病变异，利用该变异开发的试剂盒，可以用于ALS的早期诊断和治疗参考，提高患者生存质量。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳市宝安区妇幼保健院
<120> 一种FUS突变基因、检测引物和试剂盒
<130> 无
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctatgatcg aggcggcta 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggcctctgt tcaactgctc 20
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccctggcaag atggattcca gataagactt taaatcagaa taaaaaagta gagcagttga 60

Claims (9)

1.一种肌萎缩侧索硬化症FUS突变基因，其特征在于，所述FUS突变基因第14内含子的1541位点具有c.1541+1G>A突变位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的引物，其特征在于，所述引物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，所述引物的下游引物如SEQ ID NO.2所示。
3.一种检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求2所述的引物。
4.根据权利要求3所述的检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、dNTP、Eva Green、taq聚合酶。
5.根据权利要求3所述的检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液为Tris-Cl缓冲液。
6.根据权利要求4所述的检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述dNTP为0.2mM。
7.根据权利要求4所述的检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述Eva Green为Biotium荧光染料。
8.根据权利要求4所述的检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述taq聚合酶为1U。
9.根据权利要求3所述的检测肌萎缩侧索硬化症FUS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述引物中的上游引物和下游引物均为0.25μM。
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